<C7D1B9E6C0E7C8B0C0C7C7D0B0FAC7D0C8B8C1F B1C731C8A35F33C2F7C6EDC1FD E687770>

Journal of Korean Medicine Rehabilitation Vol. 31 No. 1, January 2021 pissn 1229-1854 eissn 2288-4114 https://doi.org/10.18325/jkmr.2021.31.1.59 Original Article 김선길 * 김주일 * 김지훈 * 윤찬석 * 정지원 * 나창수 김선종 * 동신대학교한의과대학한방재활의학과교실 *, 동신대학교한의과대학경락경혈학회 Genotoxicity Study of ChondroT Sun-Gil Kim, K.M.D.*, Joo Il Kim, K.M.D.*, Ji-Hoon Kim, K.M.D.*, Chan Suk Yoon, K.M.D.*, Ji-Won Jeong, K.M.D.*, Chang-Su Na, K.M.D., Seon-Jong Kim, K.M.D.* Departments of Korean Medicine Rehabilitation*, Meridian and Acupoint, College of Korean Medicine, Dongshin University RECEIVED September 15, 2020 ACCEPTED September 21, 2020 CORRESPONDING TO Seon-Jong Kim, Department of Korean Medicine Rehabilitation, Mokpo Oriental Hospital of Dongshin University, 313 Baengnyeon-daero, Mokpo 58665, Korea TEL (061) 280-7905 FAX (061) 280-7788 E-mail mofoster@hanmail.net Copyright 2021 The Society of Korean Medicine Rehabilitation Objectives This study was performed to observe the genotoxic effect of the ChondroT. Methods To evaluate the genotoxicity of ChondroT, an experiment of bacterial reverse mutation test, in vitro mammalian chromosomal aberration test and mammalian erythrocyte micronucleus test in mouse was conducted. Results TA98, TA100 and TA1537 strains in the absence of metabolic activation system (S9 mix), the number of revertant colonies being greater than 2-fold of the respective negative control value. Both in -S9 mix and +S9 mix, the frequencies of aberration cells with structural aberration and numerical aberrations of chromosome were less than 5%. There was no increase of polychromatic erythrocyte with one or more micronuclei at any dose of test substance compared to the negative control group (p<0.05). Conclusions In TA98, TA100 and TA1537 strains in the absence of metabolic activation system (S9 mix), the number of revertant colonies was greater than 2-fold of the respective negative control value, showing positive results. ChondroT was considered to be non-clastogenic to Chinese hamster lung (CHL/IU) cells under the present experimental condition. and ChondroT was determined not to induce an increased frequency of micronuclei in the bone marrow cells of male ICR mice under the present experimental condition. (J Korean Med Rehabil 2021;31(1):59-79) Key words ChondroT, Mutagenicity tests, Chromosome aberrations, Micronucleus tests 서론»»» 유전독성시험은시험물질이유전자또는염색체에미치는상해작용을평가하는시험을말하며, 신약개발과정에서독성에따른후보물질선별작업에필수적으로수행하는시험항목으로서잠재적인발암성또는돌연변이유발물질을검출하기위한시험이다 1-3). 임상에사용중인한약제제라하더라도다른처방과의조합이 나가감을통해그독성이증감하는사례가보고되고있기에 4), 복합처방으로사용되는한약제제에대한독성시험및안전성연구의필요성이증대하고있다 5). 의약품개발에있어유전독성시험은특정화학물질노출이염색체혹은유전자수준에손상을가해형태적변화나기능이상을초래하는지평가하는것으로, 세균성복귀돌연변이시험과소핵시험에의한시험관내유전독성평가를우선시행하도록권장한다 6). 시험관내유전독성 www.e-jkmr.org 59

김선길 김주일 김지훈 윤찬석 정지원 나창수 김선종 시험결과가긍정적인경우그결과가생체내에서동일하게적용하는지평가하기위해생체내시험 (in vivo) 인포유류적혈구소핵시험, 형질전환쥐시험법및혜성시험등이수행된다 7). ChondroT는청강의감에수록된강활제통음 8) 처방에서강활, 당귀, 금은화, 위령선, 황백을 bio-informatics 기법 9) 을활용하여선별한뒤해당약재를 6:4:4:4:3 비율로혼합하여만든물추출물이다. 선행된연구에서 ChondroT는강활제통음에비해관절염치료효과가우수하였고 10), adjuvant로유도된염증성관절염동물모델에서관절염에대한유효성이검증되었으며 11) collagenase로유발된골관절염모델에서염증성사이토카인생성을억제하고이질통에대한회피반응을감소시키는것이확인되었다 12,13). 또한 monosodium-lodoacetate (MIA) 로발생한관절염동물시험에서염증성사이토카인 (interleukin [IL]-6, IL-β, tumor necrosis factor-α) 의생성을억제하였고, 하지부종 (paw edema) 을감소시켰으며, 조직학적검사에서연골을보호하는효과가있었다 14). Collagen과 thrombin으로활성화된혈소판에대한항응고효과가보고되었고 15), 신장의 mouse urate transporter 1 활성도와 xanthine oxidase 활성도를조절하여혈중요산수치감소를통해통풍을억제하였으며 16), 파골세포의형성에관여하는 nuclear factor-kappa B와 microtubule-associated protein kinases의생성을억제하여골다공증을예방하는효과도보고되었다 17). ChondroT에대한독성평가는단회경구투여독성시험을통해최고용량이 2,000 mg/kg을상회하는것이보고되었고 18), 4주반복경구투여용량결정시험을통해최고용량이 2,000 mg/kg 이상임이확인되었으며 18), 13 주반복독성연구결과 2,000 mg/kg/day의무독성량 (no-observed adverse effect level) 을확인하였다 19). 이에이전 13주반복독성연구에이어 ChondroT의 유전독성안전성확보를위해 Good Laboratory Practice (GLP) 인증기관인한국화학시험연구원에서진행한박테리아를이용하는복귀돌연변이시험, 포유류배양세포를이용하는염색체이상시험, 포유류골수세포를이용하는소핵시험을통해유전독성연구를진행하여유의한지견을얻었기에보고하는바이다. 재료및방법»»» 1. 재료 1) 약재본실험에사용한 ChondroT는 정우신약 ( 서울, 한국 ) 에서공급받아사용하였으며, 처방구성은 Table I과같다. ChondroT는금은화중 chlorogenic acid로서 1.7 mg 이상, 당귀중총 decursin 및 decursinol angelate의총합 0.85 mg 이상, 황백중 berberine chloride로서 1.15 mg 이상의지표성분을함유하는갈색의건조엑스 (3.4 1) 로시험물질품질평가를통해 Lot number 901 (( 주 ) 정우제약, 아산, 한국 ) 를실험에사용하였다. 2. 실험방법 1) 박테리아를이용한복귀돌연변이실험 (1) 음성대조물질시험물질을 200 mg/ml 멸균증류수에 10분동안 vortex 용해하였고, 혼합했을때에발열, 발포, 변색이없음을확인하였다. 멸균증류수는대한약품공업 ( 주 )( 서울, 한국 ) 의제품을사용하였고상온 (1~30 ) 에서보관하였다. (2) 양성대조물질식품의약품안전처고시 2017년-제 71호에서추천되는 Table I. Composition of ChondroT and the Used Parts of 5 Individual Herbs Scientific name Latin name Family Used part Source Rate Ostericum koreanum Maximowicz Osterici Radix Umbelliferae Root Korea 6 Angelica gigas Nakai Angelicae Gigantis Radix Umbelliferae Root Korea 4 Lonicera japonica Thunberg Lonicerae Folium Caprifoliaceae Root China 4 Clematis manshurica Ruprecht Clematidis Radix Ranunculaceae Leaf China 4 Phellodendrom amurense Ruprecht Phellodendri Cortex Rutaceae Tree bark China 3 60 J Korean Med Rehabil 2021;31(1):59-79.

furylfuramide, sodium azide, 2-aminoanthracene, 9-aminoacridine, benzopyrene을사용하였다. Furylfuramide는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan) 제품을사용했으며상온 (1~30 ) 에서보관하였다. Sodium azide, 2-aminoanthracene, 9-aminoacridine, benzopyrene 는모두 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을사용하였으며모두상온 (1~30 ) 에서보관하였다. (3) 실험균주 Salmonella typhimurium에는 TA100, TA1535, TA98, TA1537를 Escherichia coli에는 WP2uvrA를 Molecular Toxicology, Inc. (Boone, NC, USA) 에서공급받아사용하였다. Nutrient broth 배지중에서 10시간, 37 전배양을실시한 0.8 ml 균현탁액에 0.07 ml의비율로 dimethylsulfoxide (DMSO; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 를혼합조성하였다. 분주량을 0.5 ml로동결하여 -65 이하에서보관하였다. (4) 배지 1 Nutrient broth 조제증류수 100 ml에 2.5 g의비율로 Oxoid Nutrient Broth No. 2 (Oxoid Ltd., Hampshire, UK) 를더해용해한뒤 121 에서 15분간고압증기멸균하여냉장보관하였다. 2 Top agar 조제연한천에다음의수용액을각각사용직전에 10% 로첨가하였다. 연한천은증류수 100 ml에 0.6 g의비율로 Bacto-agar (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) 및 0.5 g의 NaCl (Sigma-Aldrich Co.) 을합하고, 이것을 15분간 121 에서고압증기멸균하여 (55±5) 에조제했다. 살모넬라균은 0.5 mmol/l D-biotin L-histidine 혼합수용액을사용직전에 10% 농도로연한천에첨가하였다. 대장균은 0.5 mmol/l L-tryptophan 수용액을사용직전에 10% 농도로연한천에첨가하였다. Top agar는사용직전에조제되었으며, (55±5) 으로보온하였다. 2019년 5월 27일과 2019년 6월 10일에자체조제하였다. (5) S9 mix ( 대사활성계 ) S9은수컷 Sprague Dawley (SD) rat에 500 mg/kg 농도의 Aroclor1254를단회복강투여하여효소를유도한후 5일째에간으로부터조제되었다. 동결건조된 S9 1 vial에멸균증류수 2.1 ml을첨가하여현탁하였다. Cofactor mix는제조원 Oriental Yeast Co., Ltd. (Tokyo Japan) 의 Cofactor-I에멸균증류수 9.5 ml를넣어용해한후 pore size 0.45 μm의 membrane filter로여과한것으로, 사용시조제하였다. S9 mix는 Cofactor mix 9.5 ml당 S9 0.5 ml의비율을추가하여사용시조제하였으며냉장상태를유지하였다. (6) 농도결정실험가이드라인에따라시험균주 TA98, TA100, TA1535, TA1537, WP2uvrA를최고농도 5,000 µg/plate, 공비 10 으로 50, 150, 500, 1,500, 5,000 (μg/plate) 로구별하여농도를설정하였다. 농도결정시험결과, 대사활성계미적용 (-S9 mix) 의 TA100 및 TA1537 균주에서콜로니의증가양상이확인되었으며, 이결과는대사활성계미적용 (-S9 mix) 의 TA100 및 TA1537 균주에서콜로니수의농도상관성 ( 농도의존적증가양상 ) 을판단하기힘든농도이기때문에재현성및농도상관성을확인하기위하여최고농도를 10,000 μg/plate 로설정하고공차 2,000 μg/plate 및공비 2를적용하여 1,000, 2,000, 4,000, 6,000, 8,000, 10,000 (μg/plate) 로구별하여농도를재설정하였다. (7) 실험방법실험은 pre-incubation method를이용하였으며, 대사활성계미적용 (-S9 mix) 과대사활성계적용 (+S9 mix) 환경에서실시하였다. 1 각농도에대해멸균한시험관에음성대조물질, 시험물질용액및양성대조물질용액을 0.1 ml 첨가하였다. 2 대사활성계미적용 (-S9 mix) 의경우, 0.1 mol/l sodium-phosphate buffer (ph 7.4) 를 0.5 ml 넣어혼합한뒤 0.1 ml 균현탁액을추가하였다. 3 대사활성계적용 (+S9 mix) 의경우, 0.5 ml의 S9 mix를넣어혼합한뒤 0.1 ml 균현탁액을추가하였다. 4 이혼합액을 20분간 37 에서진탕 ( 진탕횟수 : 120 회 / 분 ) 하여배양하였다 (pre-incubation). 5 Pre-incubation 후이혼합액에 2 ml의 top agar를넣어 minimal glucose agar plate 위에중층하였다. 6 중층한 top agar가응고된후 (48±2) 시간 37 에 www.e-jkmr.org 61

김선길 김주일 김지훈 윤찬석 정지원 나창수 김선종 서배양하였다. (8) 판단기준콜로니계수는육안으로이뤄졌으며, 최소 1개균주에서평판당복귀돌연변이콜로니수가 1개이상의농도에서재현성있는증가를나타낼때양성으로판단했으며, 콜로니수의음성대조군대비증가여부및농도상관성을고려하였다. (9) 결과의집계균의생육저해는 (48±2) 시간배양후현미경으로관찰하였으며, 침전및석출은 (48±2) 시간배양후육안으로관찰하였다. 양성대조, 음성대조및시험물질의각처리에대해계수한콜로니수의평균값및표준편차를산출하였으며, 평균값및표준편차는소수점이하에서반올림하였다. 2) 포유류배양세포를이용한염색체이상실험 (1) 음성대조물질시험물질을 200 mg/ml 멸균증류수에 10분동안 vortex 용해하였고, 혼합했을때에발열, 발포, 변색이없음을확인하였다. 멸균증류수는대한약품공업 ( 주 ) 의제품을사용하였고상온 (1~30 ) 에서보관하였다. (2) 양성대조물질 2 mg/vial 함량의 mitomycin C, 98.0% 순도의 cyclophosphamide monohydrate (CPA) 을사용하였다. 모두 Sigma-Aldrich Co. 제품을사용하였으며모두냉장환경 (2~8 ) 에서보관하였다. (3) 실험세포 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) 에서입수한 CHL/IU (Female, Chinese Hamster Lung 유래 ) 를사용하였다. DMSO를 10% (v/v) 의비율로첨가한배지에세포를부유시켜약 1 ml씩분주하였으며, 액체질소보존용기에옮겨동결보존하였다. 보존된동결세포는시험기간중해동및배양하여사용되었으며, 다른시험과공통으로사용하였다. 입수후동결보존한세포에해동후시험에사용하기전에염색체모드 (2n) 는 25, 배가시간이 15.9시간, mycoplasma의음성상태를확인하였다. (4) Minimum essential medium (MEM) 배지 MEM 배지및 MEM은사전혹은시험개시후에구입, 조제하였으며다른시험과공통으로사용하였다. MEM에 heat-inactivated fetal bovine serum (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 10% (v/v), penicillin streptomycin (Gibco) 1% 비율로첨가하였다. (5) S9 mix ( 대사활성계 ) S9은 SD rat ( 수컷 ) 에 Aroclor1254를 500 mg/kg의농도로복강내단회투여하여효소를유도한뒤 5일째에간으로부터조제하였다. 멸균증류수 2.1 ml와동결건조된 S9 1 vial을혼합하여현탁하였다. Cofactor mix는제조원 Oriental Yeast Co. 의 Cofactor-I 에멸균증류수 7 ml를넣어용해한후 pore size 0.45 μm 의 membrane filter로여과한것을 Cofactor mix한것으로사용시조제하였다. S9 mix는 Cofactor mix 4.9 ml 당 S9 2.1 ml의비율로추가하여 S9 mix로하였다. S9 mix는사용시조제하고사용할때까지냉장보존 (2~ 8 ) 하였다. (6) 농도결정실험단기간처리법 (-S9 mix, +S9 mix) 과연속처리법 (24시간처리 ) 으로조건을나눠서실험하였다. 가이드라인에서규정하고있는최고농도 5,000 µg/plate로하여 313, 625, 1,250, 2,500, 5,000 (μg/plate) 로구별하여설정하였다. 농도결정시험결과, 생세포수의급격한감소로인하여본실험의최고농도설정에어려움이있어 -S9 mix와 24시간처리는 1,100, 1,200, 1,250, 1,300, 1,400 (μg/plate) 으로농도를구별하였다. 또한 +S9 mix는 2,000, 2,250, 2,500, 2,750, 3,000으로농도를구별하였다. 농도결정시험결과를토대로 relative increase in cell counts (RICC) 55를넘는농도를각처리조건에서최고농도로하여 -S9 mix는 300, 600, 1,200, 1,250, 1,300 (μg/plate) 의농도로구별하고, +S9 mix는 600, 1,200, 2,400, 2,500, 2,600 (μg/plate) 의농도로구별하여실험하였다. (7) 표본제작 Colcemid를최종농도 0.2 μg/ml이되도록각 culture flask에첨가하여처리종료 2시간전에분열중기세포를축적하였다. 처리종료후세포표면을 phosphate buffered saline (-) 로세정하고, 0.25% trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid로처리 (37, 5분 ) 하여세포를박리하였다. 원심관에서세포부유액을회수해원심분리 (5분간, 1,000 rpm; 이하동일 ) 하여세포를모았으며, 상등액을제거한후각원심관에 0.075 mol/l 농도의 KCL 용액 4 ml을넣고저장처리 (15분, 37 ) 한뒤, 0.5 ml의냉각한고 62 J Korean Med Rehabil 2021;31(1):59-79.

정액 ( 메탄올 : 빙초산혼합액 [3:1, v/v]) 을첨가하여혼합한후원심분리하여상등액을제거하였다. 여기에 4 ml의고정액를혼합한후에원심분리하여상등액을제거하는과정을재차실시한후적당량의고정액으로세포를부유시킨뒤 slide tray 위에둔 slide glass에 2-3 개소에떨어뜨려건조시켜 culture flask당 2매이상의표본을제작하였다. (8) 판단기준 1 구조이상염색분체형절단, 염색분체형교환, 염색체형절단, 염색체형교환 ( 이동원체, 환상염색체등 ), 단편화를구조이상으로판단하였다. 2 Gap 염색분체의폭보다염색분체로보여지는비염색부분의폭이좁은것을 gap으로판단하였다. 구조이상에는포함하지않았으며, 다른이상과구별해기록하였다. 3 수적이상동원체수가 35 이상의배수성세포, 핵내배가세포의수적이상으로판단하였다. 4 염색체이상세포염색체구조이상을 1개이상가지는세포또는염색체수적이상을가지는세포를염색체이상세포로판정하였다. 이때, 관찰가능한분열중기세포는 culture flask 당 150개 ( 농도당 300개 ) 의세포를채용데이터로선정하였다. 3) 포유류골수세포를이용한소핵실험본시험은동물보호법 [ 시행 2018-09-21][ 법률제15502 호 (2018-03-20, 일부개정 )] 및실험동물에관한법률 [ 시행 2019-03-25][ 법률제16075호 (2018-12-24, 일부개정 )] 에근거하여시행되었으며, ( 재 ) 한국화학융합시험연구원화순의동물윤리위원회에의해승인되었다 ( 승인번호 : IAC2019-1142). (1) 음성대조물질선정시험물질을 200 mg/ml 멸균증류수에 10분동안 vortex 용해하였고, 혼합했을때에발열, 발포, 변색이없음을확인하였다. 멸균증류수는대한약품공업 ( 주 ) 의제품을사용하였고상온 (1~30 ) 에서보관하였다. (2) 양성대조물질선정제조원 Sigma-Aldrich Co. 의 CPA를사용하였으며냉 장조건 (2~8 ) 에서보관하였다. (3) 실험동물 1 시험계 ( 주 ) 오리엔트바이오 ( 성남, 한국 ) 에서공급받은 CD1 계통의 ICR mouse를사용하였다. 용량결정실험도입시에는체중 22.57~25.72 g의 6주령암컷과체중 26.91~30.60 g의 6주령수컷을 18마리사용하였다. 또한용량결정실험투여시에는체중 27.79~30.43 g의 7 주령암컷과체중 34.61~36.98 g의 6주령수컷을 15마리사용하였다. 본실험도입시에는체중 27.03~30.14 g의 6주령수컷을 28마리사용하였다. 또한본실험의투여시에는체중 33.39~36.59 g의 7주령수컷을 25마리사용하였다. 2 사육환경 Stainless steel cage (180W 300D 140H) mm에평균온도 (21.6~22.4), 상대습도 (53.7~56.7)%, 광조건 12 시간 (08:00~20:00) 암조건 12시간 (20:00~08:00), 조도 (150~300) Lux의조명주기, 환기횟수 (10~20) 회 /h의사육환경을유지하였으며, 음수는 R/O수, 사료는방사선멸균된 Rodent Diet 20 5053 (Labdiet, St. Louis, MO, USA) 를자유섭취시켰다. (4) 투여투여전약 3~4시간절식시킨실험동물에경구투여용 sonde를이용하여시험물질을위내에강제투여하였다. 양성대조물질은시험물질 2회차투여일에복강내투여하였다. 24시간간격으로 2회강제경구투여하였다. 1 용량설정실험 Table Ⅱ와같이군당 3마리의마우스를암컷과수컷으로구별하여시험물질투여군 4군및음성대조군 1군의총 5군으로실험하였다. 2 본실험용량설정시험결과, 암컷및수컷간의시험물질에대한감수성차이는확인되지않았고, 최고농도인 2,000 mg/kg B.W./day 군에서도사망사례가없었으므로본시험에서는수컷마우스에최고농도를 2,000 mg/kg B.W./day로하여 Table Ⅲ과같이투여하였다. (5) 관찰항목일반증상관찰투여당일과부검당일 1회이상관찰하였다. 표준작업지침서방법에따라체중측정실험동 www.e-jkmr.org 63

김선길 김주일 김지훈 윤찬석 정지원 나창수 김선종 Table Ⅱ. Capacity Setting Test in ICR Mice (Group Summary) Sex Group Dose Times Route Numbers of animals Male G1 Negative control 2 Oral 3 (1101-1103) G2 500 mg/kg B.W./day 2 Oral 3 (1201-1203) G3 1,000 mg/kg B.W./day 2 Oral 3 (1301-1303) G4 1,500 mg/kg B.W./day 2 Oral 3 (1401-1403) G5 2,000 mg/kg B.W./day 2 Oral 3 (1501-1503) Female G6 Negative Control 2 Oral 3 (2101-2103) G7 500 mg/kg B.W./day 2 Oral 3 (2201-2203) G8 1,000 mg/kg B.W./day 2 Oral 3 (2301-2303) G9 1,500 mg/kg B.W./day 2 Oral 3 (2401-2403) G10 2,000 mg/kg B.W./day 2 Oral 3 (2501-2503) Table Ⅲ. Capacity Setting Test in ICR Mice (Group Summary) Division Dose (mg/kg B.W./day) Concentration (mg/ml) Volume (ml/kg once) Times Route Numbers of animals Negative control 0 0 10 2 Oral 5 (1101-1105) 500 50 10 2 Oral 5 (1201-1205) Test substance 1,000 100 10 2 Oral 5 (1301-1305) 2,000 200 10 2 Oral 5 (1401-1405) Positive control 70 7 10 1 Intraperitoneal 5 (1501-1505) 물도입시, 군분리전, 투여전및부검전에개별체중을측정하였다. (6) 소핵의판정기준 1 다염성적혈구의구별관찰시야에서핵이없이적색형광을보이는것으로하였다. 2 정염성적혈구의구별관찰시야에서형광을전혀나타내지않고음영으로만구분되며다염성적혈구크기인것으로하였다. 3 소핵의판정기준크기는제일작은것은식별이가능한것으로, 제일큰것은적혈구직경의 1/2까지로하였다. 형태는주로원형이나기타반원형, 도너츠형등의형태의것을포함시켰다. 색깔은근접한유핵세포의핵과동일하게녹색형광을띠는것으로하였다. (7) 자료의통계처리통계처리는 SPSS program (Ver. 19; IBM Co., Armonk, NY, USA) 을이용하여실시하였다. 소핵유발빈도에있 어음성대조군과시험물질투여군간의비교는 Kruskal- Wallis' H-test 통계법을사용하였다. 소핵유발빈도에있어서음성대조군과양성대조군간의비교는 Mann-Whitney's U-test를사용하였으며, 전체적혈구중다염성적혈구의비율 (polychromatic erythrocyte [PCE]/[PCE+normochromatic erythrocyt {NCE}]) 에서음성대조군과시험물질투여군간의비교 ( 양성대조군포함 ) 는 one-way analysis of variance (ANOVA) test와 Dunnett's test를사용하였다. 전체적혈구중다염성적혈구의비율 [(PCE/(PCE+NCE)] 에있어서음성대조군과양성대조군의비교는 Student's t-test를사용하였고, 체중에있어부검시각개체의체중에대해서는 Dunnett's test와 ANOVA test를실시하여부검시군간차이를조사하였다. 64 J Korean Med Rehabil 2021;31(1):59-79.

결과»»» 1. 박테리아를이용한복귀돌연변이실험 1) 농도결정실험대사활성계미적용 (-S9 mix) 의 TA98 및 TA1537 균주에서 2배이상콜로니의증가양상이확인되었고 TA100 균주에서 1.8배의콜로니증가양상이확인되었다. 생육저해는대사활성계미적용 (-S9 mix) 및대사활성계적용 (+S9 mix) 모두에서확인되지않았으며, 시험물질의석출도대사활성계적용유무에관계없이모든농도에서확인되지않았다 (Tables IV, V). 2) 본실험대사활성계미적용 (-S9 mix) 의 TA100 및 TA1537 균주에서콜로니의증가양상이확인되었다. 생육저해는대사활성계미적용 (-S9 mix) 및대사활성계적용 (+S9 mix) 모두에서확인되지않았으며, 시험물질의석출도대사활성계적용유무에관계없이모든농도에서확인되지않았다 (Tables Ⅵ, Ⅶ). 3) 무균실험농도결정시험에서 S9 mix 및최고농도의시험물질조제액은세균과곰팡이의오염이관찰되지않았고, 본시험에서도 S9 mix 및최고농도의시험물질조제액은세균과곰팡이의오염이관찰되지않았다. 2. 포유류배양세포를이용한염색체이상실험 1) 농도결정실험시험물질처리개시시에시험물질에침전이없음을확인하였다. 시험물질의세포독성은농도의존적으로증가하였다. 세포독성지표인상대세포수증가 (RICC) (55±5)% 는 -S9 mix 에서는 1,218.92 μg/ml, +S9 mix에서는 2,522.53 μg/ml, 24시간처리에서는 1,234.04 μg/ml이었다 (Tables Ⅷ, Ⅸ). 2) 염색체이상실험 ( 단시간처리법 ) 시험물질처리개시시에시험물질의침전은확인되지않았다. 표본관찰결과, -S9 mix 처리군의 0, 300, 600, 1,200, 1,250 및 1,300 μg/ml 농도에서염색체구조이상세포의출현빈도는각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.3 및 0.0% 로관찰되었으며, 수적이상세포의출현빈도는각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.0 및 0.0% 로관찰되었다. 그리고 +S9 mix의 0, 600, 1,200, 2,400, 2,500 및 2,600 μg/ml에있어서의염색체구조이상세포의출현빈도는 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.3 및 0.3% 로관찰되었으며, 수적이상세포의출현빈도는각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.0 및 0.0% 로관찰되었다. 각처리조건의음성대조군에서수적이상세포및구조이상세포의출현빈도는 5% 미만으로확인되었고, 양성대조군에서구조이상세포의출현빈도는 10% 이상으로확인되었다 (Tables Ⅹ, Ⅺ). 3) 염색체이상실험 (24시간처리법 ) 시험물질처리개시시에시험물질의침전은확인되지않았다. 표본관찰결과, 0, 300, 600, 1,200, 1,250 및 1,300 μg/ml 에있어서의염색체구조이상세포의출현빈도는각각 0.0, 0.3, 0.0, 0.0, 0.3 및 0.0% 로관찰되었고염색체수적이상세포의출현빈도는각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.0 및 0.0% 로관찰되었다. 음성대조군의경우구조이상세포및수적이상세포의출현빈도는 5% 미만으로확인되었고, 양성대조군의경우구조이상세포의출현빈도는 10% 이상으로확인되었다 (Table Ⅻ). 3. 포유류골수세포를이용한소핵실험 1) 용량설정실험용량설정시험결과, 시험물질에의한일반증상및사망동물은확인되지않았다. 암컷과수컷간의감수성의차이가확인되지않았으므로일반적으로감수성이뛰어나다고알려져있는수컷마우스를본시험의시험동물로사용하였다. 용량설정시험결과를토대로본시험에서최고농도는 2,000 mg/kg B.W./day 로설정하였다 (Table XIII). 2) 본실험 (1) 체중모든투여군에서음성대조군대비통계학적유의성 www.e-jkmr.org 65

김선길 김주일 김지훈 윤찬석 정지원 나창수 김선종 Table Ⅳ. Result of Concentration Range-Finding Test (Group Summary) Tester strain Chemical Dose Colonies/plate (Mean±S.D.) [Factor]* treated (μg/plate) Without S9 mix With S9 mix Negative control 0 27±3 32±5 50 25±4 [0.9] 34±5 [1.1] TA98 150 25±4 [0.9] 34±2 [1.1] 500 23±3 [0.9] 31±2 [1.0] 1,500 27±3 [1.0] 31±2 [1.0] 5,000 77±8 [2.9] 30±2 [0.9] Negative control 0 117±6 132±2 50 119±5 [1.0] 130±4 [1.0] TA100 150 116±6 [1.0] 140±1 [1.1] 500 118±2 [1.0] 135±7 [1.0] 1,500 116±5 [1.0] 133±2 [1.0] 5,000 205±33 [1.8] 136±2 [1.0] Negative control 0 11±3 10±1 50 10±3 [0.9] 11±3 [1.0] TA1535 150 9±2 [0.9] 9±2 [0.8] 500 10±3 [1.0] 12±2 [1.2] 1,500 11±2 [1.0] 10±0 [1.0] 5,000 12±2 [1.2] 11±3 [1.1] Negative control 0 9±2 11±2 50 11±1 [1.2] 11±2 [1.0] TA1537 150 11±3 [1.1] 11±1 [1.0] 500 11±2 [1.2] 11±2 [1.0] 1,500 11±1 [1.2] 11±1 [1.0] 5,000 24±4 [2.6] 11±1 [1.1] Negative control 0 47±5 63±4 50 49±3 [1.0] 60±3 [1.0] WP2uvr A 150 45±4 [0.9] 57±3 [0.9] 500 45±1 [1.0] 62±3 [1.0] 1,500 45±3 [1.0] 62±5 [1.0] 5,000 47±2 [1.0] 55±3 [0.9] Positive controls TA98 AF-2 0.1 507±13 [23.0] TA100 AF-2 0.01 457±4 [4.1] TA1535 NaN 3 0.5 367±8 [34.4] TA1537 9-AA 40.0 270±12 [27.0] WP2uvrA AF-2 0.01 388±5 [8.3] TA98 B(a)P 2.5 275±6 [8.3] TA100 B(a)P 2.5 1,106±48 [8.2] TA1535 2-AA 2.0 183±5 [17.7] TA1537 2-AA 2.0 201±7 [17.7] WP2uvrA 2-AA 10.0 368±3.5 [6.7] S.D.: standard deviation, AF-2: 2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide, NaN 3 : sodium azide, 9-AA: 9-aminoacridine, B(a)P: benzo(a)pyrene, 2-AA: 2-aminoanthracene. *No. of colonies of treated plate/no. of colonies of negative control plate. 66 J Korean Med Rehabil 2021;31(1):59-79.

Table Ⅴ. Result of Concentration Range-Finding Test (Individual Summary) Tester strain Chemical Dose Colonies/plate (Plate A, B and C)* treated (μg/plate) Without S9 mix With S9 mix Negative control 0 29 24 28 32 27 36 50 29 22 25 37 37 29 TA98 150 28 21 27 32 36 35 500 24 26 20 32 29 32 1,500 24 26 30 30 30 34 5,000 79 69 84 31 27 31 Negative control 0 123 112 115 131 130 134 50 116 117 125 141 139 141 TA100 150 111 122 115 141 139 141 500 116 119 120 138 127 141 1,500 112 122 115 132 132 136 5,000 194 179 243 136 137 134 Negative control 0 9 9 14 11 10 10 50 8 8 13 13 12 7 TA1535 150 11 8 9 7 10 9 500 12 7 12 11 14 11 1,500 13 11 9 10 10 10 5,000 14 10 13 8 12 14 Negative control 0 8 8 12 9 13 10 50 12 10 11 13 9 11 TA1537 150 8 10 14 12 10 10 500 10 13 11 12 12 8 1,500 11 10 12 10 10 12 5,000 21 28 23 11 11 12 Negative control 0 42 48 52 58 64 66 50 46 52 49 63 61 57 WP2uvrA 150 41 44 49 53 59 58 500 46 45 44 65 62 59 1,500 42 45 48 63 66 57 5,000 46 49 47 52 57 56 Positive controls TA98 AF-2 0.1 516 508 482 TA100 AF-2 0.01 467 458 453 TA1535 NaN 3 0.5 367 374 359 TA1537 9-AA 40.0 280 272 269 WP2uvrA AF-2 0.01 395 379 382 TA98 B(a)P 2.5 285 290 272 TA100 B(a)P 2.5 952 897 1,012 TA1535 2-AA 2.0 186 194 192 TA1537 2-AA 2.0 208 204 192 WP2uvrA 2-AA 10.0 384 370 369 AF-2: 2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide, NaN 3 : sodium azide, 9-AA: 9-aminoacridine, B(a)P: benzo(a)pyrene, 2-AA: 2-aminoanthracene. *No. of colonies of treated plate/no. of colonies of negative control plate. www.e-jkmr.org 67

김선길 김주일 김지훈 윤찬석 정지원 나창수 김선종 Table Ⅵ. Result of Main Test (Group Summary) Tester strain Chemical Dose Colonies/plate (Mean±S.D.) [Factor]* treated (μg/plate) Without S9 mix With S9 mix Negative control 0 22±3 33±4 1,000 27±1 [1.2] 33±4 [1.0] 2,000 22±1 [1.0] 33±3 [1.0] TA98 4,000 24±2 [1.1] 36±2 [1.1] 6,000 34±8 [1.6] 36±3 [1.1] 8,000 39±9 [1.8] 33±4 [1.0] 10,000 46±3 [2.1] 32±3 [1.0] Negative control 0 112±6 136±6 1,000 121±3 [1.1] 134±3 [1.0] 2,000 151±21 [1.3] 135±5 [1.0] TA100 4,000 205±11 [1.8] 133±4 [1.0] 6,000 226±15 [2.0] 133±5 [1.0] 8,000 266±47 [2.4] 134±4 [1.0] 10,000 367±31 [3.3] 134±3 [1.0] Negative control 0 11±1 10±4 1,000 9±2 [0.9] 11±3 [1.1] 2,000 10±2 [0.9] 12±2 [1.1] TA1535 4,000 11±2 [1.0] 11±1 [1.1] 6,000 12±2 [1.2] 10±2 [1.0] 8,000 13±2 [1.2] 11±2 [1.1] 10,000 11±3 [1.0] 10±2 [0.9] Negative control 0 10±2 11±2 1,000 10±2 [1.0] 11±2 [0.9] 2,000 10±0 [1.0] 10±3 [0.9] TA1537 4,000 10±1 [1.0] 13±2 [1.1] 6,000 22±3 [2.2] 11±2 [0.9] 8,000 33±2 [3.3] 10±3 [0.9] 10,000 42±7 [4.2] 9±3 [0.8] Negative control 0 47±5 55±3 1,000 46±2 [1.0] 56±3 [1.0] 2,000 45±4 [1.0] 58±4 [1.1] WP2uvrA 4,000 45±5 [1.0] 54±4 [1.0] 6,000 47±1 [1.0] 56±3 [1.0] 8,000 46±3 [1.0] 54±3 [1.0] 10,000 47±4 [1.0] 55±4 [1.0] Positive controls TA98 AF-2 0.1 507±13 [23.0] TA100 AF-2 0.01 457±4 [4.1] TA1535 NaN 3 0.5 367±8 [34.4] TA1537 9-AA 40.0 270±12 [27.0] WP2uvrA AF-2 0.01 388±5 [8.3] 68 J Korean Med Rehabil 2021;31(1):59-79.

Table Ⅵ. Continued Tester strain Chemical Dose Colonies/plate (Mean±S.D.) [Factor]* treated (μg/plate) Without S9 mix With S9 mix TA98 B(a)P 2.5 275±6 [8.3] TA100 B(a)P 2.5 1,106±48 [8.2] TA1535 2-AA 2.0 183±5 [17.7] TA1537 2-AA 2.0 201±7 [17.7] WP2uvrA 2-AA 10.0 368±3.5 [6.7] S.D.: standard deviation, AF-2: 2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide, NaN 3 : sodium azide, 9-AA: 9-aminoacridine, B(a)P: benzo(a)pyrene, 2-AA: 2-aminoanthracene. *No. of colonies of treated plate/no. of colonies of negative control plate. Table Ⅶ. Result of Main Test (Individual Summary) Tester strain TA98 TA100 TA1535 TA1537 Chemical Dose Colonies/plate (Plate A, B and C)* treated (μg/plate) Without S9 mix With S9 mix Negative control 0 21 20 25 38 32 30 1,000 28 28 26 29 36 34 2,000 22 22 23 37 32 31 4,000 22 24 25 35 34 38 6,000 26 41 36 36 39 33 8,000 33 34 49 30 32 38 10,000 47 49 43 35 30 31 Negative control 0 118 107 111 135 142 130 1,000 125 120 119 131 137 134 2,000 158 167 127 135 139 130 4,000 204 216 194 129 136 134 6,000 216 243 219 128 138 133 8,000 220 314 265 130 135 138 10,000 402 354 345 131 137 135 Negative control 0 12 10 10 10 14 7 1,000 11 10 7 8 12 13 2,000 10 12 8 11 14 10 4,000 9 12 11 12 12 10 6,000 14 11 12 8 12 11 8,000 11 13 14 10 14 10 10,000 7 13 12 8 9 12 Negative control 0 8 10 12 11 10 13 1,000 12 11 8 12 12 8 2,000 10 10 10 7 12 10 4,000 10 10 9 13 11 14 6,000 19 21 25 9 12 11 8,000 33 35 32 13 10 8 10,000 49 36 40 12 7 9 www.e-jkmr.org 69

김선길 김주일 김지훈 윤찬석 정지원 나창수 김선종 Table Ⅶ. Continued Tester strain Chemical Dose Colonies/plate (Plate A, B and C)* treated (μg/plate) Without S9 mix With S9 mix Negative control 0 48 42 51 58 52 54 1,000 46 44 47 55 53 59 2,000 44 50 42 54 58 62 WP2uvrA 4,000 42 43 51 52 58 51 6,000 48 47 47 55 59 54 8,000 43 49 45 53 52 58 10,000 44 46 52 51 58 55 Positive controls TA98 AF-2 0.1 519 494 508 TA100 AF-2 0.01 457 460 453 TA1535 NaN 3 0.5 367 374 359 TA1537 9-AA 40.0 284 262 264 WP2uvrA AF-2 0.01 392 383 390 TA98 B(a)P 2.5 282 273 270 TA100 B(a)P 2.5 1,143 1,052 1,124 TA1535 2-AA 2.0 179 183 188 TA1537 2-AA 2.0 195 199 208 WP2uvrA 2-AA 10.0 368 371 364 AF-2: 2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide, NaN 3 : sodium azide, 9-AA: 9-aminoacridine, B(a)P: Benzo(a)pyrene, 2-AA: 2-aminoanthracene. *No. of colonies of treated plate/no. of colonies of negative control plate. Table Ⅷ. Results of Concentration Range Finding Test I Concentration Short-term treatment test Continuous treatment test (μg/ml) Without S9 mix (%) With S9 mix (%) 24 hours exposure 0 100.00 100.0 100.00 313 90.33 87.17 108.95 625 83.25 87.53 102.77 1,250 49.08 90.61 53.85 2,500 1.78 49.87 0 5,000 0 31.44 0 을가진체중변화는관찰되지않았다 (Tables XIV, XV). (2) 일반증상본시험의시험군중사망동물은관찰되지않았다 (Tables XVI, XVII). (3) 소핵출현빈도및총적혈구비율 4,000개이상의다염성적혈구를부검하여관찰한결과, 음성대조군의다염성적혈구중소핵을갖는적혈구의 출현빈도는 (0.12±0.02)% 이었으며, 500 mg/kg B.W./day 투여군의소핵출현빈도는 (0.08±0.02)%, 1,000 mg/kg B.W./day 투여군의빈도는 (0.09±0.01)%, 2,000 mg/kg B.W./day 투여군의빈도는 (0.10±0.03)%, 양성대조군의빈도는 (6.40±0.40)% 를나타내었다. 시험물질을투여한각군에서다염성적혈구중소핵을갖는적혈구의발생빈도는음성대조군대비증가하지않았으며, 통계적 70 J Korean Med Rehabil 2021;31(1):59-79.

Table Ⅸ. Results of Concentration Range Finding Test II Short-term treatment test Continuous treatment test Concentration (μg/ml) Without Concentration With Concentration 24 hours S9 mix (%) (μg/ml) S9 mix (%) (μg/ml) exposure 0 100.00 0 100.0 0 100.00 1,100 84.54 2,000 64.53 1,100 65.64 1,200 69.29 2,250 76.09 1,200 62.35 1,250 51.41 2,500 56.73 1,250 51.84 1,300 46.12 2,750 40.23 1,300 51.47 1,400 44.61 3,000 21.26 1,400 52.48 RICC 55 1,218.92 μg/ml RICC 55 2,522.53 μg/ml RICC 55 1,234.04 μg/ml RICC: relative increase in cell counts. Table Ⅹ. Result of Chromosomal Aberration Test (Short-Term Treatment Test, -S9 Mix) Treatment recovery period (h) S9 mix Concentration (μg/ml) Number of observed Number of structural aberrations (Frequencies %) ctb cte csb cse other Total (cells %) g Cell growth index (%) Number of numerical aberrations (Frequencies %) Number of Polyploids Endo observed Total (cells %) 6-18 - Negative 150 0 0 0 0 0 0 0 100.8 150 0 0 0 control (SDW) 150 0 0 0 0 0 0 0 99.2 150 0 0 0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 100.0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 6-18 - 300 150 0 0 0 0 0 0 0 100.6 150 0 0 0 150 0 0 0 0 0 0 0 90.7 150 0 0 0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 95.7 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 6-18 - 600 150 0 0 0 0 0 0 0 84.9 150 0 0 0 150 0 0 0 0 0 0 0 83.4 150 0 0 0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 84.2 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 6-18 - 1,200 150 0 0 0 0 0 0 0 53.5 150 0 0 0 150 0 0 0 0 0 0 0 51.9 150 0 0 0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 52.7 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 6-18 - 1,250 150 0 0 0 0 0 0 0 47.7 150 0 0 0 150 0 1 0 0 0 1 0 50.3 150 0 0 0 300 0 (0.0) 1 (0.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (0.3) 0 49.0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 6-18 - 1,300 150 0 0 0 0 0 0 0 37.0 150 0 0 0 150 0 0 0 0 0 0 0 43.4 150 0 0 0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 40.2 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 6-18 - Positive 150 5 26 1 2 0 34 0 150 0 0 0 control (MMC 0.1) 150 4 27 2 2 0 35 1 150 0 0 0 300 9 (3.0) 53 (17.7) 3 (1.0) 4 (1.3) 0 (0.0) 69 (23.0) 1 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) ctb: chromatid type break, cte: chromatid type exchange, csb: chromoso-type break, cse: chromosome type exchange, other: fragmentation etc., g: gap, Endo: endoreduplication, -: without metabolic activation, SDW: sterile distilled water, MMC: mitomycin C. 으로유의한차이또한없었다. 반면양성대조군의소핵출현빈도는음성대조군에비해현저한증가를보였으며, 통계학적으로유의한수준이었다 (p<0.05). 세포독성의지표인 [PCE/(PCE+NCE)] 비율은위와같은 순서로평균 (49.68±1.49)%, (51.31±0.71)%, (50.46±1.18)%, (50.92±1.01)% 및 (42.58±1.39)% 이었으며, 모든투여군에서음성대조군대비통계학적으로유의한차이가없었다. 한편양성대조군의 [PCE/(PCE+NCE)] 비율은음 www.e-jkmr.org 71

김선길 김주일 김지훈 윤찬석 정지원 나창수 김선종 Table Ⅺ. Result of Chromosomal Aberration Test (Short-Term Treatment Test, +S9 Mix) Treatment recovery period (h) S9 mix Concentration (μg/ml) Number of observed Number of structural aberrations (Frequencies %) ctb cte csb cse other Total (cells %) g Cell growth index (%) Number of numerical aberrations (Frequencies %) Number of Polyploids Endo observed Total (cells %) 6-18 + Negative 150 0 0 0 0 0 0 1 97.3 150 0 0 0 control 150 0 0 0 0 0 0 0 102.8 150 0 0 0 (SDW) 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 100.0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 6-18 + 600 150 0 0 0 0 0 0 0 88.6 150 0 0 0 150 0 0 0 0 0 0 0 113.0 150 0 0 0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 100.8 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 6-18 + 1,200 150 0 0 0 0 0 0 0 118.9 150 0 0 0 150 0 0 0 0 0 0 0 94.1 150 0 0 0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 106.5 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 6-18 + 2,400 150 0 0 0 0 0 0 0 77.2 150 0 0 0 150 0 0 0 0 0 0 0 76.4 150 0 0 0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 76.8 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 6-18 + 2,500 150 0 1 0 0 0 1 0 66.2 150 0 0 0 150 0 0 0 0 0 0 0 56.0 150 0 0 0 300 0 (0.0) 1 (0.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (0.3) 0 61.1 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 6-18 + 2,600 150 0 1 0 0 0 1 0 57.6 150 0 0 0 150 0 0 0 0 0 0 0 55.6 150 0 0 0 300 0 (0.0) 1 (0.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (0.3) 0 56.6 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 6-18 + Positive 150 2 27 1 3 0 33 0 150 0 0 0 control 150 3 25 4 0 0 32 0 150 0 0 0 (CPA 5) 300 5 (1.7) 52 (17.3) 5 (1.7) 3 (1.0) 0 (0.0) 65 (21.7) 0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) ctb: chromatid type break, cte: chromatid type exchange, csb: chromoso-type break, cse: chromosome type exchange, other: fragmentation etc., g: gap, Endo: endoreduplication, +: with metabolic activation, SDW: sterile distilled water, CPA: cyclophosphamide monohydrate. Table Ⅻ. Result of Chromosomal Aberration Test (Continuous Treatment Test, -S9 Mix) Treatment recovery period (h) S9 mix Concentration (μg/ml) Number of observed Number of structural aberrations (Frequencies %) ctb cte csb cse other Total (cells %) g Cell growth index (%) Number of numerical aberrations (Frequencies %) Number of Polyploids Endo observed Total (cells %) 24-0 - Negative 150 0 0 0 0 0 0 1 105.0 150 0 0 0 control 150 0 0 0 0 0 0 0 95.0 150 0 0 0 (SDW) 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 100.0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 24-0 - 300 150 0 0 0 0 0 0 0 88.3 150 0 0 0 150 0 1 0 0 0 1 0 90.5 150 0 0 0 300 0 (0.0) 1 (0.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (0.3) 0 89.4 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 24-0 - 600 150 0 0 0 0 0 0 0 83.5 150 0 0 0 150 0 0 0 0 0 0 0 96.1 150 0 0 0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 89.8 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 24-0 - 1,200 150 0 0 0 0 0 0 0 53.4 150 0 0 0 150 0 0 0 0 0 0 0 60.1 150 0 0 0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 56.7 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 24-0 - 1,250 150 0 0 0 0 0 0 0 50.1 150 0 0 0 150 1 0 0 0 0 1 0 56.7 150 0 0 0 300 1 (0.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (0.3) 0 53.4 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 24-0 - 1,300 150 0 0 0 0 0 0 0 43.4 150 0 0 0 150 0 0 0 0 0 0 0 53.4 150 0 0 0 300 0 (0.0) 1 (0.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (0.3) 0 48.4 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 24-0 - Positive 150 3 29 1 1 0 34 0 150 0 0 0 control 150 2 27 2 1 0 32 0 150 0 0 0 (MMC 0.05) 300 5 (1.7) 56 (18.7) 3 (1.0) 2 (0.7) 0 (0.0) 66 (22.0) 0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) ctb: chromatid type break, cte: chromatid type exchange, csb: chromoso-type break, cse: chromosome type exchange, other: fragmentation etc., g: gap, Endo: endoreduplication, -: without metabolic activation, SDW: sterile distilled water, MMC: mitomycin C. 72 J Korean Med Rehabil 2021;31(1):59-79.

Table XIII. Clinical Signs and Mortalities (Group Summary) Sex Chemical treated Dose (mg/kg B.W./day) Mortality (dead/tatal) Male Negative control (SDW) 0 0 % (0/3) * Test substance 500 0 % (0/3) Test substance 1,000 0 % (0/3) Test substance 1,500 0 % (0/3) Positive control (CPA) 2,000 0 % (0/3) Female Negative control (SDW) 0 0 % (0/3) * Test substance 500 0 % (0/3) Test substance 1,000 0 % (0/3) Test substance 1,500 0 % (0/3) Positive control (CPA) 2,000 0 % (0/3) SDW: sterile distilled water, CPA: cyclophosphamide monohydrate. *No. of dead animals/no. of tested animals Table XIV. Body Weight of Animals (Group Summary) Sex Male Dose Body weights (mean±s.d.; g) at the time of adiministration (No. of animal) Chemical treated (mg/kg Sacrifice B.W./day) 1st 2nd (No. of animal) Negative control (SDW) 0 34.92±0.57 (5) 34.93±0.74 (5) 34.84±0.76 (5) Test substance 500 35.09±1.23 (5) 34.24±1.35 (5) 34.09±1.20 (5) Test substance 1,000 34.81±0.83 (5) 34.61±0.85 (5) 34.21±0.52 (5) Test substance 2,000 35.19±0.93 (5) 34.98±1.08 (5) 34.46±1.25 (5) Positive control (CPA) 70 35.25±0.55 (5) 35.22±0.76 (5) 34.94±0.48 (5) S.D.: standard deviation, SDW: sterile distilled water, CPA: cyclophosphamide monohydrate. 성대조군에비해통계학적으로유의한차이가나타났다 (p<0.05)(tables XVIII, XIX). 고찰및결론»»» 최근국제적으로의약품개발시임상및비임상시험에대한새로운방법및데이터들이제시되고있으며, 보다혁신적인신약개발을가속화하기위하여의약품국제조화회의 (International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use, ICH) 에서는 2009년비임상시험에대한가이드라인을개정발표하였다 20). 이에따라의약품개발은동물과사람에서유효성과안전성정보를평가하는단계적과정이라는일반원칙이적용되므로 21), 의약품의안전성을확인하기위하여일반독성시험, 면역독성시험, 생식발생독성시험, 유전독성시험등다양한독성평가가진행되어야한다 22). 이중유전독성이란세포또는개체수준에서돌연변이 (mutation) 를유발하는성질을가리키는개념에서현재는세포유전물질 (DNA) 에상해성을나타내는성질 (genotoxicity) 을포함하는광범위한의미로이용되고있으며 3), 의약품등의유전독성시험은 ICH, 경제협력개발기구 (Organisation for Economic Cooperation and Development, OECD) 및식품의약품안전청고시제 2017년- 제71호의가이드라인에따라크게 3가지로구별되어수행되고있다 1,2). 첫번째, 유전자돌연변이 (gene mutation) 를지표로하는것과 23) 두번째, 염색체이상 (chromosomal aberration) 을지표로하는것 24) 그리고세번째, DNA에대한상해성또는수복성 (DNA damage www.e-jkmr.org 73

김선길 김주일 김지훈 윤찬석 정지원 나창수 김선종 Table XV. Body Weight of Animals (Individual Data, Male) Chemical treated Body weights (g) at the time of Adiministration (No. of animal) Dose Animal (mg/kg B.W./day) No. Sacrifice 1st 2nd (No. of animal) Negative control (SDW) 0 1101 35.20 35.12 34.01 1102 34.30 33.70 34.05 1103 34.64 34.87 35.28 1104 34.70 35.38 35.17 1105 35.75 35.57 35.67 Test substance 500 1201 35.74 35.13 34.37 1202 33.39 33.09 32.62 1203 35.30 34.62 34.63 1204 36.59 35.77 35.64 1205 34.44 32.59 33.20 Test substance 1,000 1301 35.49 35.63 34.37 1302 33.84 34.36 34.69 1303 34.94 34.68 34.31 1304 35.70 35.04 34.38 1305 34.06 33.34 33.32 Test substance 2,000 1401 34.89 35.60 34.29 1402 36.23 36.60 36.62 1403 35.41 34.12 33.71 1404 33.78 34.37 34.16 1405 35.66 34.22 33.51 Positive control (CPA) 70 1501 34.34 33.94 34.51 1502 35.52 35.18 34.61 1503 35.13 35.50 34.76 1504 35.71 35.91 35.69 1505 35.55 35.57 35.13 SDW: sterile distilled water, CPA: cyclophosphamide monohydrate. Table XVI. Clinical Signs and Mortalities (Group Summary) Sex Chemical treated Dose (mg/kg B.W./day) Clinical signs Mortality (dead / tatal) Male Negative control (SDW) 0 N 0% (0/5) * Test substance 500 N 0% (0/5) Test substance 1,000 N 0% (0/5) Test substance 2,000 N 0% (0/5) Positive control (CPA) 70 N 0% (0/5) SDW: sterile distilled water, N: normal, CPA: cyclophosphamide monohydrate. *No. of dead animals/no. of tested animals. 또는 repair) 을지표로하는것이그것이다 1,21,25). 박테리아를이용한복귀돌연변이실험 (Ames test, bacterial reverse mutation test) 은 Salmonella Typhimurium LT2 strain에서유래된히스티딘요구성돌연변이주를 74 J Korean Med Rehabil 2021;31(1):59-79.

Table XVII. Clinical Signs and Mortalities (Individual Data, Male) Chemical treated Negative control (SDW) Dose (mg/kg B.W./day) Animal No. Clinical signs 0 1101 Normal 1102 Normal 1103 Normal 1104 Normal 1105 Normal Test substance 500 1201 Normal 1202 Normal 1203 Normal 1204 Normal 1205 Normal Test substance 1,000 1301 Normal 1302 Normal 1303 Normal 1304 Normal 1305 Normal Test substance 2,000 1401 Normal 1402 Normal 1403 Normal 1404 Normal 1405 Normal Positive control (CPA) 70 1501 Normal 1502 Normal 1503 Normal 1504 Normal 1505 Normal SDW: sterile distilled water, CPA: cyclophosphamide monohydrate. 활용하여복귀돌연변이를검출하는시험법이다 23). 포유류배양세포를이용한염색체이상시험 (in vitro chromosomal aberration assay) 은포유동물세포를배양한 Chinese hamster lung (CHL) 세포를활용하여대사활성계적용상태및비적용상태에서염색체형과염색체분형의교환 (exchange) 및절단 (deletion) 이확인되는염색체이상의계수를통한염색체수나구조의변화를보이는중기상의출현빈도를조사하여염색체이상유발성여부를판정하는연구이다 24). 또한마우스를이용한소핵시험 (in vivo micronucleusassay) 은동물의말초혈액또는골수세포를사용하여최종적인유전독성을판정하는실험으로소핵을가진다염성적혈구의증가여부를통해시험물질에의한염색체이상유무를평가하는방법이다 25). 박테리아를이용한 ChondroT의복귀돌연변이시험은히스티딘요구성인 Salmonella typhimurium TA100, TA1537, TA98, TA1535와트립토판요구성 Escherichia coli WP2uvrA (pkm101) 균주를사용하였다. 농도결정시험의결과, 대사활성계미적용 (-S9 mix) 의 TA98 및 TA1537 균주에서 2배이상의콜로니의증가양상이확인되었고, TA100 균주에서 1.8배의콜로니증가양상이확인되었다. 생육저해는대사활성계미적용 (-S9 mix) 및대사활성계적용 (+S9 mix) 모두에서확인되지않았으며, 시험물질의석출도대사활성계미적용 (-S9 mix) 및대사활성계적용 (+S9 mix) 모두에서확인되지않았다. 본시험에서는대사활성계미적용 (-S9 mix) 의 TA100 및 TA1537 균주에서콜로니수의농도상관성 ( 농도의존적증가양상 ) 및재현성을더정확하게판단하기위하여최고농도를 10,000 μg/plate, 공차 2,000 μg/plate 및공 Table XVIII. Micronucleus Test in ICR Mice (Group Summary) Sex Male Chemical treated Dose (mg/kg B.W./day) No. of animal MNPCE/4000PCEs (Mean±S.D., %) PCE/(PCE+NCE) (Mean±S.D., %) Negative control (SDW) 0 5 0.12±0.02 49.68±1.49 Test substance 500 5 0.08±0.02 51.31±0.71 Test substance 1,000 5 0.09±0.01 50.46±1.18 Test substance 2,000 5 0.10±0.03 50.92±1.01 Positive control (CPA) 70 5 6.40±0.40 * 42.58±1.39 * MNPCE: PCE with one or more micronuclei, PCE: polychromatic erythrocyte, S.D.: standard deviation, NCE: normochromatic erythrocyte, SDW: sterile distilled water, CPA: cyclophosphamide monohydrate. *Significant difference as compared with control (p<0.05). www.e-jkmr.org 75

김선길 김주일 김지훈 윤찬석 정지원 나창수 김선종 Table XIX. Micronucleus Test in ICR Mice (Individual Data, Male) Chemical treated Dose (mg/kg B.W./day) Animal No. PCE's MNPCE Frequency of MNPCE (%) No. of PCE / NCE PCE/ (PCE+NCE) Negative control 0 1101 4,000 5 0.13 279 / 283 49.64 (SDW) 1102 4,000 4 0.10 289 / 264 52.26 1103 4,000 6 0.15 277 / 289 48.94 1104 4,000 5 0.13 284 / 296 48.97 1105 4,000 4 0.10 273 / 289 48.58 Test substance 500 1201 4,000 3 0.08 288 / 285 50.26 1202 4,000 2 0.05 275 / 253 52.08 1203 4,000 3 0.08 284 / 267 51.54 1204 4,000 4 0.10 285 / 274 50.98 1205 4,000 4 0.10 277 / 259 51.68 Test substance 1,000 1301 4,000 3 0.08 279 / 267 51.10 1302 4,000 3 0.08 288 / 295 49.40 1303 4,000 4 0.10 279 / 261 51.67 1304 4,000 4 0.10 268 / 279 48.99 1305 4,000 4 0.10 274 / 262 51.12 Test substance 2,000 1401 4,000 5 0.13 287 / 278 50.80 1402 4,000 5 0.13 281 / 264 51.56 1403 4,000 3 0.08 275 / 281 49.46 1404 4,000 3 0.08 295 / 287 50.69 1405 4,000 3 0.08 295 / 271 52.12 Positive control 70 1501 4,000 251 6.28 249 / 316 44.07 (CPA) 1502 4,000 279 6.98 213 / 308 40.88 1503 4,000 249 6.23 231 / 309 42.78 1504 4,000 237 5.93 225 / 318 41.44 1505 4,000 263 6.58 251 / 323 43.73 PCE: polychromatic erythrocyte, MNPCE: PCE with one or more micronuclei, NCE: normochromatic erythrocyte, SDW: sterile distilled water, CPA: cyclophosphamide monohydrate. 비 2를적용하여농도 1,000, 2,000, 4,000, 6,000, 8,000, 10,000(μg/plate) 로실험을진행하였으며, 그결과대사활성계미적용 (-S9 mix) 의 TA100 및 TA1537 균주에서콜로니의증가양상이확인되었다. 생육저해는대사활성계미적용 (-S9 mix) 및대사활성계적용 (+S9 mix) 모두에서확인되지않았으며, 시험물질의석출도대사활성계미적용 (-S9 mix) 및대사활성계적용 (+S9 mix) 모두에서확인되지않았다. 시험에서생육저해는 4 농도이상에서관찰되지않았으며, 5 농도이상에서평가가가능했다. 복귀돌연변이시험에사용된 TA1535와 TA100은염기쌍치환돌연변이물질인 hisg46을포함하고있어 point mutation을평가에사용되는지표로서 26) TA1535 에서복귀돌연변이의절대증가는 TA100에서절대증가를초래하는유사성을가지고있다 27,28). 이두물질의차이점은 TA100은 pkm101를포함하고있어복귀돌연변이에더민감하게작용하는것이며, TA1535는 TA100 과달리특정 3가지화학물질 (acetaldehyde oxime, 6-mercaptopurine, and 1,3-butadiene) 에더민감하게반응한다는것이다 29,30). 또한시험에사용된 TA98균주는 frameshift mutation을평가하는지표로알데히드기를가진유기체가디클로로메틸유기체 (dichloromethyl group) 로교체될때민감하게반응하는특징이있다 31). ChondroT 의경우대사활성계미적용상태에서 TA100과 TA1535 76 J Korean Med Rehabil 2021;31(1):59-79.

균주를이용한복귀돌연변이실험의결과가반대로나왔으며, 발생된복귀돌연변이콜로니수또한음성대조군에비해약 2배수준에불과하였다. 또한대사활성계적용상태의모든균주가복귀돌연변이발생에음성반응을보였으므로추가시험을통해복귀돌연변이변이원성보유여부를판단해야할것으로생각한다. 포유류배양세포를이용한 ChondroT의염색체이상시험은 CHL에서유래된배양세포를통해진행되었다. 농도결정시험에서시험물질의세포독성은농도의존적으로증가하였다. 세포독성지표인상대세포수증가 (RICC) (55±5)% 는 -S9 mix에서는 1,218.92 μg/ml, +S9 mix에서는 2,522.53 μg/ml, 24시간처리에서는 1,234.04 μg/ml이었다. 단시간처리법을통한염색체이상시험에서 -S9 mix 처리군의 0, 300, 600, 1,200, 1,250 및 1,300 μg/ml 농도에서염색체구조이상세포의출현빈도는각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.3 및 0.0% 로관찰되었으며, 수적이상세포의출현빈도는각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.0 및 0.0% 로관찰되었다. 또한 +S9 mix의 0, 600, 1,200, 2,400, 2,500 및 2,600 μg/ml에있어서의염색체구조이상세포의출현빈도는 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.3 및 0.3% 로관찰되었으며, 수적이상세포의출현빈도는각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.0 및 0.0% 로관찰되었다. 24시간처리를통한염색체이상시험에서 -S9 mix 처리군의 0, 300, 600, 1,200, 1,250 및 1,300 μg/ml 농도에서염색체구조이상세포의출현빈도는각각 0.0, 0.3, 0.0, 0.0, 0.3 및 0.0% 로관찰되었고염색체수적이상세포의출현빈도는각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.0 및 0.0% 로관찰되었다. 음성대조군의경우구조이상세포및수적이상세포의출현빈도는 5% 미만으로확인되었고, 양성대조군의경우구조이상세포의출현빈도는 10% 이상으로확인되었다. -S9 mix 처리군과 +S9 mix 처리군모두염색체구조이상세포및수적이상세포의출현빈도가단시간처리법, 연속처리법에서 5% 미만이었으므로본시험조건하에서 ChondroT는 CHL/IU세포에대하여염색체이상을유발하지않는것이확인되었다. 포유류골수세포에대한 ChondroT의소핵유발성시험은 ICR 마우스를통해진행하였다. 본시험결과모든투여군에서음성대조군에비해통계적으로유의한체중차이가관찰되지않았고, 사망동물또한관찰되지않았다. 개체당 4,000개이상의다염성적혈구를부 검하여관찰한결과, 음성대조군의다염성적혈구중소핵을갖는적혈구의출현빈도는 (0.12±0.02)% 이었 으며, 500 mg/kg B.W./day 투여군의소핵출현빈도는 (0.08±0.02)%, 1,000 mg/kg B.W./day 투여군의빈도는 (0.09±0.01)%, 2,000 mg/kg B.W./day 투여군의빈도는 (0.10±0.03)%, 양성대조군의빈도는 (6.40±0.40)% 를나타내었다. 시험물질을투여한각군에서다염성적혈구중소핵을갖는적혈구의출현빈도는음성대조군과비교하여증가되는경향이없었으며, 통계적으로유의한차이또한없었다. 세포독성의지표인 [PCE/(PCE+NCE)] 비율은음성대조군, 500, 1,000, 2,000 mg/kg B.W./day, 양성대조군의순서로평균 (49.68±1.49)%, (51.31±0.71)%, (50.46±1.18)%, (50.92±1.01)% 및 (42.58±1.39)% 이었으며모든투여군에서음성대조군대비통계학적으로유의한차이가없었으므로, 본시험조건하에서 ChondroT 는수컷 ICR 마우스골수세포에대해소핵을유발하지않는것이확인되었다. 이상의결과에서 ChondroT는 In vitro 복귀돌연변이시험중대사활성계미적용 (-S9 mix) 의 TA98 및 TA1537 균주에서콜로니의증가양상이확인되었으나, 대사활성계적용 (+S9 mix) 의환경에서콜로니증가가없었고, 포유류배양세포에서염색체이상을유발하지않았으며, 포유류골수세포에대해소핵유발이없었다. 이는시험물질또는그대사활성물질이골수에까지도달하지않았을가능성이높고 21,23,32), ChondroT 구성약재의히스티딘전구물질함유로인한히스티딘유래의 TA98, TA1537 균주콜로니증가양상이의심되므로향후 ChondroT의복귀돌연변이양성소견에대해서는독성시험기준해설서가이드라인에따라코멧시험, 다중독성평가등의 23,32) 추가연구가필요할것으로생각한다. References»»» 1. Ministry of Food and Drug Safety. Ministry of Food and Drug Safety Notice No. 2017-71, Partially Amended and Enforced on Aug 30. [Internet] 2017 [cited 2019 Jan 24]. Available from: URL:https://mfds.go.kr/eng/brd /m_18/view.do?seq=71459&srchfr=&srchto=&srchwo rd=&srchtp=&itm_seq_1=0&itm_seq_2=0&multi_itm _seq=0&company_cd=&company_nm=&page=1. www.e-jkmr.org 77

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