J Koren So Foo Si Nutr 한국식품영양과학회지 44(9), 56~63(5) http://x.oi.org/.3746/jkfn.5.44.9.56 유자에탄올추출물의면역력증진효과 양지원 전혜린 유양희 3 김진영 5 최효경 4 최경철 전우진 3 윤호근 연세대학교의과대학, 울산대학교의과대학 3 전남대학교식품영양학과, 4 한국식품연구원, 5 ( 주 ) 산들촌 Citrus Ethnol Extrts Promotes Innte Immune Response y Ativting NF-κB Jiwon Yng, Hyelin Jeon, Yng Hee You 3, Jin Young Kim 5, Hyo-Kyoung Choi 4, Kyung-Chul Choi, Woo Jin Jun 3, n Ho-Geun Yoon Yonsei University College of Meiine University of Ulsn College of Meiine 3 Deprtment of Foo n Nutrition, Chonnm Ntionl University 4 Division of Nutrition n Metolism Reserh Group, Kore Foo Reserh Institute 5 SDCFOOD Co., Lt. ABSTRACT Citrus junos Sie. ex Tnk hs een tritionlly lle Yuz in Kore n is use s uisine mteril or te s well s meiinl her. In this stuy, we evlute the immune-enhning effet of Citrus junos ethnol extrt (CJE) on RAW64.7 mouse mrophge n primry immunoytes. CJE tretment showe inrese mrophge tivity in ose-epennt mnner. CJE lso enhne nturl killer (NK) ell tivity. We mesure ltte ehyrogense (LDH) level s mesurement of NK ell ytotoxiity ginst YAC- lymphom ells. CJE tretment showe n inrese LDH level in ose-epenent mnner. Finlly, we evlute the effet of CJE on mouse primry splenoyte prolifertion. CJE tretment slightly inrese splenoyte prolifertion ompre to the ontrol. The results of this stuy suggest tht CJE n help immune funtion vi mrophge ytokine proution, inrese NK ell tivity, n splenoyte prolifertion. Key wors: Citrus junos Sie. ex Tnk, immuno-stimulting tivity, ytokine, NK ell, RAW64.7 ell 서 년이후전세계적으로급성호흡기증후군 (SARS), 조류독감, 에볼라바이러스등과같은급성신종전염병들이등장하면서이러한전염병에대한인체의방어능력인면역력의중요성이더욱대두되고있다. 인체의체내항상성이깨지거나병원균의침입과같이위협이되는것들에대한생체방어력인면역력은대식세포나 nturl killer(nk) 세포등이관련된비특이적면역과 T 세포나 B 세포가관여하는특이적면역으로분류할수있다 (). 병원균이인체에침입했을때호중구 (neutrophile), 단핵구 (monoyte), 대식세포 (mrophge) 와같은탐식세포 (phgoytes) 들은가장먼저인체를병원균들로부터방어하는선천면역반응의주요세포군이다 (). 특히대식세포는상피세포장벽이후의 Reeive 3 April 5; Aepte 3 August 5 Corresponing uthor: Ho-Geun Yoon, Deprtment of Biohemistry n Moleulr Biology, Yonsei University College of Meiine, Seoul 37, Kore E-mil: yhgeun@yuhs., Phone: +8--8-683 론 생체방어에있어최초대응세포로항원제시세포 (ntigen presenting ell) 로서의기능도수행하며, 적응면역과관련하여 T 세포작용에도영향을준다 (3). 또한병원균에감염된세포나암세포등도제거하고, 면역반응에기여하는산화질소 (nitri oxie, NO) 와 tumor nerosis ftor-α(tnfα) 와같은사이토카인 (ytokine) 등을분비하기도한다 (4). 인체의적응면역이작동하기전에병원균으로부터신속하게대응할수있는선천성면역기능을담당하는대식세포의활성인자를찾기위한천연물질들의연구가활발히진행되고있다. 최근에는 RAW64.7 대식세포주에서발효울금의면역조절효과를보고한결과가있었고 (4), 생약추출물을이용하여대식세포의면역증강효과를연구한결과 (5) 와사과씨에탄올추출물이대식세포면역조절활성에미치는영향에대한보고가있었다 (6). 유자 (Citrus junos Sie. ex Tnk, Yuzu) 는중국, 일본, 한국등지에서자생하는유자나무의신맛이강한과실로, 향미가좋아음식의소스나유자청으로만들어져음용차로도이용되어왔다 (7). 풍부한비타민 C와무기질및구연산을함유한유자에는이들영양소외에도플라보노이드성
유자에탄올추출물의면역력증진효과 57 분이심혈관계질환의발생률을감소시키고, 과육과과피에함유된강한항산화활성성분은활성산소인자유라디칼 (free ril) 을소거시켜질병에대한예방의학적인활성도가지고있다 (8). 따라서본연구에서는유자가인체의선천성면역증강에도움을줄가능성이있는지를알아보고자유자를 3% 주정으로추출하였고, in vitro 상에서면역증강의기전을알아보기위한목적으로 in vitro 면역실험에서주로이용되는마우스의대식세포유래세포주인 RAW64.7을이용하여유자주정추출물이주는면역활성영향을평가하였다. 선천성면역에미치는유자추출물의영향을알아보기위한연구이므로면역세포들이위치하는보조면역장기기관중하나인비장 (spleen) 의세포증식에유자 3% 주정추출물이미치는영향을측정하였고외부의자극이존재할때변화하는전사인자인 NF-κB의활성을확인하였으며, 이로인해발현에영향을받을수있는염증성사이토카인과염증반응의주요요소인 ylooxygense(cox)-와 prostglnin E (PGE)의발현을확인하였다. 또한병원균에감염된세포를직접적으로공격하여인체의방어작용을담당하는 NK 세포활성에미치는유자주정추출물의영향과면역증강의가능성을확인하고자하였다. 재료및방법실험재료유자 3% 주정추출물 (Citrus junos Sie. ex Tnk ethnol extrt; CJE) 제조에사용된유자는경일약업사 (Yeongheon, Kore) 에서구입하였고, 3% 의에탄올을포함하는정제수혼합용액으로추출한후추출액을 Whtmn No.4 filter pper(whtmn pl, Kent, UK) 로여과하였다. 이를감압농축기를사용하여추출용매를제거한후동결건조하여분말형태의추출물을다시멸균한 3차증류수에녹여서실험에사용하였다. 세포배양 RAW64.7 세포는마우스유래의대식세포이고, YAC- 세포는마우스림프종유래세포로두세포주모두경희대학교의학영양학과 (Suwon, Kore) 에서분양받아사용하였다. 세포배양을위한배지의조성을 RAW64.7 세포는 DMEM(HyClone Lortories, Logn, UT, USA) 에, YAC- 세포는 RPMI-64(HyClone Lortories) 에각각 % fetl ovine serum(fbs, HyClone Lortories) 과 U/mL peniillin, μg/ml streptomyin(hyclone Lortories) 을첨가하였고 37 C, 5% CO 조건에서배양하였다. 세포생존율 CJE의 RAW64.7 세포에대한최적처리농도를결정하 기위하여 WST(Wter Solule Tetrzolium Slt) 시약인 EZ-CYTOX Cell Viility ssy kit(daeil LAB SERVICE Co., Lt., Seoul, Kore) 을이용하여살아있는세포의양을측정하였다. RAW64.7 세포는 4 ells/well이되도록 96 well ell ulture plte(spl Life Siene, Poheon, Kore) 에분주하여안정화시킨후유자추출물을 5, 5,,, 4, 6, 8,, μg/ml의농도가되도록 DMEM 배지에희석하여 48시간동안배양하였다. WST 시약을 μl씩각 well에넣고 37 C, 5% CO 조건에서 3시간동안반응시킨후 miroplte reer(spetr- MAX34PC384, Moleulr Devies, Sunnyvle, CA, USA) 에서 45 nm로흡광도를측정하였다. CJE의 NF-κB, COX-, PGE 발현능평가염증반응의주요요소인 NF-κB, COX-, PGE의발현능을확인하기위하여다음과같은방법으로실험을진행하였다. RAW64.7 세포를 6 mm ulture ish에 5 6 ells/well의농도로분주하여안정화시킨다음여기에 CJE 는농도별로, LPS는 μg/ml를 4시간동안처리하였다. NF-κB의활성을확인하기위해서는세포핵내로전좌된 NF-κB의측정이필요하므로핵단백추출물을얻은다음이용균액을이용하여실험을진행하였고, 측정은 Trns- AM NF-κB Chemiluminesene kit(ative Motif, Crls, CA, USA) 을이용하였다. COX-의발현은 reltime PCR 기법을통해검증하였는데, RAW64.7 세포의 NF-κB 활성을확인하기위한상기실험과같은조건으로처리한뒤 RNesy extrtion kit(qigen) 으로제조사의실험방법에따라 RNA를분리하였다. 분리된 RNA로 PrimeSript TM Reverse Trnsriptse(Tkr Bio In., Shig, Jpn) 를사용하여 DNA를합성하였고, 유전자들의발현을측정하기위하여 FstStrt Universl SYBR Green Mster(ROX)(Rohe Dignostis, Mnnheim, Germny) 를사용한 rel-time PCR을 PIKOREAL 96 (Thermo Sientifi, Tewksury, MA, USA) 기기를이용하여실시하였다. 분석에사용한각각의 primer의염기서열은 GAPDH forwr 5'-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA-3', reverse 5'-GCG GCA CGT CAG ATC CA-3', COX- forwr 5'-CCA GCA CTT CAC CCA TCA GTT-3', reverse 5'-ACC CAG GTC CTC GCT TAT GA-3' 이었다. 또한 PGE는상등액을이용하여측정하는실험으로, prostglnin E prmeter ssy kit(r&d Systems, In., Minnepolis, MN, USA) 을구입하여제조사의실험방법에따라측정하였다. CJE의산화질소유도능평가 RAW64.7 세포를 4 ells/well이되도록 96 well ell ulture plte(spl Life Siene) 에분주하여안정시킨후 DMEM 배지에희석한 CJE를농도별 (5, 5,,
58 양지원 전혜린 유양희 김진영 최효경 최경철 전우진 윤호근 3, 5 μg/ml) 로처리하였고, 양성대조군으로 μg/ml의 lipopolyshrie(lps, Sigm-Alrih Co., St. Louis, MO, USA) 를처리하여 4시간배양하였다. 새로운 96 well plte에세포배양상등액 5 μl와동량의그리스시약 (Griess regent, Sigm-Alrih Co.) 을넣어상온에서 5 분간반응시킨후 miroplte reer(moleulr Devies) 에서흡광도 54 nm로측정하였다. 산화질소의농도는질산화나트륨 (soium nitrite, NNO, Sigm-Alrih Co.) 을이용하여얻은표준곡선으로계산하였다. Rel-time PCR에의한 CJE의사이토카인발현능평가 RAW64.7 세포를 6 mm ell ulture ish에 5 6 ells/well의농도로분주하여안정화시킨후 CJE 5, 5,, 3, 5 μg/ml와양성대조군으로설정한 LPS μg/ ml를 4시간동안처리한다음 RNesy extrtion kit (Qigen, Githersurg, Mryln, USA) 으로제조사의실험방법에따라 RNA를분리하였다. 분리된 RNA로 Prime- Sript TM Reverse Trnsriptse(Tkr Bio In.) 를사용하여 DNA를합성하였다. 유전자들의발현을측정하기위하여 FstStrt Universl SYBR Green Mster(ROX) (Rohe Dignostis) 를이용하여 rel-time PCR을 PIKOREAL 96(Thermo Sientifi) 기기를이용하여실시하였다. 분석에사용한각각의 primer 의염기서열은 GAPDH forwr 5'-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA-3', reverse 5'-GCG GCA CGT CAG ATC CA-3', TNF-α forwr 5'-CAT CTT CTC AAA ATT CGA GTG ACA A-3', reverse 5'-TGG GAG TAG ACA AGG TAC AAC CC-3', IL-β forwr 5'-GGA GAA CCA AGC AAC GAC AAA ATA-3', reverse 5'-TGG GGA ACT CTG CAG ACT CAA AC-3', IL- forwr 5'-GGT TGC CAA GCC TTA TCG GA-3', reverse 5'-ACC TGC TCC ACT GCC TTG CT-3', IL-6 fowr 5'-GTT TTC TGC AAG TGC ATC ATC G-3', reverse 5'-GGT TTC TGC AAG TGC ATC ATC G-3' 와같다. 마우스비장세포분리및 NK 세포활성측정 6~7주령 mle ICR 마우스는오리엔트바이오 (Seongnm, Kore) 에서구입하였고, 서울아산병원아산생명과학연구원실험동물실험실 (IACUC 승인번호 : 4--77) 의연구지침에따라이산화탄소를이용한안락사방법을통해희생시켜비장을적출하였다. 비장은 4 μm size ell striner(spl Life Siene) 에서마쇄하여 RPMI-64 (HyClone Lortories) 에 % fetl ovine serum(fbs, HyClone Lortories) 과 U/mL peniillin, μg/ ml streptomyin(hyclone Lortories) 을첨가한배지로세척한후, re loo ell lysing uffer(sigm-alrih Co.) 로적혈구를제거하였다. YAC- 세포 (NK-sensitive ell line) 는 NK 세포에의해공격되는세포로 YAC- 세포 가 NK 세포에의해공격을받아배지에유리된 ltte ehyrogense(ldh) 를측정하여 NK 세포의활성을측정하였다. NK 세포와 YAC- 세포를 96 well plte에여러농도별 CJE와함께분주하여 37 C, 5% CO 조건에서 4시간동안배양한후유리된 LDH를 LDH-Cytotoxiity Colorimetri ssy kit Ⅱ(Biovision, Milpits, CA, USA) 로 kit 의 protool을따라측정하였다. 비장세포증식능측정비장세포의증식능에미치는유자추출물의영향을측정하기위하여마우스에서분리한비장세포를 96 well plte 에 5 ells/well이되도록분주하고 CJE를농도별로처리하였다. 양성대조군으로 Connvlin A(Sigm-Alrih Co.) μg/ml를처리하여 48시간배양하고여기에 EZ- CYTOX Cell Viility ssy kit(daeil LAB SERVICE Co., Lt.) 을처리하고 37 C, 5% CO 조건에서 3시간동안반응시켜 miroplte reer(moleulr Devies) 로 45 nm에서흡광도를측정하였다. 통계처리모든실험은 3번이상반복하여평균값과오차를구하여나타내었고, 통계처리는 SPSS(Sttistil Pkge for Soil Siene, version., SPSS In., Chigo, IL, USA) 통계프로그램을이용하여 one wy ANOVA test로분석하였으며, 실험군간의유의성은 Dunn's multiple rnge test로 P<.5 수준에서비교하였다. 결과세포독성세포실험에사용할유자추출물의최적농도를결정하기위해실시한세포독성시험에서유자 3% 주정추출물 (CJE) 은최저농도 5 μg/ml에서부터최고농도, μg/ml까지 RAW64.7 세포에처리한결과최고농도에서도 48시간까지독성을나타내지않았다. 세포독성시험결과는 Fig. 에제시하였으며, 독성실험결과에서확인된안전농도범위안에서이후의실험을진행하였다. CJE의 NF-κB, COX-, PGE 발현능평가외부자극인자인 LPS를대식세포에처리하면세포막에존재하는수용체 (Toll-like reeptor, TLR4) 와결합하게되고, 이에의해세포질에있는전사인자인 NF-κB가활성을띄게된다. 이를통해염증성사이토카인의발현이증가하고, 염증성인자인 COX- 또한활성을가지게되어 rhioni i로부터 PGE를발생시킨다 (9). NF-κB의활성화로인하여사이토카인들과 COX-, PGE가과하게발현하면인체에악영향을미칠수있지만적정수준내에서발현의촉진이이루어질경우면역반응을촉진하게된다
유자에탄올추출물의면역력증진효과 59 Cell viility (% of ontrol). 4 8 6 4 n.s. 5 5 4 6 8 CJE onentrtion (µg/ml) Fig.. Effet of Citrus junos ethnoli extrts (CJE) on the ell viility of RAW64.7 mrophge. The results re men±sd of triplite experiment. n.s.: no signifine. (). 따라서선천성면역반응의촉진, 증강의가능성및그기전을확인하기위해 NF-κB의활성도, COX-의발현, PGE의생성량을측정하였고그결과를 Fig. 에나타내었다. Fig. A는 NF-κB 활성도를그래프로나타낸것으로, 정상대조군대비 LPS만을처리한양성대조군에서활성도가 4배이상증가하였다. CJE 처리한실험군에서도농도의존적인경향을보이며활성도가증가하는것을알수있었는데, 특히 3~5 μg/ml의농도에서유의미한차이를보였다. Fig. B는 mrna 수준에서 COX- 유전자발현의결과를나타낸그래프로, 정상대조군에비해양성대조군에서의발현이약 3.3배높았다. CJE만을농도별로처리하였을때 NF-κB 활성결과와마찬가지로 3~5 μg/ml의농도에서유의적인차이를보이며 COX-의발현이증가하 는경향을보였다. Fig. C는 PGE의분비를측정한결과로, 앞선두결과와마찬가지로정상대조군대비양성대조군에서유의적으로 ( 약 6배이상 ) 증가하였고 3~5 μg/ ml의농도에서유의미한차이를보이며분비량이증가하는것을확인할수있었다. CJE의 NF-κB 활성, COX-의발현, PGE의분비증강은양성대조군인 LPS 처리군에비해모두유의적으로낮은수치를기록했다 (P<.5). 이러한결과들을통해 CJE가 NF-κB의활성을높이고이를통해 COX-의발현이증가되도록하여 PGE의분비에도영향을미친다는것을알수있었다. CJE의산화질소유도능평가대식세포에 LPS를처리하면염증반응을일으켜 TNFα, IL-β, IL-6, IL- 등의사이토카인과산화질소와같은염증관련인자의생성을촉진하는것으로알려져있다 (). 특히산화질소는자유라디칼로서심혈관계, 신경계및면역계의전달물질로세포내항상성유지, 신경전달물질의운반, 항암작용등의기능을한다 (). 이것이과량생성되면전신적염증을유발하여생체에여러부정적인영향을미칠수있으나적정량의산화질소생성은선천성면역의중요한인자로여겨진다 (3). 따라서본연구에서는정상대조군, LPS만을처리한양성대조군과 LPS를처리하지않고 CJE를농도별로처리한실험군이생성해내는산화질소에대해측정하였다. CJE를처리하였을때유도되는산화질소와 LPS를처리하였을때유도되는산화질소의분비량을비교하여 CJE가선천성면역을활성화시킬정도의산화질소를생성하는지확인하였고, 그결과를 Fig. 3에나타내었다. A Ativte NF-κB. (pg/µg ell protein). 6 5 4 3 B Reltive expression level. of COX- (fol). 4 3.5 3.5.5.5 CON LPS 5 5 3 5 CJE onentrtion (µg/ml) CON LPS 5 5 3 5 CJE onentrtion (µg/ml) C 7 PGE relese (pg/ml). 6 5 4 3 CON LPS 5 5 3 5 CJE onentrtion (µg/ml) Fig.. Effet of Citrus junos ethnoli extrts (CJE) on etetion of tivte NF-κB (A), COX- expression (B), n relese PGE (C) y RAW64.7. The results re men±sd of triplite experiment. Vlues with the ifferent letters ove r grphs re signifintly ifferent y one wy ANOVA test (P<.5).
6 양지원 전혜린 유양희 김진영 최효경 최경철 전우진 윤호근 Nitri oxie (µm). 4 35 3 5 5 5 e CON LPS 5 5 3 5 CJE onentrtion (µg/ml) Fig. 3. Effet of Citrus junos ethnoli extrts (CJE) on nitri oxie proution y RAW64.7. Vlues with the ifferent letters ove r grphs re signifintly ifferent y one wy ANOVA test (P<.5). 양성대조군은대조군에비해약 4배가량많은양의산화질소를생성하였고 CJE는 5 μg/ml의농도에서부터 3 μg/ ml까지산화질소의분비가농도의존적으로증가하는경향을보였으나, CJE 3 μg/ml와 5 μg/ml 사이에서는산화질소의증가에유의적차이가없는것으로나타났다. CJE 의산화질소분비능은양성대조군인 LPS 처리군보다는모두유의적으로낮았다 (P<.5). 사이토카인발현능선천성면역반응의중요인자로여겨지는 TNF-α나 IL-β, IL-6, IL- 등과같은사이토카인은대식세포가활성화되면발현이증가하게되고이를통해다른면역세포들의면역반응을촉진시키는역할을하게되는데, CJE가이들사이토카인발현에미치는효과를측정하기위하여다음의실험을계획하였다. 산화질소생성능의평가시험방법과마찬가지로어떤처리도하지않은정상대조군, LPS만을처리한양성대조군, CJE를농도별로처리한실험군이발현해내는사이토카인을 rel-time PCR을통하여측정하였다. Fig. 4A는 TNF-α의발현을측정한결과로, 정상대조군에비해 LPS를처리한양성대조군에서 배많은양의 TNF-α 를발현하였다. 세포에처리된 CJE 추출물의농도가증가할수록 TNF-α의발현이증가하는경향을보였으나, 5 μg/ ml의농도에서보인결과가정상대조군에비해유의적인차이를보였고그이하의농도에서는정상대조군과유의미한차이를보이지는못했다. Fig. 4B는단핵구나대식세포등에서분비되어 T 세포를활성화시키는것으로알려진 IL-β의발현을측정한결과로, LPS에의해양성대조군의 IL-β 발현량이정상대조군에비해약 배가량증가한것을알수있었다. CJE만처리한실험군에서 CJE 농도의존적으로 IL-β의발현이증가하는경향을가진다는결과를얻었고, 특히 5 μg/ml의농도에서는 LPS군과비슷한수준까지증가하는것을확인하였다. Fig. 4C는 B 세포분화 A.5 B.5 Reltive expression level. of TNF-α (fol)..5.5 Reltive expression level. of IL-β (fol)..5.5 CON LPS 5 5 3 5 CJE onentrtion (µg/ml) CON LPS 5 5 3 5 CJE onentrtion (µg/ml) C Reltive expression level. of IL-6 (fol)..5.5.5 D Reltive expression level. of IL- (fol)..5.5.5 CON LPS 5 5 3 5 CJE onentrtion (µg/ml) CON LPS 5 5 3 5 CJE onentrtion (µg/ml) Fig. 4. Effet of Citrus junos ethnoli extrts (CJE) on ytokines expression levels y RAW64.7 mrophge. The results re men±sd of triplite experiment. A, tumor nerosis ftor (TNF)-α; B, IL-β; C, IL-6; D, IL-. Vlues with the ifferent letters ove r grphs re signifintly ifferent y one wy ANOVA test (P<.5).
유자에탄올추출물의면역력증진효과 6 활성을가진사이토카인 IL-6의발현을확인한그래프로, CJE 3 μg/ml 이하의농도에서는유의미한변화를보이지못하였지만 3~5 μg/ml의농도에서정상대조군과유의적인발현량의차이를보이는것을확인하였다. 그러나양성대조군의발현량에대하여약 64% 정도의발현량을보였으며, 이는정상대조군과현격한차이를보이지는못하였다. Fig. 4D는 Th 세포에서생성되는사이토카인 IL-의발현을나타낸그래프인데, IL-은 Th 세포에서생성하는 TNF-α나 IL-β, IL-6의생산을억제적으로조절하여여러가지염증성사이토카인생성의균형을조절하는역할을하는것으로알려져있다. IL-의발현은정상대조군대비양성대조군에서만약 배가량유의적으로발현이증가함이나타났으며, 정상대조군과양성대조군에비해 CJE 처리군에서는통계적으로유의미한차이는보이지않았다. Splenoyte prolifertion. (% of ontrol). 6 4 8 6 4 CON ConA 5 5 3 5 CJE onentrtion (µg/ml) Fig. 6. Effet of Citrus junos ethnoli extrts (CJE) on prolifertion rte of mouse primry splenoytes. The results re men±sd of triplite experiment. Vlues with the ifferent letters ove r grphs re signifintly ifferent y one wy ANOVA test (P<.5). NK 세포활성측정 NK 세포는선천성면역반응중하나로바이러스에감염된세포, 종양세포, 비정상세포, 표적세포를인지하여결합한뒤독성과립들을세포에통과시켜세포사멸을유도한다 (4). NK 세포의활성은다양한활성화및억제수용체를통한신호전달균형에의해조절되는데, 이렇게세포와결합했을때오는활성신호와억제신호를인식하여정상세포는공격하지않고비정상세포는제거함으로써세포살해활성이조절된다 (5,6). NK 세포의활성측정은 YAC- 세포에대한 NK 세포의공격으로인해발생하는 LDH를측정함으로써평가하는데, CJE 처리에따른 NK 세포활성을 Fig. 5에제시하였다. CJE 추출물은 NK 세포의활성에농도의존적으로영향을주는것으로나타났으며, 특히 3 μg/ml의농도에서부터정상대조군대비유의적인차이를보이는것으로나타났다. 비장세포증식능비장은혈액에서유래되는항원에대해반응하는주요면역반응기관으로, 특히 T 및 B 림프구의성숙과항원자극 NK ell tivity (% of ytotoxiity). 5 4 3 CON 5 5 3 5 CJE onentrtion (µg/ml) Fig. 5. Effet of Citrus junos ethnoli extrts (CJE) on NK ell tivity y splenoytes. The results re men±sd of triplite experiment. Vlues with the ifferent letters ove r grphs re signifintly ifferent y one wy ANOVA test (P<.5). 에의한림프구의분화가이루어지기때문에비장내림프구의증식은면역시스템에서중요한의미를가진다 (7). Connvlin A(Con A) 는 in vitro 상에서마우스 T 세포의자극을위해처리하는물질로 T 세포의활성화, 증식, CD4와 CD8 세포로의분화를유도하게된다 (). 이러한특징으로인해 Con A를양성대조군으로사용하게되었고그와비교하여 CJE 추출물이마우스의비장세포증식에어떤영향을주는지측정하였다. Fig. 6의결과에서알수있듯이 CJE는농도의존적으로마우스비장세포의증식을촉진시키며, 특히 3 μg/ml의농도에서부터정상대조군대비유의적인차이를나타내는것을확인하였다. 고찰유자는우리나라남해안지방에서나는감귤류의일종으로뛰어난향과특유의산미를가지고있고주로과육및과피를사용해유자청으로제조되어유자차로이용되어왔으며, 유자에함유되어있는 hesperitin, nringin, nringenin 등다량의플라보노이드화합물에의한항산화효능이연구되었다 (8). 또한유자의오일내에존재하는 limonene 성분은면역세포인호중구에서항염증효과가있음이보고되었으나 (9), 유자의선천성면역기능에대한연구는미비하여유자 3% 주정추출물을이용한면역조절효능을평가하고자하였다. 유자 3% 주정추출물 (CJE) 의면역력효능평가의안전범위확인을위해마우스유래대식세포주인 RAW64.7을이용하여최저농도 5 μg/ml에서부터최고농도인, μg/ml로 48시간동안처리하였다. 최고농도인, μg/ ml로 48시간처리한결과세포생존율이대조군과거의비슷하거나오히려세포생존에도움을주는것으로나타났으므로추가적인안전성검증을통하여 CJE의식품으로의개발이가능할것으로사료된다. 대식세포는탐식작용을하는면역세포로인체의거의모든조직에존재하는내재면역
6 양지원 전혜린 유양희 김진영 최효경 최경철 전우진 윤호근 의중요한 차방어기능을담당하는데 (4), 세균이나이물질을탐색, 제거하는과정에서여러가지사이토카인을분비하고면역작용에필요한물질들을분비하는등항원에대한면역작용의중추적인역할을한다 (). 면역세포에 LPS와같은면역유발물질을처리하면세포질의전사인자인 NFκB는활성화되어핵안으로전좌되고이후 COX-나염증성사이토카인의발현증가및촉진을통해면역반응은더욱활성화된다 (9). CJE가면역반응에미치는영향을측정하고선천성면역증진의가능성을확인하기위한실험을진행하였는데, NF-κB의활성도, COX-의발현, PGE의분비는 CJE에농도의존적으로증가하는것을알수있었다. 특히 3 μg/ml의농도에서부터정상대조군과유의적인차이를보이는결과가나타났다. PGE의분비뿐만아니라대식세포에서생성되는염증성물질인산화질소는면역계에서종양세포나세포내감염된미생물에대한방어작용을하는중요한신호전달물질로, 과량생성되면전신적염증을유발하여생체에여러부정적인영향을미칠수있으나적정량의산화질소생성은선천성면역의중요한인자로여겨진다 (3). 감초, 건지황, 당귀, 도라지, 목천료생약추출물에의한 RAW64.7의산화질소생성능을평가한연구에서이들생약추출물들은양성대조군인 LPS의처리와비슷한수준으로대식세포의산화질소생성능을보였다 (5). 본연구에서 CJE의대식세포의산화질소생성능은양성대조군인 LPS에의한산화질소생성능보다높지는않았지만농도의존적으로증가하는경향을보였고 3 μg/ml의농도에서부터유의적인차이를보였으며, 5 μg/ml 이후의농도에서는그증가가크지않아산화질소생성의유효농도는 3 ~5 μg/ml로사료된다 ( 데이터제시안함 ). 본연구에서측정한염증성사이토카인인 TNF-α, IL-β, IL-6는대식세포에분비되는사이토카인인데, 이들을측정함으로써대식세포의면역활성을예측할수있다. 활성화된대식세포는미생물및바이러스에감작된세포를제거하는능력이크게증가한다 (6). CJE 처리에의해 RAW64.7에서 TNF-α와 IL-β, IL-6의유전자발현은 LPS 처리군보다는낮았으나 CJE에농도의존적으로증가하였고, 특히 3 μg/ml의농도에서부터유전자발현이증가하는결과를보였다. 그러나 IL- 유전자발현은유의미한변화를보이지는못했다. 대식세포에서분비하는산화질소는염증유도사이토카인을억제하는항염증사이토카인 (nti-inflmmtory ytokine) 인 IL-을증가시킨다. Fig. 3에서 CJE는 RAW64.7 세포의산화질소분비를증가시켰으나그증가량이 IL-의유전자발현에영향을줄만큼의미있는수치는아니었던것으로사료된다. 본연구에서는대식세포의탐식작용 (phgoytosis ssy) 을직접적으로측정하지는않았지만, 대식세포가활성화되었을때증가하는지표인 NF-κB, COX-, PGE, 산화질소, TNF-α, IL-β 등의유전자발현증가를확인하였다. 이를통해 CJE는대식세포가활성화되어탐식작용과같은면역기능에도도움을줄수있을것이라는 결론을내리게되었다. 또한 CJE는 NK 세포의활성을높이도록도와주고비장세포의증식을촉진시키는것으로 Fig. 5와 Fig. 6의결과에나타났다. 비장은혈액으로부터항원을수집하여 T 세포와 B 세포의성숙이일어나고항원에의해자극받은후림프구의분화가일어나는면역력을관장하는주요기관 () 인데, 비장세포증식활성은 CJE에농도의존적으로증가하는양상을보이는것이확인되었다. 5 μg/ ml의농도에서는대조군에비해 3% 의증식활성을보였지만면역반응매개체 (immune moultor) 인 LPS로자극을주었을때보다는낮은증가를보였다. 이러한결과는 CJE 의투여가비장세포를증식시키는 mitogen 활성이있음을보여주는것으로, 외부의항원에노출되었을때 CJE가항원에대한면역반응을유도하는면역세포의수를증가시킴으로써항원에대한효과적인방어에도움을줄것이며, 세포실험상에서면역증강에도움을줄수있는농도는 3~ 5 μg/ml이므로이를바탕으로추후에실험동물을이용한 in vivo 후속연구를통해 CJE를이용한면역증강기능성식품개발이가능할것으로여겨진다. 요 본연구에서는유자가선천성면역력에미치는효과를알아보기위하여유자 3% 주정추출물 (CJE) 을사용하였으며선천성면역에중요한역할을하는대식세포를이용해실험하였다. CJE는마우스대식세포인 RAW64.7에서, μg/ ml의최고농도까지세포독성을보이지않았고, 전사인자 NF-κB와염증성매개물질인 COX-, PGE의활성및발현증강에영향을미치며, 특히 3 μg/ml의농도에서부터유의적차이를보이는것으로확인되었다. 산화질소생성능과대식세포에서분비되는사이토카인인 TNF-α, IL-β의발현을대조군에비해농도의존적으로증가시킨다는결과를얻었으나, IL-6에서는통계적으로약간의유의성이있는증가를보였고 IL-은정상대조군에비해거의유의적인차이를보이지않았다. CJE는또한 NK 세포의활성을농도의존적으로증가시키고비장세포의증식능도농도의존적으로증가시킨다는것을확인하였다. 이러한결과로미루어보아 CJE는인체의대식세포활성의증가를통해선천성면역력을증가시킬것으로판단된다. 약 감사의글 본연구는산업통산자원부와한국산업기술진흥원의지역특화산업육성사업의일환으로수행된연구결과로이에감사드립니다. REFERENCES. Yu AR, Prk HY, Kim YS, H SK, Hong HD, Choi HD.. Immuno-enhning effet of see extrts on RAW
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