제출문 질병관리본부장 귀하 이보고서를 경남지역지역사회획득메티실린내성황색포도알균의발생양상및특성조 사 ( 경북대학교 / 이제철 ) 과제의연구결과보고서로제출합니다. 2006. 4. 5 주관연구기관명 : 경북대학교 주관연구책임자 : 이제철 - 1 -
연구결과보고서요약문 연구과제명 중심단어 경남지역지역사회획득메티실린내성황색포도알균의발생양상및특성조사 지역사회감염, SCCmec, MRSA, 피부감염 주관연구기관경북대학교주관연구책임자이제철연구기간 2005. 10. 7-2006. 4. 6 연구목적및방법 : 메티실린내성황색포도알균 (MRSA) 은병원감염 (hospital-acquired infection) 의중요원인균일뿐만아니라지역사회획득감염 (community-acquired infection) 을일으킨다. 본연구는 2004년 11월부터경남의 7개지역 9곳의 1, 2차병, 의원으로부터분리된황색포도알균균주를대상으로지역사회획득감염의임상적특성을규명하기위하여균이분리된환자의차트를후향적으로분석하였고, 지역사회획득감염을일으킨황색포도알균의항균제감수성정도, 병원성유전자보유, 유전학적연관성등을조사하였다. 연구결과 : 연구기간중총 162주의균을분리하였으며, 그중지역사회획득감염을일으킨균주는 CA-MSSA 균주 10주와 CA-MRSA 균주 24주로나타나황색포도알균의지역사회획득감염에서 CA-MRSA 빈도는 70.6% 로나타났다. CA-MRSA 감염부위는피부감염 (17건), 이 ( 耳 ) 감염 (3건), 질감염 (2건) 및기타 (2건) 으로피부감염이가장많았으며, 감염연령은성인 (9명) 보다소아 (15명) 에서흔하게나타났다. CA-MRSA 감염의특정위험인자는없었다. CA-MRSA 균주의 oxacillin의최소발육저지농도는 16-256 μg/ml까지다양하였고, clindamycin에는 87.5% 의균이내성을나타내었다. Panton-Valentine-Leukocidin유전자는검사한 CA-MRSA 균에서는검색되지않았지만, exfoliative toxin B 유전자는포도알균피부열상증후군환자에서분리된균에서검출되었다. ST89, SCCmec type II variant, spa type t375의특징을가진 CA-MRSA 균주는모두어린이에서 SSSS를일으켰으며, ST72, spa type t324 또는 t664, SCCmec type IVa 또는 IV variant 균주는주로성인에서피부감염부터폐렴까지다양한감염을일으켰다. Erythromycin 내성이며 clindamycin에감수성을나타내는 ST72 균주는모두 ermc 유전자를가지고있었으며, D-test에서모두 inducible 내성을나타내었다. 경남남부지역에서는 2 clone의 CA-MRSA 균주가유행하고있으며, 각각의 clone에따라특징적인임상양상과세균학적특성을가지고있었다. 결론 : 경남지역을대상으로 CA-MRSA 감염을확인한결과 MSSA보다 MRSA 균감염이고빈도로나타났고, 외국처럼피부감염이가장흔하였으며, 치료제로흔히사용하는 clindamycin에는대부분의균주가내성을나타내어 CA-MRSA의진단과치료에주의가필요하다. 또한특정클론의 CA-MRSA 균주가대부분의감염을발생시키므로이들유행균주의전파와확산을예방할수있는대책이필요한것으로생각된다. - 2 -
Project Summary Title of Project Key Words Prevalence and Characterization of Community-Acquired Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus in Gyeongnam Province community-acquired infection, SCCmec, MRSA, skin infection Institute Kyungpook National University Project Leader LEE JE CHUL Project Period 2005. 10. 7. - 2006. 4. 6. Background: We analyzed the clinical and bacteriological characteristics of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA) infection in Southern Korea. Methods: Twenty-four CA-MRSA isolates were collected from outpatients at 6 hospitals in Kyungnam province, Korea. Clonal relatedness of CA-MRSA isolates was analyzed by molecular typing techniques. Toxin and resistance genes were detected by PCR amplification. Antimicrobial susceptibility and the D-test were performed. Results: Three distinct genotypes of CA-MRSA were identified: sequence type (ST) 89, ST72, and ST5. Ten CA-MRSA isolates with ST89 and SCCmec type II variant were all associated with staphylococcal scalded skin syndrome. etb was detected in 9 of 10 CA-MRSA isolates belonged to ST89. Twelve CA-MRSA isolates with ST72 and SCCmectype IVa caused a wide range of clinical manifestations. pvl was not detected in any CA-MRSA isolates. CA-MRSA isolates belonged to ST89 were resistant to clindamycin by the constitutive expression of erma, while CA-MRSA isolates belonged to ST72 expressed inducible ermc. Conclusions: Two predominant CA-MRSA clones with distinct clinical and microbiological features are circulating in Southern Korea. Further large prospective study regarding an effective preventive strategy and appropriate treatment regimen is necessary to control CA-MRSA. - 3 -
목 차 제 1 장서론 --------------- 5 제 1절연구개발의필요성및목적 ----------------- 5 제 2절연구개발의범위와방향 ----------------- 8 제 2 장국내 외기술개발현황 --------------- 10 제 1절지역사회획득 MRSA 균에대한국내 외현황 ------- 10 제 2절연구결과가국내 외기술개발현황에서차지하는위치 -- 13 제 3 장 연구수행내용및결과 --------------- 14 제 1절연구수행체계 ----------------- 14 제 2절연구방법 ----------------- 15 제 3절연구내용및결과 ----------------- 18 제 4 장연구개발목표달성도및대외기여도 ---------- 27 제 1 절. 연구개발목표달성도 ----------------- 27 제 2 절. 대외기여도 ----------------- 28 제 5 장연구결과의활용성과및계획 -------------- 29 제 6 장기타사항 -------------- 30 제 7 장참고문헌 -------------- 31 연구과제요약 -------------- 34 본연구결과의학회지게재를위해준비중인논문 ------- 36-4 -
제 1 장서론 제 1 절연구개발의필요성및목적 1. 연구의필요성 항균제감수성황색포도알균 SCCmec 유전자획득 메티실린내성황색포도알균 원내감염 MRSA 지역사회획득감염 MRSA 국내특성 ST5, ST239 클론이우세 다약제내성균주가많음 특이적인독소유전자없음 SCCmec type II 와 III 이우세 클론에따른특이적전파양상 클론에따른임상적특성 위험인자규명 국내특성 CA-MRSA 감염연구없음 세균학적특성규명없음 임상적특성모름 경남에서많은수의포도알균피부열상증후군 (4S) 환자발생 일반인에서 MRSA 보균율높음 의학적문제점 CA-MRSA 균에의한유병률증가 CA-MRSA 균의약제내성으로치료의어려움 특정 MRSA 균의전국적확산에따른국민보건위협 지역사회획득 MRSA 의세균학적및임상적특성을규명하여 MRSA 의전파및확산방지대책마련 MRSA 의유병율감소대책마련 - 5 -
가. 메티실린내성포도알균 (methicillin-resistant S. aureus, MRSA) MRSA 균주는 1961년영국에서처음분리된이후전세계적으로확산되어병원감염의중요원인균으로자리잡고있으며, 최근에와서는세계적으로지역사회획득 MRSA(community-acquired MRSA, CA-MRSA) 감염보고가증가되고있는추세에있음. 나. 메티실린내성기전메티실린감수성포도알균 (methicillin-susceptible S. aureus, MSSA) 이 Staphylococcal Chromosomal Cassette mec(sccmec) 을획득하여 MRSA 균주로됨. 현재까지알려진보고에의하면병원감염을일으킨대부분의균주는 SCCmec type II 또는 III를가지고있으며, 지역사회획득감염을일으킨균주는 SCCmec type IV를가지고있음. 그러나시간경과에따라병원감염을일으킨 MRSA균주에서 SCCmec 유전자의여러변형들이나타나고있음. 다. MRSA에의한원내감염원내감염을일으킨포도알균중 MRSA의빈도는병원에따라다르지만 60-70% 의매우높은빈도로나타남. MRSA 균주들의항균제내성의심각성과 MSSA 균에비해사망률이높게나타나는것이문제시됨. 국내에서분리된원내감염유발 MRSA 균주들은 sequence type(st) 5 또는 ST239 클론에속하는균주들로이들의항균제내성양상은클론에따라뚜렷한차이를나타내므로 MRSA를대상으로클론의분류, 내성양상의비교, SCCmec type에따른메티실린의 MIC 차이, 임상양상의특성등의규명이시도되고있음. 라. MRSA에의한지역사회획득감염미국과유럽및인근일본과대만에서는 2000년이후에 CA-MRSA 감염의많은보고와더불어이들 MRSA에의한폭발감염 (outbreak) 도보고되고있음. CA-MRSA 균들은대부분피부와연조직감염을일으키는것으로알려져있음. 그러나우리나라에서는지역사회획득감염의빈도는일반적으로낮은정도로만알려져있고, CA-MRSA 감염의정확한빈도및발생양상에관한보고는없음. 마. MRSA 에의한병원감염과지역사회획득감염의차이점 다른외국의연구에서 CA-MRSA 는병원감염과는감염의양상, 발생질병, 세균의클론, 병원성, 항 균제감수성, 전파및확산양상등임상적및세균학적특성이다른것으로알려져있음. 바. 울산과경남에서 staphylococcal scalded skin syndrome(4s) 환자발생 2002년부터 2005년상반기까지울산과경남지역에거주하는소아에서 54명의 4S 환자가발생하였고, 4S 환자의비강에서분리된일부의황색포도알균이 MRSA로나타나 CA-MRSA에의한국내연구가필요한실정임. - 6 -
사. CA-MRSA 감염의의학적문제점국내에서는 CA-MRSA에관한세균학적및임상적특성에관한정보가거의없으므로감염병환자치료시항생제사용에관한지침이없음. 또한국내에서발생하는 CA-MRSA균주가특정클론에서유래된단일클론인지아니면여러종류의클론이혼재해있는지를알지못하므로지역사회감염을일으킨 CA-MRSA 균의전파와확산방법등에대한정보가없음. 따라서 4S 환자가다수발생한지역인울산과경남지역에서지역사회획득감염을일으킨황색포도알균을대상으로 CA-MRSA의발생빈도를조사하고, 이들감염에의한질병양상, 감염의위험인자, 질병의경과, 진단및치료에관한임상적특성과감염을일으킨 CA-MRSA 균주의역학적특성, 병원성및항균제감수성등의세균학적특성을조사하고연구할필요성이있음. 2. 연구의목적 연구목적 우리나라에서발생한 CA-MRSA 감염증의세균학적 임상적특성을규명하여 CA-MRSA의전파및확산을예방할수있는대책을마련하는데기초자료를제공하고자함 연구개발목표 경남지역에서발생한지역사회획득황색포도알균감염증을대상으로 CA-MRSA 감염증의발생양상조사 CA-MRSA 균주의분자역학적연관성및병원성유전자조사 CA-MRSA 감염증의임상적특성조사 - 7 -
제 2 절연구개발의범위와방향 1. 경남지역지역사회획득황색포도알균감염증중 MRSA의발생양상조사 경남지역에서지역사회획득황색포도알균감염증이의심되는환자를선택. 임상검체에서분리된균주를대상으로세균학적동정을실시하여황색포도알균으로동정되면환자차트를분석하여오염균 (contaminant), 집락균 (colonization) 및감염균 (true infection) 으로분류. 경남지역지역사회획득황색포도알균감염증의빈도와그중 MRSA의발생빈도를조사하여지역사회획득황색포도알균감염증의발생양상을규명. 경남지역에서지역사회획득메티실린내성황색포도알균에의한감염증발생조사 2. 지역사회획득감염을일으킨황색포도알균의임상적특성조사 지역사회획득황색포도알균감염이의심되는환자를대상으로환자차트를분석하고설문을실시하여지역사회획득황색포도알균감염증을확증. 환자의 demographic data, 질병의양상, 질병의경과, 기저질환, 치료용항균제종류및투여기간등을분석. 또한지역사회획득황색포도알균감염의위험인자를분석. 소아과, 진단검사의학과및감염내과전문의에게균주수집의적절성과임상양상및통계처리등의자문을구하여지역사회획득황색포도알균감염의임상적특성을규명. 경남지역에서발생한지역사회획득황색포도알균감염증의임상적특성규명 3. 지역사회획득감염을일으킨황색포도알균의각종항균제에대한감수성조사 지역사회획득황색포도알균감염증으로확증된균주를대상으로실험실에서 Clinical Laboratory Standard Institutes(formally NCCLS) 의기준에따라항균제를선택하여항균제감수성검사를실시. Clindamycin 내성을확인하기위하여 erm 유전자를 PCR로증폭하고 D-test를실시하여 inducible 내성을확인. 지역사회획득감염을일으킨황색포도알균의각종항균제에대한감수성을조사하여환자치료를위한항균제선택의근거및지침마련 4. 지역사회획득감염을일으킨메티실린내성황색포도알균의유전학적연관성규명 Multilocus sequence typing(mlst) 를실시하여 CA-MRSA 균주의 sequence type(st) 과 clonal complex(cc) 를결정하여다른나라에서분리된 CA-MRSA 균주와역학적연관성을비교. - 8 -
SCCmec typing을실시하여 type을결정하여지금까지의보고와같이지역사회획득 MRSA에서주로발견되는 type IV가우리나라에서도우세한지를조사하고여러가지 SCCmec 변이형의빈도를분석. spa typingdf 실시하여균주를분류. Pulsed-field gel electrophoresis(pfge) 를실시하고 GelCompar software를이용하여각각의균주를 clustering하여울산과경남지역에서의지역사회획득황색포도알균의유전학적연관성분석. 지역사회획득감염을일으킨메티실린내성황색포도알균의세균학적특성을조사하여분리된균주를클론별로분류하고각클론별로감염의위험인자와전파양상을분석하여지역사회획득메티실린내성황색포도알균의전파와확산을방지할수있는대책마련의기초자료제공. 5. 지역사회획득황색포도알균의병원성인자조사 외국에서분리된 CA-MRSA 균주에서발견되는 Panton-Valentine-Leukocidin(PVL) 유전자를검색하고 PVL 양성균주와 PVL 음성균주에의한환자의임상양상을분석. 경남지역에서발생한 4S 환자에서발견되는 exfoliative B 독소뿐만아니라 exfoliative A 독소를 PCR로증폭하여 exfoliative toxin의종류에따른임상양상을비교분석. 지역사회획득감염을일으킨 MRSA의병원성인자에따른임상양상을분석 - 9 -
제 2 장 국내 외기술개발현황 제 1절지역사회획득 MRSA 균에대한국내 외현황 1. 국외현황 가. 지역사회획득감염을일으키는 MRSA 균의유래 일부연구자들은 CA-MRSA 균주들이원내감염을일으킨소수의폭발감염클론이나산발감염균과매우유사한특성을보이므로 CA-MRSA 균이원내감염균에서유래하였다고주장하고있고, 다른연구자들은지역사회에존재하던 MSSA 균이 SCCmec DNA를획득함으로해서 CA-MRSA 균이된후이들이다시지역사회에광범위하게전파되고있는것으로보고있음. 하지만확실하게규명된바는없음. 나. CA-MRSA 감염증의발생빈도 MRSA의발생빈도는각나라마다다르지만전세계적인관심사가되었음. 특히 MRSA 감염이병원감염에만국한되어있지않고 MRSA 획득의위험인자가없는건강인에서도지역사회에서 MRSA 감염이발생함. 연구자마다 CA-MRSA 감염의빈도 (prevalence) 는 CA-MRSA의정의 (definition) 와연구 setting에따라큰차이를나타내고있음. CA-MRSA 감염은외국에서는소아과환자, 면역저하환자, 알라스카인, 미국인, 태평양에있는도서지역인, 스포츠선수, 군인등에서이미많은보고가있었음. 대만은지역사회소아에서발생한황색포도알균감염의 25-75% 가 CA-MRSA로추정하고있음. 스위스의경우에는병원입원환자 14,253명을대상으로한연구에서 CA-MRSA 빈도는입원환자 1,000명중 0.9명으로나타났음. 다. HA-MRSA와 CA-MRSA의구분 HA-MRSA와 CA-MRSA의구분은환자를기준으로한미국 CDC 기준에따라구분되었으나, 현재는 SCCmec typing과 phylogenetic analysis에근거한 MRSA 균의 molecular epidemiological definition에따라구분하는경향이있음. HA-MRSA는 SCCmec type II와 III가대부분을차지하고 CA-MRSA는 SCCmec type IV가대부분을차지함. 또한 MLST에서도 HA-MRSA와 CA-MRSA는각각다른 sequence type으로나타남. 따라서 CDC 기준과 MRSA균의세균학적및유전학적특성을종합하여 HA-MRSA와 CA-MRSA를구분하는바람직할것으로판단됨. 라. CA-MRSA 에의한감염증 유럽을비롯한미국등에서는 CA-MRSA 에의한감염증은대부분 abscesses, cellulitis, folliculitis 및 - 10 -
impetigo 등의피부와연조직감염을일으킨다고알려져있음. 감염의증상은경증이대부분이지만 심한경우사망에까지도달함. 마. CA-MRSA균의세균학적특성 CA-MRSA 균은 epidemic HA-MRSA의대부분을차지하는 major pandemic MRSA 클론과는 SCCmec type, 세균의성장속도, 보유하고있는항균제내성유전자및독소유전자등에서다른유전적배경을가지고있음. 대부분의균주는 CA-MRSA에서중요한병원성인자로알려져있는 PVL 독소를가지고있으며, 지역적으로특정클론에의한감염이높게나타나는특징을보임. 바. CA-MRSA 균의 control 수학모델을이용한가설에서 CA-MRSA도지역사회에서 endemic하게될수있음이증명되었음. 그러나아직대부분의나라에서는 CA-MRSA 감염의전파를차단할수있는정책이나프로그램은아직마련되어있지않은실정임. CA-MRSA 감염의감시체계마련과역학조사및임상연구등이 CA-MRSA 감염의관리를위해서연구되고있음. 2. 국내현황가. 국내 MRSA 균에의한지역사회획득감염실태 국내에서는황색포도알균의지역사회획득감염에대한체계적인연구는아직까지없는실정이며, 일반적으로 MRSA에의한지역사회획득감염빈도는낮은것으로알려져있음. 그러나일반인을대상으로한연구에서는 MRSA 분리빈도가예상밖으로높게나타나체계적인 MRSA 보균율등을조사할필요성이있으며, 이들 MRSA 보균자및보균율과 CA-MRSA 감염율의상관성을규명할필요성이있음. 나. 경남지역에서황색포도알균피부열상증후군환자의발생 경남지역에서는어느한지역에국한되지않고전체지역에서여러명의 4S환자가소아에서발생하였으며, 이들분리균을대상으로한세균학적특성조사에서 CA-MRSA균도있었음. 이들 CA-MRSA 균주는모두일반적인지역사회획득감염에서나타나는 SCCmec type IV가아닌 SCCmec type II variant로나타났고, 이들균주들은모두 exfoliative toxin B를산생하였음. 이러한사실은경남지역에서 MRSA에의한지역사회획득감염이특정클론에의해서발생함을의미하므로경남지역을대상으로한체계적인황색포도알균에의한지역사회획득감염의발생양상과임상적특성및세균학적특성을조사할필요성이있음. - 11 -
다. 지역사회획득황색포도알균감염증의진단과치료를위한데이터부족 대부분의지역사회획득황색포도알균감염증은피부및연조직감염으로발생하는것으로알려져있으나, 4S처럼다른형태의감염으로도나타나므로환자의진단에어려움이있음. 지역사회획득감염을일으킨균주가 MSSA인지 MRSA인지를 1, 2차병원에서는쉽게구분하지못하고, 항균제감수성결과가체계적으로연구되어있지않으므로치료에어려움이있음. 지역사회획득감염을일으킨황색포도알균을대상으로정확한균종동정, 항균제감수성검사, 발병양상등을체계적으로연구하여임상의들이직접환자진단과치료에활용할수있는데이터를확보하는것이필요한실정임. 라. 지역사회획득황색포도알균감염증의전파와확산을예방할수있는정책수립 지역사회획득황색포도알균및 MRSA 균을관리하기위한국가정책에활용할수있는데이터를확보하기위서는지역사회획득황색포도알균감염증의정확한발생양상, 전파양상, 항균제감수성정도, 클론별세균학적및임상적특성, 지역별균주확산의경로등을정확하게파악하여야함. 그러나지금까지국내에서는지역사회획득황색포도알균감염증에대한체계적인연구가되어있지않으므로활용할수있는데이터의양이국한되어있으므로 CA-MRSA의 control을위해서적절한연구가필요한실정임. - 12 -
제 2절연구결과가국내 외기술개발현황에서차지하는위치 1. 국내 CA-MRSA 발생현황파악 본연구는국내에서는처음으로특정지역을대상으로지역사회획득황색포도알균감염중에서 MRSA 에의한감염증의빈도를조사하였음. 2. HA-MRSA균과 CA-MRSA균의연관성조사 국내에서발생한 HA-MRSA균주의세균학적특성은비교적잘알려져있으나 CA-MRSA균주와의유전학적연관성은전혀연구되어있지않은실정임. 따라서본연구는국내에확산되어있는 HA-MRSA 균주와경남지역에서발생한 CA-MRSA와의세균학적특성및유전학적특성을규명하여경남지역에서분리한 CA-MRSA 균주는국내에서유행하는 HA-MRSA균주와는세균학적유전학적특성이다름을규명하였음. 3. CA-MRSA 균감염에의한임상양상파악 지금까지외국의보고에의하면 CA-MRSA 균에의한감염증은피부와연조직감염이대부분을이루고있는것으로알려져있으나, 본연구결과에의하면경남지역에서발생한 CA-MRSA 균에의한감염증은피부감염이 64%, 이 ( 耳 ) 감염이 16%, 질감염이 8% 및비뇨기, 폐및소화기감염이각각 4% 로나타나전체적으로볼때피부감염이주를이루고있지만, 피부이외의다른부위감염도외국에비해많이나타나는특징이있음을규명하였음. 4. 국내분리 CA-MRSA의세균학적특성조사 외국에서분리된 CA-MRSA 균주는 PVL 독소산생이 CA-MRSA 균의특징중하나였으나, 경남지역에서국내에서분리된 CA-MRSA의어떤균주도 PVL 독소를가진균주는없었음. 이는국내에서발생한 CA-MRSA 감염증의임상양상이다른나라에비해경증으로나타날수있음을시사하는결과임. 포도알균피부열상증후군을유발하는 MRSA 균주는모두특정클론에의한감염임을증명하여이들균의역학조사및전파를예방할수있는대책수립이시급함. - 13 -
제 3 장 연구수행내용및결과 제 1 절연구수행체계 경남지역에서발생한 CA-MRSA 감염증의세균학적 임상적특성규명 CA-MRSA균의유전학적특성조사 : SCCmec typing, PFGE, MLST CA-MRSA균의병원성인자조사 : PVL toxin, exfoliative toxin CA-MRSA와 CA-MSSA균을대상으로항균제감수성검사 오염이나집락화가아닌감염환자를대상으로 CA-MRSA와 CA-MSSA 빈도조사 황색포도알균균종동정및 MRSA 동정 환자차트를통한임상데이터분석 2004년 11월 - 2005년 8월까지발생한환자를대상으로조사 경남의 7 개지역 9 개병, 의원을대상 - 14 -
제 2절연구방법 1. 경남지역에서의 S. aureus 균주수집 가. 대상병원 2004년 11월부터 2005년 12월까지경남지역내창원 ( 창원파티마병원, 서울이비인후과 ), 마산 ( 마산의료원, 미래산부인과 ), 거제 ( 삼성병원 ), 김해 ( 강성구이비인후과 ), 밀양 ( 한솔병원 ), 진해와의령의일차의원등경남에위치한 7개지역의 9곳의병, 의원으로부터 S. aureus 균주를분리하고수집하였음. 나. 수집방법 경남지역병, 의원내원환자중세균감염증을가진환자를대상으로 세균배양을실시하여 S. aureus 균이배양되면 설문으로병원감염을제외하고 지역사회감염이의심되는환자의임상데이터분석및세균학적검사 S. aureus Coagulase-negative Staphylococcus MSSA MRSA HA-MSSA CA-MSSA CA-MRSA HA-MRSA CA-MSSA 와 CA-MRSA 균주수집 - 15 -
2. 임상데이터분석 CA-MRSA의정의 : an MRSA isolate recovered from a clinical culture from a patient who had no history of hospitalization or admission to a long-term care facility within one year before the MRSA-culture date, surgery, dialysis, presence of a permanent indwelling catheters or percutaneous medical devices (tracheostomy tube, gastrostomy tube, or urinary catheter), or previous isolation of MRSA. 환자의임상데이터를후향적으로조사. 환자의나이, 성별, 기저질환, 기저질환의중증도, 세균배양기록, 질병의경과등과지역사회획득감염의 CDC 기준에따라설문을실시하여데이터를분석. 소아과, 진단검사의학과및감염내과전문의의협조를받아임상데이터분석. 3. 황색포도알균및 MRSA 동정 임상검체를 mannitol salt agar에도말하고하룻밤배양하여황색의집락이나온것은 3-5개의집락을취하여순배양하고 nuc 유전자 PCR을시행하여양성으로나타난것은황색포도알균으로동정. nuc 유전자 PCR에서양성으로나온균을대상으로 meca 유전자 PCR과 oxacilllin 감수성검사를시행하여모두양성으로나타난것은 MRSA 균으로동정. 4. 항균제감수성검사 항균제감수성검사는 Mueller-Hinton agar를사용한우무평판희석법에의하여수행. 검사방법은 CLSI의기준에따름. 사용항균제는 penicillin, oxaciliin, ampicillin, amoxicillin-clavulanic acid, ampicillin-sulbactam, erythromycin, clindamycin, linezolid, trimethoprim-sulfamethoxazole, vancomycin, chloramphenicol, ciprofoxacin, norfloxacin, gentamicin, quinupristin-dalfopristin, rifampin, tetracycline 등을사용. 5. Clindamycin 유도내성검사 D-test로검사. Clindamycin과 erythromycin disk를 center to center의거리가 15 mm되게하여 D-shaped zone 형성유무를검사. 5. 독소유전자검색 PVL 독소 (luks-pv 와 lukf-pv) 와 exfoliative A, B 독소를 PCR 로증폭하여검색. - 16 -
6. 세균학적특성조사 http://www.mlst.net에서권장하는방법에따라 MLST를수행하고분석. Multiplex PCR 법으로 SCCmec typing을실시. spa typing을실시. PFGE Bacterial plug를제작하여각 plug당 30 U의제한효소로염색체절단. CHEF-DR III system(bio-rad Co) 에서전기영동. Gelcompar II software program을이용하여 cluster analysis 수행. 7. 지역사회획득감염을일으킨황색포도알균의보관 세균학적특성이규명된 CA-MRSA 균주와 CA-MSSA 균주를배양하여양의적혈구와함께섞어 서저온냉동고에보관하고동시에임상데이터를정리. - 17 -
제 3절연구내용및결과 1. 수집균주의특성 경남지역에서총 162균주를수집하였으며, 분리된균주를대상으로임상데이터분석과세균학적검사를통하여최종적으로지역사회감염을일으킨메티실린내성황색포알균 (CA-MRSA) 22주와메티실린감수성황색포도알균 (CA-MSSA) 10주로나타나지역사회감염을일으킨황색포도알균중 MRSA의빈도는 68.8%(22/32) 로나타났다. 수집균주 162주를대상으로설문이나임상데이터를종합하여분석하였을때병원감염이가장많았고 (78주), 정상균무리또는실제감염이아닌집락화 (52 주 ) 균주가많았다. 특히지역사회감염이의심되는균주를대상으로세균학적특성을조사한결과병원에서의균종동정결과황색포도알균으로나온균이 coagulase-negative Staphylococcus인 S. epidermidis(9주 ) 로판명되어병원의임상검사실에서정밀한세균동정과정이필요할것으로생각된다. 지역사회감염을일으킨황색포도알균의분포는창원파티마병원에서가장많은균을분리하여창원에서분리된균이 26주, 마산 3주, 진해, 거제, 김해에서각각 1주씩분리되었다. 이러한결과는균주분리를창원지역에서집중적으로한결과이지만, 창원파티마병원에내원하는환자들의주소지는창원, 마산, 밀양, 거재, 진해등경남남부지역에다양하게분포하므로경남남부지역의황색포도알균감염증을대표할수있을것으로생각된다. 황색포도알균에의한지역사회감염은대부분어린이에많은감염을일으키는것으로알려져있으므 로본연구에서는소아과외래환자들을주대상으로삼았으며, 또한황색포도알균에의한지역사회 감염은대부분피부및연조직감염을일으키므로피부병변을가진환자들이주대상이되었다. 균분리율이계절적으로큰차이는없었다. Table 1. Characteristics of staphylococci isolates from Kyungnam Province, Korea. 균주분류수집균주수수집지역 ( 균주수 ) CA-MSSA 10 창원 (9), 마산 (1) CA-MRSA 22 HA-MRSA 78 Normal flora, colonized bacteria, CNS 52 창원 (18: 일차병원-2, 이차병원-16), 마산 (1), 진해 (1), 거제 (1), 김해 (1) Total 162-18 -
2. 지역사회획득황색포도알균감염의임상적특성가. CA-MRSA CA-MRSA 감염환자의남녀비율은 10:14로여자가 1.4 배많았으며, 감염부위는피부감염 (17명), 이감염 (3명), 질감염 (2명), 및폐및소화기감염 ( 각 1명 ) 의순이었다. 환자의연령별분포는소아가 15명이었으며, 성인은 9명이있었다. 임상차트분석결과감염에대한특정위험인자는없었으나, 2명의환자는 atopic dermatitis를가지고있었다. 질병으로는 staphylococcal scalded skin syndrome 환자가 9명으로가장많았으며, 다음으로일차피부감염증을가진환자가피부가 6명으로다음을차지하였다. SSSS를가진환자들은병원에입원하여치료를받았으며, 사용된항균제는 vancomycin, ampicillin/sulbactam, amoxicillin/clavulanate 등이었다. 또한통원치료를받은환자들은일차적으로 clindamycin으로치료하였다. Table 2. Clinical characteristics of patients with CA-MRSA infections. Patient (isolate) no. Sex/age (years) Hospital/clinic (area) Clinical diagnosis Infection site Underlying disease 1 (04CST011) F/2 Hospital (Changwon) Impetigo Skin - 2 (04CST015) F/68 Hospital (Changwon) Vaginitis Vagina - 3 (04CST044) F/4 Hospital (Changwon) Secondary infection Skin Atopic dermatitis 4 (04CST047) M/2 Hospital (Changwon) Secondary infection Skin Atopic dermatitis 5 (05CST001) M/1 Hospital (Changwon) Impetigo Skin - 6 (05CST002) F/2 Hospital (Changwon) SSSS Nares - 7 (05CST003) M/7 Hospital (Changwon) SSSS Nares - 8 (05CST013) F/2 Hospital (Changwon) SSSS Nares - 9 (05CST043) M/3 Hospital (Changwon) SSSS Nares - 10 (05CST045) M/58 Clinics, Changwon Acute otitis media Ear - 11 (05CST057) F/3 Hospital (Changwon) SSSS Nares - 12 (05CST077) M/35 Hospital (Changwon) Pneumonia Lung - 13 (05CST082) F/1 Hospital (Changwon) Acute otitis media Ear - 14 (05CST084) F/67 Hospital (Changwon) Secondary infection Bile duct - 15 (05CST087) F/66 Clinic (Changwon) Acute otitis media Ear - 16 (05CST088) F/54 Clinic (Masan) Vaginitis Vagina - 17 (05CST090) M/39 Clinic (Geoje) Abscess Skin - 18 (05CST108) F/28 Clinic (Jinhae) Breast abscess Skin - 19 (05CST115) F/34 Clinic (Masan) Breast abscess Skin - 20 (05CST125) F/1 Hospital (Changwon) Perianal abscess Skin - 21 (05CST124) M/3 Hospital (Changwon) SSSS Nares - 22 (05CST139) F/2 Hospital (Changwon) SSSS Nares - 23 (03CST001) M/5 Hospital (Changwon) SSSS Nares - 24 (03CST002) M/4 Hospital (Changwon) SSSS Nares - - 19 -
나. CA-MSSA 남녀비율은 1:1로동일하였으며, 감염부위는피부감염이 9명으로이감염에비해월등히많았다. 연령별분포는소아대성인의비율이동일하였으며, 감염에대한특정위험인자는없었다. 치료는모두통원치료로감염증이치료되었다. Table 3. Characteristics of CA-MSSA isolates from Kyungnam Province, Korea. Organ 최초진단명 환자수 남 / 여 환자연령 Impetigo 2 1/1 소아 (2) Cellulitis 1 1/0 성인 (1) Skin Scarlet fever 1 0/1 소아 (1) Skin abscess 4 3/1 성인 (3), 소아 (1) Perianal abscess 1 0/1 소아 (1) Ear Otitis Media 1 0/1 성인 (1) 3. 지역사회감염을일으킨황색포도알균의항균제감수성검사가. CA-MRSA 균주의항균제감수성검사 Oxacillin 감수성 MIC가 8 μg/ml과 16 μg/ml인균주가각각 1주, 32 μg/ml인균주가 4주, 64 μg/ml인균주가 11주, 128 μg/ml인균주가 4주, 256 μg/ml인균주가 2주로나타나경남지역에서분리된 CA-MRSA 균주는 oxacillin에저도또는중증도내성을나타내는균주가대부분이었다. 항균제내성양상 : 조사한 13가지항균제중에서 6종의항균제에내성을나타낸균주부터 2종의항균제에내성을나타낸균주가있었다. Ampicillin-tobramycin-erythromycin 내성형과 ampicillin-gentamicinetobramycin-clindamycin-erythromycin 내성형이각각 5주로가장흔한내성형이며, 3 class 이상의항균제에내성을나타내는다약제내성균주는 21주가있었다. - 20 -
Table 4. Antimicrobial susceptibility of CA-MSSA isolates from Kyungnam Province, Korea. 항균제 내성균주수 감수성균주수 내성률 Vancomycin 0 24 0% Teicoplanin 0 24 0% Ciprofloxacin 0 24 0% Trimethoprim/sulfamethoxazole 0 24 0% Chloramphenicol 0 24 0% Rifampin 0 24 0% Tetracycline 3 21 12.5% Gentamicin 5 19 20.8% Imipenem 6 18 25% Clindamycin 11 13 45.8% Erythromycin 21 3 87.5% Tobramycin 22 2 91.7% Ampicillin 24 0 100% Table 5. Multiplicity of antimicrobial resistance in CA-MRSA isolates. Multiplicity of resistance Resistance pattern Number of isolates 2 ApIp 1 ApGmTb 1 3 ApTbEm 5 ApTbSu 1 ApIpTb 1 ApTbSuEm 2 4 ApIpTcEm 1 ApTbClEm 3 ApIpTbEm 1 5 ApGmTbClEm 5 ApIpTbClEm 1 6 ApGmTbTcClEm 1 ApIpTbTcClEm 1 Abbreviations: Ap, ampicillin; Ip, imipenem; Gm, gentamicin; Tb, tobramycin; Em, erythromycin; Su, sulfamethoxazole; Cl, clindamycin; Tc, tetracycline. 나. CA-MSSA 균주의항균제감수성검사 Oxacillin 항균제감수성 MIC는모두 2 μg/ml 미만으로나타났으며, CA-MRSA 균주에비해대부분의항균제에감수성을나타내었다. - 21 -
Table 6. Antimicrobial susceptibility of CA-MSSA isolates from Kyungnam Province, Korea. 항균제 내성균주수 감수성균주수 내성률 Vancomycin 0 10 0% Teicoplanin 0 10 0% Ciprofloxacin 0 10 0% Trimethoprim/sulfamethoxazole 0 10 0% Chloramphenicol 0 10 0% Rifampin 0 10 0% Imipenem 0 10 0% Clindamycin 1 9 10% Erytnromycin 1 9 10% Gentamicin 1 9 10% Tetracycline 2 8 20% Tobramycin 3 7 30% Ampicillin 10 0 100% 항균제내성양상 조사한 13 가지항균제중에서 Ap 한종의항균제에내성을나타낸균주부터 6 종의항균제에내성을 나타낸균주가있었으며, Ap 내성형이 6 주로가장흔한내성형이었다. Table 7. Multiplicity of antimicrobial resistance in CA-MSSA isolates.. Multiplicity of resistance Resistance pattern Number of isolates 1 Ap 6 2 ApTb 2 3 ApTbTc 1 6 ApGmTbTcClEm 1 CA-MRSA 균과 CA-MSSA 균의항균제감수성비교 CA-MRSA 균주에비해 CA-MSSA 균주가내성양상이단순하고내성률도낮았다. 다. CA-MRSA 균주에서의 clindamycin 내성의조사 표현형에의한내성정도 24 주의 CA-MRSA 균주중에서 erythromycin 내성은 21 주, clindamycin 내성은 11 주로나타났다. D-test 및내성유전자증폭에의한 clindamycin 내성의검사 조사한균주중 clindamycin 과 erythromycin 에모두내성을나타내는 11 주는 erma 유전자를가지고 - 22 -
있었으며, clindamycin 에감수성이고 erythromycin 에내성인균주는 ermc 유전자를보유하고있었 다. ermc 유전자를가진 11 주를대상으로 D-test 를실시한결과이들균주모두에서 D-test 양성으 로나타나 clindamycin 내성이 erythromycin 에의해유도됨을알수있었다. Figure 1. Double-disk diffusion test (D-test) demonstrating induction of resistance to clindamycin by erythromycin. The D-shaped inhibition zone is produced by a blunting of the zone of inhibition around the clindamycin disk. 4. CA-MRSA 균의세균학적특성조사가. 병원성조사 Panton-Valentine-Leukocidin (PVL) 유전자조사한모든 CA-MRSA 균주및 CA-MSSA 균주에서음성으로나타났다. Exfoliative toxin A, B 유전자검색 10명의 SSSS 환자에서분리된균주 9주에서 exfoliative B 독소가검출되었으며, exfoliative A 독소는검출되지않았다. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figure 2. Detection of exfoliative toxin B by PCR. Lane 1, negative control; lane 2, positive control; lane 3-9, CA-MRSA isolates. - 23 -
나. CA-MRSA 균주의 genotyping Table 8. Genotypic characteristics of 24 CA-MRSA isolates. CC ST spa type SCCmec PFGE type No. of isolates 5 5 TJMGMK (t062) IV A 1 TJMBMDMGMK (t002) II-5 B 1 72 72 UJGGMDMGM (t664) IVa (8), IV var (1) C 9 UJGGMDMGGM (t324) IVa (3) C 3 89 89 Y2EJCMBPB (t375) II-5 D 10 Multilocus sequncing typing 24주의균주를대상으로 MLST를실행한결과 ST5 균주가 2주, ST72 균주가 12주, ST89 균주가 10주로나타났다. 이들균주들을 clonal complex로 grouping하면 ST89는 CC89, ST72는 CC72, ST5 는 CC5로묶여 24주의균주는 3 type의 CC와 3 type의 ST로분류되었다. spa typing ST89 의균주는모두동일한 spa type(t375) 을가지고있었으나, ST5 와 ST72 의균주는각각 2 type 의 spa 구조를가지고있었다. SCCmec typing 24주의 CA-MRSA 균주의 SCCmec type을조사한결과 SCCmec type IV, IVa, IV variant가 13주로가장많았고, II variant(ii-5) 균주가 11주있었다. SCCmec type은각각의 ST에따라서명확하게구분이되었다. SCCmec type II-5 균주 10주는모두 SSSS 환자에서분리된균주였으며, 모두 CC89에속하는균주이었다. 또한 ST72의균주는모두 IVa와 IN variant에속하는 SCCmec type을가지고있었다. 이러한결과는다른나라에서처럼 SCCmec type IV를보유하는균주와는큰차이가나타나는결과이었다. SCCmec type IV와 IVa 균주 13주에서 oxacillin MIC는 64와 128 μg/ml인균주가 12주로나타났고, SCCmec type II-5 균주의 oxacillin MIC는 8-256 μg/ml로다양하게나타났다. - 24 -
Table 9. Distribution of SCCmec type in CA-MRSA isolates. SCCmec type 균주수 진단명 II-5 11 4S(10), otitis media(1) IV variant 1 Impetigo(1) IV 1 Impetigo(1) IVA 11 vaginitis(2), otitis media(2), pneumonia(1), GIT(1), impetigo (1), abscess(4) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Figure 3. SCCmec typing of CA-MRSA isolates. Lane 1, negative control; lane 2, positive control; lane 3-9, CA-MRSA isolates. Lane 1-3, SCCmec type II; Lane 4-5, SCCmec type II variant (II-1); Lane 6, 7, 8, 10, SCCmec type II variant; Lane 9, SCCmec type II variant (II-5); Lane 11-13, SCCmec type III; Lane 14-15, SCCmec type IIIA; Lane 16, SCCmec type III variant (III-1); Lane 17-18, SCCmec type II variant (II-7); Lane 19-20, SCCmec type IVA. PFGE CA-MRSA 균주 22 주를대상으로 PFGE 를실시한결과 ST 에따라서 PFGE pattern 도명확하게구 분되었다. ST5 ST72 ST89 Figure 4. PFGE of SmaI-digested genomic DNA of 22 CA-MRSA isolates. - 25 -
5. CA-MRSA 균감염의종합적특성 경남지역에서분리한 CA-MRSA 균주 24주를대상으로임상감염의특징및세균학적특성을종합해보면 2 predominant CA-MRSA clone에의해대부분의 CA-MRSA 감염이일어남을알수있었다. 특히임상적특징도각각의 clone에따라명확하게구분되었다. 즉, ST89에속하는균주는어린이에서 SSSS를유발하며, ST72와 ST5 균주는피부감염부터폐렴까지다양한인상양상을나타내었다. ST72와 ST5에속하는균주는국내병원감염에서도분리되는균주로이들균들이지역사회감염에서도발견된다는것은이들균주의유래는본연구에서규명하지못하였지만병원에서지역사회, 또는지역사회에서병원으로의 MRSA 균주가전파되는추정할수있었다. 국내일차병원또는이차병원에서지역사회황색포도알균감염이의심되면항균제감수성검사결과가나오기전까지는경험적으로 clindamycin으로감염을치료하는것이일반적이지만, 본연구에서는 24주의균주중 21주가 constitutive 또는 inducible로 clindamycin에내성을나타내므로이러한 clindamycin 경험적치료에문제가있음을알수있었다. 본연구결과에서는 CA-MSSA 균주뿐만 아니라 CA-MRSA 균주모두에감수성을나타내는 trimethoprim/sulfamethoxazole(co-trimoxazole) 이값싸고경구로투여할수있는장점을가지고있으므로 CA-MRSA 치료제로의사용가능성을 확인하였다. 본연구는경남남부지역에서분리된 CA-MRSA 균주만을대상으로하였고, 균주의분리지역또한특정지역에편중되어있으므로연구결과가우리나라전체의 CA-MRSA 감염을대표할수는없을것으로판단되므로국내에서의 CA-MRSA 균감염의실태조사와확산을방지할수있는대책을마련하기위해서는국내전체를대표할수있는 large prospective study가꼭필요한것으로생각된다. - 26 -
제 4 장 연구개발목표달성도및대외기여도 제 1 절. 연구개발목표달성도 연구개발목표 경남지역에서발생한지역사회획득황색포도알균감염증을대상으로 CA-MRSA 감염증의발생양상조사 CA-MRSA 균주의분자역학적연관성및병원성유전자조사 CA-MRSA 감염증의임상적특성조사 1. 균주수집 경남지역내 7 개지역으로부터 162 주의균주를수집하여 24 주의 CA-MRSA 균주와 10 주의 CA-MSSA 균주를확보하였음. 2. 임상데이터분석 CA-MRSA 및 CA-MSSA 균이분리된환자의임상데이터를후향적으로분석하여임상적특성을파악하여세균학적특성과연관지어분석하였음. CA-MRSA와 CA-MSSA 균감염의감염부위, 감염환자의연령및성별차이, 위험인자등을분석하였음. 3. 항균제감수성검사 CA-MRSA 균주와 CA-MSSA 균주의항균제감수성검사를 CLSI 기준에의거하여우무평판희석법에의하여검사하였고, CA-MRSA 균과 CA-MSSA 균의항균제감수성을분석하였음. Clindamycin의 inducible 내성을조사하였음. 4. 병원성인자분석 PVL 유전자와 exfoliative toxin A 와 B 를 PCR 로검색하였음. 5. 세균학적특성조사 SCCmec typing: CA-MRSA 균주의 SCCmec typing은모두실시하여분석하였음. PFGE: 24주의 CA-MRSA 균주의 PFGE는모두시행하였음. MLST 및 spa typing: 24주의 CA-MRSA 균주의 MLST를완료하였음. - 27 -
제 2절. 대외기여도 1. 대외기술발전에의기여도 국내에서특정지역을대상으로한 CA-MRSA 감염에대한첫보고서로향후국내에서의 CA-MRSA 감염연구의기초자료제공. 국내에서분리된 CA-MRSA 균의임상적특성을규명하여외국에서의 CA-MRSA 감염과는여러 가지차이가있음을규명. 국내에서는 2 predominant CA-MRSA clone 이존재함을증명하였고, 특정클론 (ST89, ST90) 이황 색포도알균피부열상증후군을일으킴을규명하였음. 지역사회획득황색포도알균감염에서 MRSA 에의한감염의빈도를규명하여향후 CA-MRSA 감 염의진단과치료제선택시유용한자료로활용될수있음. - 28 -
제 5 장 연구결과의활용성과및계획 제 1 절계량적성과 학술발표 1 회 (2006 년기초의학학술대회 ) 에초록을접수하였으며, 본연구보고서의마지막에학회지 (Journal of clinical microbiology) 에게재하기위한원고를첨부하였음. 제 2 절성과내용기술 대외기술발전에의기여도에기술하였음. 제 3 절활용계획 1. 국내 CA-MRSA 감염현황파악에기초자료로활용 2. 국내 CA-MRSA와국외 CA-MRSA 균주의비교자료로활용 3. 국내 CA-MRSA 감염의확산을예방하기위한정책수립에기초자료로활용 4. 국내일차의원에서는 CA-MRSA의진단과항균제감수성검사가불가능하므로연구자료를근거로 CA-MRSA 감염의경험적항생제치료에기초자료로활용 - 29 -
제 6 장 기타사항 제 1 절변경사항 최초연구조원이진종숙과차화윤으로되어있었으나, 차화윤이 2005년 10월퇴사하여최철희로변경되었고, 2006년 1월부터는전담연구원인이지영이입사하여진종숙을다시이지영으로교체하였음. 연구조원변경사항 차화윤 --> 최철희 (2005 년 10 월 ) 진종숙 --> 이지영 (2006 년 1 월 ) 제 2 절추가지원 추가지원은필요치않으나, 연구기간이끝난뒤에연구비의 50% 가입금되므로연구진행에많은어려움이있으므로연구자의입장에서는먼저연구자가개인적인경비를지출하여야하므로불합리한조항을변경하여줄것을요청함. - 30 -
제 7 장 참고문헌 1. Aires de Sousa M, Bartzavali C, Spiliopoulou I, Santos Sanches I, Crisstomo MI, de Lencastre H. Two international methicillin-resistantstaphylococcus aureus clones endemic in a university hospital in Patras, Greece. J Clin Microbiol 2003; 41:2027-32. 2. Aires de Sousa M, Crisstomo MI, Santos Sanches I, et al. Frequent recovery of a single clonal type of methicillin-resistantstaphylococcus aureus from patients in two hospitals in Taiwan and China. J Clin Microbiol 2003; 41:159-63. 3. Aires de Sousa M, de Lencastre H, Santos Sanches I, Kikuchi K, Totsuka K, Tomasz A. Similarity of antibiotic resistance patterns and molecular typing properties of methicillin-resistantstaphylococcus aureus isolates widely spread in hospitals in New York city and in a hospital in Tokyo, Japan. Microb Drug Resist 20006:253-8. 4. Chen CJ, Huang YC: Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Taiwan. J Microbiol Immunol Infect 2005; 38(6):376-82. 5. Chung M, Dickinson G, de Lencastre H, Tomasz A. International clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in two hospitals in Miami, Florida. J Clin Microbiol 2004; 42:542-7. 6. Cosgrove SE, Sakoulas G, Perencevich EN, Schwaber MJ, Karchmer AW, Carmeli Y. Comparison of mortality associated with methicillin-resistantand methicillin-susceptible Staphylococcus aureus bacteremia: A meta-analysis. Clin Infect Dis 2003; 36:53-9. 7. Crisstomo MI, Westh H, Tomasz A, Chung M, Oliviera DC, de Lencastre H. The evolution of methicillin resistance in Staphylococcus aureus: similarity of genetic backgrounds in historically early methicillin-susceptible and resistant isolates and contemporary epidemic clones. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:9865-70. 8. de Lencastre H, Severina EP, Milch H, Thege MK, Tomasz A. Wide geographic distribution of a unique methicillin-resistant Staphylococcus aureus clone in Hungarian hospitals. Clin Microbiol Infect 1997 3:289-96. 9. Enright MC, Day NP, Davies CE, Peacock SJ, Spratt BG. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2000 38:1008-15. 10. Enright MC, Robinson DA, Randle G, Feli EJ, Grundmann H, Spratt BG. The evolutionary history of methicillin-resistantstaphylococcus aureus (MRSA). Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:7687-92. 11. Feli EJ, Li BC, Aanensen DM, Hanage WP, Spratt BG. eburst: inferring patterns of evolutionary descent among clusters of related bacterial genotypes from multilocus sequence typing data. J Bacteriol 2004; 186:1518-30. 12. Harbarth S, Francois P, Shrenzel J, Fankhauser-Rodriguez C, Hugonnet S, Koessler T, Huyghe A, Pittet D: Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Switzerland. - 31 -
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