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The Korean Journal of Microbiology (2010) Vol. 46, No. 3, pp. 303-307 Copyright c 2010, The Microbiological Society of Korea 단보 국내에서분리된 Acinetobacter baumannii 의 Integron 과연관된다제내성분석 김성환 최지혜 박은진 서인원 손승렬 * 단국대학교첨단과학대학미생물학과및기초과학연구소 Analysis of Integron-Associated Multi-Drug Resistance of Acinetobacter baumannii Isolated in Korea Seong Hwan Kim, Ji Hye Choi, Eun Jin Park, In Won Suh, and Seung-Yeol Son * Department of Microbiology and Institute of Basic Sciences, Dankook University, Cheonan 330-714, Republic of Korea (Received July 30, 2010/Accepted September 16, 2010) Acinetobacter baumannii 1625, a clinical isolate identified by Vitek and 16S rdna sequence, showed an extended resistance to most β-lactams including imipenem, kanamycin, gentamicin, tobramycin, and cephalosporins of the third and fourth generations, and produced metallo-β-lactamase (MBL) of IMP-1 type which is rare in Korea. The isolate contained a class 1 integron of about 2.5 kb in size and the integron included acca4 (aminoglycoside resistance gene), bla IMP-1 (carbapenem resistance gene), and bla OXA-2 (extended-spectrum β-lactam resistance gene) gene cassettes in order. The coexistence of IMP-1 type and OXA-2 type β-lactamase gene cassettes in an integron has not been reported in Korea. The transformed integron rendered the transformant resistant more than eight folds against imipenem, ampicilin, piperacillin, cefazolin, cefoperazone, and aztreonam comparing to the reference strain. This study clearly showed that the extended multi-drug resistance of 1625 was mainly due to the integron. Keywords:, carbapenem-resistance, integron, MBL Acinetobacter는토양및물등의자연계에서분리되는호기성포도당비발효, 그람음성구간균으로운동성은없으며, 건강한사람의피부에정상상재세균으로존재한다. 대부분의 Acinetobacter 균종은환경미생물이지만, 인체나동물감염의경우 ( 유전종 2), A. genospecies 3, 및 A. genospecies 13TU (Tjenberhg and Ursing) 균종이대부분을차지하며, 특히 에의한감염이대부분을차지하고유전종 3, 및유전종 13TU에의한감염도점차증가하고있다 (1). Acinetobacter로인하여야기되는감염의중요한문제점은다양한항생제에대한내성발생이다. Acinetobacter의 carbapenem 내성기전에는항균제의막투과성감소나유출, 그리고다양한 β-lactamase에의한내성등이있는데, 이들에의한 carbapenem 내성은대부분유도에의하거나미약하며, 다른균으로의전파가능성이적다. 이들의내성기전보다중요한것은 carbapenemase에의한 carbapenem의불활성화이다. 최근 carbapenem 항균제의사용이증가되면서 Pseudomonas * For correspondence. E-mail: syson@dankook.ac.kr; Tel: +82-41-550-3455; Fax: +82-41-550-3409 aeruginosa,, Serratia marcescens 및 Enterobacter cloacae 등의 carbapenemase 생성균들이증가하고있어이들에대한감염증의치료와내성연구의중요성이부각되고있다 (13). Carbapenem을분해하는 carbapenemase에는 Class A, B, D 등이있으나, 이중에서 carbapenem을가장잘분해하는것은 class B이며효소의활성을위해 zinc와같은 metal 이온이필요하기때문에 metallo-β-lactamase (MBL) 로명명되었다 (16). MBL 유전자는대부분 IMP형 (bla IMP) 과 VIM형 (bla VIM) family 로나뉘는데아시아, 유럽, 북아메리카, 남아메리카를포함하여전세계적으로보고되고있으며, 브라질의 Sao Paulo에서는 SPM-1형 (17) 이보고되었다. 이중 bla IMP-1 유전자는 1991년일본에서 P. aeruginosa로부터처음분리되었으며, 주로일본, 아시아및유럽에서분리되고있다 (18). bla VIM-1 type은이태리 Verona에서처음분리되었으며, 이어서프랑스에서 VIM-2형이분리되었다 (6, 15). VIM형의 MBL은 IMP형과약 30% 정도아미노산유사성을보이며, IMP형과같이 aztreonam을제외한모든 β-lactam 항균제를가수분해할수있다 (14). 국내에

304 Kim et al. Table 1. Antibiotic resistance of 1625 by disk diffusion method Antibiotics (μg/ml) 1625 ATCC 19606 ATCC 25922 Zone diameter R I S Ampicillin (10) a 0 0 0 13 14-16 17 Kanamycin (30) a 0 0 0 13 14-17 18 Piperacillin-tazobactam (100/10) 19 23 25 17 18-20 21 Gentamycin (10) 0 17 20 12 13-14 15 Tobramycin (10) 0 17 15 12 13-14 15 Imipenem (10) 10 22 23 13 14-15 16 Aztreonam (30) a 9 23 26 15 16-21 22 Ceftazidime (30) 8 20 23 14 15-17 18 Cefepime (30) 0 26 27 14 15-17 18 Cefotaxime (30) 0 26 30 14 15-22 23 Cefoperazone (75) a 0 18 26 15 16-20 21 Ciprofloxacin (5) 0 23 30 15 16-20 21 a Interpretive standards for Acinetobacter spp. were not available in CLSI guideline, and the interpretive standards for Enterobacteriaceae in NCCLS (2007) are used instead. Abbreviations: R, resistant; I, intermediate; S, susceptible. 서는 1995년 MBL을생성하는 P. aeruginosa와 P. putida 다수를분리하여그것이프랑스에서보고된 VIM-2형과염기서열이같음을보고하였으며 (8), 이어 에서도 VIM-2 형이검출되었다 (19). MBL의유전자는일반적으로 integron내에 cassette 형식으로삽입되어존재한다고알려져있고, 이는 carbapenem 항균제를가장잘분해하기때문에내성기전에서매우중요하다 (2). Integron은 Tn21 family에속하는이동성 DNA element로서 tyrosine recombinase에속하는 intergrase (inti) 를발현시켜 gene cassette를획득하며, 이들을발현시키는 promoter를 5 CS (Conserved Sequence) 에가지고있다. Integron은 inti의염기서열에의해분류되며지금까지 10종류의 integron이알려져있다. 이중 5가지 integron만내성유전자와연관되어있으며 (4), 임상에서분리되는균주는대부분 class 1 integron을가지고있다. 대부분의 bla IMP 유전자와 bla VIM 유전자는 class 1 integron에존재하며드물게 class 3 integron에존재하는예가보고되기도하였다 (2). Martinez-Frejio 등 (10) 은 9개국에서분리된균주에서 integron을검사하였는데, integron을갖고있지않은균주보다 integron을갖고있는균주들이서로다른항균제에대한내성이많았다고보고하였다. Integron은스스로이동 (transposition) 할수없으며, 대부분 transposon에위치한다. 만약이 transpson이전달성 plasmid에존재한다면내성유전자가 genome과 genome 사이에서쉽게이동할수있으며, MBL을포함한내성유전자확산의중요한제공자역할을할것이다. 기회감염성세균인 에의한감염증치료에는대부분의항생제내성균들이분비하는 β-lactamase에안정한 carbapenem 계열 (imipenem, meropenem 등 ) 의항생제들이사용되고있는데, 최근이계열의항생제에내성을지니는 A. baumannii 균들이증가하고있어치료가어려워지고있으며 이에따른내성연구의중요성이부각되고있다 (3). 국내외에서항생제내성과관련된 integron들이보고된경우는많이있으나, carbapenem 내성을나타내는 균의 integron 에관한보고는소수에불과하다. 그리하여본연구는새로운내성증가에관여되는요소가무엇인지알아보고자 2005년말국내임상검체에서새로이분리되어 MBL을생성하는것으로보이는균주를동정한후, 항생제내성양상을파악하고, 보유내성유전자및내성유전자형을조사하고자하였으며, 또한내성에관련된 integron의유무와구조를파악하고이해하고자하였다. 2005년말국내대학병원의환자검체 ( 농 ) 에서분리된균주로서, Vitek system 및디스크확산법에서 imipenem에내성인균주가선별되었다. 실험대상균주는 Vitek test 결과 A. baumannii 임을확인하였고, 또한 16S rdna 염기서열분석으로 임을다시확인할수있었다 ( 자료미제시 ). 이실험균주를 1625로명명하고디스크확산법 (11) 으로항균제감수성검사를시행한결과사용한항생제에대하여모두내성임을확인하였고, 미량액체배지희석법 (microbroth dilution method) 에의한최소억제농도 (MIC) 측정 (12) 결과도그결과를뒷받침해주었다. Imipenem과 meropenem에대한 MIC도각각 64 μg/ml와 64 μg/ml 이상을나타내어 MBL 생성균주로간주할수있었고, penicillin 계열은물론, 그외제 3세대및제 4세대 cephalosporin 계열항균제와 aminoglycoside 계열항균제에도모두내성이며, monobactam 계열에도내성임을확인하였다 (Tables 1 and 2). Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) 에의해 1625가생산하는 MBL의활성억제효과를알아보고자 imipenem-edta double disk synergy test (7) 를시행하였다. MBL은효소의활성을위해 zinc 이온을필요로하며, EDTA 에의해 zinc 이온이제거되기때문에 EDTA disk 주위의 A.

의 integron 305 Table 2. Minimal inhibitory concentrations (MICs) of β-lacatams and aminoglycosides against 1625, DH5α transformant and DH5α reference strain Antibiotics 1625 MIC (μg/ml) transfomant DH5α Ampicillin >128 >128 2 Imipenem 64 1 0.06 meropenem >64 0.125 0.06 Piperacillin >256 >256 0.5 Cefazolin >128 128 - Cefotaxime >64 0.125 0.06 Cefoperazone >64 >64 - Aztreonam >64 2 0.125 1 2 3 4 M 6 7 8 9 baumannii 1625는 imipenem에대해감수성을나타내게된다. Imipenem disk가단독으로있을때에는억제대의직경이약 10 mm 정도였으나, 실험결과 imipenem disk와 EDTA disk 사이에서상승효과에의한억제대의확장현상이관찰되었으며, 이는 1625의 β-lactamase는활성에금속이온이필요한 MBL임을확인할수있었다 ( 자료미제시 ). 국내에서 imipenem 내성을일으키는유전자로밝혀진 IMP-1형과 VIM-2형유전자를알아보고자, 각각에특이적인 primer들을사용하여 PCR을시행한결과, 1625 는 VIM-2 특이적인 primer에의해서는증폭되지않았으나, IMP-1 특이적인 primer에의해서는 plasmid DNA를주형으로사용하였을때, 약 500 bp의크기의증폭산물이관찰되었으며 (Fig. 1), 이염기서열은기존에보고된 bla IMP-1 의염기서열과일치하였다. 순수하게분리및정제된 1625의 plasmid DNA를주형으로하여 5 CS와 3 CS primer로약 2.5 kb의 integron을증폭하였으며, 이 integron을주형으로사용하였을때에도 bla IMP-1 유전자가증폭되었다 (Fig. 1). 이 integron의염기서열을분석한결과, 길이가총 2,552 bp인 integron으로서 3 개의항생제내성유전자 cassette들이존재하였고, 5 CS와 3 CS도확인되었다. 5 CS에서재결합부위인 atti1 존재를확인하였고, NCBI [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/] 의 Database와비교한결과 class 1 integron 임을알수있었다. 3개의 gene cassette는각유전자사이마다 gene cassette 특유의 59-be (base element) 가존재하고있었으며, core site와 inverse core site 역시존재하는것을알수있었다. 이는기존에보고된 A. baumannii에서발견된 integron들과비교했을때크기는비슷하지만내성유전자의분포와구조에서차이를보였다 (Fig. 2). Integron의첫번째유전자 cassette는 acca4 유전자로 aminoglycoside-6 -N-acetyltransferase를생성하여 aminoglycoside의 6번째아미노그룹을가수분해하며, aminoglycoside 변형효소중가장광범위한내성을보인다. 이 gene cassette는 5 CS 윗부분에있는 intergrase 바로다음에위치하였으므로 promotor에의해강하게발현되었을것으로생각된다. 실제로 A. Fig. 1. Amplification of bla IMP-1 and bla VIM-2 genes in 1625 and transformants. Lanes 1 and 6 : Total DNA of 1625 was used as a template. Lanes 2 and 7 : Plasmid DNA of 1625 was used as a template. Lanes 3 and 8 : Amplified integron DNA of 1625 was used as a template. Lanes 4 and 9 : Plasmid DNA of a transformant was used as a template. Lane M : DNA size marker. bla IMP-1 gene specific primers were used in lanes 1-4 and bla VIM-2 gene specific primers were used in lanes 6-9. baumannii 1625는 kanamycin은물론항균제감수성검사시사용되었던 gentamicin, tobramycin에내성을보였는데 (Table 1), 이유전자에의해감수성이저하된것으로보인다. 두번째위치한 bla IMP-1 gene은 MBL을생성하는유전자로한국에서많이분리되는 VIM-2형과는달리잘발견되지않았으나, 2002 년에 Yum 등 (19) 이국내에서 IMP-1형을가진 를보고하였다. 이연구에서밝혀진 bla IMP-1 유전자의염기서열은 Yum 등 (19) 이보고한유전자의염기서열과 98% 일치하였다. 이유전자가생산하는 MBL은 cabapenem계열인 imipenem 에내성을갖도록하는주요요인이며, 실험결과에서도내성을나타내었다 (Table 1). 마지막에위치하는 bla OXA-2 유전자는 extended spectrum β-lactamase의한종류인 oxacillinase를암호화하고있다. 이효소가과형성되면 aztreonam, cefotaxime 등에내성을나타낼수있다. 항균제감수성검사시사용했던 cefazolin, cefotaxime, cefoperazone 등에내성을보여준것으로보아이유전자에의해감수성이저하된것으로생각된다. 이 integron은유전자 cassette가 3개이므로 gene cassette들이많이삽입되어있는다른 integron보다는유전자모두가잘발현될것으로사료되며, 앞서시행한항균제감수성시험결과처럼다제내성을나타내는것이 integron의분석과일치함을

306 Kim et al. (A) 1625 (2.5 kb) (this study) (B) P17 (3.1 kb) (Kraniotaki et al., 2006) (C) AB394 (2.5 kb) (Liu et al., 2006) Fig. 2. Comparison of structures of integrons found in 1625 and other. Coding sequences are indicated by block arrows with corresponding names, and transcriptional orientations. Black filled arrows indicate the position and direction of primers 5'CS and 3'CS used for amplification. 알수있다. 또한후에시행한 transformants의 MIC 실험에서도대조균주보다대부분의항생제에서내성이증가한것으로보아 cloning된 integron내의내성유전자 casseette의발현이이루어진것으로볼수있다. MIC실험에사용한항균제중내성이없는 DH5α보다 8배이상증가한항목이 imipenem, ampicilin, piperacillin, cefazolin, cefoperazone, aztreonam인것은이 integron내의 gene cassette들의영향인것으로사료된다 (Table 2). 특히 IMP-1형의 MBL은 aztreonam을가수분해하지못하나, integron내에함께연결된 OXA-2형 β -lactamase에의해 carbapenem계열의항생제에모두내성을보인것으로생각되며, 동시에존재하는경우광범위한다제내성을보여줌을확인할수있었다. 1625는 integron이가진 3종류의내성유전자 cassette에의해다양한종류와넒은범위의항생제에내성을보이는것으로본연구에서확인하였다. 이전에보고된연구들과비교했을때, IMP-1형과 OXA-2형 β-lactamase가동시에존재하는 는국내에서보고된바없었고, 이균주가분리된이후에도 carbapenemase를생산하는 가더욱확산되고있으며, 내성유전자의종류도다양해지고있다. 만약 1625의 integron이전달성 plasmid에위치하였다면 conjugation에의해항생제내성유전자들은쉽게다른병원균들로전파될수있을것이므로이에대한많은연구가필요하다고판단된다. 적요임상분리균주인 1625는 imipenem (carbapenem 계열 ) 을포함한대부분의 β-lactam계열의항생제들과 kanamycin, gentamicin, tobramycin 및제 3세대와 4세대 cephalosporin 계열의항생제들에광범위한내성을나타내었고, 한국에서는드문 IMP-1형 metallo-β-lactamase (MBL) 를생성하는균주임이확인되었다. 1625는약 2.5 kb 크기의 class 1 integron을갖고있었으며, 이 integron내에 aminoglycoside계열내성유전자인 acca4, carbapenem 계열내성유전자인 bla IMP-1, 광범위한 β-lactam 내성유전자인 bla OXA-2 유전자 cassette들이차례대로위치해있음을확인하였는데, 이것은 IMP-1형과 OXA-2형 β-lactamase의유전자를같은 integron내에동시에갖는새로운배열및구조로서이전에국내에서보고된바없는것이다. 이 2.5 kb 크기의 integron을항생제내성이없는 에형질전환시켰을때, imipenem, ampicillin, piperacillin, cefazolin, cefoperazone, aztreonam 등의항생제들에대하여 8배이상증가된내성정도를보였다. 이는 1625의 integron이다제내성을부여하는기능을하고있음을보여준다. 참고문헌 1. Bergogne-Bé rézin, E. and K.J. Towner. 1996. Acinetobacter spp. as nsocomial pathogens : microbiolgical, clinical, and epidemiological features. Clin. Microbiol. Rev. 9, 148-165. 2. Collis, C.M., M.J. Kim, S.R. Partridge, H.W. Stokes, and R.M. Hall. 2002. Characterization of the class 3 integron and the sitespecific recombination system it determines. J. Bacteriol. 184, 3017-3026. 3. Corbella, X., A. Montero, M. Pujol, M.A. Domiguez, J. Ayats, and M.J. Argerich. 2000. Emergence and rapid spread of carbapenem resistance during a large and sustained hospital outbreak of multiresistant Acinetobater baumannii. J. Clin. Microbiol. 38, 4086-4095. 4. Correia, M., F. Boavida, F. Grosso, M.J. Salgad, L.M. Lito, J.M., Cristino, S. Mendo, and A. Duarte. 2003. Molecular characterization of a new class 3 integron in Klebsiella pneumoniae.

의 integron 307 Antimicrob. Agents Chemother. 47, 2838-2843. 5. Kraniotaki, E., R. Manganelli, E. Platsouka, A. Grossato, O. Paniara, and G. Palù. 2006. Molecular investigation of an outbreak of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii, with characterisation of class 1 integrons. J. Antimicrob. Agents. 28, 193-199. 6. Lauretti, L., M.I. Ricco, A. Mazzriol, G. Cornaglia, G. Amicosante, R. Fontana, and M. Rossolini. 1999. Cloning and characterization of bla VIM, a new intergron-borne metallo-β -lactamase gene form a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate. Antibicrob. Agents Chemother. 43, 1584-1590. 7. Lee, K., Y. Chong, H.B. Shin, Y.A. Kim, D. Yong, and J.H. Yum. 2001. Modified hodge and EDTA-disk synergy tests to screen metallo-β-lactamase-producing strains of Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter species. Clin. Microbiol. Infect. 7, 88-102. 8. Lee, K., J.B. Lim, J.H. Yum, D. Yong, Y. Chong, J.M. Kim, and D.M. Livermore. 2002. bla VIM-2 cassette containing novel integrons in metallo-β-lactamase-preoducing Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas putida isolates disseminated in a Korean hospital. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1053-1058. 9. Liu, S.Y., J.Y. Lin, C. Chu, L.H. Su, T.Y. Lin, and C.H. Chiu. 2006. Integron-associated imipenem resistance in Acinetobacter baumannii isolated from a regional hospital in Taiwan. J. Antimicrob. Agents Chemother. 27, 81-84. 10. Martinez-Freijo, P., A.C. Fluit, F.J. Schmitz, V.S.C. Grek, J. Verhouf, and N.E. Jones. 1998. Class 1 integrons in Gramnegative isolates from different European hospitals and association with decreased susceptibility to multiple antibiotic compounds. J. Antimicrob. Chemother. 42, 689-696. 11. National Committee for Clinical laboratory Standards. 1998. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 6th informational supplement. Pennsylvania: NCCLS, 1998:M100-S6. 12. National Committee for Clinical laboratory Standards. 2000. Method for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically-5th editions: approved standard. Wayne: NCCLS, 2000;M7-A5. 13. Nemec, A., L. Janda, O. Melter, and L. Dijkshoorn. 1999. Genotypic similarity of multiresistant Acinetobacter baumannii isolates in the Czech Republic. J. Med. Microbiol. 48, 287-296. 14. Nordamann, P. and L. Poirel. 2002. Emerging carbapenemases in Gram-negative aerobes. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 8, 321-331. 15. Poirel, L., T. Nass, D. Nicolas, L. Collet, S. Bellais, J.D. Cavallo, and P. Nordmann. 2000. Characterization of VIM-2, a carbapenem-hydrolyzing metallo-β-lactamase and its plasmid and integron-bone gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate in France. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 891-897. 16. Rasmussen, B.A., Y. Gluzman, and E.P. Tally. 1990. Cloning and sequencing of the class B β-lactamase gene(ccra) from Bacteroides fragilis TAL3636. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 1590-1592. 17. Toleman, M.A., A.M. Simm, T.A. Murphy, A.C. Gales, D.J. Biedenbach, R.N. Jones, and T.R. Walsh. 2002. Molecular Characterization of SPM-1, a novel metallo-β-lactamase isolated in Latin America: report from the SENTRY antimicrobial program. J. Antimicrob. Chemother. 50, 673-679. 18. Watanabe, N., S. Iyobe, M. Inoue, and S. Nitsuhashi. 1991. Transferable imipenem resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 35, 147-151. 19. Yum, J.H., K. Yi, H. Lee, D. Yong, K. Lee, J.M. Lim, G.M. Rossolini, and Y. Chong. 2002. Molecular characterization of metallo-β-lactamase-producing Acinetobacter baumannii and Acinetobater genospecies 3 from Korea; identification of two new integrons carrying the bla VIM-2 gene cassettes. J. Antimicrob. Chemother. 49, 837-840.