Code RR180A - 연구용 - Bacterial 16S rdna PCR Kit 사용설명서 v201011da
미생물분류는형태적특징, 생리 생화학적성질과상태, 화학분류학적성질과상태등을이용하여구분하는것이일반적이지만, 이와같은방법을이용하면많은시간을필요로한다. 또한분류가힘든경우나, 정확하지못한결과를얻는경우도있다. 최근미생물분류에도분자생물학적인방법을이용하여, 미생물이가지고있는 DNA를분석하는방법이이용되고있다. 그타겟의하나로유전자의길이가비교적길고, 기능변화에따른유전자변이의가능성이낮은 rdna영역이이용되고있다. 이제품에는세균의 16S rdna영역내의특정부분 ( 약 1.5 kb) 을증폭하기위한시약및 PCR에의해얻은증폭산물의서열을분석하기위한 primer(sequencing용 ) 가포함되어있다. 16S rdna 영역을증폭하기위한 PCR 효소로는 TaKaRa Ex Taq HS를사용하고있으므로, mispriming이나 primer dimer등의비특이적증폭을막을수있다. 이제품을사용해얻은증폭산물을이용하여, kit내에포함되어있는 sequencing용 primer로염기서열분석을실시하여데이터베이스상의배열과의상동검색을하여세균을분류한다. 주의 : 본제품은세균의종류에따라서적합하지않는경우가있습니다. 진균류분석에는 Fungal rdna(d1/d2) PCR Kit(Code RR181A) 를이용하십시요. I. 제품구성품 (25 μl PCR 반응시 50 회 ) 1) Premix Ex Taq HS (2 conc.) *1 2 625 μl 2) 16S rdna Primer Mix (bacterial) *2 10 125 μl 3) dh 2 O 650 μl 4) Positive Control (E. coli DNA) 1 ng/ μl 25 μl 5) Sequencing Primer F1 (bacterial) *2 7.5 pmol/ μl 50 μl 6) Sequencing Primer F2 (bacterial) 7.5 pmol/ μl 50 μl 7) Sequencing Primer R1 (bacterial) *2 7.5 pmol/ μl 50 μl 8) Sequencing Primer R2 (bacterial) 7.5 pmol/ μl 50 μl * 1 :TaKaRa Ex Taq HS, reaction Buffer, dntp mixture를포함 *2 : 16S rdna Primer Mix (bacteria) 에포함되어있는 primer는 Sequencing Primer F1 (bacterial) 및 Sequencing Primer R1 (bacterial) 과같다. Sequencing Primer의위치는아래그림을참조. 그림. 증폭산물과 Sequencing primer 의위치
II. 보존 -20 Premix Ex Taq HS는동결과융해를반복하면활성이저하되므로주의해주세요. 녹일때는심하게 vortexing하지않도록권장하며, 녹인후에는 inverting하여골고루섞어주세요. III. 본제품이외에필요한주요한시약및기기 1) 유전자증폭시스템 (authorized instruments) TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient/Standard(Code TP600/TP650) TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice mini(code TP100) 2) PCR tube 0.2 ml Hi-Tube Dome Cap(Code NJ200) 등 3) 전기영동장치 Mupid-2 plus(code AD110) Mupid-exU(Code AD140) Mupid-One(Code AD160) 4) Agarose gel Agarose L03 TAKARA (Code 5003) NuSieve 3:1 Agarose(Code 50091) 등 5) DNA staining GelStar Nucleic Acid Stain(Code 50535), SYBR Green I(Code 50512/50513), Ethidium Bromide 주 ) GelStar, SYBR Green I 를사용할경우전용필터가필요할수도있습니다. 6) Microcentrifuge 7) Micropipette, tip (autoclave 처리한것 )
IV. 실험과정 IV-1. DNA 샘플조제분류를위한균체샘플은 colony 혹은 colony를배양한배양액을사용한다. 균체혼합물을사용할경우 PCR 증폭시복수의증폭산물이생성될수있기때문에, 염기서열분석을통해정확한정보를얻을수없다. 복수의균체혼합물의경우, cloning을하여복수의클론으로염기서열분석을해야한다. 세균의경우, 아래조제방법을추천한다. IV-1-1. 열추출에의한조제 로 PCR 에사용할수 있는 DNA 샘플을얻을수없는경우에는 IV-1-2 방법을사용한다. IV-1-1. 열추출에의한조제 1. Colony에서 DNA를조제할경우, 멸균증류수 100 μl를 microtube에넣어 colony에서채취한균체를현탁한다. 배양액의경우에는배양액 50 μl를 microtube에넣어, 원심분리하여상청액을제거한후, 균체에멸균증류수 100 μl를첨가해균체현탁액을만든다. 2. 1. 의현탁액을 95 에서 15분간열처리한다. 3. 가볍게원심분리하여, 상청을샘플 DNA용액으로사용한다. IV-1-2. 알칼리열추출에의한조제 1. Colony에서 DNA를조제할경우, 멸균증류수 50 μl를 microtube에넣어 colony에서채취한균체를현탁한다. 배양액의경우에는배양액 50 μl를 microtube에넣어, 원심분리하여상청액을제거한후, 균체에멸균증류수 50 μl를첨가해균체현탁액을만든다. 2. 1. 의현탁액에 100 mm NaOH 를 50μl넣어혼합후, 95 에서 15분간열처리한다. 3. 1 M Tris-HCl(pH7.0) 을 11 μl를첨가하여혼합한다. 4. 가볍게원심분리하여, 상청을샘플 DNA용액으로사용한다. IV-2. 16s rdna 영역증폭 (1) 아래반응액을준비한다. 약 1회반응 Premix Ex Taq HS (2 ) 12.5 μl 16S rdna Primer Mix (bacterial)(10x) 2.5 μl샘플 DNA 용액 1~2.5 μl *1 dh 2 O X μl *2 25 μl * 1 : 샘플 DNA용액이외의 component로먼저 premix로반응액을만들어, 0.2 ml tube에분주한후넣는다. 샘플 DNA용액의조제법에따라서 PCR을저해할가능성이있다. 그경우, 사용한샘플의 DNA용액량을줄이기위해멸균수로희석하여사용하는등, 검토가
필요한경우도있다. * 2 : 사용하는샘플 DNA 용액의양에따라최종반응용량이 25 μl가되도록함. 반응후전기영동및정제후얻은증폭산물양이염기서열분석에부족하다고판단할 경우, 반응액을늘려서반응한다. (2) 조제한반응액을 0.2 ml 튜브에분주한다. (3) 샘플 DNA용액을첨가해 Thermal Cycler에세팅한다. 필요에따라서, Negative Control로샘플 DNA용액대신멸균수를첨가한반응과 Positive Control로 Positive Control(E. coli DNA) 를 1 μl첨가한것을별도로준비한다.. (4) 이하의조건으로 PCR 를실시한다. 94 1 min 94 30 sec 55 30 sec 30 cycles *3 72 1 min 72 3 min * 3 :PCR 증폭산물을늘리기위해서 cycle 수를늘리는것도가능하지만, negative Control 의 background가나타날확률이있다. 반응종료후, 분석하기전까지보관할경우 -20 에보존한다. IV-3. 증폭산물확인반응종료후, 반응액일부를 agarose gel에전기영동한다 (1% agarose gel 등 ). Positive Control 및샘플 DNA용액을이용했을경우, 약 1.5 kb( ~ 약 1.7 kb) 의증폭산물을얻을수있고, negative Control에서는증폭산물이없는것을확인한다. M 1 2 3 M 1 : Negative Control 2 : 샘플 DNA 용액 3 : Positive Control 4 : phy Marker 1 % agarose
IV-4. DNA 증폭산물정제증폭산물을전기영동으로확인한후, 염기서열분석을위해 PCR 반응액을정제해야한다. 약 1.5 kb(~ 약 1.7 kb) 의단일밴드를얻을수있었을경우, PCR Purification Kit를사용하여정제한다. 약 1.5 kb(~ 약 1.7 kb) 이외의비특이적밴드가합성되었을경우에는전기영동후, agarose gel에서목적단편을회수해정제한다 (Gel Extraction Kit사용 ). 정제후, A260의흡광도를측정하여정제한증폭산물를정량한다. IV-5. DNA 증폭산물의염기서열분석정제한증폭산물의염기서열을분석한다. Sequencing용 primer는 4 종류가있으며, 제품구성품 에있는각 primer의위치를확인하고적합한 primer를선택하여사용한다. <Sequencing Primer의선택> 단일해석 Sequencing Primer F1과 Sequencing Primer R1, 2종류의 primer로증폭산물전체의염기서열을분석하는것은가능하지만, 가운데부분의정확도가약간떨어질수도있다. 위 2 종류와 Sequencing Primer F2 혹은 Sequencing Primer R2 둘중의하나를더하여 3 종류의 primer를사용하면, 보다정확도가높은결과를얻을수있다. 중복해석 Sequencing Primer F1, Sequencing Primer F2, Sequencing Primer R1, Sequencing Primer R2, 4 종류의 primer를사용한다. 정확도가높은염기서열을얻을수있다. IV-6. 염기서열정보분석분석하여얻은염기서열정보를데이터베이스상의배열과상동성검색하여, 세균의종류를유추한다. <참고정보> BLAST 검색은 BLAST 알고리즘을실행하는프로그램을다운로드하여이용한다. NCBI BLAST:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 또, NCBI 나 DDBJ의인터넷상에서도사용할수있다. NCBI:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ DDBJ:http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html V. Troubleshooting PCR 산물이확인되지않는다. Protocol에따라서증폭을실시했으나, 충분한증폭량을얻지못했다 DNA 조제에사용하는균체량을늘려주세요. 다른 DNA 샘플조제방법을시험해보세요. PCR 반응이저해되었다. 조제한 DNA 샘플을희석해사용해주세요.
대상미생물이진균류이다. 진균류증폭전용제품 (Fungal rdna (D1/D2) PCR Kit) 를사용해주세요. VI. 관련제품 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient/Standard(Code TP600/TP650) TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice mini(code TP100) 0.2 ml Hi-Tube Dome Cap(Code NJ200) Fungal rdna (D1/D2) PCR Kit(Code RR181A) VII. 주의 본제품은연구용시약입니다. 사람, 동물등에대한의료, 임상진단에는사용할수없습니다. 식품, 화장품, 가정용품등으로도사용하지말아주세요. 다카라바이오의승인없이제품의재판매, 양도및재판매, 양도등을위한제품변형및상용물품제조에사용할수없습니다.