( ).fm

Korean J. Food Sci. Ani. Resour. Vol. 29, No. 5, pp. 619~626(2009) 성인으로부터분리된 Lactobacillus casei CU2604 의우유배지에서의생장특성및생리적특성 김희진 1 최재경 1 이경민 임중현 엄석진 김근배 * 중앙대학교동물자원과학과 Growth Characteristics and Physiological Properties in Milk of Lactobacillus casei CU2604 Isolated from Adult Feces Hee Jin Kim 1, Jae Kyoung Choi 1, Kyung Min Lee, Jung Hyun Im, Seok Jin Eom, and Geun-Bae Kim* Department of Animal Science and Technology, Chung-Ang University, Ansung 456-756, Korea Abstract As a trial for the development of a new starter culture for yogurt products, more than two hundred lactic acid bacteria strains were isolated from raw milk and healthy human feces. The strains that showed excellent growth and acid production ability in the 10% skim milk media were selected and identified as Lactobacillus casei through the API carbohydrate fermentation pattern and 16S rdna sequence analysis. L. casei CU2604 was further investigated for its physiological characteristics as a starter culture compared with a commercial strain. The CU2604 strain showed good acid production and growth characteristics in milk, which were comparable to those of the L. casei Shirota strain. Despite the fact that both these strains displayed the same sugar fermenting pattern and PFGE band pattern, and had similar growth characteristic in milk, L. casei CU2604 exhibited different fatty acid composition in the cell wall, showed more tolerance to bile and to ph, and presented better growth inhibition activity against pathogenic bacteria. Based on these results, the L. casei CU2604 strain holds great promise for use as a novel and efficient starter culture in the production of yogurt. Additional studies on the probiotic characteristics of this strain are currently being conducted. Key words: Lactobacillus casei, yogurt starter, probiotics, PFGE, fatty acid composition 서 많은소화관질환이장점막기능의변화와연관이있고 probiotic 유산균은장내균총의안정화를위한새로운기능성식품인것이밝혀지면서 (Marteau et al., 1993; Salminen et al., 1996; Sanders, 1995) probiotic 유산균이함유된발효유제품이주는건강에유익한효과에대한관심이증가하고있다. Probiotics란장내미생물균형을유지시킴으로써숙주에게이로운작용을하는살아있는미생물을의미하며 (Fuller, 1989), 충분한양을섭취할경우면역-염증반응의억제 (Cebra, 1999), 항암작용 (Fuller and Gibson, 1997), 장내균 1 These authors are equally contributed in this work. *Corresponding author : Geun-Bae Kim, Department of Animal Science and Technology, Chung-Ang University, Ansung 456-756, Korea. Tel: 82-31-670-3027, Fax: 82-31-676-5986, E- mail: kimgeun@cau.ac.kr 론 총의안정화, 유당불내증경감, 콜레스테롤수치감소등과같은수요자에게유익한효과를제공한다고보고되었다 (Heenan et al., 2004; Sanders, 1993; Schaafsma, 1996a,b). 효과적인 probiotics는장관을통과하며위산과담즙산에견뎌야하고, 장관내에부착력이있어야하며 (Mishra and Prasad, 2005), 내열성이뛰어나고증식이빨라야한다 (Park et al., 1996). Probiotics로사용되고있는미생물로는 Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus가연구되었는데 (Gilliland, 1979) Latobacilli의섭취는인체의병원성균에대한저항성을증가시키며, 이는 probiotic의선택적인증가로인해병원성균에대한경쟁력이증가하는것과면역조절효과가있는것으로보고되었다 (Havenaar and Spanhaak, 1994). 또한, lactobacilli의섭취는 macrophages와 lymphocytes, natural killer cells를증가시키고 γ-interferon의생산과 IgA 분비를증가시킨다고보고되었다 (Kaila et al., 1992; Perdigon et al., 1990). 619

620 Korean J. Food Sci. Ani. Resour., Vol. 29, No. 5 (2009) Lactobacillus casei strain은유럽과아시아등지에서발효유제품을생산하는데널리이용되고있으며, 특히 Lactobacillus casei Shirota(Yakult Ltd., Japan) 와 Lactobacillus casei DN114001(Danone, France) 는발효유제품 Yakult 와 Actimel 에이용되는대표적인 probiotic 균주이다 (Saxelin, 2005). L. casei strain은많은연구결과 rotavirus를비롯한바이러스성설사에효과적이고방광암의재발을감소시키며면역조절작용이있는것으로밝혀졌다 (Aso et al., 1995; Nagao et al., 2000; Sugita and Togawa, 1994). 발효유제조에이용되는 starter에대한국내연구는생리활성물질인 GABA 생성, ACE 억제능, CLA생성등 lactic acid bacteria(lab) 에대한다양한이로운효과들을확인하여 (Lim et al., 2008, Lim et al., 2009, Park et al., 2008) probiotics에대한자체개발이점차적으로진행되어지는추세이다. 이에본연구는건강한성인분변으로부터발효유제조에사용가능한 Lactobacillus 균주를분리및동정하고, 상업적으로이용되는균주와비교하여종균제의국내개발에발판을마련하기위하여실시하였다. 재료및방법 되도록첨가하였다. 37 o C에서 24시간및 48시간동안배양한후각각의당이용성을비교하였다. 49가지탄소원에대하여미생물증식에의한색의변화여부를관찰하여각탄소원의이용여부를관찰하였고최종동정결과는동정용프로그램 API web을이용하여해석하였다. 16s rdna sequencing을통한분자생물학적동정 MRS agar 배지에자란 colony를채취하여 PCR tube에 Lyse-N-Go PCR reagent(pierce, USA) 를 5 µl 넣고 Genomic DNA를추출한후, 25 µl의 HotStarTaq Master mix(qiagen, Germany) 와, 각각 1µL씩의 primer, 18 µl의 distilled water 를첨가한후 PCR program을실시하였다. MRS agar에서 48시간배양한균주를 template로이용하였고, primer는 universal primer 27F와 1492R을사용하였다. PCR product 는 PCR purification kit(qiagen, Germany) 을이용하여정제하였다. 정제과정을통해얻어진 DNA를 Nano Drop (Nanophotometer, Implen, Germany) 을이용하여농도를측정한후에 25-50 µl로최종적농도를맞춘후 double strand DNA sequencing(macrozen, Korea) 을실시하였다. 얻어진 sequence는 BLAST로검색하여 strain을동정하였다. 균주의선발건강한성인의분변을수거하여혐기희석액 (KH 2 PO 4 4.5 g/l Na 2 HPO 4 6.0 g/l, L-Cystein HCl 0.5 g/l, Tween 80 0.5 g/l) 으로희석한시료를 Rogosa SL agar(difco, USA) 에 0.1 ml씩평판도말법으로접종한후 37 o C에서 48시간배양하였다. 형성된균의집락을 0.05% L-Cystein HCl이함유된 MRS배지 (Difco, USA) 에순수분리하여젖산균으로추정되는집락을 streaking하여호기적배양을하였다. 순수분리된균주를그람염색과현미경관찰을통하여그람양성간균을선발하고 10% skim milk(difco, USA) 에서 24시간배양후커드형성능력이있는균주를선발한후, 10% skim milk에서 2차계대배양을하면서커드형성능력과산생성능력이뛰어난균주를최종선발하였다. 선발된균주의동정 API kit 를이용한생화학적동정 선발된균주의발효특성을알아보기위하여 API 50 CHL Carbohydrate Test Kit(bioMerieux Co., France) 를이용하였다. MRS 액체배지에 2회계대배양한후원심분리 (10,000 g, 10 min, 4 o C) 를한후상등액을버리고, 균체만모아 5 ml의 50 mm sodium phosphate buffer(spb, ph 6.5) 로 2회세척한후, 동일한 buffer를이용하여 Mcfarland Standard 4 이상의탁도를맞추어접종용균주로사용하였다. API 50 CHL medium(5 ml) 에균주배양액 1.5 ml를넣은후, 각 strip에 100 µl씩분주하고 strip에 mineral oil로중층이 담즙내성 Gilliland와 Walker(1990) 의방법에의하여 0.05% L- Cystein HCl이함유된 MRS 액체배지에 0.3% oxgall을첨가하여 2차계대가끝난균주들을 0.5% 접종하였고, 대조군으로는 0.3% oxgall을첨가하지않은 MRS 액체배지에동량을접종하여 3반복실험을수행하였다. OD 620 값을측정하기위하여배양액과시료를 4:1로희석하여측정하였으며, 호기적인조건으로 37 o C water bath에서배양하여 12시간후에 OD 620 값을측정하였다. 내산성 Hyronimus 등 (2000) 의방법에따라 0.05% L-Cystein HCl 이함유된 MRS 액체배지에 3.0 M hydrochloric acid로 ph 3.0을맞추어제조한후, overnight 배양시킨균주를 1% 접종하였다. 대조군인초기균수를측정하기위하여 phosphate buffer(0.1 M, ph 6.2) 로희석한후 pouring하여 37 o C에서 48시간배양하고, 균주를접종한용액을 37 o C water bath 에서 3시간동안정치배양한후위와동일한방법으로희석하여배양하였다. 그리고배양후에나타난집락수를계수함으로써산성 ph에대한내성을측정하였다. 항균력분리한유산균을 MRS 액체배지에서배양하고, 병원성균인 Escherichia coli O157:H7 ATCC 43888, Listeria monocytogenes KCTC 3710, Salmonella Typhimurium ATCC 43174을 tryptic soy broth(tsb) 에서각각배양한

L. casei CU2604 as a Yogurt Starter 621 후, 200 ml MRS 액체배지속에분리된균주 10 7 CFU/mL 와병원성균 10 6 CFU/mL를 MRS 액체배지에혼합접종하고병원성균만을단독접종한다음 37 o C water bath 에서 9시간동안배양하였다. 배양후, 각각의배양액을병원성균에대한선택배지, 즉 E. coli O157:H7은 Eosin Methylene Blue agar(difco, USA), L. monocytogenes 는 Oxford Medium Base(Difco, USA), S. Typhimurium은 Xylose Lysine Desoxycholate agar(difco, USA) 에 100 µl 씩평판도말법으로접종하였다. 37 o C에서 24시간동안배양하여집락수를계수하고, 혼합배양한것과단독배양한것을비교하였다. 환원탈지유에서젖산균의생장특성성인분변에서분리된 L. casei CU2604와한국야쿠르트 에서분양받은 L. casei YIT 9029의생균수, ph, 산도를측정하여비교실험하였다. 생균수는 MRS 액체배지에 2차계대배양한뒤 10% skim milk에 2% glucose 를첨가한 20 ml 용액에젖산균을 200 µl 접종한후 37 o C에서 4시간간격으로 36시간까지배양하면서측정하였다. 배양한각시료를 0.1% peptone용액에희석하여 MRS agar를이용하여 pouring한후 37 o C에서 48시간배양하여계수하였다. ph는배양한시료를 ph meter기 (M530P, Nova Analytics Crop., USA) 를이용하여측정하였고, 오염방지를위하여균주마다각각 9개 (0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 30, 36 h) 의 tube에균주를접종하여 4시간간격으로측정하였다. Rapid pulsed field gel electrophoresis(pfge) 를이용한동정 Rapid PFGE methods는 Briczinski와 Roberts(2006) 방법에의하여실시하였다. 시험균주를 MRS 액체배지에 overnight으로배양한후 2mL을취하여원심분리 (14000 g, 4 o C, 10 min) 하여 cell pellet을회수하였다. 2 ml의 100 mm Tris, 100 mm EDTA(pH 7.6) 로 1회세척후 600 µl의동일한 buffer를이용하여현탁시키고 160 µl를새로운 tube 에옮겼다. 40 µl의 lysozyme(100 mg/ml) 과 10 µl의 proteinase K(20 mg/ml) 을첨가한후같은양 (volume) 의 0.1% SDS가함유된 1.6% agarose와섞어 re-usable plug mold(bio-rad Laboratories, USA) 에분주하였다. Lysis를위하여 plug를 2mL의 lysozyme(4 mg/ml) 과 mutanolysin (200 units/ml) 이함유된 0.5 M EDTA, 1% sarkosyl buffer (ph 9.0) 에 55 o C, 90분간배양하였다. 그후 proteinase K (0.5 mg/ml) 가함유된 fresh sarkosyl buffer에 55 o C, 60분간배양하였다. 50 o C로예열된멸균증류수를이용하여 50 o C에서 15분간세척한후, 50 o C로예열된 10 mm Tris, 1 mm EDTA buffer(ph 7.6) 를이용하여 50 o C, 15분간 75 rpm으로진탕배양하며 buffer를 3번교체하며세척하 였다. Lysis가끝난 plug는 comb size에맞게절단후 200 µl의 restriction digest mixture(50 units의 Sfi I 또는 NotI) 을이용하여 37 o C에서 18시간처리하였다. 전기영동은 0.5 TBE buffer(45 mm Tris, 45 mm boric acid, 1 mm EDTA, ph 8.0) 를이용하여 1% 의 agarose gel 을이용하여수행하였다. Rambda ladder(bio-rad Laboratories, USA) 를 molecular size marker로이용하였다. CHEF DR-III(Bio-rad Laboratories, USA) 를이용하여 switch times을 1.0 sec에서 20.0 sec로 6V/cm, 14 o C에서 18시간동안전기영동하였다. 전기영동이끝난 gel은 ethidium bromide(0.4 mg/l; Promega, USA) 을이용하여 1시간염색후, 증류수로 2시간탈색하여 UV trans-illuminator를이용하여 band pattern 을관찰하였다. 지방산조성분리균주의세포벽지방산조성은 Miller(1982) 의방법에따라수행하였다. 배양한 cell 약 40 mg을 Screw cap tube에옮긴후, 50% methanol에 15% NaOH를첨가한용액 1mL을넣고 100 o C에서 30분간가열하여실온에서냉각하였다. 여기에 methanolic-hcl 2 ml(6.0 N HCl 325 ml 과 methanol 275 ml 혼합용액 ) 을첨가하여 80 o C에서 10 분간가열한뒤급냉한후 1.25 ml의 hexane/methyl-tertbutylether(1:1, v/v) 을넣고 10분간잘섞어주었다. 실온에정치한후반응액이 2개의층으로분리되면하등액만을제거하고 3mL의 dilute NaOH(10.8 g NaOH/900 ml D.W) 를첨가하여 10분간잘섞어준후실온에정치하여상등액의 2/3정도를 screw-capped sample vial(12 32 mm, Agilent technologies) 로옮겨 capping하여지방산분석용시료로사용하였다. 준비된시료의분석에는 Agilent technologies 6890 Gas chromatography가이용되었으며 separation column은 A30 m 0.320 mm 0.25 µm Crosslinked Methyl siloxane column (HP-1) 을사용하였다. 분석된 profile은 Sherlock MIS Software를이용하였으며 standard calibration 용액과의비교에의해 peak의동정, retention time, peak의면적, 면적비율을구하였다. 통계처리통계처리는 SAS(SAS, USA, 1996) 프로그램을사용하여 Duncan의다중검정을통하여유의성검정 (p<0.05) 을실시하였다. 결과및고찰 Lactobacillus 균주의분리및선발건강한성인의분변으로부터분리한균주로서선택배지

622 Korean J. Food Sci. Ani. Resour., Vol. 29, No. 5 (2009) 에서의성장, 그람양성, 현미경하에서간균인총 204개의 sample 중에서 10% skim milk에서 24시간배양후커드형성여부에따라 19개를선발하였고, 2차계대하여 48시간후에커드형성여부를통해 6개를선발하였으며, 이중 ph를측정하여산생성능력이우수한 3개의균주 CU2604, CU3204, LC8과원유에서분리한 L. casei MCL 그리고한국야쿠르트 중앙연구소에서분양받은 L. casei YIT 9029를실험에이용하였다. 선발된균주의당발효패턴과 16S rdna sequencing API kit를이용하여선발된균주 3개와원유로부터분리한 L. casei MCL, L. casei YIT 9029의당이용성확인결과, ribose, galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, mannitol, sorbitol, N acetyl glucosamine, esculin, maltose, lactose, saccharose, trehalose, D-turanose, D-tagatose, gluconate는모든균주들이이용하는능력이있었으며, adonitol, L-sorbose, amygdalin, arbutin, salicin, cellobiose, iunin, melezitose, gentiobiose, D-lyxose, L-arabitol에대해서는균주별로다른패턴을나타내는것을확인할수있었다 (Table 1). 이를동정용프로그램 API web에입력한결과, 선발된 3개의균주모두 Lactobacillus casei로판명되었다. 이중, L. casei YIT 9029와같은당발효패턴을보인 CU2604를 universal primer인 27F와 1492R을이용하여 16S rrna 유전자부분을증폭하여 DNA sequencing (Macrogen, Korea) 을실시하였다. CU2604의염기서열 (Fig. 1) 을 BLAST search한결과, L. casei(i.d.99%) 로동정되어 L. casei CU2604로명명하였다. Table 1. Carbohydrate fermentation of the 5 strains of Lactobacillus casei on API 50 CHL kit Carbohydrate substrate Result 9029 CU2604 CU3204 LC8 MCL Adonitol + + - - - Sorbose + + + + - Amygdalin + + - + + Arbutin + + - + + Salicin + + - + + Cellobiose + + - + + Iunin - - - + + Melezitose - - + + + Gentiobiose + + - + + D-Lyxose - - - + - L-Arabitol - - - + - 9029 : Lactobacillus paracasei ssp paracasei 1 99.9%, 2604 : Lactobacillus paracasei ssp paracasei 1 99.9%, 3204 : Lactobacillus paracasei ssp paracasei 1 98.8%, LC8 : Lactobacillus paracasei ssp paracasei 1 99.9%, MCL : Lactobacillus paracasei ssp paracasei 1 99.3% Lactobacillus casei의담즙내성담즙에대한 L. casei 다섯균주의내성결과는 Fig. 2에서보는바와같이모두담즙내성을보였으나, 균주간에차이가있었다. 0.3% oxgall을첨가한액체배지에서 12시간후의 OD 620 값을각각의초기균수와비교하였을때 L. casei YIT 9029보다 L. casei CU2604, L. casei LC8, L. casei MCL의생존율이더우수한것으로나타났다. 성공적인 probiotics로서균주가갖추어야할특성인담즙내성, 내산성이있음으로써장내에서도살아남아장내균총을유익한방향으로향상시킨다는결과가보고된바있으며 (Mishra and Prasad, 2005), 이는분리한균주들의 probiotic Fig. 1. 16S rrna gene sequences of L. casei CU2604.

L. casei CU2604 as a Yogurt Starter 623 Fig. 2. Survival rates of five Lactobacillus casei strains after 12 h in MRS broth containing 0.3% oxgall. a~c Means with different superscript are significantly differ at p< 0.05. 적용에대한잠재성을확인할수있었다. Lactobacillus casei의내산성산에대한 L. casei의내성은 Fig. 3에서보는바와같이모두높은 ph 내성을가지고있는것으로확인되었다. ph 3.0의조건에서 3시간정치배양한후, 87.84% 의생존율을보인 L. casei YIT 9029의균주와비교했을때 L. casei CU2604는 89.51% 로비교균주들중가장높은생존율을보였다. LAB에대한내산성실험은과거에도많은연구가진행되었으며, 대부분 ph 3.0에서높은생존율을나타내는결과를확인할수있었다 (Cho et al., 2007; Lim et al., 2008). Martini 등 (1987) 은음식또는유제품과함께소화될때위의 ph를 3.0이나그이상으로높여주기때문에 ph 3.0에서의생존율은중요하다고발표한바있다. L. casei CU2604의항균력 L. casei CU2604이병원성균주에대하여어느정도억제능력이있는지측정, 비교하기위해혼합배양을실시 Fig. 3. Survival rates of five Lactobacillus casei strains after 3 h in MRS broth (ph 3.0). a~b Means with different superscript are significantly differ at p<0.05. 한결과는 Table 2와같다. 본실험에앞서병원성균주와 L. casei의초기균수를측정하였으며, 각각의균주마다자라는속도가다르게나타난병원성균주들은최종적으로약 10 6 CFU/mL의농도에맞추어실험을수행하였고, L. casei는약 10 7 CFU/mL을맞추어실행하였다. Control 은병원성균주들을 MRS 액체배지에서단독배양하였을때의증식균수이며, L. casei CU2604와혼합배양하였을때의균수와비교하여병원성균주들의성장억제비율을조사하였다. 또한 L. casei YIT 9029와혼합배양한것과항균력을비교하였는데 L. casei CU2604는 E. coli O157:H7에대해 86.89%, S. Typhimurium에대해 85%, L. monocytogenes에대해서 82.50% 의항균력을보였고 L. casei YIT 9029와비슷한항균력을보였으며, 두균주모두병원성균에대한우수한항균력을보였다. 배양후 ph 의변화를보면 L. casei CU2604와혼합배양한것은 ph 4.62-4.65이고, L. casei YIT 9029와혼합배양한것은 ph 4.59-4.64이며, 대조구인병원성균만단독배양한것은 ph 5.54-6.01이었는데이는혼합배양과정중에 L. casei CU2604 와 L. casei YIT 9029이생성하는젖산에의해병원성균주의증식억제효과가있는것으로사료된다. Table 2. Growth competition of pathogens with L. casei CU2604 and L. casei YIT 9029 in MRS broth after 9 h incubation at 37 o C Pathogens Growth Competitors Control 1) L. casei YIT9029 2) +Pathogens L. casei CU2604 3) +Pathogens Inhibition rates (%) CFU/mL ph CFU/mL ph CFU/mL ph YIT 9029 CU2604 Escherichia coli 2.9 10 7 5.54 3.3 10 6 4.64 3.8 10 6 4.64 88.62 86.89 Salmonella Typhimurium 3.0 10 7 6.00 4.5 10 6 4.59 4.5 10 6 4.62 85.00 85.00 Listeria monocytogenes 1.2 10 7 6.01 1.1 10 6 4.62 2.1 10 6 4.65 90.83 82.50 1) Initial count of pathogens : 1.0 10 6 CFU/mL 2) Initial count of L. casei YIT 9029 : 1.0 10 7 CFU/mL 3) Initial count of L. casei CU2604 : 2.1 10 7 CFU/mL

624 Korean J. Food Sci. Ani. Resour., Vol. 29, No. 5 (2009) Fig. 4. The change of ph and titratable acidity of 10% reconstituted skim milk supplemented with 2% glucose during bacterial growth at 37 o C. Fig. 5. Bacterial growth in 10% reconstituted skim milk supplemented with 2% glucose at 37 o C. 우유배지에서의생장능력비교성인분변으로부터분리된 L. casei CU2604와 L. casei YIT 9029의생균수, ph, 산도를측정하여비교실험한결과 Fig. 4에서보는바와같이 L. casei CU2604의 ph 변화는 L. casei YIT 9029와비슷한양상을보였다. 16시간이후에 L. casei YIT 9029의 ph가급격히감소하였으나최종 ph는 L. casei CU2604가더낮았으며, 발효유의최적 ph조건인 ph 4.3에도달하는데 24시간이상의시간이소요되는결과를얻을수있었다. Fig. 5는생균수의변화를나타낸것으로 ph 변화와같이 L. casei CU2604의생균수는 L. casei YIT 9029와같은양상을보였고, 12-20 시간에 L. casei YIT 9029의균수가급격히증가하나 36 시간배양후살펴보면 L. casei YIT 9029보다 L. casei CU2604의생균수가더많음을알수있다. 두균주는 4-8시간대에대수기를나타내었다. Rapid pulsed field gel electrophoresis(pfge) 를이용한동정각시료로부터분리하여당발효패턴과 16S rrna gene seqeuncing 결과 L. casei로동정된균주들의 strain 간의차이를보기위해 SfiI, NotI으로 digestion한후 PFGE한결과는 Fig. 6과같다. 분리균주중 L. casei CU2604는 L. casei YIT 9029와같은패턴을보이는것이관찰되었고 L. casei CU3204와 L. casei LC8, L. casei MCL은서로다른 PFGE 패턴을보이는것을관찰하였다. Lactobacillus에대한연구결과 PFGE는 strain간의구분을위한가장효과적인방법이라고보고되었다 (Bjorkroth et al., 1996; Ferrero et al., 1996; Roussel et al., 1993). 일반적인방법으로는시간과비용이많이든다는단점이있 Fig. 6. PFGE patterns of genomic DNA of Lactobacillus strains after digestion by SfiI (1 to 5) and NotI (6 to 10). Lane M, rambda ladder; lane 1, Lactobacillus casei YIT 9029; lane 2, L. casei CU2604; lane 3, L. casei CU3204; lane 4, L. casei LC8; lane 5,L. casei MCL; lane 6, L. casei YIT 9029; lane 7, L. casei CU2604; lane 8, L. casei CU3204; lane 9, L. casei LC8; lane 10, L. casei MCL. 으나, 본연구에서는 Briczinski와 Roberts(2006) 가발표한 rapid method를이용함으로써그단점을보완하였다. L. casei CU2604 의지방산조성두균주의세포벽지방산조성을살펴보면, L. casei YIT

L. casei CU2604 as a Yogurt Starter 625 Table 3. Cellular fatty acid composition of L. casei YIT 9029 and L. casei CU2604 Fatty acids L. casei YIT 9029 L. casei CU2604 C12:0 - * 00.65 C14:0 02.63 01.52 C16:1 w7c/15 iso 2OH 06.12 - C15:0 iso 2OH/16:1w7c 04.39 - C16:0 06.63 08.67 C15:0 3OH 04.27 - C18:1 w9c 33.88 54.52 C18:1 w7c 12.03 02.55 C18:0 03.04 04.74 C19:0 iso 00.98 - C19:0 cyclo w10c/19w6 26.03 27.36 * Not detected. 9029의경우 C12:0가존재하지않고 C18:1 w9c가 33.88% 로가장많은비율을차지하고있으며 C19:0 cyclo w10c/ 19w6와 C18:1 w7c와함께대부분을이루고있다 (Table 3). 반면에 L. casei CU2604는 C12:0가미량으로존재하고 C18:1 w9c가 54.52% 로 L. casei YIT 9029보다많은비율을차지하고있다. 또 L. casei YIT 9029에는존재하는 C16:1 w7c/15 iso 2OH와 C15:0 iso 2OH/16:1w7c, C15:0 3OH는존재하지않는것이확인되었고, 이에 L. casei CU2604는 L. casei YIT 9029와다른균주임을알수있었다. 요 이연구는성인분변으로부터발효유제조에이용되는 probiotic로서의우수한능력을지닌균주를선발하는데목적을두었으며선택배지에서의성장, 그람양성, 현미경관찰을통해서간균인총 204개의 sample 중에서 10% skim milk에서 24시간배양후커드형성여부에따라 19 개를선발하였고, 2차계대하여 48시간후에커드형성여부를통해 6개를선발하였다. 그중에서산생성능력이우수한균주를 3개선발하여원유로부터분리한 L. casei MCL과 L. casei YIT 9029의특성을비교하였다. 선발된균주는그람양성이고, 간균이며, 당발효실험과 16S rdna 분석결과 Lactobacillus casei로판명되어 L. casei CU2604, L. casei CU3204, L. casei LC8로명명하였다. 이중 L. casei YIT 9029과동일한당발효패턴을보인 L. casei CU2604는 ph 변화와생균수의변화가 L. casei YIT 9029와비슷한양상을보이고 PFGE 패턴이같았다. 그러나세포벽지방산조성분석결과를통하여 L. casei YIT 9029와는다른균주임을알수있었으며, 담즙내성, ph내성은더우수한결과를보였고, 또한 L. casei CU2604는병원성균에대하여우수한생육억제능력을나타내었다. 이러한결과를토대로 L. casei CU2604는상업용균주에 약 못지않은스타터로서의특징을가지고있는것으로판단되며, 이균주의 probiotics 특성에대한추가적인연구가진행중에있다. 감사의글 이논문은 2007년도중앙대학교연구장학기금지원에의한것임. 참고문헌 1. Aso, Y., Akaza H., Kotake T., Tsukamoto T., Imai K., and Naito S. (1995) Preventive effect of a Lactobacillus casei preparation on the recurrence of superficial bladder cancer in a double-blind trial. Eur. J. Urol. 27, 104-109. 2. Bjorkroth, J., Ridell, J., and Korkeala H. (1996) Characterization of Lactobacillus sake strains associating with production of ropy slime by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) patterns. Int. J. Food Microbiol. 31, 59-68. 3. Briczinski, E. P. and Roberts, R. F. (2006) A rapid pulsedfield gel electrophoresis method for analysis of Bifidobacteria. J. Dairy Sci. 89, 2424-2427. 4. Cebra, J. J. (1999) Influences of microbiota on intestinal immune system development. Am. J. Clin. Nutr. 69, 1046-1051. 5. Cho, J. K., Li, G. H., Cho, S. J., Yoon, Y. C., Hwang, S. G., Heo, K. C., and Choe, I. S. (2007) The identification and physiological properties of Lactobacillus plantarum JK-01 isolated from Kimchi. Kor. J. Food Sci. Ani. Resour. 27, 363-370. 6. Ferrero, M., Cesena, C., Morelli, L., Scolari, G., and Vescovo, M. (1996) Molecular characterization of Lactobacillus casei strains. FEMS Mirobiol. Lett. 140, 215-219 7. Fuller, R. (1989) Probiotic in man and animals. A review. J. Appl. Bacteriol. 66, 365-378. 8. Fuller, R. and Gibson, G. R. (1997) Modification of the intestinal flora using probiotics and prebiotics. Scandi. J. Gastroenterol. 32 (Suppl. 222), 28-31. 9. Gilliland, S. E. (1979) Beneficial interrelationships between certain microorganisms and humans: candidate microorganisms for use as dietary adjuncts. J. Food Prot. 42, 164-167. 10. Gilliland, S. E. and Walker, D. K. (1990) Factors to consider when selecting a culture of Lactobacillus acidophilus as a dietary adjunct to produce a hypocholesterolemic effect in humans. J. Dairy Sci. 73, 905-911. 11. Havenaar, R. and Spanhaak, S. (1994) Probiotics from an immunological point of view. Curr. Opin. Biotechnol. 5, 320-325. 12. Heenan, C. M., Adams, M. C., Hosken, R. W., and Fleet, G. H. (2004) Survival and sensory acceptability of probiotic microorganisms in a nonfermented frozen vegetarian dessert. Lebensmittel Wissenschaft und technol. 37, 461-466. 13. Hyronimus, B., Le Marrec, C., Sassi, H., and Deschamps, A.

626 Korean J. Food Sci. Ani. Resour., Vol. 29, No. 5 (2009) (2000) Acid and bile tolerance of spore-forming lactic acid bacteria. Int. J. Food. Microbiol. 61, 193-197. 14. Kaila, M., Isolauri, E., Soppi, E., Virtanen, E., Laine, S., and Arvilommi, H. (1992) Enhancement of the circulating antibody secreting cell response in human diarrhoea by a human Lactobacillus strain. Pediatr. Res. 32, 141-144. 15. Lim, S. D., Kim, K. S., and Do, J. R. (2008) Physiological characteristics and ACE inhibitory activity of Lactobacillus zeae RMK354 isolated from raw milk. Kor. J. Food Sci. Ani. Resour. 28, 587-595. 16. Lim, S. D., Kim, K. S., and Do, J. R. (2009) Physiological characteristics and GABA production of Lactobacillus acidophilus RMK567 isolated from raw milk. Kor. J. Food Sci. Ani. Resour. 29, 15-23. 17. Marteau, P., Pochart, P., Bouhnik, Y., and Rambaud, J. C. (1993) The fate and effect of transiting nonpathogenic microorganisms in the human intestine. In Intestinal Flora, Immunity, Nutrition and Health, ed. AP Simopoulos, T Corning and A Rérat. World Rev. Nutr. Diet. 74, 1-21. 18. Martini, M. C., Bolweg, G. L., Levitt, M. D., and Savaiano, D. A. (1987) Lactose digestion by yoghurt β-galactosidase : Influence of ph and microbial cell integrity. Am. J. Clin. Nutr. 45, 432-437. 19. Miller, L. T. (1982) Single derivatization method for routine analysis of bacterial whole-cell fatty acid methyl esters, including hydroxy acid. J. Clin. Microbiol. 18, 861-867. 20. Mishra, V. and Prasad, D. N. (2005) Application of in vitro methods for selection of Lactobacillus casei strains as potential probiotics. Int. J. Food. Microbiol. 103, 109-115. 21. Nagao, F., Nakayama, M., Muto, T., and Okumura, K. (2000) Effects of a fermented milk drink containing Lactobacillus casei strain Shirota on the immune system in healthy human subjects. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 2706-2708. 22. Park, J. G., Song, W. H., Hong, S. M., and Kim, C. H. (2008) Production of conjugated linoleic acid by Lactobacillus acidophilus isolated from breast-fed infants. Kor. J. Food Sci. Ani. Resour. 28, 580-586. 23. Park, S. Y., Ko, Y. T., Jeong, H. K., Yang, J. O., Chung, H. S., Kim, Y. B., and Ji, G. E. (1996) Effect of various lactic acid bacteria on the serum cholesterol levels in rats and resistance to acid, bile and antibiotics. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 24, 304-310. 24. Perdigon, G., Nader de Marcias, M. E., Alvarez, S., Oliver, G., and Pesce deruiz Holgado A. A. (1990) Prevention of gastrointestinal infection using immunobiological methods with fermented milk with Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus. J. Dairy Res. 57, 255-264. 25. Roussel, Y., Colmin, C., Simonet, J. M., and Decaris, B. (1993) Strain characterization, genome size and plasmid content in the Lactobacillus acidophilus group (Hansen and Mocquot). J. Appl. Bacteriol. 74, 549-556. 26. Salminen S., Isolauri E., and Salminen E. (1996) Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier: successful strains and future challenges. Antonie van Leeuwenhoek 70, 347-358. 27. Sanders, M. E. (1993) Effect of consumption of lactic cultures on human health. In: Advances in Food and Nutrition Research (edited by J. Kinsella), San Diego, CA, USA: Academic Press. pp. 67-130. 28. Sanders, M. E. (1995) Lactic acid bacteria as promoters of human health. In Functional Foods: Designer Foods, Pharmafoods, Nutraceuticals, ed. I. Goldberg, London: Chapman and Hall. pp. 294-322. 29. SAS (1996) SAS/STAT User's Guide. Release 6.12, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA. 30. Saxelin, M., Tynkkynen, S., Mattila-Sandholm, T., and de Vos, W. M. (2005) Probiotic and other functional microbes: from markets to mechanisms. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 204-211. 31. Schaafsma, G. (1996a) Significance of probiotics in human diets. In: SOMED 21st International Congress on Microbial Ecology and Disease, Paris, October 28-30. pp. 38. 32. Schaafsma, G. (1996b) State of the art concerning probiotic strains in milk products. IDF Nutrition Newsletters. 5, 23-24. 33. Sugita, T. and Togawa, M. (1994) Efficacy of Lactobacillus preparation Biolactis powder in children with rotavirus enteritis. Jpn. J. Pediatr. 47, 2755-2762. (Received 2009.5.28/Revised 2009.9.23/Accepted 2009.9.28)