(51) Int. Cl. A61K 31/7064 (2006.01) (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2006 년 05 월 24 일 10-0583194 2006 년 05 월 18 일 (21) 출원번호 10-2003-0094526 (65) 공개번호 10-2005-0063164 (22) 출원일자 2003년12월22일 (43) 공개일자 2005년06월28일 (73) 특허권자이승정강원도강릉시포남 2 동 1215-2 이종길충북청주시흥덕구죽림동가경주공 3 단지아파트 304-802 김경제경기도남양주시별내면청학리 353-1 청학주공아파트 708-1104 (72) 발명자이승정강원도강릉시포남 2 동 1215-2 김경제경기도남양주시별내면청학리 353-1 청학주공아파트 708-1104 이종길충북청주시흥덕구죽림동가경주공 3 단지아파트 304-802 김하원서울특별시강동구천호 1 동우성아파트 5 동 201 호 한신하경기도남양주시별내면청학리 353-1 주공아파트 708 동 1104 호 이민원서울특별시서초구반포동 20-4 주공아파트 351-306 임영선강원도강릉시노암동 2 주공아파트 206 동 206 호 임희정서울특별시도봉구쌍문 3 동 315-81 박은정서울특별시강남구삼성동 79 홍실아파트 5 동 603 호 손한식서울특별시노원구중계본동 17-4 윤윤하 - 1 -
서울특별시중랑구묵 2 동 233-6202 호 (74) 대리인신동인 심사관 : 김희수 (54) 코디세핀을함유하는당뇨병의치료및예방용조성물 요약 본발명은코디세핀 (cordycepin) 을유효성분으로함유하는당뇨병의치료및예방용조성물에관한것으로, 본발명의코디세핀은 STZ- 유도당뇨병성마우스에서혈당강하작용을나타내며, 이는비장의면역세포인 T- 세포와 B- 세포의과도한증식을억제함으로써췌장의베타세포 (β-cell) 파괴를방지하는효능을나타내기때문으로사료된다. 또한, 이와동시에복강내대식세포의활성을촉진하여, 면역기능증가및과도한면역반응억제에관여하여면역조절효과를나타낸다. 따라서, 이를함유하는조성물은당뇨병의치료및예방용의약품및건강기능식품으로이용할수있다. 또한, 본발명에서코디세핀은적은용량 (0.2 mg/kg) 에서항당뇨효과가있음이밝혀졌다. 대표도 도 1 색인어 코디세핀, 혈당강하, 면역세포, 티 - 세포, 비 - 세포, 베타세포, 복강, 대식세포, 면역조절, 조성물, 당뇨병, 의약품, 건강기능식품. 명세서 도면의간단한설명 도 1 은코디세핀이 STZ- 유도당뇨병성마우스로부터수득한 LPS- 처리복막대식세포내산화질소생성에미치는효과를측정한도이며, 도 2a 는코디세핀이 LPS- 처리된 STZ- 유도당뇨병성마우스에서비장세포증식에미치는효과를측정한도이고, 도 2b 는코디세핀이 Con A 처리된 STZ- 유도당뇨병성마우스에서비장세포증식에미치는효과를측정한도이다. 발명의상세한설명 발명의목적 발명이속하는기술및그분야의종래기술 본발명은코디세핀을유효성분으로함유하는당뇨병의치료및예방용조성물에관한것이다. 당뇨병은 1998 년사망통계에따르면한국인의사망요인중 6 위, 2001 년사망통계에따르면사망요인중 4 위를차지하고있으며, 당뇨병으로인한사망률이최근 10 년간 125 % 이상증가하였다 (Korea National Statistical Office, Annual Report of on the Cause of Death Statistics, 통계청, 2002). 당뇨병유병률의급격한증가는식이와운동을포함하는라이프스타일 (life style) 의변화가가장주요한요인으로제시되었다. - 2 -
당뇨병이란인슐린양 ( 量 ) 의부족으로혈액중의포도당 ( 혈당 ) 이정상인보다그농도가높아져서소변에포도당을배출하는만성질환이다. 정상의경우섭취한음식물은대부분포도당으로바뀌고, 혈액은이포도당을몸을구성하고있는세포로운반해준다. 포도당이세포속으로이동하는데는인슐린 ( 호르몬 ) 이필요하다. 당뇨병은인슐린이제대로만들어지지않거나작용을하지못하기때문에포도당이세포내로이동되지못해발생하는것이다. 세포속으로운반되지못한포도당은그대로혈액속에남아있게되어혈액은당이많은 ' 고혈당 ' 상태가되고소변으로배출되는것이다. 당뇨병은인슐린생산여부에따라두가지유형으로특징지어지며, 인슐린의존형인제 I 형당뇨병 (insulin dependent diabetes, IDDM) 은혈액내의글루코스조절호르몬인인슐린 (Insulin) 의분비결핍으로야기되고, 주로 10 내지 20 대의젊은연령층에서발병되기때문에소아당뇨병 (juvenile diabetes) 이라불리우기도한다. 제 Ⅱ 형당뇨병 (non-insulin dependent diabetes, NIDDM) 은주로 40 대이후에발병되며, 우리나라당뇨병환자의대부분을차지한다. 제 Ⅰ 형과는달리성인형당뇨병이라불리우며발병원인은아직명확히밝혀져있지않으나, 유전적인요인과환경적요소가함께관여되어발생하는것으로알려졌다. 인슐린의존형당뇨병 (IDDM) 은인슐린을분비하는췌장의베타 - 세포가심하게파괴되어인슐린의감소및고혈당증 (hyperglycemia) 으로되는특징을가지고있으며, 자가면역질환으로간주되고있다. 이는아직밝혀지지않은원인에의해면역세포가활성화되고이들세포는췌도 (pancreatic islet) 로침윤하여체도에서면역세포는인슐린을만드는베타세포를파괴하여당뇨병을유발하게된다. 좀더설명하면, 감수성이예민한사람에게서췌도염이생기면결과적으로자동면역반응에의해질환이생기는데, 이는췌장베타 - 세포도에반응하는 T- 림프구에의해매개된다고여겨진다. 이러한 CD4 + /CD8 + T- 림프구는직접적으로인슐린을만드는베타 - 세포손상을야기하거나사이토카인및유리기생성및베타 - 세포에프로그램화된세포괴사및아폽토시스를유도하는것과같은간접적메카니즘을통하여베타 - 세포손상을야기한다 (Anjli, K., et al., J. Clin. Endocrinol., 84, pp4371-4378, 1999). 인슐린은근육세포, 간세포, 지방세포등에작용하여당대사를촉진시키고, 혈중당농도를낮추는기능을하는물질이나, 베타세포의파괴에의해혈중인슐린양이감소되면근육세포나지방세포의당대사가낮아져당뇨가유발된다. 많은연구에의하여베타 - 세포항원 (β-cell antigen), 대식세포 (macrophage), Th 세포 (helper T cells), 세포독성 T 세포 (cytotoxic T cells, CTLs) 등이당뇨발명에관여하고있다고알려져있으며, 면역세포에서분비되는사이토카인이나유리기 (oxygen free radicals) 등이베타세포의파괴에관여하고있다고보고되었다. 당뇨병의치료에는약물, 식이및운동요법의세가지요법이필수적인데, 현재까지당뇨병의명확한병인과완치법은확립되어있지않다. 당뇨병의중요한치료목표는혈당을가능한정상에가깝게조절하고, 합병증을예방하며합병증으로인한위험을최소화하는것이다. 현재제 1 형당뇨환자중일부와대부분의제 2 형당뇨환자가혈당조절을위해복용하고있는경구혈당강하제는복부팽만감, 구토, 복통, 저혈당등부작용을나타낼수있어그사용이제한될수있다 (Hanefeld M., J. Diabetes Complications, 12, pp228-237, 1998). 따라서천연물로부터혈당강하제를개발할필요성이절실하다. 또한, 면역억제제를사용하는치료법또한많은연구가이루어지고있으나면역억제제를사용한치료법은과도한면역억제로인하여 2 차감염, 신장독성, 간독성등을야기시켜당뇨병치료제로서의사용에는아직많은문제점을가지고있다. 따라서, 최근면역조절제를이용한당뇨병치료연구가진행되고있다. 동충하초 ( 冬蟲夏草 ) 는겨울기간동안곤충의체내에서식하면서양분을흡수하여숙주를파괴시킨후, 여름이되면곤충의몸밖으로식물체가자라나는모습에서그명칭이유래되었다. 즉, 동충하초균의포자또는균사가곤충또는균핵에침입하여기주안에내생균핵을만든다음, 밖으로자실체를형성하는것이바로동충하초버섯이다. 식물분류체계상동충하초는자낭균강 (Ascomycota), 맥각균목 (Clavicipitales), 맥각균과 (Clavicipitaceae) 에속하며코디셉스 (Cordyceps), 포도넥트리아 (Podonectria), 토루비엘라 (Torrubiella ) 등의세가지종이있는데, 그중대표적인것이코디셉스종이다 (Kobayasi Y., Trans Mycol. Soc. Japan, 23, pp329-364, 1982). 전세계적으로현재까지약 800 여종의동충하초균이알려져있으며, 이중국내에서채집및분류된것은 78 종이다 ( 성재모, 한국의동충하초, 교학사, pp62-90, 1996). 동충하초는기주특이성이낮아여러곤충을기주로하는경우가많으며, 일반적으로균명을사용하여명명되나 (Kobayasi Y., et al., Iconography of vegetable wasps and plant worms, Hoikusha Publishing Company Ltd, pp280-295, 1983), 천연에서얻을수있는자연산동충하초는매우희귀하여확보가어렵고, 따라서다양한종류의동충하초가인공재배되고있으며이에관한성분및효능연구가진행되고있다. - 3 -
이중코디셉스시넨시스 (Cordyceps sinensis) 는가장가치있는생약중하나로, 야생코디셉스시넨시스는희귀하고인공적으로배양하기도매우어렵기때문에중국과학자들은발효능이있는 Cs-4 균주를개발하였다. 코디셉스시넨시스는다양한약학적효능즉, 산소 - 유리라디칼소거능, 항노화, 내분비, 성기능회복, 호흡기, 간장, 순환기, 항암및신장질환에대한효과가있음이주 (Zhu, J. S., et al., J. Altern. Complement. Med., 4, pp289-303 1998) 에의해잘요약되어졌다. 코디셉스밀리타리스 (Cordyceps militaris) 는코디셉스 (Cordyceps) 의또다른종으로, 중국과한국에서폭넓게사용되고있다. 코디세핀 (Cordycepin, 3'-deoxyadenosine) 은코디셉스시넨시스의유효성분의하나로여겨지고있다 (Chen, S. Z., and Chu, J. Z., Zhongguo Kangshengsu Zazhi., 21, pp9-12, 1996; Zhu, J. S., et al., J. Altern. Complement. Med., 4, pp289-303 1998). 좀더일찍이커닝험 (Cunningham, K. G., et al., J. Chem. Soc., pp2299-3000, 1951) 은코디셉스밀리타리스로부터바실러스서브틸러스 (Bacillus subtlis) 성장저해능이있는산출물을분리하였다. 이화합물은후에코디세핀으로동정되었다 (Kaczka, E. A., et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 14, pp456-457, 1964). 구조가확인된후, 코디세핀의다양한생물학적효과가연구되어졌는데, 예를들면, 항균활성 (Sugar, A. M., and McCaffrey, R. P., Agents Chemother., 42, pp1424-1427, 1998), 항 - 말라리활성 (Trigg, P. I., et al., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 65, pp514-520, 1971), 항 - 헤르페스활성 (Julian-Ortiz, J. V., et al., J. Med. Chem., 42, pp3308-3314, 1999), 어떤세포라인에서항 - 종양형성활성 (Deitch, A. D., and Sawicki, S. G., Exp. Cell Res., 118, pp1-13, 1979), 항 - 백혈병 (leukemic) 활성 (Koc, Y., et al., Leukemia, 10, pp1019-1024, 1996) 에대한연구가보고된바있다. 한편, 코디세핀은지금까지는폴리아데닐화저해제로세포독성을갖는항암제로만알려져있었으나, 최근들어미국에서항백혈병치료제로서임상 I 단계에있는약물이다 (Eiichi N., et al., Biochemical Phar., Vol. 59, pp273-281, 2000), 그러나, 상기문헌어디에도코디세핀의항당뇨활성에대한어떠한교시나시사된바없다. 본발명자는큰번데기동충하초저급알콜가용분획물로부터분리한코디세핀 (F1) 의여러생리활성을검토하던중, 혈당강하효과를알게되어코디세핀의항당뇨활성을평가하게되었으며, 그결과항당뇨효과를확인하여본발명을완성하였다. 발명이이루고자하는기술적과제 본발명의목적은코디세핀을함유하는당뇨병의치료및예방용조성물을제공하기위한것으로, 코디세핀은혈당강하및비장의 T- 세포와 B- 세포의과도한증식을억제함으로써췌장의베타세포 (β- 세포 ) 파괴방지효과와같은항당뇨활성을나타내므로당뇨병의치료및예방용의약품및건강기능식품에사용할수있다. 발명의구성및작용 상기목적을달성하기위하여, 본발명은코디세핀 (cordycepin) 을유효성분으로함유하는당뇨병의치료및예방용조성물을제공한다. 상기코디세핀은시중에서구입하여사용하거나큰번데기동충하초로부터분리정제하여사용할수도있다. 코디세핀의항당뇨효과를측정한결과, STZ- 유도당뇨병성마우스에서혈당강하및비장의면역세포의과도한증식억제로인한췌장의베타세포의파괴억제효과등을확인하였다. 본발명의당뇨병의치료및예방용약학조성물은, 상기코디세핀을조성물총중량에대하여 0.00001 ~ 15 중량 %, 바람직하게는 0.05 중량 % 이하, 더욱바람직하게는 0.2 mg/kg 이하로포함한다. 또한, 본발명의코디세핀을포함하는약학조성물은약학적조성물의제조에통상적으로사용하는적절한담체, 부형제및희석제를더포함할수있다. 본발명의코디세핀의약학적투여형태는이들의약학적허용가능한염의형태로도사용될수있고, 또한단독으로또는타약학적활성화합물과결합뿐만아니라적당한집합으로사용될수있다. - 4 -
본발명에따른코디세핀을포함하는약학조성물은, 각각통상의방법에따라산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸등의경구형제형, 외용제, 좌제및멸균주사용액의형태로제형화하여사용될수있다. 상기코디세핀을포함하는조성물에포함될수있는담체, 부형제및희석제로는락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트및광물유를들수있다. 제제화할경우에는보통사용하는충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제등의희석제또는부형제를사용하여조제된다. 경구투여를위한고형제제에는정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이포함되며, 이러한고형제제는상기코디세핀에적어도하나이상의부형제예를들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는락토오스 (lactose), 젤라틴등을섞어조제된다. 또한단순한부형제이외에마그네슘스테아레이트, 탈크같은윤활제들도사용된다. 경구를위한액상제제로는현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이해당되는데흔히사용되는단순희석제인물, 리퀴드파라핀이외에여러가지부형제, 예를들면습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이포함될수있다. 비경구투여를위한제제에는멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가포함된다. 비수성용제, 현탁제로는프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과같은식물성기름, 에틸올레이트와같은주사가능한에스테르등이사용될수있다. 좌제의기제로는위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴등이사용될수있다. 본발명의코디세핀의바람직한투여량은환자의상태및체중, 질병의정도, 약물형태, 투여경로및기간에따라다르지만, 당업자에의해적절하게선택될수있다. 그러나, 바람직한효과를위해서, 본발명의코디세핀은 1 일 0.0001 내지 100 mg/kg 으로, 0.001 내지 100 mg/kg 으로투여하는것이좋다. 투여는하루에한번투여할수도있고, 수회나누어투여할수도있다. 상기투여량은어떠한면으로든본발명의범위을한정하는것은아니다. 본발명의코디세핀은쥐, 생쥐, 가축, 인간등의포유동물에다양한경로로투여될수있다. 투여의모든방식은예상될수있는데, 예를들면, 경구, 직장또는정맥, 근육, 피하, 자궁내경막또는뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에의해투여될수있다. 또한, 본발명은당뇨병의예방및개선효과를나타내는상기코디세핀및식품학적으로허용가능한식품보조첨가제를포함하는건강기능식품을제공한다. 코디세핀을첨가할수있는식품으로는, 예를들어, 각종식품류, 음료, 껌, 차, 비타민복합제, 건강기능식품류등이있다. 또한당뇨병의예방및개선을목적으로식품또는음료에첨가될수있다. 이때, 식품또는음료중의상기코디세핀의양은, 일반적으로본발명의건강기능식품조성물의경우는전체식품중량의 0.00001 내지 15 중량 %, 바람직하게는 15 중량 % 이하로가할수있으며, 건강음료조성물에는 100 ml를기준으로 0.00001 0.05 g, 바람직하게는 0.05 g 이하의비율로가할수있다. 본발명의건강음료조성물은지시된비율로필수성분으로서상기코디세핀을함유하는외에는액체성분에는특별한제한점은없으며통상의음료와같이여러가지향미제또는천연탄수화물등을추가성분으로서함유할수있다. 상술한천연탄수화물의예는모노사카라이드, 예를들어, 포도당, 과당등 ; 디사카라이드, 예를들어말토스, 슈크로스등 ; 및폴리사카라이드, 예를들어덱스트린, 시클로덱스트린등과같은통상적인당, 및자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨등의당알콜이다. 상술한것이외의향미제로서천연향미제 ( 타우마틴, 스테비아추출물 ( 예를들어레바우디오시드 A, 글리시르히진등 ), 및합성향미제 ( 사카린, 아스파르탐등 ) 를유리하게사용할수있다. 상기천연탄수화물의비율은본발명의조성물 100 ml당일반적으로약 1 20 g, 바람직하게는약 5 12 g 이다. 상기외에본발명의조성물은여러가지영양제, 비타민, 광물 ( 전해질 ), 합성풍미제및천연풍미제등의풍미제, 착색제및중진제 ( 치즈, 초콜릿등 ), 펙트산및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에사용되는탄산화제등을함유할수있다. 그밖에본발명의조성물들은천연과일쥬스및과일쥬스음료및야채음료의제조를위한과육을함유할수있다. 이러한성분은독립적으로또는조합하여사용할수있다. 이러한첨가제의비율은그렇게중요하진않지만본발명의조성물 100 중량부당 0 내지약 20 중량부의범위에서선택되는것이일반적이다. 이하, 본발명을하기실시예및실험예에의해상세히설명한다. 단, 하기실시예및실험예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명의내용이하기실시예및실험예에의해한정되는것은아니다. - 5 -
실시예 1. 큰번데기동충하초로부터저급알콜가용분획물의제조 큰번데기동충하초는 CM 바이오텍 ( 강릉시, 대한민국 ) 에서현미와큰번데기를혼합한배지에서재배된큰번데기동충하초의배지부분을제거한자실체를 60 에서 3 일간건조시킨것을제공받아사용하였다. 상기건조시킨큰번데기동충하초자실체 1 kg 을 10 l 의탈이온수 (Distilled Deionized Water: DDW) 를가하고 100 에서 6 시간동안 3 회추출하여온수추출물을수득하고 70 에서감압농축장치로농축하여농축물을얻은다음, 동결건조하였다 (325 g). 동결건조물은적당량의 DDW 에녹인다음그부피의약 8 배가량의 99 % 에탄올을가하여하루밤방치하여침전물을제거하고, 상층액만을모아서 55 에서감압농축장치로농축하여본발명의큰번데기동충하초저급알콜가용분획물인큰번데기에탄올가용분획물 ( 이하, F3 이라고함 ) 을제조하고, 물로희석한다음동결건조하여시료 (195 g) 로사용하였다. 실시예 2. 큰번데기동충하초저급알콜가용분획물로부터코디세핀 (F1) 의제조 상기실시예 1 에서제조된큰번데기동충하초저급알콜가용성분획물을물에희석한다음강양이온교환수지 SK1B 칼럼 (Diaion, H + ) 에서베드볼륨 (bed volume) 의 3 배가량의 4 % 염산 (HCl) 으로용출한다음, 용출액을제거하고 4 % 수산화암모늄 (NH 4 OH) 으로용출한후, 4 % 수산화암모늄용출액을 TLC(CHCl 3 : MeOH: H 2 O= 65: 35: 10, 아니스알데하이드 (anisaldehyde) 시약 ) 로농축함과함께코디세핀의존재를조사하였다. 농축물은다시 DDW 로희석한다음, 음이온교환 수지 (Diaion, OH - ) 를통과시켜수득한용출액은다시적당한볼륨으로농축되고, 합성흡착제 HP20 칼럼을통과시킨다음, DDW 는베드볼륨의 3 배가량의 DDW 로용출시킨다음, 용출액을제거하였고, 마지막으로베드볼륨의 3 배이상의 5 % 프로필알콜 (propyl alcohol) 로용출한후, 용출액을농축한다음, 다시적당한볼륨의 DDW 로희석하고, 동결건조하여본발명의아데노신을함유하는코디세핀 (crude cordycepin containing adenosine; CCCA, 이하 F1 이라고함 ) 을제조하였다. 실시예 3. 큰번데기에탄올가용분획물로부터분리한코디세핀 (F1) 의성분함량측정 트레할레이즈저해활성 (Trehalase inhibitory activity) 을가지고있는상기실시예 2 에서수득된 F1 의코디세핀및아데노신의함량을 HPLC 로분석한결과, 코디세핀은 164 mg/g(16.4 %), 아데노신은 253 mg/g(25.3 %) 였다. 또한, PH- 테스트 (TEST)(L-8800 아미노산분석시스템, Hitachi 사, 일본 ) 로분석한결과, 트립토판 34.8 mg/g 및페닐알라닌 33.43 mg/g 을함유함을나타냈다. 실험예 1. 전처리 1-1. 시료의준비 본실험에서는시료로표준코디세핀 ( 시그마사, St. Louis, MO., USA) 을사용하여코디세핀의항당뇨활성을조사하였고, 그외시료로아카보스 (acarbose, 한국바이엘 ), 표준트립토판 ( 시그마사, St. Louis, MO., USA) 을사용하였으며, 상기실시예 2 의코디세핀 (F1) 의항당뇨활성도조사하여비교하였다. 통계분석에서수치는평균 ±SD 로표시하였고, 비교 (comparison) 는홀자료 (the unpaired data) 를위한스튜턴트의 t- 검정 (Student's t-test) 을사용하여분석하였다. 차이는 P 수치가 0.05 보다적거나같게얻어졌을때유의성이있는것으로고려하였다. 소프트웨어는사회과학 (social sciences) 을위한통계패키지 (the Statistical Package) 를사용하였다. 1-2. 실험동물의처치 ( 마우스에당뇨병유도 ) 실험동물로는 CrjBgi:CD-1 수컷마우스를바이오제노믹스 (Bio Genomics 사, 한국 ) 에서구입하여, 4 주에서 5 주가량의적응기간동안실험실내동물실험실내에서사육하였다. 이때마우스들은빛과어둠이 12 시간간격으로교차하는환경하에표준식이 ( 삼양사, 한국 ) 및음용수를자유롭게섭취할수있도록하였으며, 온도는 23 ±2, 습도 55 ±5 % 로인위적으로조정되었다. 당뇨병을유발하기위하여베타세포를파괴할수있는물질인스트렙토조토신 (STZ, 시그마사, St. Louis, MO., USA) 은 150 mg/kg 을 0.01 M 구연산완충용액 (citrate buffer, ph 4.5) 에용해한다음, 식이군 (the diabetic group) 의 5 주령마우스에투여하였으며, 대조군 (the control group) 의마우스에는식염수 (saline) 를단독투여하였다. - 6 -
이때, 각군의마우스는 6 마리로하였고, 섭취된식이와물의양은 2 일마다측정되었고, 상기성분주입후 6 일째되었을때, 12 시간절식시킨후, 혈액샘플을헤파린화된모세관튜브 (a heparinized capillary tube, Chase Scientific Glass Inc., USA) 를이용하여안와채혈 (blood collecting from the retro-orbital venous plexus) 을통해수득한다음, 4 에서 3000 rpm 으로 10 분동안원심분리 (5810R, 에펜도르프 (Eppendorf), 독일 ) 하였다. 상청액혈장내당수치는당효소적방법 (Asan Pharm. Co. Ltd. Korea, Licensed by Nissui Pharm. Co. Ltd.) 에의해당뇨병성마우스의유도를확인하기위하여측정되었으며, 200 mg/ dl와동등하거나그이상의혈당수치를가진마우스들은당뇨병성으로간주되었다. 이러한 STZ- 유도고혈당성마우스 (STZ-induced hyperglycemic mice) 는 STZ- 대조군및시험군으로사용되었으며, 대조군 ( 정상군 ) 및 STZ- 유도당뇨병성마우스의체중을측정하였고, 같은날섭취한물과식이의양도계산하였다. 당뇨병을유도한후, STZ- 유도당뇨병성마우스의체중, 물및식이섭취량의변화를확인한결과를하기표 1 에나타내었다. STZ- 유도당뇨병성마우스와정상마우스 ( 대조군 ) 를비교하였을때상대적으로체중은 11 %, 식이섭취량은 11.6 % 감소하였고, 그와반대로물섭취량은두배가량증가하였다. 이러한사실은당뇨병이성공적으로유도되었음을나타낸다 ( 하기표 1 참조, p<0.0001). 체중 (g) [ 표 1] 물섭취 ( ml / 마우스 / 일 ) 식이섭취 (g/ 마우스 / 일 ) 대조군 31.72 ±0.23 7.71 ±0.21 6.89 ±0.36 STZ-유도당뇨병성마우스 28.22 ±2.53 * 14.54 ±3.26 * 6.09 ±0.15 * * : 대조군 ( 정상마우스 ) 과유의적으로차이가있음 (p<0.0001). 수치는평균 ±S.E.M.( 대조군 n=6, STZ- 유도당뇨병성마우스 n=45) 로나타냄. 실험예 2. 시료의투여및혈당저하효과 2-1. 시료의투여 상기실험예 1-2 의 STZ- 유도당뇨병성마우스를각각대조군 ( 정상마우스 ), STZ- 대조군, 아카보스군 (acarbose, 10 mg/kg, 한국바이엘 ), 상기실시예 2 의 F1 군 (4 mg/kg), 표준코디세핀군 (0.2 mg/kg), 표준트립토판군 (1 mg/kg) 의 6 그룹으로나누고 (n=6), STZ- 대조군은전분 (2 g/kg) 을단독으로투여하였고, 다른시험군은전분 (2 g/kg) 및상기양의시료를투여하였다. 이러한전분과부하실험 (the starch over loading test) 후, 같은양의시료가하루에계속하여두번투여되었고, 식염수 (saline) 는 STZ- 대조군에투여되었다. 각시료의투입은채혈로인한스트레스를줄수있는영향을고려하여 4 일째날에중단한다음, 5 일째날에재개하였다. 티오글리콜레이트배지 (thioglycollate broth, 3 %, 2 ml ) 는대식세포를수집하기위하여 6 일째되는날에모든군에주입되었다. 2-2. 혈당강하효과 혈당수치는상기실험예 2-1 에서실험개시에앞서 12 시간동안절식시킨후, 전분및각시료투여 60 분후, 처음시료투여일로부터 4 일및 8 일째되는날 12 시간절식후에각각상기실험예 1-2 의당효소적방법 (Asan Pharm. Co. Ltd. Korea, Licensed by Nissui Pharm. Co. Ltd.) 으로측정하였다. 하기표 2 에전분 (2 g/kg) 투여전및후에 STZ- 유도당뇨병성마우스의혈당수치에미치는코디세핀등의효과를측정한결과를나타내었다. 코디세핀 (0.2 mg/kg) F1(4 mg/kg) 및아카보스 (10 mg/kg) 투여 60 분후, 전분과부하실험에서 STZ- 유도당뇨병성마우스의혈당수치의감소효과는아카보스가가장높았고, 코디세핀과 F1 은비슷하였다. 또한, 하기표 3 에코디세핀등의상기각시료가경구투여 3 일후및 7 일투여후 STZ- 유도당뇨병성마우스의혈당수치에미치는효과를측정한결과를나타내었다. 3 일투여후 4 일째에, 아카보스는 37.2 % 로혈당수치의유의적인감소를 - 7 -
나타냈으며, F1 및코디세핀도혈당수치를약간낮추는효과가있었다. 7 일투여후 8 일째에, 아카보스및코디세핀의저해율은각각 37.5 %, 48.4 % 로잠재적인저혈당활성을나타내었으며, F1 및트립토판은약간의혈당강하효과를나타냈으나유의성은없었다. 상기의결과에서코디세핀은 4 일째되는날은혈당수치를낮추는데크게기여하지못했으나, 8 일째되는날혈당수치를크게떨어뜨리는것을알수있었으며, F1(0.656 mg/4 mg/kg) 은높은코디세핀의함량에도불구하고오히려순수코디세핀 0.2 mg/kg 보다혈당을강하시키지못했다. 따라서적은용량에서오히려항당뇨작용이있는것으로나타났다. [ 표 2] 그룹 혈당수치 (mg/ dl ) 전 후 STZ-대조군 461.9 ±73.2 637.5 ±26.9 아카보스 (10 mg/kg) 466.8 ±62.8 401.2 ±76.2 * F1(4 mg/kg) 466.5 ±69.3 555.1 ±51.4 코디세핀 (0.2 mg/kg) 472.2 ±60.5 593.8 ±62.3 트립토판 (1 mg/kg) 466.1 ±56.0 516.6 ±94.9 - 각시료는하룻밤동안절식시킨후경구로전분 (2 g/kg) 을투여하였음. 혈당수치는투여전및투여 60 분후에측정되었음. 대조군을식염수를투여하였음. 수치는각그룹의 6마리마우스의평균 ±S.E.M. 으로표현되었음. * : 대조군과유의적으로차이가있음 (P<0.05). [ 표 3] STZ-유도그룹 혈당수치 (mg/ dl ) 4일째 8일째 STZ-대조군 566.17 ±18.44 656.77 ±26.83 아카보스 (10 mg/kg) 355.42 ±76.14 * 419.19 ±137.98 * F1(4 mg/kg) 538.12 ±33.63 578.33 ±19.35 코디세핀 (0.2 mg/kg) 538.47 ±40.68 338.95 ±39.89 * 트립토판 (1 mg/kg) 479.16 ±71.59 452.97 ±98.99 - 모든시료는하루에두번경구적으로투여되었음. 대조군은식염수를투여하였음. 혈액수집은 12 시간절식한후수행되었음. 수치는각군의 6 마리마우스의평균 ±S.E.M. 으로표현되었음. * : 대조군과유의적으로차이가있음 (P<0.05). 실험예 3. 복막의대식세포증식및산화질소생성에미치는효과 코디세핀이복막의대식세포증식및산화질소생성에미치는효과를측정하기위하여하기와같은실험을실시하였다. 실험예 2-1 에서각시료투입후 8 일째되는날실험동물의체중을달고, 각그룹을헤파린화된모세관튜브 (a heparinized capillary tube, Chase Scientific Glass Inc., USA) 를사용하여안와채혈 (blood collecting from the retro-orbital venous plexus) 을통해혈액을수집한후, 10 ml의냉 PBS 를복강내투여한다음, 2 분동안실험동물의복강부위를문지른후, 복강으로부터다시 PBS 를수집한다음, 또다른 10 ml의냉 PBS 를주입하고, 복막침출물을같은방법으로수집하였다. 대식세포가함유되어있는수집된복막침출물은 4, 1200 rpm 에서 10 분동안원심분리한다음, 상청액은제거하고, 적혈구가함유된세포현탁액은 2 ml의 ACE(8 g NH 4 Cl, 1 g Na 2 EDTA, 0.1 g KH 2 PO 4, ph 7.4) 용 혈완충용액으로 5 분동안처리한다음 PBS 를가하여원심분리한후, 상청액을제거하고, 대식세포는 100 U/ ml의페니실린, 100 μg / ml의스트렙토마이신 (Gibco, BRL, Grand Island) 및 10 % 소태아혈청 (fetal bovine serum; FBS, HyClone, - 8 -
Labs, Logan, UT) 을포함한 10 ml의둘베코스변형이글배지 (Dulbeccos Modified Eagle Medium; DMEM, Gibco, BRL, Grand Island) 가든페트리 - 디쉬 (the petri-dish) 에옮겨 CO 2 배양기 (Forma scientific, Inc., Marietta, U.S.A) 에 서 2 시간동안 (37, 5.5 % CO 2 ) 배양하였다. 이후, 페트리 - 디쉬의바닥에붙어있는대식세포들을수집한후, 완전배지 (complete medium, DMEM-10) 에 2 10 6 cells/ ml농도로조절하였다. 그다음, 림프구의미토젠 (mitogen) 인 LPS(25 ng/ ml ) 로처리한대식세포용액과 LPS 로처리하지않은대식세포용액 200 μl를각각 96 웰플레이트의모든웰에주입하고, 30 시간동안 CO 2 배양기 (37, 5.5 % CO 2 ) 에서배양한다음, 50 μl의 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide) 표지시약을모든웰에가하고 4 시간동안배양한후, 대식세포의증식을 540 nm 에서 ELISA 리더 (reader) 로측정하였다. 대식세포용액의상청액은 30 시간동안배양한후, 100 μl를새로운 96 웰플레이트에주입하고, 100 μl의그리즈시약 (Griess reagents) 으로실온에서 10 분동안모든웰을처리한다음, 산화질소 (NO) 의양을 540 nm 에서 ELISA 리더 (Emax, Molecular Devices, U.S.A) 로측정하였다. 코디세핀, 상기실시예 2 의 F1 및다른시료의복용이 STZ- 유도당뇨병성마우스로부터수득된 LPS- 처리복막대식세포내산화질소합성에미치는영향을측정한결과, 7 일동안코디세핀 (0.2 mg/kg) 을복용한 STZ- 유도당뇨병성마우스에서유래한 LPS(25 ng/ ml )- 처리복막대식세포는 LPS- 처리 STZ- 대조군 (39.93 μm) 과비교하였을때 2 배이상산화질소합성 (98.37 μm) 이강화되었다. 반면에, 그자체에고농도의코디세핀 (656 μg /4 mg) 을함유하고있는 F1(4 mg/kg) 을복용한 STZ- 유도당뇨병성마우스로부터수득된 LPS 처리대식세포는산화질소합성이강화되지않았다 ( 도 1 참조 ). 또한, 상기각시료의복용이 STZ- 유도당뇨병성마우스로부터수득된 LPS- 처리복막대식세포의증식에미치는영향을측정한결과, 모든군에서 LPS 처리전과후에대식세포증식사이의유의적인차이가없었다. 이상에서와같이코디세핀투여군에서유래된대식세포는 LPS 처리시에대조군보다산화질소의생성이월등히증가하는것을볼때에코디세핀이면역증강을촉진시킨다고볼수있다. 실험예 4. 비장세포의증식에미치는효과 코디세핀이비장세포의증식에미치는효과를측정하기위하여하기와같은실험을실시하였다. 상기실험예 2-1 에서각시료투입후 8 일째되는날실험동물로부터대식세포를수집하고, 마우스는경추탈골에의해희생되었으며, 비장, 간, 신장, 근육의무게를측정하고, 비장을제외한모든기관은 - 70 냉동실에저장하였다. 비장은 10 ml의 PBS 가담긴페트리디쉬에이식하고, 마이크로슬라이드 (micro slide) 로얇게뜬후 4 에서 10 분동안 1200 rpm 으로원심분리한다음상청액을제거한다음, 세포펠렛 (pellet) 을교반하여느슨하게한후, 3 ml의 ACE 용혈완충용액을가하고, 10 분동안정치한다음, PBS 를가하고원심분리하였다. 상청액은제거하고, 10 ml의 PBS 를세포펠렛에가한다 음, 비장세포의양을 DMEM-10 배지에 1 10 6 세포 / ml로조정하였다. 각군의비장세포는 B- 림프구의미토젠 (mitogen) 인 LPS[lipopolysaccharide, 10 μg / ml, 대장균 (Escherichia coli) 0111:B4, Sigma, St. Louis, MO. USA], T- 림프구의미토젠인 Con A[4 μg / ml, 콘카나발린 A(concanavalin A), Sigma, St. Louis, MO. USA] 로처리하거나처리하지않았으 며, 이중 200 μl를새로운 96 웰플레이트 (2 10 5 세포 /200 μl ) 의각웰에이식한다음, CO 2 배양기에서 3 일동안배양 (37, 5.5 % CO 2 ) 하였다. 그런다음에 XTT(sodium 3'-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-terazolium]-bis(4- methoxy-6-nitro)benzene sulfonic acid hydrae) 표지시약 (1 mg/ ml, 50 μl ) 을 96 웰플레이트에가하고, 3 시간배양한후, 비장세포의증식량을 490 nm 에서 ELISA 리더로측정하였다. 코디세핀, 상기실시예 2 의 F1 및각시료의복용이 STZ- 유도당뇨병성마우스로부터수득된비장의증식에미치는효과를측정해본결과, 각시료를복용한 STZ- 유도당뇨병성마우스로부터수득한비장세포의관찰시 LPS 및 ConA 무처리군사이의뚜렷한차이는없었다. LPS- 처리된 STZ- 유도당뇨병성마우스에서코디세핀및다른군들은 STZ- 대조군보다비장의 B- 세포의증식이억제된것으로나타났다. 반면에, F1 군은 STZ- 대조군보다비장의 B- 세포의증식이증가하였고, 정상대조군보다는감소하였다 ( 도 2a 참조 ). - 9 -
또한, Con A 처리된 STZ- 유도당뇨병성마우스에서코디세핀및아카보스군은정상군및 STZ- 대조군보다비장의 T- 세포의증식이억제되었다. 반면에, F1 및트립토판투여군은정상 - 대조군보다비장의 T- 세포의증식이증가하였으나, STZ- 대조군보다는감소하였다 ( 도 2b 참조 ). 이상에서와같이코디세핀의항당뇨효과는 T- 세포의과도한증식을억제하여, T- 세포의베타 - 세포가파괴하는것을막아주는것으로사료되며, 코디세핀을 3 일간투여후 4 일째에는항당뇨효과가없다가 7 일투여후 8 일째에항당뇨효과가있었던것은베타 - 세포가회복되는기간이필요했기때문으로사료된다. 실험예 5. 독성실험 대체약물 (the alternative drug) 로안전하게사용할수있는지여부를알아보기위하여각시료는상기실험예 1-2 의실험동물을 STZ- 대조군, 아카보스군 (acarbose, 10 mg/kg, 한국바이엘 ), 상기실시예 2 의 F1 군 (4 mg/kg), 표준코디세핀군 (0.2 mg/kg), 표준트립토판군 (1 mg/kg) 의 6 그룹으로나누고 (n=6), STZ- 대조군은전분 (2 g/kg) 을단독으로투여하였고, 다른시험군은전분 (2 g/kg) 및상기양의시료를하루에두번투여한후, 처음투여일로부터 8 일째되는날희생시킨후, 근육, 간, 비장및신장의무게를측정하였으며, 정상마우스와 STZ- 유도마우스를비교해보았다. 그결과, 하기표 4 에나타낸것처럼, 코디세핀 (0.2 mg/kg) 은유의적인차이가없었으나, F1(4 mg/kg), STZ- 대조군및아카보스 (10 mg/kg) 는대조군마우스와유의적인차이를나타내었다 ( 각각 P<0.05, P<0.005, P<0.001). 이와같은결과로코디세핀은대체약물로유용하다고할수있다. [ 표 4] 그룹 근육 / 체중 간 / 체중 비장 / 체중 신장 / 체중 ( 10-2 ) ( 10-2 ) ( 10-3 ) ( 10-2 ) 대조군 7.57 ±0.73 4.75 ±0.22 4.82 ±0.36 1.68 ±0.07 STZ-대조군 8.03 ±0.68 7.59 ±0.88 ** 5.73 ±0.13 2.32 ±0.11 * 아카보스 8.50 ±0.59 6.47 ±0.60 6.38 ±0.11 *** 2.19 ±0.20 ** F1 8.67 ±0.79 7.09 ±0.65 ** 6.33 ±0.21 *** 2.10 ±0.09 *** 코디세핀 8.09 ±0.58 5.37 ±0.67 5.40 ±0.21 1.77 ±0.10 트립토판 8.32 ±0.54 5.14 ±0.41 5.79 ±0.44 1.90 ±0.06 - 모든시료 ( 상기표 3 과같은양임 ) 는하루에두번투여되었음. - 수치는각군의 6 마리마우스의평균 ±S.E.M. 으로표현되었음. * : 대조군과유의적으로차이가있음 (P<0.001). ** : 대조군과유의적으로차이가있음 (P<0.005). *** : 대조군과유의적으로차이가있음 (P<0.05). 하기에상기조성물의제제예를설명하나, 이는본발명을한정하고자함이아닌단지구체적으로설명하고자함이다. 제제예 1. 주사제제의제조 코디세핀...100 mg 소디움메타비설파이트...3.0 mg 메틸파라벤...0.8 mg 프로필파라벤...0.1 mg - 10 -
주사용멸균증류수... 적량 상기의성분을혼합하고통상의방법으로 2 ml로한후, 2 ml용량의앰플에충전하고멸균하여주사제를제조한다. 제제예 2. 정제의제조 코디세핀...200 mg 유당...100 mg 전분...100 mg 스테아린산마그네슘적량 상기의성분을혼합하고통상의정제의제조방법에따라서타정하여정제를제조한다. 제제예 3. 캡슐제의제조 코디세핀...100 mg 유당...50 mg 전분...50 mg 탈크...2 mg 스테아린산마그네슘... 적량 상기의성분을혼합하고통상의캡슐제의제조방법에따라서젤라틴캡슐에충전하여캡슐제를제조한다. 제제예 4. 액제의제조 코디세핀...1000 mg 설탕...20 g 이성화당...20 g 레몬향... 적량 정제수를가하여전체 1000 ml로맞추었다. 통상의액제의제조방법에따라상기의성분을혼합한다음, 갈색병에충전하고멸균시켜액제를제조한다. 제제예 5. 건강식품의제조 코디세핀...1000 mg 비타민혼합물... 적량 비타민 A 아세테이트...70 μg 비타민 E...1.0 mg - 11 -
비타민 B1...0.13 mg 비타민 B2...0.15 mg 비타민 B6...0.5 mg 비타민 B12...0.2 μg 비타민 C...10 mg 비오틴...10 μg 니코틴산아미드...1.7 mg 엽산...50 μg 판토텐산칼슘...0.5 mg 무기질혼합물... 적량 황산제 1 철...1.75 mg 산화아연...0.82 mg 탄산마그네슘...25.3 mg 제 1 인산칼륨...15 mg 제 2 인산칼슘...55 mg 구연산칼륨...90 mg 탄산칼슘...100 mg 염화마그네슘...24.8 mg 상기의비타민및미네랄혼합물의조성비는비교적건강식품에적합한성분을바람직한실시예로혼합조성하였지만, 그배합비를임의로변형실시하여도무방하며, 통상의건강식품제조방법에따라상기의성분을혼합한다음, 과립을제조하고, 통상의방법에따라건강식품조성물제조에사용할수있다. 제제예 6. 건강음료의제조 코디세핀...1000 mg 구연산...1000 mg 올리고당...100 g 매실농축액...2 g 타우린...1 g 정제수를가하여... 전체 900 ml - 12 -
통상의건강음료제조방법에따라상기의성분을혼합한다음, 약 1 시간동안 85 에서교반가열한후, 만들어진용액을여과하여멸균된 2l 용기에취득하여밀봉멸균한뒤냉장보관한다음본발명의건강음료조성물제조에사용한다. 상기조성비는비교적기호음료에적합한성분을바람직한실시예로혼합조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도등지역적, 민족적기호도에따라서그배합비를임의로변형실시하여도무방하다. 발명의효과 상술한바와같이, 코디세핀은 STZ- 유도당뇨병성마우스에서혈당강하및면역세포인대식세포를활성화시키고, 비장의면역세포인 T- 세포와 B- 세포의과도한증식을억제함으로써췌장의베타세포 (β-cell) 파괴를방지하는효능을나타내기때문으로사료된다. 또한, 이와동시에복강내대식세포의활성을촉진하여, 면역기능증가및과도한면역반응억제에관여하여면역조절효과를나타낸다. 따라서, 이를함유하는조성물은당뇨병의치료및예방용의약품및건강기능식품에사용할수있다. (57) 청구의범위 청구항 1. 큰번데기동충하초로부터분리정제한코디세핀을유효성분으로함유하는당뇨병의치료및예방용약학조성물. 청구항 2. 삭제 청구항 3. 삭제 청구항 4. 당뇨병의예방및개선효과를나타내는큰번데기동충하초로부터분리정제한코디세핀및식품학적으로허용가능한식품보조첨가제를포함하는건강기능식품. 청구항 5. - 13 -
삭제 도면 도면 1 도면 2a 도면 2b - 14 -