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1 Korean Journal of Microbiology (2016) Vol. 52, No. 4, pp pissn DOI eissn Copyright c 2016, The Microbiological Society of Korea Article 이상발효유산균과내산성효모와의혼합배양이사워도우의저장성에미치는영향 임은서 * 동명대학교식품영양학과 Effect of the mixed culture of heterofermentative lactic acid bacteria and acid-tolerant yeast on the shelf-life of sourdough Eun-Seo Lim* Department of Food Science & Nutrition, Tongmyong University, Busan 48520, Republic of Korea (Received November 30, 2016; Revised December 19, 2016; Accepted December 19, 2016) ABSTRACT: The primary objective of this study was to investigate the effects of the bacteriocin-producing heterofermentative lactic acid bacteria (LAB) and acid-resistant yeast isolated from Mukeunji, a Korean ripened kimchi on shelf-life extension and quality improvement of sourdough. According to gene sequence analysis the heterofermentative LAB that showed the antimicrobial activity against breadspoilage Bacillus strains were identified as Leuconostoc mesenteroides LAS112, Lactobacillus brevis LAS129, and L. mesenteroides subsp. dextranicum LAB137. In addition, the yeasts that were able to grow at acidic ph were identified as Pichia membranifaciens YS05, Pichia fermentans YS19, and Pichia anomala YS26. During sourdough fermentation the levels of acetic acid and bacteriocin produced by L. brevis LAS129 strain were higher than those of L. mesenteroides LAS112 and L. mesenteroides subsp. dextranicum LAS 137 strains, whereas LAS112 strain produced the highest levels of lactic acid. The maximum bacteriocin activity (640 AU/g) against Bacillus subtilis ATCC was obtained in sourdough fermented by mixed culture of L. brevis LAS129 and P. membranifaciens YS05 or P. anomala YS26. After 24 h of fermentation at 30 C, the viable cell counts of LAS129 (10 9 CFU/g) in sourdough were higher than those of the YS05 or YS26 (10 7 CFU/g). Meanwhile, the viable cells of bread-spoilage strain in sourdough fermented with these strains were significantly (P < 0.05) lower than the control group. Key words: antimicrobial activity, bacteriocin, lactic acid bacteria, sourdough, yeast 빵의부패와관련된대표적인미생물로는 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis 및 Bacillus cereus 등이있으며, 이와같은 Bacillus속의일부균종은식중독을유발하는병원성균으로알려져있다 (Collins et al., 1991). Bacillus 속세균은원료 ( 밀가루 ), 식품첨가물 ( 밀가루개량제, 팽창제 ) 및제조과정중환경으로부터오염된다 (Bailey and Von Holy, 1993). 이들의포자는내열성이므로빵을굽는과정중에도생존가능하며, 25~30 C 온도하에서수분활성도 0.95 이상이면포자가발아하여점질물을생성하게된다. 영양세포로전환된세균은빵에이미와이취및변색을유발하고, 끈적임과부스러짐현상 *For correspondence. limsm020@tu.ac.kr; Tel.: ; Fax: 이발생하며, Bacillus균이생성하는전분이나단백질분해효소에의한유기물분해와세포외 (extracellular) 점질성다당류의생성에의한조직의변화가나타난다 (Thompson et al., 1993). Bacillus 속의증식억제및포자발아를지연시키기위해일반적으로식품위생법상에서허용하는합성보존제인프로피온산이나초산등을주로사용한다. 하지만초산은제빵류의관능적품질을저하시키고프로피온산은일부어린이에게자극, 불안초조, 집중력저하및수면장애를동반하기도한다고알려져있다 (Dengate and Ruben, 2002). 게다가칼슘과결합한형태인프로피온산칼슘을과량섭취한경우발암유발가능성이높은것으로보고되고있다 (Rosenquist and Hansen, 1998). 따라서화학합성품을대체할수있는천연항균제개발이

2 472 Lim 절실히요구되는가운데사워도우를이용한발효빵의경우유산균이생산한유기산으로인해 ph가낮아짐에따라부패균의증식을억제하여빵의저장기간을연장시키고독특한신맛을부여함으로써풍미를향상시킨다 (Katina et al., 2006). 유산균은유산, 초산, 이산화탄소, 디아세틸, 과산화수소및박테리오신등의다양한대사산물을생성하여부패세균의증식을억제하는항균활성을나타낸다 (Valerio et al., 2008). 일부유산균이생산한 phenyllactic acid (PLA) 와 ρ OH-phenyllactic acid (OH-PLA) 등도세균의증식을저해한다고알려져있다 (Ohhira et al., 2004; Makras et al., 2006). 한편, 박테리오신은펩타이성물질로서체내소화효소에의해서도쉽게분해되어잔류성이없고부패균및식중독균등유해미생물의증식을억제하는천연항균물질이며오랜기간동안발효식품제조에사용되고있는유산균이생산하므로안전성이확보된보존제로서 Generally Recognized As Safe (GRAS) 물질로등재되었다 (Garneau et al., 2002). 사워도우발효스타터로서 Lactobacillus 속균주로발효시킨경우박테리오신을생산함으로써곰팡이나부패세균등의유해미생물증식을억제하여저장성을향상시키고빵의조직과향미를개선시키며노화를지연시키는등품질을향상시키는것으로보고된바있다 (Mentes et al., 2007). Corsetti 등 (2004) 도사워도우발효를위해박테리오신을생산하는 Lactococcus lactis ssp. lactis M30을사용한결과, 도우의품질개선에효과적이라고하였다. 따라서본연구에서는묵은지로부터유산균을분리하고빵의주요부패균인 Bacillus 속에대한항균활성이있는유산, 초산및박테리오신을생산하는이상발효유산균만을선발동정하였다. 분리된유산균과의혼합배양으로사워도우를제조하기위해낮은 ph 환경하에서증식가능한내산성효모를분리동정하였고, 선발된유산균과효모를이용하여사워도우를발효시킨후일정한저장기간동안유산균, 효모및 Bacillus속의균수변화와 ph, 총산도및유기산함량과박테리오신의활성변화를측정하였다. 재료및방법 이상발효유산균분리배양가정에서담근후 1년이상숙성시킨묵은지시료 (50 g) 를수집한다음 phosphate buffer saline (PBS, ph 7.0, 450 ml) 을가하여약 3분간균질화하였다. 십진희석한시료용액은 1% (w/v) CaCO 3 이함유된 Lactobacilli MRS agar (Difco) 평판배 지에도말한후 37 C에서 48시간동안배양하였다. 배양후유산생성에의해집락주변에투명한환을생성하는균주만을모아 MRS agar 평판배지상에서순수분리하고사면배지상에서계대배양하였다. 유전자염기서열분석을위해전보 (Lim, 2016) 에따라 DNA extraction kit (Qiagen) 로균주의 DNA를추출정제한후 27F (5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ) 와 1492R (5 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ) primer를사용하여중합효소연쇄반응 (polymeraase chain reaction, PCR) 으로 DNA를증폭하였다. 반응후 DNA sequencer (ABI Prism 3730 Avant Genetic Analyzer, Applied Biosystems) 로동정하여이상발효유산균주를실험에사용하였다. Bacillus 속에대한박테리오신생산유산균선발및동정 B. cereus ATCC 11778, B. licheniformis KCTC 1918, Bacillus stearothermophilus ATCC 및 B. subtilis ATCC 균주에대한분리된유산균이생산한박테리오신의항균활성은 microplate plate method (Hole et al., 1991) 로측정하였다. 유산균은 MRS broth에접종하여 37 C에서 24시간호기적인조건하에서배양후원심분리 (7,000 g, 10분, 4 C) 하여배양상등액을회수하였다. 유기산과과산화수소의영향을배제하기위해 1 N NaOH를사용하여배양상등액의 ph를 6.5로조정한다음 catalase (1 mg/ml, Sigma-Aldrich) 를처리하고단백질을침전시키기위해황산암모늄 (60%, w/v) 을가하여교반 (4 C, overnight) 하였다. 그런다음원심분리 (12,000 g, 30분, 4 C) 하여회수한침전물은 20 mm PBS (ph 6.5) 에현탁시킨후투석 (molecular weight cut-off = 1,000 Da, Spectrum Medical Industries, Inc.) 하여박테리오신용액으로사용하였다. 한편, Bacillus 속균주들은 Nutrient broth (NB, Difco) 에접종한후 30 C, 24시간배양후얻은배양액은원심분리 (7,000 g, 10 분, 4 C) 하여세포를회수하고 PBS (ph 7.0) 내에서 CFU/ml로조정하였다 (Choi et al., 2012). Microtiter plate well (Falcon) 에멸균된 BHI broth (900 μl), Bacillus 속세포현탁액 (50 μl) 및일정한농도에맞춘박테리오신용액 (50 μl) 을가한후 37 C에서 24시간동안배양하였다. 배양액의탁도는 580 nm에서 microplate reader (BioTek, Inc.) 를이용하여측정하였고, 박테리오신의항균활성은대조구 (PBS 처리구 ) 혼탁도의 50% 이하를나타내는최대희석배수의역수를취하여 arbitrary units (AU) 로나타내었다 (Gerez et al., 2009). 박테리오신용액에 pepsin, protease 및 proteinase K (l mg/ml, Sigma-Aldrich) 를가하여 37 C에서 3시간배양한후 80 C에서약 2분간가열하여효소반응을정지시킨다음잔존하는박테리오신활성을측정하여단백질성분임을확인하였다. 미생물학회지제 52 권제 4 호

3 유산균박테리오신이사워도우의저장성에미치는영향 473 내산성효모분리동정묵은지로부터효모를분리하기위해 PBS (ph 7.0) 를가하여균질화한시료 1 ml를채취하여 yeast glucose chloramphenicaol (YGC) agar 평판배지위에도말접종하여 25 C에서 72시간배양하였다. 생성된집락은 yeast extract peptone dextrose (YEPD) agar 배지상에서획선접종하여순수분리하였고동일한배지에계대배양하였다. 분리된효모는 YEPD broth에접종하여 30 C에서 24시간동안배양한후원심분리 (7,000 g, 10분, 4 C) 하여세포를모으고 TE buffer (10 mm Tris-HCl, ph 8.0; 1 mm EDTA) 로세척한다음세포수를 CFU/ml로조정하였다. 세포현탁액은 ph 3.5에맞춘 YM broth에가하여 30 C 에서 24시간배양한후 YEPD agar 상에서균수를측정하여산성하에서증식이가능한내산성효모를선발하였다. 선발된효모는 YEPD broth에접종하여배양하고원심분리 (7,000 g, 10분, 4 C) 해서얻은세포는 TE buffer 내에서현탁시키고 genomic DNA purification kit (Promega Co.) 로 DNA를추출하여주형 DNA로사용하였다. 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 시 26S rdna의 D1/D2 domain을증폭시키기위해 NL-1 (5 -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ) 과 NL-4 (5 -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3 ) primer, ITS1/5.8S rdna/its2 domain 은 ITS-1 (5 -TCCGTAGGTGAACCTGCG-3 ) 과 ITS-4 (5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ) primer를사용하여 PCR Thermal cycler (Bio-Rad Laboratories Ltd.) 로반응 ( 초기변성은 94 C에서 3분, 변성은 94 C에서 2분, 풀림은 42 C에서 1분, 신장은 72 C에서 2분, 연장은 72 C에서 7분, 36회반복 ) 시켰다. PCR 산물은 purification kit (Qiagen) 로정제한후 DNA 염기서열을분석하였다. 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 의 BLAST search ( 를사용하여 26S rrna 단편의유전자염기서열상동성을확인하고동정하였다 (Min et al., 2012). 사워도우제조 Choi 등 (2012) 의방법을일부변형하여선발된이상발효유산균과내산성효모로사워도우를제조하였다. 즉, 분리된유산균과효모는각각 MRS broth와 YM broth에접종한다음 37 C ( 유산균 ) 와 30 C ( 효모 ) 에서각각 24시간배양한후배양액을원심분리 (7,000 g, 10분, 4 C) 하여회수한세포를 PBS (ph 7.0) 로 2회세척및현탁시켜준비하였다. 밀가루 ( 강력분 ; 수분 10.5%, 조단백 16.7%, 조지방 0.9%, 조회분 1.5%) 380 g, 물 210 g, 소금 5.3 g, 설탕 11.2 g 및유산균 ( CFU/g) 과 효모 ( CFU/g) 세포현탁액각각 5 g씩접종한후약 5 분간반죽기 (HM3000, Brown) 를이용하여혼합하였다. 반죽한시료는멸균된비이커에담아온도 30 C, 상대습도 80% 하에서 24시간동안발효시켜사워도우를제조하였다. 사워도우내물리화학적성분변화사워도우제조직후부터 30 C에서 5일간보관하는동안 ph, 총산도및항균물질 ( 유산, 초산, 박테리오신 ) 함량변화를조사하였다. 사워도우의 ph는시료 (10 g) 와증류수 (90 ml) 를혼합한후 ph meter (Fisher Scientific) 를이용하여측정하였다. 한편, 시료와동량의증류수를혼합한후 1% (w/v) phenolphthalein 을첨가한다음 0.1 N NaOH 용액으로적정소비량을계산하여공식 [ 산도 (%) = (0.1 N NaOH 소비량 0.1 N NaOH 역가 0.9)/ 시료양 ] 에대입한후총산도를측정하였다. 유기산함량은 Alfonzo 등 (2013) 의방법에따라시료 (10 g) 에증류수 (90 ml) 를가하여균질기로혼합한시료용액 10 ml를취한뒤 1 mm HClO 4 (5 ml) 를가하고원심분리 (4,000 g, 15분 ) 하였다. 상등액을회수하고 1 mm HClO 4 를가하여 ph 3.0으로조정한후증류수를가하여 25 ml로정용하였다. 시료용액을약 30분간냉각시킨다음여과제균 (0.22 μm membrane filter) 하고 High-pressure liquid chromatography (HPLC, Shimadzu) 의이온교환컬럼 (Aminex HPX-87 H, mm, Bio-Rad Life Science Group) 온도 60 C에서이동상 (8 mm H 2SO 4) 의유속 0.7 ml/min의조건하에서 210 nm에서 UV detector로분석하고표준용액의검량곡선으로부터유기산함량을정량하였다. 박테리오신함량측정을위해시료 (10 g) 에 40% acetonitrite-0.1% (v/v) trifluoroacetic acid (90 ml) 를가하여균질화하여소수성물질을추출한다음원심분리 (15,000 g, 10분 ) 하였다. 침전물을모아동결건조시키고 50% (v/v) 알코올에용해시킨용액으로 B. subtilis ATCC 35421에대한항균활성을앞서언급한 microtiter plate method에따라측정하였다. 박테리오신을생산하지않는유산균을대조구로하여용매에의한항균활성을배제하였다 (Settanni et al., 2005). 사워도우내미생물균수변화제조직후부터 4 C에서 5일간저장하는동안사워도우내에함유된유산균, 효모및 B. subtilis의균수변화를측정하였다. 시료 (10 g) 를무균적으로채취하고 PBS (ph 7.0, 90 ml) 를가하여균질화한후곰팡이및효모의증식을억제하기위해 cycloheximide (10 mg/l, Merck) 를첨가한 MRS agar 배지상에서 37 C, 24시간동안배양하여유산균수를측정하였다. 이 Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 4

4 474 Lim 때유산균과효모를접종하지않고시료를동일한조건에서배양하여원료자체에서유래된균수는제외시켰다. 한편, 효모수는균질화한시료로부터 1 ml 취하여 YGC agar 배지상에서 30 C, 24시간동안배양하여표준한천평판배양법으로측정하였다. 게다가유산균과효모로발효시킨사워도우내 B. subtilis의균수변화를조사하기위해 BHI broth에서 30 C, 24 시간배양한후원심분리 (7,000 g, 10분, 4 C) 하고침전물은 PBS (ph 7.0) 에현탁시켜세포수를 CFU/g으로조정하여접종하였다 (Juodeikiene et al., 2011). 발효종료후저장하는동안일정시간별채취한사워도우 (10 g) 는 PBS (ph 7.0) 로적당하게희석한후 Nutrient Agar (NA) 상에서 37 C, 48시간배양하여표준한천평판배양법으로잔존하는균수를측정하였다. 통계처리 항목별모든실험은총 3회실시하였고, 측정값은평균 ± 표준편차로나타내었고, 통계분석을위해 Statistical Package for Social Science 12.0 software (SPSS) 프로그램을이용하였다. 실험구와대조구의유의적차이는 Student s t-test를통해유의수준 P < 0.05에서그룹간유의성을검증하였다. 결과및고찰 묵은지로부터분리된이상발효유산균의동정및 Bacillus 속에대한항균활성 묵은지로부터분리된균주중염기서열분석을통해이상발효유산균주만을선발하여 Bacillus 속에대한박테리오신의항균활성을측정한결과는 Table 1과같다. 9종의시료로부터분 리된유산균총 23종중에서편성 (obligately) 이상발효유산균은 7종으로확인되었으며, 염기서열분석결과 Lactobacillus fermentum LAS105, Leuconostoc mesenteroides LAS112, Lactobacillus brevis LAS129, Leuconostoc citreum LAS134, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum LAS137, Leuconostoc inhae LAS148 및 Weissella koreensis LAS152로동정되었고이들은 NCBI에등재된균주들과 % 의상동성을나타내었다. 분리동정된이상발효유산균 7종을대상으로 Bacillus 속에대한박테리오신생성능을확인한결과, LAS105, LAS134, LAS148 및 LAS152는 Bacillus 속에대한항균활성이있는박테리오신을생산하지않았으나, L. mesenteroides LAS112 가생산한박테리오신의항균활성은 B. sterothermophilus와 B. subtilis에대해각각 2,560 및 640 AU/ml으로나타났다. 또한 L. brevis LAS129는 B. subtilis에대해항균활성을나타내었고, L. mesenteroides subsp. dextranicum LAS137도 B. cereus, B. licheniformis및 B. subtilis에대한항균활성을나타낸박테리오신을생산하였다. 한편, LAS112 유산균의박테리오신은 pepsin 및 protease의처리에의해항균활성이일부소실되었고, LAS129 유산균의박테리오신은 pepsin 처리에의해항균활성이완전히소실되었으며, LAS137 유산균의박테리오신은 protease와 proteinase K처리에의해항균활성이감소되었음을확인하여이들박테리오신은단백질성분임을확인하였다 ( 결과미제시 ). 김치로부터분리된유산균으로는 L. mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, L. citreum, L. brevis, L. fermentum, Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus, W. koreensis, Weissella kimchi, Weissella pramsenteroides 및 Streptococcus faecalis 등이보고된바있어본연구에서분리된유산균과일부균종이일치하였다 (Cheigh and Park, 1994). 유산균중에는원료내 Table 1. 16S rrna gene sequence analysis and bacteriocin activity of heterofermentative lactic acid bacteria isolated from Mukeunji, a Korean ripened kimchi Strain 16S rrna sequencing Related strain in NCBI (Accession No.) Similarity (%) LAS105 Lactobacillus fermentum DM29 (KT80434) 99.9 Identification Lactobacillus fermentum LAS105 Bacteriocin activity (AU/ml) B. cereus B. licheniformis B. stearothermophilus B. subtilis ND ND ND ND LAS112 Leuconostoc mesenteroides KNUC03 (AY264850) Leuconostoc mesenteroides LAS112 ND ND 2, LAS129 Lactobacillus brevis BFE 8266 (EU147302) 99.9 Lactobacillus brevis LAS129 ND ND ND 1,280 LAS134 Leuconostoc citreum (KU899044) Leuconostoc citreum LAS134 ND ND ND ND LAS137 Leuconostoc mesenterodies subsp. dextranicum NCFB 529 (NR040817) 99.5 Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum LAS ND 80 LAS148 Leuconostoc inhae AS-73 (KR857386) 99.3 Leuconostoc inhae LAS148 ND ND ND ND LAS152 Weissella koreensis HB (KU363029) 98.0 Weissella koreensis LAS152 ND ND ND ND 미생물학회지제 52 권제 4 호

5 유산균박테리오신이사워도우의저장성에미치는영향 475 에함유된당으로부터유산을생산하는정상 (homo) 발효유산균은김치숙성과정중이취 (off-flavor) 를유발하고, 반면유산, 초산, 이산화탄소및에탄올을생산하는이상 (hetero) 발효유산균은신선한맛과탄산에의한청량감을부여한다 (Cheigh and Park, 1994). Kim 등 (2016) 은김치로부터이상발효유산균인 W. koreensis, Lactobacillus graminis 및 Weissella cibaria 등을분리 동정하였다. 한편, 유산균은유기산을비롯하여단쇄지방산, 과산화수소, 박테리오신및저분자화합물등과같이다양한항균물질을생산하는것으로알려져있다 (Choi et al., 2012). 유산균종에따라항균활성과항균스펙트럼의범위는다양하다. 김치로부터분리된박테리오신생산유산균은 Escherichia coli, B. cereus, Clostridium perfringenes, Listeria monocytogenes 및 Staphyloccoccus aureus 등의증식을억제하는것으로보고된바있다 (Park et al., 1983). 특히, 빵부패의주요원인균인 B. subtilis, B. licheniformis, Bacillus megaterium 및 B. cereus 등은세포외협막성분인점질물을생성하므로수분함량이많은빵을변질시키고, 로프 (rope) 를형성하여완숙파인애플과같은달콤한과일향을내고변색및크럼 (crumb) 으로인한연부 (softening) 을유발하는데 (Thompson et al., 1993), 이에대해 Lactobacillus sakei KTU05-6이생산하는유기산과박테리오신은 B. subtilis subsp. subtilis와 B. subtilis subsp. spizizenii 의증식을저해하였고 Pediococcus acidilactici KTU05-7과 P. pentsosaceus KTU05-8, KTU05-9 및 KTU05-10의항균물질에의해서도 B. subtilis 증식억제효과를나타내었다고보고된바있으나 (Cizeikiene et al., 2013), 본연구결과에서는 L. mesenteroides LAS112, L. brevis LAS129 및 L. mesenteroides subsp. dextranicum LAS137이 B. subtilis에대해항균활성을나타내는박테리오신을생산하여기존의결과에서밝혀진유산균종과는다소차이가있었다. Corsetti 등 (1996) 은사워도우로부터분리된총 232종의유산균중에서 33% 정도가 B. subtilis에대한항균활성을나타내었다고보고하였다. 한편, L. sakei KTU05-6, P. acidilactici KTU05-7과 P. pentsosaceus KTU05-8, KTU05-9 및 KTU05-10가생산하는박테리오신은 proteinase K, trypsin, pepsin 및 chymotrypsin의처리에의해항균활성이완전히파괴되었다고하였으며 (Cizeikiene et al., 2013), LAS112, LAS129 및 LAS137 균주가생산하는박테리오신의항균활성도일부단백질분해효소에의해저해되었다. 묵은지로부터내산성효모분리동정묵은지로부터분리된효모의내산성과염기서열분석을통한동정결과는 Table 2와같다. YEPD 배지의 ph를조정하지않은상태에서 24시간배양후분리된효모들의균수는 10 8 ~10 9 CFU/ml에이르렀으나, ph 3.5로조정한배지내에서 YS05, YS26 균주는 10 7 CFU/ml, YS19는 10 6 CFU/ml 및 YS14와 YS21 균주는 10 5 CFU/ml로측정되었다. 분리효모중 YEPD 배지에초기균수 CFU/ml으로접종한후 24시간만에균수가증가된것은 YS05, YS19 및 YS26의 Pichia 속균주로서이들은내산성이강한균주로간주하였다. 한편, NCBI의 BLAST 상동성검색을통해 Pichia membranifaciens YS05, Debaryomyces hansenii YS14, Pichia fermentans YS19, Candida tropicalis YS21 및 Pichia anomala YS26으로동정되었고이들은주로산막효모들이었다. 김치로부터분리된효모로는 Brettanomyces, Candida, Crytococcus, Citeromyces, Debaryomyces, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces 및 Torulopsis 속등으로알려져 (Kim et al., 1996) 본연구에서분리된균종과일부일치하였다. 사워도우에서주로분리되거나발효에이용되는효모로는 Saccharomyces cerevisiae, Candida krusei, Torulopsis holmii, Pichia saitoi, Candida stellate, Saccharomyces exiguous, Saccharomyces inusitatus, Candida guillermondii, Hansenula anomala, Torulopsis delbrueckii 등의효모가있다고보고되어 (Gobbetti, 1998; Chavan and Chavan, 2011) 묵은지로부터분리된내산성효모인 Pichia 속도사워도우제조에이용될수있는것으로보여진다. 효모는 ph 2.0~11.0의범위내에서증식및생존이가능하 Table 2. 26S rrna gene sequence analysis of yeasts isolated from Mukeunji, a Korean ripened kimchi and the growth of the strains at low ph Strain 26S rrna sequencing Viable cell count (CFU/ml) Identification Related strain in NCBI (Accession No.) Similarity (%) YEPD (control) YEPD (ph 3.5) YS05 Pichia membranifaciens IFO (AB019215) 98.5 Pichia membranifaciens YS05 1.7± ± YS14 Debaryomyces hansenii D139 (HM627097) 97.9 Debaryomyces hansenii YS14 5.3± ± YS19 Pichia fermentans NRRL Y-1619 (EF550234) 97.8 Pichia fermentans YS19 5.5± ± YS21 Candida tropicalis HND-1 (EU822494) 99.6 Candida tropicalis YS21 6.0± ± YS26 Pichia anomala CTSP F5 (EU862177) 98.2 Pichia anomala YS26 9.9± ± Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 4

6 476 Lim 여세균보다낮은 ph값에서내성이더강하여피클이나과일등 ph가낮은식품에서흔히분리된다. 특히 S. cerevisiae의성장가능한 ph는 2.35~8.6인것으로알려져있으며 (Beales, 2004), S. cerevisiae에대한초산과유산의최소증식억제농도는각각 0.6% (100 mm) 와 2.5% (278 mm) 이며, 초산 0.05~0.1% 와유산 0.2~0.8% 농도하에서효모세포는스트레스로인해증식속도가감소되고유기산의농도가증가할수록포도당의소비속도, 알코올생산량은감소되는것으로알려져있는데 (Narendranath et al., 2001), 묵은지로부터분리된 D. hansenii YS14와 C. tropicalis YS21은 ph 3.5하에서증식하지못하는것으로확인되었다. 저장기간동안사워도우의물리화학적성분변화 B. subtilis에대한항균활성을나타내는박테리오신생산균주인 L. mesenteroides LAS112, L. brevis LAS129 및 L. mesenteroides subsp. dextranicum LAS137 유산균과내산성효모인 P. membranifaciens YS05, P. fermentans YS19 및 P. anomala YS26을혼합배양하여발효시킨사워도우의 ph, 총산도, 유산및초산생산량과박테리오신활성을측정한결과는 Table 3과같다. LAS112 단독으로발효시킨사워도우의 ph는 4.19±0.10, 총산도는 1.30±0.20%, 유산량은 69.5±5.5 mm, 초산량은 43.8±5.8 mm, 박테리오신활성은 320 AU/ml 으로나타났다. LAS112 단독으로발효시킨경우물리화학적특성은 YS05와혼합배양시에는유의한차이가없었으나, YS19 및 YS26과혼합배양한경우에는 ph가유의하게높았고총산도, 유기산생성량및박테리오신활성은낮았다. LAS129 단독으로발효시킨사워도우의 ph는 3.60±0.09, 총산도는 1.60±0.20, 유산량은 61.4±3.3 mm, 초산량은 89.2±2.0 mm, 박테리오신활성은 640 AU/ml으로나타나 LAS112 단독배양일때보다많은양의초산을생산하고박테리오신활성도높게나타났다. LAS129 단독으로발효시킨사워도우의물리화학적특성은 YS05및 YS26과혼합배양에의해선유의한수치변화가없었으나, YS19와혼합배양시에는박테리오신활성이 50% 수준으로나타났다. LAS137 단독으로발효시킨사워도우의 ph는 4.00±0.22, 총산도는 1.46±0.30, 유산량은 55.1±3.1 mm, 초산량은 60.4±4.4 mm, 박테리오신활성은 80 AU/ml으로나타나 LAS112 혹은 LAS129 단독배양일때보다박테리오신활성은매우낮게나타났으며, YS05, YS19 및 YS26 효모와혼합배양했을때의물리화학적특성과는큰차이가없었다. 사워도우의 ph가낮을수록 B. subtilis와 B. licheniformis 의증식저해효과가더높게나타났고 (Mentes et al., 2007), Lactobacillus 속이생산하는박테리오신의항균활성도 ph 3.0~4.0에서가장높았으므로산도는항균활성뿐만아니라항균물질생산에도영향을주는것으로확인되었다 (Corsetti et al., 1996). 시판되고있는사워도우의 ph는 3.81~4.77 정도였으며 ph가감소할수록총산도는증가하였고, 유산은 1.97±0.05 ~9.41±0.48 mg/g, 초산은 0.36±0.02~1.46±0.09 mg/g 정도에이른다 (Ventimiglia et al., 2015). Choi 등 (2012) 에따르면유기산으로산성화한대조구도우의 ph (4.5 전후 ) 및총산도 (1.35% 내외 ) 는발효 24시간동안거의일정한값을유지한반면, 김치로부터분리한 L. citreum HO12 혹은 W. koreensis Table 3. Physico-chemical properties of sourdough fermented with heterofermenative lactic acid bacteria as a mono-culture and co-culture with acid-resistant yeast Microorganisms for cultures ph Titrability (%) Lactic acid (mm) Acetic acid (mm) Bacteriocin activity (AU/g) Control (LAS112) 4.19± ± ± ± LAS112+YS ± ± ± ± LAS112+YS ±0.07* 1.02±0.16* 44.6±3.9* 28.6±7.3* 160 LAS112+YS ±0.12* 1.09±0.16* 49.1±6.0* 30.5±2.9* 160 Control (LAS129) 3.60± ± ± ± LAS129+YS ± ± ± ± LAS129+YS ±0.11* 1.27±0.14* 40.8±8.2* 66.0±7.6* 320 LAS129+YS ± ± ± ± Control (LAS137) 4.00± ± ± ± LAS137+YS ± ± ± ± LAS137+YS ± ± ± ± LAS137+YS ± ± ± ± Data are means±standard deviation from triplicate determinations. * The difference between the means of the two groups (such as an experiment vs. control group) is statistically significant (P < 0.05). 미생물학회지제 52 권제 4 호

7 유산균박테리오신이사워도우의저장성에미치는영향 477 HO20로제조한사워도우의 ph가 6.38에서 4.39로급격하게감소됨에따라총산도는증가되었다. 특히, L. citreum HO12 로발효시킨사워도우의총산도는 12시간후 W. koreensis HO20보다높게나타났으나 16시간이후부터는거의비슷한수준을유지하였다. 이들유산균으로제조한사워도우의 ph와총산도는유의적인차이가없었으나유산과초산의비율과양에는현저한차이를보였다. 특히유산의함량은 W. koreensis HO20 (63.0±0.2 mm) 으로제조한사워도우에서더높게검출된반면, 초산의양은 L. citreum HO12 (32.0±0.4 mm) 로발효시킨사워도우에서높게나타났다. S. cerevisiae 단독배양으로제조한사워도우의 ph는 4.86으로감소되었고이에적정산도는 2.4 정도로나타났다. L. sanfranciscensis, L. brevis, W. cibaria, P. pentosaceus, Enterococcus faecium, L. paralimentarius 등의유산균단독으로제조한경우 ph는 3.46~3.87이었고, 적정산도는 6.4~10.9 정도였으나, 효모와유산균의혼합배양시 ph는 3.46~3.99, 적정산도는 6.2~10.9 정도로나타났다. 또한유산균단독배양시유기산생산량은 0.04~0.09 mm/g이었으나, S. cerevisiae와 L. paralimentarius 의혼합배양한경우는다른유산균에비해약간높은 0.11 mm/g의유산을생산하였다. 게다가이들유산균단독으로배양했을때초산은극히소량생산하였으나, 효모와혼합배양한경우 L. sanfranciscensis와 L. brevis는각각 0.01 mm/g, W. cibaria는 0.02 mm/g의초산을생산하였다고보고하였다 (Paramithiotis et al., 2006). 기존의보고된결과와본연구결과에서볼때사워도우의 ph, 총산도및유기산생산량은유산균과효모의종류및발효조건에따라상이한것을알수있었다. 사워도우내효모는발효과정중이산화탄소를생산하여빵의부피가증가시키며, 관능학적특성과조직감, 식용가치및종합적기호도향상에도기여하는것으로알려져있다 (Li et al., 2015). 또한유산균에의한가용성당의이용성에따른에너지이용효율과유기산생산량은당의종류와혼합배양에사용된효모에따라영향을받는다. 사워도우발효초기단계에서산도와 ph는일정하다가중반부에이르면효모가유산균의증식을촉진하여산도는급격하게증가된다고보고된바있으나 (Chavan and Chavan, 2011), YS19 및 YS26 효모가 LAS112 혹은 LAS129 유산균의증식을방해하여대사산물의생산량이유산균단독일때보다감소된것으로추정된다. Pepe 등 (2003) 은 118종의유산균중에서 L. sakei T56, L. planatrum E5, L. sanfranciscensis M207, Weissella paramesteroides A51, L. mesenteroides A27 및 E. faecium A86 등 15종 (12.7%) 의배양상등액으로로프형성균인 B. subtilis에대한항균력을 agar well diffusion method로측정한 결과, 저해환을 5~7 mm 형성하였으나, 상등액을중화시켰을때항균력이소실되었으므로유기산에의한저해효과가나타났다고보고하였다. Rosenquist와 Hansen (1995) 은 nisin을생산하는유산균은 well diffusion assay에의해 Bacillus 속의증식을억제하였으나, 4,000 IU/ml 농도의 nisin을빵에첨가한경우로프를형성하는 Bacillus 속의발아와증식억제에는유의한효과가없었다고하였다. 한편, B. subtilis와 B. licheniformis 의증식을효과적으로저해하는유기산으로는프로피온산과초산이었으며, 빵에첨가한경우에도 6일동안 Bacillus 속의증식을억제하였다고하였다. Voysey와 Hammond (1993) 는초산 0.15~0.16% 혹은프로피온산 0.2% 을제빵도우에첨가한경우 Bacillus 속에의한부패를효과적으로억제하였고, Rosenquist와 Hansen (1998) 은로프를형성하는 B. subtilis의증식을억제할수있는최대 ph 범위는 4.69라고제안하였다. 본연구에서는 L. mesenteroides LAS112, L. brevis LAS129 및 L. mesenteroides subsp. dextranicum LAS137이생산하는박테리오신은 Bacillus 속에대한항균활성을나타내었으므로균주에따라항균효과가다양함을알수있다. 한편, L. mesenteroides, L. mesenteroides subsp. dextranicum 및 L. brevis가생산하는박테리오신의항균활성은액체배지내에서보다사워도우내에서더낮게나타났다. 기존연구결과에따르면, In vitro 상에서 Bacillus 속에대한박테리오신의항균활성이탁월해도사워도우내에서활성이감소하거나나타나지않는경우, 이는도우의입자와표면에박테리오신이결합하거나, 제어대상미생물의수가많을수록박테리오신의활성이감소되는것으로보고된바있다 (Rosenquist and Hansen, 1998). 박테리오신을생산하는유산균에의한항균활성은온도, ph 및산소등의배양조건과배지성분의대사과정에영향을받는다 (Corsetti et al., 2004). 게다가식품성분에대한박테리오신의결합, 단백질분해효소에의해불활성화, 용해성변화및박테리오신의전하및부패세균의세포외피변화등의요인들은식품내의박테리오신항균활성에영향을주는것으로알려져있다 (Gänzle et al., 1999). 저장기간동안사워도우내미생물균수변화 L. mesenteroides LAS112, L. brevis LAS129 및 L. mesenteroides subsp. dextranicum LAS137 유산균단독배양과 P. membranifaciens YS05, P. fermentans YS19 및 P. anomala YS26를혼합배양시인위적으로접종하여사워도우를제조하고저장하는동안 B. subtilis의균수변화를측정한결과는 Table 4와같다. 사워도우에 B. subtilis ( CFU/g) 만을접종하여배양한경우 24시간만에 8.5± CFU/g에이르렀으나, LAS112로 Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 4

8 478 Lim Table 4. Changes in the viable cell counts of lactic acid bacteria, yeast, and Bacillus subtilis in sourdough fermented with heterofermenative lactic acid bacteria as a mono-culture and co-culture with acid-resistant yeast during storage at 4 C for 5 days Viable cell counts (CFU/ml) Microorganism for mixed cultures LAB Yeast Bacillus subtilis Control (B. subtilis) 8.5± ± ± ± LAS112+ B. subtilis 5.5± ± ± ± ± * 5.1± * 3.3± * 3.2± * LAS112+YS05+B. subtilis 6.9± ± ± ± ± ± ± ± ± * 3.6± * 5.1± * 4.7± * LAS112+YS19+B. subtilis 2.1± ± ± ± ± ± ± ± ± * 7.5± * 8.1± * 9.8± * LAS112+YS26+ B. subtilis 1.3± ± ± ± ± ± ± ± ± * 9.9± * 7.1± * 9.5± * LAS129+ B. subtilis 9.4± ± ± ± ± * 4.6± * 4.1± * 8.3± * LAS129+YS05+B. subtilis 1.7± ± ± ± ± ± ± ± ± * 3.5± * 5.2± * 5.5± * LAS129+YS19+B. subtilis 5.0± ± ± ± ± ± ± ± ± * 2.4± * 3.0± * 4.3± * LAS129+YS26+ B. subtilis 2.0± ± ± ± ± ± ± ± ± * 5.9± * 6.8± * 4.6± * LAS137+ B. subtilis 9.2± ± ± ± ± ± * 3.6± * 3.9± * LAS137+YS05+B. subtilis 8.8± ± ± ± ± ± ± ± ± ± * 5.1± * 4.1± * LAS137+YS19+B. subtilis 1.5± ± ± ± ± ± ± ± ± ± * 2.6± * 2.3± * LAS137+YS26+ B. subtilis 2.5± ± ± ± ± ± ± ± ± ± * 3.3± * 5.0± * Data are means±standard deviation from triplicate determinations. * The difference between the means of the two groups (such as an experiment vs. control group) is statistically significant (P < 0.05). 발효시킨사워도우제조직후유산균수는 10 8 CFU/g, B. subtilis 의균수는대조구보다 3 log cycle 이상적은균수가검출되었고이는 YS05와혼합배양한경우도이와유사한수준이었다. 하지만효모와혼합발효시킨사워도우내효모수는 10 7 CFU/g 에이르렀고, YS05 효모와혼합배양했을때는 YS19 혹은 YS26와혼합발효한사워도우보다 B. subtilis 균수가낮게나타났다. LAS129 유산균은 LAS112와 LAS137 보다더높은 B. subtilis에대한항균효과를나타내었고대조구보다약 4 log cycle 이상낮은균수를유지하였다. 특히 LAS129 유산균은 YS19와혼합배양했을때 YS05나 YS26 효모와의혼합배양보다항균활성이다소낮았으나, LAS137은단독및효모와의혼합배양시비슷한수준의항균활성을나타내었다. 또한 4 C에서 5일간저장하는동안유산균, 효모및 B. subtilis의균수는유의할만한변화가없었다. 한편, 선발된 3종의유산균은과산화수소를생성하지않는것으로확인되었으며, LAS112, LAS129 및 LAS137 유산균의배양상등액 (10%) 을처리하여 24시간배양후 B. subtilis의균수변화를관찰한결과, LAS129는초기균수 ( CFU/g) 를약 0.4 log cycle 감소시켰고, LAS112 및 LAS137에의해선증식속도지연효과가나타났으므로 ( 결과미제시 ) 이들유산균의항균활성은유기산과박테리오신에기인하는것으로추정되었다. 사워도우내유산균수는 ~ CFU/g, 효모수는 ~ CFU/g에이르는것으로 Hammers 등 (2005) 은보고하였고, Corsetti 등 (2001) 은유산균과효모수의비율은 1000:1 내지 10:1 정도라고하였는데본연구에서제조한사워 도우내유산균과효모의균수는혼합균주에따라다소차이가있었으나대개 10:1 정도의비율로나타났다. 사워도우제조시 S. cerevisiae와유산균을혼합배양했을때, L. brevis의최대비증식속도를유의하게감소시킨반면, L. sanfranciscensis는유의하게증가되었고, E. faecium와 L. paralimentarius의증식속도변화는극히미미했으며, W. cibaria와 P. pentosaceus 의속도에는거의변화가없었다 (Paramithiotis et al., 2006). Gobbetti 등 (1995) 은이상발효유산균과혼합한경우효모의증식속도가빨라진반면 L. plantarum DC400 및 L. farciminis CF3 등의정상발효유산균과혼합배양한경우효모의증식속도는다소느리나 CO 2 생산량은더많은것으로나타났다고하였다. Gobbetti 등 (1994) 은 L. brevis subsp. lindneri 혹은 L. planatrum 유산균과 S. cerevisiae 혹은 S. exiguous 효모를혼합배양한결과, 단독배양에비해효모의수율에는유의한변화가없었으나, 유산균의증식속도와유산이나초산등최종대사산물의수율은더높게나타났다고보고하였다. 또한유산균의증식에필수적인발린 (valine) 이나루신 (leucine) 이첨가되지않은배지내에서유산균이증식가능한것은효모가이들아미노산을생성하기때문인것으로추정하였으나, 본연구에사용된효모는사워도우내에서유산균의증식에유의할만한영향을주지않았고, 특히 YS19와 YS26은 LAS112의증식을오히려방해하였다. Paramithiotis 등 (2006) 에따르면, L. brevis 의최대비증식속도의감소는효모와의혼합배양시맥아당이용을위한효모와의길항작용에기인한다고보고하여본결과와유사한경향을보였다. 미생물학회지제 52 권제 4 호

9 유산균박테리오신이사워도우의저장성에미치는영향 479 한편, S. cerevisiae와 L. plantarum DM616을혼합하여사워도우를발효시킨결과 24시간동안에는이들두균주의균수는비교적안정적이었으나, 그이후에는유산균이효모의증식을방해하여효모균수가급격하게감소하였는데이는주영양원인탄소원이용을위해서로경쟁하고유산균의유기산생성에의해 ph가감소되어효모의증식이억제되는것으로분석하였다 (Li et al., 2015). 유산균은효모의균종및혼재하는미생물의수에의존하여효모의증식에영향을준다고알려져있다 (Li et al., 2015). 김치로부터분리된 L. citreum HO12와 W. koreensis HO20으로발효시킨사워도우내유산균의초기균수는약 6.4 Log CFU/g 정도였으나, 24시간발효후에는각각 9.2 및 9.4 CFU/g으로증가되었다고하였는데본연구에사용된 LAS112, LAS129 및 LAS137 균주는이들보다는다소낮은균수가검출되었다. 한편, 이들유산균은빵의부패미생물인 B. subtilis와 Aspergillus niger 및 Penicillium roqueforti 등의포자발아를억제하는데효과적이었으며, 항균활성은유기산에기인한다고보고하였다 (Choi et al., 2012). 유기산의항균활성은소수성과비해리된산의농도에의존하며 ph가감소할수록친유성의비해리형의농도가증가하기때문에대부분의유기산은 ph가낮을수록항균효과가증가하게된다 (Choi et al., 2012). 유산균은영양요구성이까다로운균으로서발효과정동안사워도우내에존재하는효모가아미노산, 펩타이드및비타민등을공급함으로써유산균의증식이촉진되는것으로밝혀졌다. 반면유산균의유기산생성에영향을주는탄수화물을두고효모와유산균은서로경쟁하므로주요당성분에대해비경쟁적환경을조성하는것이미생물의증식을위해필요하다 (Gobbetti, 1998). 시리얼가공품에함유된당, 단백질, 무기질, 지질및유리지방산이나각종효소등의내재적인자와발효온도와시간, 도우수율, 산소및원료에함유된미생물균수등은사워도우내발효미생물의증식과발효빵의형태에영향을주는중요한인자들이다 (Chavan and Chavan, 2011). 항균및항진균성물질을생산하는 L. sanfranciscensis는사워도우내에서우점종유산균이고효모의증식을보호하여안정된사워도우제품생산에기여하므로유용한유산균과효모의혼합발효식품은발효스타터에의한자체품질향상기능을발휘한다고알려져있다 (Gobbetti, 1998). 유산균을이용하여제조한사워도우는빵의향미, 조직감, 저장기간연장및영양학적가치향상등의유용한특성을부여한다. 빵제조시사용하는보존제는부패세균이나곰팡이에의한빵의변질과경제적손실을억제하기위해주로사용하며장기간과량섭취시독성유발가능성이알려지면서소 비자들은보존료사용을기피한다. 대체물질로서항균및항진균활성이있는유산균의대사산물을이용하여사워도우로빵을제조하면보존제무첨가제품을선호하는소비자들의욕구를충족시키며항로프 (anti-rope) 활성은빵의저장기간을연장시키고천연물질로서독성유발가능성도낮다 (Corsetti and Settanni, 2007). 사워도우는빵제조시도우의기계가공성을향상시키고, 피트산의가수분해를통한영양학적특성, 빵의부피감, 부드러운조직감, 독특한풍미등의관능학적특성및저장기간연장에따른품질특성에대해중요한역할을한다. 사워도우유산균은호밀펜토산 (pentosane) 의용해성을증가시켜도우의수분결합력을향상시키며, 단백질분해, 휘발성방향족화합물및전구체의형성, 빵의향미를개선하는아르기닌대사및빵의조직, 노화와저장기간에영향을주는항균및항진균물질, 항로프활성, exopolysaccharide 등의생산에영향을미친다 (De Vuyst and Neysens, 2005). 이상의결과를요약하면, 빵의부패균에대하여항균활성을나타내는유산균과효모를이용하여사워도우를발효시키는동안미생물의당이용능, 혼합배양에따른두균주간의편리혹은상호공생이나경합등에따라발효종료직후최종균수에유의한차이가있었으며, 유산균의균수가증가할수록박테리오신생산량이증가되어 B. subtilis에대한항균효과가높게나타난것으로추정된다. 따라서박테리오신이나유기산등의항균물질을생산하는유산균을사워도우제조에이용하면빵의부패균으로잘알려진 B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium 및 B. cereus 등을제어하여빵의부패지연으로인한품질향상및식중독발생위험을억제할수있으며, 화학합성보존료의사용을감소시켜독성발생위험을줄일수있을것으로판단된다. 적요 본연구에서는묵은지로부터분리된박테리오신을생산하는이상발효유산균및내산성효모가사워도우의저장기간연장과품질개선에미치는영향을조사하였다. 유전자염기서열분석결과빵부패세균인 Bacillus 속에대한항균활성을나타낸이상발효유산균은 Leuconostoc mesenteroides LAS112, Lactobacillus brevis LAS129 및 L. mesenteroides subsp. dextranicum LAB137으로동정되었고, 산성 ph 하에서증식가능한효모는 Pichia membranifaciens YS05, Pichia fermentans YS19 및 Pichia anomala YS26으로확인되었다. 사워도우발효에사용된 L. brevis LAS129는 L. mesenteroides Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 4

10 480 Lim LAS112 및 L. mesenteroides subsp. dextranicum LAS 137 보다더많은양의초산과박테리오신활성을나타내었으나, LAS112 는가장많은양의유산을생산하였다. Bacillus subtilis ATCC 35421에대한최대의박테리오신활성 (640 AU/g) 은 L. brevis LAS129와 P. membranifaciens YS05 혹은 P. anomala YS26 으로혼합발효시킨사워도우내에서관찰되었다. 30 C에서 24시간발효후사워도우내 LAS129의균수 (10 9 CFU/g) 는 YS05 혹은 YS26의효모균수 (10 7 CFU/g) 보다높게검출되었다. 한편, 이들균주들을이용하여발효시킨사워도우내에존재하는빵부패균의균수는대조구보다유의하게 (P < 0.05) 낮은수준으로나타났다. 감사의말 이논문은 2016 학년도동명대학교교내학술연구비지원에 의하여연구되었음 ( 과제번호 2016F057). References Alfonzo, A., Ventimiglia, G., Corona, O., Di Gerlando, R., Gaglio, R., Francesca, N., Moschetti, G., and Settanni, L Diversity and technological potential of lactic acid bacteria of wheat flours. Food Microbiol. 36, Bailey, C.P. and Von Holy, A Bacillus spore contamination associated with commercial bread manufacture. Food Microbiol. 10, Beales, N Adaptation of microorganisms to cold temperatures, weak acid preservatives, low ph, and osmotic stress: a review. Compr. Rev. Food Sci. F. 3, Chavan, R.S. and Chavan, S.R Sourdough technology-a traditional way for wholesome foods: a review. Compr. Rev. Food Sci. 10, Cheigh, H.S. and Park, K.Y Biochemical, microbiological, and nutritional aspects of kimchi. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 34, Choi, H., Kim, Y.W., Hwang, I., Kim, J., and Yoon, S Evaluation of Leuconostoc citreum HO12 and Weissella koreensis HO20 isolated from kimchi as a starter culture for whole wheat sourdough. Food Chem. 134, Cizeikiene, D., Juodeikiene, G., Paskevicius, A., and Bartkiene, E Antimicrobial activity of lactic acid bacteria against pathogenic and spoilage microorganisms isolated from food and their control in wheat bread. Food Control 31, Collins, N.F., Kirshner, L.A.M., and Von Holy, A A characterization of Bacillus isolates from ropy bread, bakery equipment and raw material. S. Afr. J. Sci. 87, Corsetti, A., Gobbetti, M., and Smacchi. E Antimicrobial activity of sourdough lactic acid bacteria: isolation of a bacteriocin-like inhibitory substance from Lactobacillus sanfrancisco C57. Food Microbiol. 13, Corsetti, A., Lavermicocca, P., Morea, M., Baruzzi, F., Tosti, N., and Gobbetti, M Phenotypic and molecular identification and clustering of lactic acid bacteria and yeasts from wheat (species Triticum durum and Triticum aestivum) sourdoughs of Southern Italy. Int. J. Food Microbiol. 64, Corsetti, A. and Settanni, L Lactobacilli in sourdough frermentation. Food Res. Int. 40, Corsetti, A., Settanni, L., and Van Sinderen, D Characterization of bacteriocin-like inhibitory substances (BLIS) from sourdough lactic acid bacteria and evaluation of their in vitro and in situ activity. J. Appl. Microbiol. 96, De Vuyst, L. and Neysens, P The sourdough microflora: biodiversity and metabolic interactions. Trends Food Sci. Tech. 16, Dengate, S. and Ruben, A Controlled trial of cumulative behavioral effects of a common bread preservative. J. Paediatr. Child H. 38, Gänzle, M.G., Weber, S., and Hammes, W.P Effect of ecological factors on the inhibitory spectrum and activity of bacteriocins. Int. J. Food Microbiol. 46, Garneau, S., Martin, N.I., and Vederas, J.C Two-peptide bacteriocins produced by lactic acid bacteria. Biochimie 84, Gerez, C.L., Torino, M.I., Roll, G., and Font de Valdez, G Prevention of bread mould spoilage by using lactic acid bacteria with antifungal properties. Food Control 20, Gobbetti, M The sourdough microflora: Interactions of lactic acid bacteria and yeasts. Trends Food Sci. Technol. 9, Gobbetti, M., Corsetti, A., and Rossi, J The sourdough microflora. Interactions between lactic acid bacteria and yeasts: metabolism of amino acids. World J. Microbiol. Biotechnol. 10, Gobbetti, M., Corsetti, A., and Rossi, J Interaction between lactic acid bacteria and yeasts in sourdough using a rheofermentometer. World J. Microbiol. Biotechnol. 11, Hammers, W.P., Brandt, M.J., Francis, K.L., Rosenheim, M., Seitter, F.H., and Vogelmann, S Microbial ecology of cereal fermentations. Trends Food Sci. Technol. 16, Hole, H., Nilssen, O., and Nes, I.F Lactococcin A, a new bacteriocin from Lactococcus lactis subsp. cremoris: isolation and characterization of the protein and its gene. J. Bacteriol. 173, Juodeikiene, G., Salomskiene, J., Eidukonyte, D., Vidmantiene, D., Narbutaite, V., and Vaiciulyte-Funk, L The impact of novel fermented products containing extruded wheat material on the quality of wheat bread. Food Technol. Biotechnol. 49, Katina, K., Heiniö, R.L., Autio, K., and Poutanen, K Optimization of sourdough process for improved sensory profile and texture 미생물학회지제 52 권제 4 호

11 유산균박테리오신이사워도우의저장성에미치는영향 481 of wheat bread. LWT Food Sci. Technol. 39, Kim, H.Y., Bong, Y.J., Jeong, J.K., Lee, S.B., Kim, B.Y., and Park, K.Y Heterofermentative lactic acid bacteria dominate in Korean commercial kimchi. Food Sci. Biotechnol. 25, Kim, H.J., Lee, C.S., Kim, Y.C., Yang, C.B., and Kang, S.M Identification of yeasts isolated from kimchi for kimchi starter. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 24, Li, Z., Li, H., Deng, C., Bian, K., and Liu, C Effect of Lactobacillus plantarum DM616 on dough fermentation and Chinese steamed bread quality. J. Food Process. Pres. 39, Lim, E.S Microbiological and chemical properties of sourdough fermented with probiotic lactic acid bacteria. Korean J. Microbiol. 52, Makras, L., Triantafyllou, V., Fayol-Messaoudi, D., Adriany, T., Zoumpopoulou, G., Tsakalidou, E., Servin, A., and De Vuyst, L Kinetic analysis of the antibacterial activity of probiotic lactobacilli towards Salmonella enterica serovar Typhimurium reveals a role for lactic acid and other inhibitory compounds. Res. Microbiol. 157, Mentes, Ő., Ercan, R., and Akcelik, M Inhibitor activities of two Lactobacillus strains, isolated from sourdough, against ropeforming Bacillus strains. Food Control 18, Min, J.H., Hyun, S.H., Kang, M.G., Lee, H.B., Kim, C.M., and Kim, H.K Isolation and identification of yeasts from wild flowers of Daejeon city and Chungcheongnam-do in Korea. Korean J. Mycol. 40, Narendranath, N.V., Thomas, K.C., and Ingledew, W.M Effects of acetic and lactic acid on the growth of Saccharomyces cerevisiae in a minimal medium. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 26, Ohhira, I., Shinsuke, K., Morita, H., Suzuki, T., Omita, S., Hisamatsu, S., Sonori, S., and Shinoda, S Identification of 3-phenyllactic acid as a possible antibacterial substance produced by Enterococcus faecalis TH10. Biocontrol Sci. 9, Paramithiotis, S., Gioulatos, S., Tsakalidou, E., and Kalantzopoulos, G Interactions between Saccharomyces cerevisiae and lactic acid bacteria in sourdough. Process Biochem. 41, Park, Y.H., Kwon, J.J., Jo, D.H., and Kim, S.I Microbial inhibition of lactic acid bacteria strains isolated from kimchi. J. Korean Agric. Chem. Soc. 26, Pepe, O., Blaiotta, G., Moschetti, G., Greco, T., and Villani, F Rope-producing strains of Bacillus spp. from wheat bread and strategy for their control by lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 69, Rosenquist, H. and Hansen, A Contamination profiles and characterization of Bacillus species in white bread and raw materials of bread production. Int. J. Food Microbiol. 26, Rosenquist, H. and Hansen, A The antimicrobial effect of organic acids, sourdough and nisin against Bacillus subtilis and B. licheniformis isolated from wheat bread. J. Appl. Microbiol. 85, Settanni, L., Massitti, O., Van Sinderen, D., and Corsetti, A In situ activity of a bacteriocin-producing Lactococcus lactis strain. Influence on the interactions between lactic acid bacteria during sourdough fermentation. J. Appl. Microbiol. 99, Thompson, J.M., Dodd, C.E.R., and Waites, W.M Spoilage of bread by Bacillus. Int. Biodeterior. Biodegrad. 32, Valerio, F., De Bellis, P., Lonigro, S.L., Visconti, A., and Lavermicocca, P Use of Lactobacillus plantarum fermentation products in bread-making to prevent Bacillus subtilis ropy spoilage. Int. J. Food Microbiol. 122, Ventimiglia, G., Alfonzo, A., Galluzzo, P., Corona, O., Francesca, N., Caracappa, S., Moschetti, G., and Settanni, L Codominance of Lactobacillus plantarum and obligate heterofermentative lactic acid bacteria during sourdough fermentation. Food Microbiol. 51, Voysey, P.A. and Hammond, J.C Reduced-additive breadmaking technology. In Technology of Reduced Additive Foods ed. Smith, J. pp London: Blackie Academic and Professional. Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 4