(72) 발명자 윤성일 충청남도아산시선장면돈포리 211 번지 박한오 대전광역시유성구전민동엑스포아파트 208 동 60 1 호 - 2 -

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1 (51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) C12N 1/20 ( ) C12N 15/10 ( ) C12N 15/09 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 ( 국제출원일자 ) 2007 년 05 월 14 일 심사청구일자 2008 년 10 월 14 일 (85) 번역문제출일자 2007 년 05 월 15 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2008 년 12 월 18 일 (86) 국제출원번호 PCT/KR2007/ (87) 국제공개번호 WO 2008/ 국제공개일자 (30) 우선권주장 2008 년 02 월 07 일 년 08 월 04 일대한민국 (KR) (56) 선행기술조사문헌 MAJHENIC, A. C. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 63, pp (2004)* * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2012년01월31일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2012년01월16일 (73) 특허권자 ( 주 ) 바이오니아 대전광역시대덕구문평서로 8-11 ( 문평동 ) (72) 발명자 강지희 부산광역시동구수정 3 동 수암빌라 B 동 201 호 유병일 대전광역시대덕구송촌동 444 선비마을아파트 205 동 306 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 특허법인태평양 전체청구항수 : 총 7 항심사관 : 김민정 (54) 인간의모유에서분리한프로바이오틱활성및체중증가억제효과를갖는유산균 (57) 요약 본발명은인간의모유로부터분리한유산균에관한것으로서, 보다상세하게는한국여성의모유에서분리되고, 내산성, 내담즙성및항균활성등의프로바이오틱활성과체중증가억제효과를갖는락토바실러스가세리 (Lactobacillus gasseri) BNR17 균주에관한것이다. 본발명의락토바실러스가세리 BNR17 은내산성, 내담즙성및장세포에대한부착활성과세균성미생물에대한높은항균활성을가지며, 인간이섭취하는음식물중의단당류성분을소화효소가분해할수없는다당류로합성하여체외로배출시킴으로써체중증가억제효과를가진다. 이러한여러가지유익한기능으로인해본발명균주는발효유및다양한발효제품, 동물의사료첨가제뿐만아니라, 체중증가를방지하기위한생균제제및식품보조첨가제로도유용하게사용될수있다

2 (72) 발명자 윤성일 충청남도아산시선장면돈포리 211 번지 박한오 대전광역시유성구전민동엑스포아파트 208 동 60 1 호 - 2 -

3 특허청구의범위청구항 1 락토바실러스가세리 BNR17( 기탁번호 : KCTC 10902BP). 청구항 2 제 1항에있어서, 서열번호 1로기재되는 16S rrna 서열을포함하는것을특징으로하는락토바실러스가세리 BNR17( 기탁번호 : KCTC 10902BP). 청구항 3 제 1항의락토바실러스가세리 BNR17( 기탁번호 : KCTC 10902BP) 을유효량함유하는조성물. 청구항 4 제 3항에있어서, 상기조성물은식품, 식품용첨가제, 동물사료및동물사료용첨가제로구성된군으로부터선택되는것을특징으로하는조성물. 청구항 5 제 4항에있어서, 상기동물사료용첨가제는비병원성의다른미생물, 효소및이들의조합중하나이상을포함하는것을특징으로하는조성물. 청구항 6 제 1항의락토바실러스가세리 BNR17( 기탁번호 : KCTC 10902BP) 을유효량함유하는비만예방또는치료용약학적조성물. 청구항 7 삭제청구항 8 삭제청구항 9 삭제청구항 10 삭제청구항 11 삭제청구항 12 삭제청구항 13 제 1항의락토바실러스가세리 BNR17( 기탁번호 : KCTC 10902BP) 의배양액. 명세서 - 3 -

4 [0001] 기술분야본발명은프로바이오틱유산균에관한것으로서, 보다상세하게는인간의모유에서분리된것으로서내산성및내담즙성, 항균력등의프로바이오틱활성이뛰어나며, 체중증가억제효과를나타내는락토바실러스속의신규한유산균에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] 배경기술유산균은인간과그역사를함께해왔으며, 인간의건강에매우유익한영향을미치는미생물로써그유용성이날로증가하고있다. 최근에는유산균에대한연구가활발히진행되어일반식품뿐만아니라건강식품및약품으로써개발되는등그응용범위가넓어지고있다. 유산균에속하는세균들로는스트렙토코커스 (Streptococcu s) 속, 페디오코커스 (Pediococcus) 속, 류코노스톡 (Leuconostoc) 속, 락토바실러스 (Lactobacillus) 속, 스포로락토바실러스 (Sporolactobacillus) 속및비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속의미생물등이있다. 이러한유산균들은동물의장내에서식하면서동물이섭취한영양분및섬유소등을분해시켜에너지원으로사용하고, 젖산및항생물질등을생산하여장내유해균의발육을억제함으로써장내건강유지에중요한역할을한다. 또한, 유산균은동물의성장촉진및사료이용율개선, 병에대한저항력증가, 유해세균의증식억제, 폐사율감소, 부패독성물질의생성억제및각종비타민생성에도이용되고있다. 그러나, 상기와같은효능을발휘하려면외부로부터유입되는유산균이아무런장애없이장내에도달하여장의점막에부착된후, 그기능을나타내어야한다. 그러기위해서는직접장에부착될수있는균주여야하고, 경구투여시위산에의한파괴가적어야하며, 담즙산에대한내성이강해야하고, 병원균에대한항균능력이강해야하는등의조건을기본적으로충족시킬수있어야한다. 또한, 인간을위한식품이나의약품에사용될유산균의경우그분리원이인간일경우효과가가장잘나타날수있으며, 특히여성의모유로부터분리된유산균은그효능이보다광범위하며안전성또한높은것으로평가받고있다. 그러나, 지금까지발견된인간유래유산균들은대부분성인의분변이나모유를먹고자라는신생아의분변으로부터분리된것으로서, 모유에서분리된유산균들도락토바실러스루테리종이대부분이고, 다른종에속하는유산균들은거의보고된바가없다. 한편, 비만은원인이정확하게밝혀지지않은여러가지요인들에의해복합적으로발생하는만성적인질환으로써, 고혈압, 당뇨, 심혈관질환, 담석, 골관절염, 수면무호흡증, 호흡장애, 전립선암, 유방암, 대장암등을유발하는요인으로작용할수있다. 이러한비만의예방또는치료방법으로는크게식이-운동요법, 수술요법, 약물요법이있다. 식이-운동요법은저칼로리-저지방섭취와산소를소비하는육체활동을통한치료방법인데, 이는인내심을가지고반복적, 지속적으로수행하여야하기때문에대중적인효과를보기는어렵다. 수술요법은외과적수술을통해체지방을물리적으로제거하는방법으로서단기간에효과를볼수있는장점이있지만수술을해야하는점, 효과의지속성이없다는점, 비용이많이든다는점등으로인해제한적으로활용되고있다. 약물요법은여러가지부작용을야기시키킬수있기때문에사용상주의가요구된다. 최근유산균이생산하는다당류에대한연구가활발히진행되고있다. 유산균이세포외다당류를만드는기작은아주복잡한것으로알려져있으며, 유산균종에따라그생산량과구조에도많은차이를보인다. 유산균이생산하는다당류는항암효과, 면역증진효과등이있음이보고되어있으며 (Kitazawa, H. Int. J. Food Microbiol., , Hosono, A. Biosci. Biotechnol. Biochem., , Chabot, S. Lait ), GRAS (Generally Recognized As Safe) 로분류되는유산균의특성상이유산균이생산하는다당류또한섭취시안전할것으로여겨진다. [0008] [0009] [0010] [0011] 발명의상세한설명기술적과제본발명은인간의모유로부터분리된유산균에관한것으로서, 산성 ph 및담즙산에대한저항성과장부착능이강하여장내에서식하면서소화효소에의해분해된저당류탄수화물을체내로흡수되지않는고분자다당물질로전환시켜배출시키므로써체중증가억제효과등을나타낼수있는유산균을제공하는것을목적으로한다. 기술적해결방법본발명은인간의모유에서분리한유산균인락토바실러스가세리 BNR17을제공한다

5 [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] 본발명의유산균균주는하기와같은균학적특성을갖는다. 1 균의형태 - 락토바실리엠알에스 (Lactobacilli MRS) 한천평판배지에서 37, 24시간배양했을때의형태 :. 균집락 (colony) 의형태, 크기및색조 : 원형, 0.5 mm 2 mm, 유백색, 표면원활.. 그람 (Gram) 염색 : 양성.. 균의형태 : 막대형 ( 간균 ).. 포자형성능 : 없음.. 운동성 : 없음. 2 생리적성질. 생육온도범위 : 25~45. 생육 ph 범위 : ph 4.0~10.0. 최적생육온도 : 37~40. 최적생육pH: ph 6.0~8.0 3 산소의영향 : 통성혐기성. 4 당이용성 : 글리세롤 (Glycerol) -, 리보오즈 (Ribose) -, 아도니톨 (Adonitol) -, 갈락토즈 (Galactose) +, D-글루코즈 (Glucose) +, D-프럭토즈 (Fructose) +, D-만노즈 (Mannose) +, 만니톨 (Mannitol) -, 솔비톨 (Sorbitol) -, N-아세틸글루코사이드 (Acetylglucoside) +, 에스쿨린 (Esculin) +, 살리신 (Salicin) +, 셀로비오즈 (Cellobiose) +, 말토즈 (Maltose) +, 락토즈 (Lactose) +, 멜리비오즈 (Melibiose) -, 사카로즈 (Saccharose) +, 트레할로즈 (Trehalose) +, 이눌린 (Inulin) -, 멜레지토즈 (Melezitose) -, 라피노즈 (Raffinose) -, 전분 (Starch) -, β-젠티오비오즈 (Gentiobiose) -, D-트라노즈 (Turanose) +, D-타가토즈 (Tagatose) + 5 내산성 : ph 2.0에서생존. 6 내담즙성 : 0.3% 의담즙농도에서생존. 7 장내부착능 : 인체장상피세포인 Caco-2 세포주에부착. 8 항생제내성 : 젠타마이신 (Gentamicin), 카나마이신 (Kanamycin), 스트렙토마이신 (Streptomycin), 바시트라신 (Bacitracin), 네오마이신 (Neomycin), 날리딕산 (Nalidixic acid), 시프로플록삭신 (Ciprofloxacin), 폴리믹신 B (Polymixcin B), 트리메토프림 (Trimethoprim) 에대해내성. 에리스로마이신 (Erythromycin), 페니실린 (Penicillin), 테트라사이클린 (Tetracycline), 암피실린 (Ampicillin), 클로람페니콜 (Chloramphenicol), 반코마이신 (Vancomycin), 세폭시틴 (Cefoxitin), 리팜핀 (Rifampin) 에대해감수성. 9 병원성세균에대한항균성대장균 (E. coli), 황색포도상구균 (S. aureus), 살모넬라균 (S. typhimurium), 바실러스균 (B. cereus), 리스테리아균 (L. monocytogenes), 프로테우스균 (P. mirabilis) 에대해항균성가짐. 10 항균성펩타이드의존재 : 유산균의항균성펩타이드성분인박테리오신중가세리신 (gassericin) T에해당하 - 5 -

6 는유전자가중합효소연쇄반응 (PCR) 에의해검출됨. [0042] 다당류의생성 : 본발명의유산균은글루코즈가 2% 함유되어있는 MRS 배지에서배양 24 시간째에약 520 mg/l 의다당류생성능을나타냈으며그구조를분석한결과글루코즈, 만노즈, 갈락토즈, 퓨코즈 (fucose), 아라 비노즈 (arabinose), D- 글루코사민 (glucosamine) 이주성분인것으로나타남. 또한, 본유산균이생산하는다당류 는 α- 아밀라제 (amylase), 판크레아틴 (pancreatine) 등의소화효소에의해분해되지않음. [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] 우리나라는서양과는식습관이매우다르므로, 한국인으로부터분리한유산균이한국인에게가장적합한것은자명하다. 본발명의한국여성의모유에서분리한유산균인락토바실러스가세리 BNR17은프로바이오틱유산균이가져야하는기본적인조건을모두충족하고있으며, 이러한특성은한국인에게가장잘부합되는건강증진효과를나타낼수있다. 본발명자들은상기와같은특성을갖는본발명의유산균균주를락토바실러스가세리 BNR17이라명명하고, 2006년 1월 23일자로한국생명공학연구원유전자은행에기탁하였다 ( 기탁번호 : KCTC 10902BP). 또한, 본발명은상기유산균을유효량함유하는조성물을제공한다. 본발명의조성물은식품, 식품용첨가제, 동물사료또는동물사료용첨가제와같은다양한형태로제공될수있다. 본발명에따른신규유산균인락토바실러스가세리 BNR17( 기탁번호 : KCTC 10902BP) 은내산성과내담즙성및항균활성이우수하므로, 다양한유산균발효유및발효제품을생산하기위한종균으로사용할수있다. 이때, 상기발효유식품으로는요구르트, 칼피스, 치즈, 버터등을들수있고, 발효제품으로는두부, 된장, 청국장, 젤리, 김치등을들수있으나, 반드시이에한정되는것은아니다. 상기발효유및발효제품은통상적인제조방법에서균주만을본발명의유산균균주로대체함으로써용이하게제조할수있다. 본발명의바람직한실시예에따르면, 본발명의락토바실러스가세리 BNR17을섭취시킨실험군래트 (rat) 의경우, 유산균주대신 PBS(phosphate-buffered saline) 를섭취시킨대조군쥐 (rat) 에비해약 7.7% 의체중증가억제효과를가진다 ( 표 6참조 ). 또한, 실험군의경우체중증가와식이효율에있어서도대조군에비해유의적인감소를나타내며, 실험군과대조군의분변중에포함된다당류함량을측정한결과실험군의분변에서의다당류함량이대조군보다높은것으로나타났다 ( 도 6 참조 ). 이러한결과는락토바실러스가세리 BNR17의난소화성다당류생성능이체중조절에영향을미칠수있다는것을의미한다. 한편, 락토바실러스가세리 BNR17을섭취한실험군의경우, 외견상부작용은관찰되지않았으며, 각장기의무게도대조군의것과유의적인차이를보이지않았다 ( 표 7 및표 8 참조 ). 또한, 미생물인체섭취시문제가될수있는균의전이현상도관찰되지않아본발명의유산균은인간이섭취하기에안전한것으로나타났다 ( 도 7 참조 ). 본발명의유산균식품은상기락토바실러스가세리 BNR17을독립적으로또는허용가능한담체에첨가하거나, 인간또는동물이섭취하기에적합한조성물형태로제조될수있다. 즉, 본발명의유산균은다른프로바이오틱세균을함유하지않은식품및이미몇가지의프로바이오틱세균을함유한식품에첨가되어사용될수있다. 예컨대, 본발명의유산균식품을제조함에있어서, 본발명의유산균과함께사용가능한다른미생물들은인간이나동물이섭취하기에적합하고섭취시병원성유해세균을억제하거나포유동물장관내의미생물균형을개선시킬수있는프로바이오틱활성을갖는것들이며, 특별히제한되지않는다. 그러한프로바이오틱미생물의예로는사카로미세스 (Saccharomyces), 칸디다 (Candida), 피치아 (Pichia) 및토룰롭시스 (Torulopsis) 를포함하는효모 (yeast), 아스퍼질러스 (Aspergillus), 리조퍼스 (Rhizopus), 뮤코 (Mucor), 페니실린 (Penicillium) 등과같은곰팡이및락토바실러스 (Lactobacillus), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 류코노스톡 (Leuconostoc), 락토코커스 (Lactococcus), 바실러스 (Bacillus), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 그로피오니박테리움 (Propionibacterium), 엔테로코커스 (Enterococcus), 페디오코커스 (Pediococcus) 속에속하는세균등이있다. 적당한프로바이오틱미생물의구체적인예로는사카로미세스세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 바실러스코아귤란스 (Bacillus coagulans), 바실러스리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스서브틸리스 (Bacillus subtilis), 비피도박테리움비피둠 (Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움인판티스 (Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움론검 (Bifidobacterium longum), 엔테로코커스패시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스패칼리스 (Enterococcus faecalis), 락토바실러스애시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스알리멘타리우스 (Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스쿠르바투스 (Lactobacillus curvatus), 락토바실러스델브루키 (Lactobacillus delbruckii), 락토바실러스존스니 (Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스파시미누스 (Lactobacillus farciminus), 락토바실러스가세리 ( Lactobacillus gasseri), 락토바실러스헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스루테리 - 6 -

7 (Lactobacillus reuteri), 락토바실러스사케이 (Lactobacillus sakei), 락토코커스락티스 (Lactococcus lactis), 페디오코커스애시디락티시 (Pediococcus acidilactici) 등을들수있다. 바람직하게는, 우수한프로바이오틱활성을가지면서면역활성증강및항암작용이뛰어난프로바이오틱미생물혼합균을본발명의유산균식품에추가로포함함으로써그효과를더욱증진시킬수있다. 본발명의유산균식품에사용될수있는담체의예로는증량제, 고섬유첨가제, 캡슐화제, 지질등일수있으며이러한담체들의예는당업계에충분히공지되어있다. 본발명의유산균인락토바실러스가세리 BNR17은동결건조되거나캡슐화된형태또는배양현탁액이나건조분말형태일수있다. [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] 또한, 본발명의조성물은상기유산균을함유하는동물사료용첨가제또는이를함유하는동물사료의형태로제공될수있다. 본발명의동물사료용첨가제는건조또는액체상태의제제형태일수있으며, 상기락토바실러스가세리 BNR17 이외에비병원성의다른미생물을더포함할수도있다. 첨가할수있는미생물로는예컨대단백질분해효소, 지질분해효소및당전환효소를생산할수있는바실러스서브틸리스 (Bacillus subtilis) 와같은고초균, 소의위와같은혐기적조건에서생리적활성및유기물분해능이있는락토바실러스균주, 가축의체중을증가시키며우유의산유량을늘리고사료의소화흡수율을높이는효과를보여주는아스퍼질러스오리자에 (Aspergillus oryzae) 와같은사상균 (Slyter, L. L. J. Animal Sci.1976, ) 및사카로미세스세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 와같은효모 (Johnson, D. E et al. J. Anim. Sci.,1983, 56, ; Williams, P. E. V. et al,1990, 211) 등이사용될수있다. 또한, 본발명의동물사료용첨가제는상기락토바실러스가세리 BNR17 이외에하나이상의효소제제를더포함할수도있다. 첨가되는효소제제는건조또는액체상태가모두가능하며효소제제로는리파제 (lipase) 와같은지방분해효소, 파이틱애시드 (phytic acid) 를분해하여인산염과이노시톨인산염을만드는파이타제 (phytase), 녹말과글리코겐 (glycogen) 등에포함되어있는 α-1,4-글리코시드결합 (glycoside bond) 을가수분해하는효소인아밀라제 (amylase), 유기인산에스테르를가수분해하는효소인포스파타제 (phosphatase), 셀룰로스 (cellulose) 를분해하는카르복시메틸셀룰라제 (carboxymethylcellulase), 자일로스 (xylose) 를분해하는자일라제 (xylase), 말토스 (maltose) 를두분자의글루코스 (glucose) 로가수분해하는말타제 (maltase) 및사카로스 (saccharose) 를가수분해하여글루코스-프룩토스 (glucose-fructose) 혼합물을만드는전환효소 (invertase) 등과같은당생성효소등이사용될수있다. 본발명의유산균을동물사료용첨가제로사용함에있어서, 사료용원료로는각종곡물및대두단백을비롯한땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물부산물, 동물내장가루및어분가루등이사용될수있으며, 이들은가공되지않거나또는가공된것을제한없이사용할수있다. 가공과정은, 반드시이에한정되는것은아니지만, 예를들면사료원료가충진된상태에서가압하에일정한배출구로압축되는공정으로, 단백질의경우에는변성이되어이용성이증가되는압출성형 (extrusion) 을사용하는것이바람직하다. 압출성형 (extrusion) 은열처리과정을통해단백질을변성시키고항효소인자를파괴시키는등의장점을갖는다. 또한, 대두단백질과같은경우에는압출성형을통해서단백질의소화율을향상시키고대두에존재하는단백질분해효소의저해제중의하나인트립신저해제 (trypsin inhibitor) 와같은항영양인자들을불활성화시키며단백질분해효소에의한소화율향상을증가시켜대두단백의영양적가치를증가시킬수있다. 또한, 본발명은상기락토바실러스가세리 BNR17( 기탁번호 : KCTC 10902BP) 을유효량함유하는비만예방또는치료용약학적조성물을제공한다. 본발명의락토바실러스가세리 BNR17 유산균은통상적으로, 투여경로에따라선택되는약학적담체및부형제, 또는보조유효성분등과의혼합에의해서얻어지는정제또는캡슐과같은단위형태로투여된다. 본발명의약학적조성물에적합한담체, 부형제및희석제에는락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아검, 인산칼슘, 알긴산염, 트래거캔스고무, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘또는광유등이포함된다. 본발명의미생물조성물은추가로윤활제, 습윤제, 유화제및현탁화제, 방부제, 감미제또는향미제를더포함할수있다. 본발명의조성물은당업계에공지된방법을사용하여, 위장을통과한뒤소장에도달하여활성성분인미생물이신속하게장내에방출되도록장용피복제제로제조될수있다. 또한, 본발명의미생물조성물은통상적인캡슐화방법을사용하여캡슐형태의조성물로제조될수있다. 예 - 7 -

8 를들어, 표준담체를사용하여동결건조시킨본발명의미생물을함유하는펠렛 (pellet) 을제조한후, 이를경질의젤라틴캡슐내에충전시킬수있다. 또는, 본발명의미생물과임의의적절한약제학적담체, 예를들어수성검, 셀룰로스, 규산염또는오일을사용하여현탁액, 분산액을제조한후, 이러한분산액또는현탁액을연질의젤라틴캡슐내에충전시킬수도있다. [0057] [0058] [0059] 본발명의약학적조성물은특히, 경구용단위제형으로서장용피복된장용성제제로서제공될수있다. 본명세서에서의 " 장용피복 " 은위산에의해서는분해되지아니하여피복이유지되나, 소장에서는충분히분해되어활성성분이소장내에방출될수있도록하는, 약제학상허용가능한모든종류의공지의피복을포함한다. 본발명의 " 장용피복 " 은 ph 1의 HCl 용액과같은인공위즙을 36 내지 38 에서접촉시킬때, 2시간이상동안그대로유지되며, 바람직하게는이후에 ph 6.8의 KH₂PO₄ 완충용액과같은인공장즙에서 30분이내에분해되는피복을지칭한다. 본발명의장용피복은 1개의코어 (core) 에약 16 내지 30, 바람직하게는 16 내지 20 또는 25 mg 이하의양으로피복된다. 본발명의장용피복의두께가 5 내지 100 μm, 바람직하게는 20 내지 80 μm인경우가장용피복으로서만족스러운결과를나타낸다. 장용피복의재료는공지의고분자물질들중에서적당히선택된다. 적당한고분자물질은다수의공지문헌 (L. Lachman 외, The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3판, 1986, pp. 365~373; H. Sucker 외, Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, pp ; Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis, 4판, Vol. 7, pp. 739 ~ 742, 및 766 ~ 778, (SpringerVerlag, 1971); 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 13판, pp ~ 1691 (Mack Publ., Co., 1970)) 에열거되어있고, 셀룰로즈에스테르유도체, 셀룰로즈에테르, 아크릴수지의메틸아크릴레이트공중합체및말레산및프탈산유도체의공중합체가이들에포함될수있다. 본발명의장용피복은장용피복용액을코어에분무하는통상적인장용피복법을사용하여제조될수있다. 장용피복공정에사용되는적당한용매로는에탄올과같은알콜, 아세톤과같은케톤, CH 2 Cl 2 와같은할로겐화 탄화수소용매이며이들용매들의혼합용매가사용될수도있다. 디 (di)-n-부틸프탈레이트또는트리아세틴과같은연화제를 1 대약 0.05 내지약 0.3 ( 코팅재료대연화제 ) 의비율로피복용액에첨가한다. 분무과정을연속적으로수행하는것이적절하며피복의조건을고려하여분무량을조절하는것이가능하다. 분무압은다양하게조절할수있고, 일반적으로약 1 내지약 1.5 바 (bar) 의분무압으로만족할만한결과가얻어진다. [0060] [0061] [0062] [0063] 본명세서의 " 약학적유효량 " 은포유동물의장내에서체내로흡수되는저당류의양을감소킬수있는본발명의미생물의최소량을의미하며, 본발명의조성물에의하여체내에투여되는미생물의양은투여경로, 투여대상을고려하여적절하게조정될수있다. 본발명의조성물은대상개체에매일일회이상투여될수있다. 단위투여량은사람피험자및다른포유동물을위한단위투여에적합하게물리적으로분리된단위를의미하며, 각단위는적절한약제학적담체를포함하며치료효과를나타내는본발명의미생물의예정된양을함유한다. 성인환자의경구투여용투여단위는본발명의미생물 0.1 g 이상을함유하는것이바람직하며, 본발명의조성물경구투여량은일회에 0.1 내지 10 g, 바람직하게는 0.5 내지 5 g이다. 본발명의미생물의약학적유효량은 0.1 내지 10 g/1일이다. 그러나, 투여량은환자의체중, 비만증상의심각도및사용되는미생물과보조유효성분에따라가변적이다. 또한, 일일총투여량을여러횟수로분할하여필요에따라연속적으로투여할수있다. 따라서, 상기투여량범위는어떠한방식으로도본발명의범위를제한하지아니한다. 본발명의조성물을주기적으로복용하는경우, 장내에본발명의미생물들이균총을이루면서인체가당류를흡수하는것을경쟁적으로방해할뿐아니라, 단당류형태의탄수화물을다당류형태로전환시켜이들이체내에서흡수되는것을방지하고, 미생물이생산한비소화성식이섬유가장내유용균의생육조건을좋게하여장운동을자극함으로써결과적으로본발명의조성물이비만의예방및치료제로기능하게된다. 한편, 의약적조성물의체중감소효과또는비만방지효과를극대화하기위해서종래당업자에게공지되어있는임의의체중감소제를적절한함량으로포함할수있으며, 이때첨가제의함량범위는반복실험등을통해당업자가용이하게결정할수있다. 첨가제로유용한성분의바람직한예로는콘쥬게이트리놀레산 (conjugated linoleic acid), 폴리덱스트로즈 (polydextrose), 이눌린 (inulin), 구아검 (guar gum), 아랍검 (arabic gum), L- 카르틴 (carteine), 포도씨추출물, 프럭토올리고당 (fructooligosaccharide), 자일로올리고당 (xylooligosaccharide), 라피노즈 (raffinose), 글루콘산 (gluconic acid), 샴피뇽 (champignon), 폴리안토시아니딘 (polyanthocyanidine), 락툴로즈 (lactulose), 락티톨 (lactitol), 락토수크로즈 (lactosucrose), 당귀추출물, - 8 -

9 헛개나무추출물, 감귤껍질추출물등이있으나, 이에한정되는것은아니다. [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] 또한, 본발명은상기락토바실러스가세리 BNR17( 기탁번호 : KCTC 10902BP) 을배양함으로써제조되는배양액을제공한다. 본발명의배양액의제조에사용되는배지는특정한종류에한정되는것은아니며, 예컨대통상의미생물배양용배지를포함하는임의의배지를제한없이사용할수있다. 또한, 본발명의배양액은특정한용도에따라임의의첨가물을추가로포함하여도무방하다. 예를들면, 본발명의배양액의체중감소효과를극대화하기위하여종래당업자에게공지되어있는임의의체중감소제를적절한함량으로포함할수있으며, 이때유효약물의구체적인함량범위는반복실험등을통해당업자가용이하게결정할수있음이자명하다. 또한, 본발명은상기유산균이생산하는박테리오신펩타이드및이를코딩하는유전자를제공한다. 본발명은본발명의박테리오신펩타이드를 " 가세리신 BNR17" 로명명하였으며, 서열번호 5로기재되는염기서열을갖는다. 본발명의박테리오신인가세리신 BNR17과종래에보고되어있는항균성펩타이드인가세리신 T (NCBI Blast Search No. AB029612, 서열번호 6) 의염기서열을비교한결과, 약 98% 의상동성이있음을알수있다. 또한, 본발명은상기가세리신 BNR17 유전자를포함하는재조합벡터를제공한다. 본발명의재조합벡터는일반적인대장균균주발현용벡터에서열번호 5로기재되는염기서열을갖는유전자를삽입함으로써제조될수있다. 본발명의재조합벡터의제조에사용될수있는모벡터는특정한종류에한정되는것은아니며, 일반적으로사용할수있는모든미생물발현용벡터, 바람직하게는대장균발현용벡터가제한없이사용될수있다. 또한, 본발명은상기재조합벡터로형질전환된형질전환체를제공한다. 상기형질전환체는상기제조합벡터를임의의숙주세포에도입시킴으로써용이하게제조될수있다. 상기숙주세포로는임의의진핵또는원핵생물, 다세포동물유래의세포주등이제한없이사용될수있음은당업자에게있어서자명하다. [0155] [0156] 산업상이용가능성상기에서살펴본바와같이, 본발명의락토바실러스가세리 BNR17은넓은생육온도및 ph 범위를가지고, 내산성, 내담즙성및장세포에대한부착활성이뛰어날뿐만아니라, 세균성미생물에대한높은항균활성을가지며체중증가억제효과를가지기때문에발효유및다양한발효제품뿐만아니라동물의사료를제조하기위한첨가제로도유용하게사용될수있다. 서열목록 - 9 -

10 [0157] 서열목록첨부 [0158] [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] 도면의간단한설명도 1은본발명의락토바실러스가세리 BNR17과락토바실러스가세리 KC26( 미국국립생물정보센터진뱅크 (GENBANK) 기탁번호 : AF243156) 의 16S rrna 서열을비교한것이다. 도 2는본발명의락토바실러스가세리 BNR17의장내부착활성을보여주는현미경사진이다. 도 3은본발명의락토바실러스가세리 BNR17이여러가지병원성세균에대한항균력이있음을보여주는사진이다. 도 4는본발명의락토바실러스가세리 BNR17의증식에따른포도당소비속도와다당류생성을보여주는그래프이다. ; 세포성장, ; 포도당농도, ; EPS( 다당류 ) 농도도 5는락토바실러스가세리 BNR17을섭취시킨래트의분변량을나타낸그래프이다. 도 6은락토바실러스가세리 BNR17을섭취시킨래트의분변중 EPS( 다당류 ) 농도를나타낸그래프이다. 도 7은본발명의락토바실러스가세리 BNR17을섭취시킨래트의소장이외의장기로부터분리된콜로니들의 RAPD-PCR 프로파일 (profile) 을보여주는전기영동사진으로서, 각각서열번호 7(A), 서열번호 8(B) 및서열번호 9(C) 로기재되는프라이머를이용하여실험한결과이다. 레인 1; Lb. gasseri BNR17, 레인 2-5; Lb. gasseri BNR17을섭취한래트의소장이외의장기로부터분리된콜로니들

11 [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] M; DNA 크기마커발명의실시를위한최선의형태이하, 본발명을실시예에의해상세히설명한다. 단, 하기실시예는본발명을예시하기위한것일뿐, 본발명의내용이하기실시예에의해한정되는것은아니다. 실시예 1. 모유로부터유산균의분리아기를분만한지 2주이내의여성의모유를채취하여인산완충용액을이용해적절하게희석한후원액과희석액을락토바실러스선택배지에도말하였다. 37 에서 2~3일간배양하여나타난콜로니들을형태및색깔별로구별하여다시순수분리하였다. 분리된콜로니에대해그람염색및현미경관찰을실시하여그람양성이면서막대형의형태를갖는콜로니만선별하였으며, 이들을 ph 6.8의 MRS 액체배지에서 37, 24시간배양하면서배양액의 ph가 4.5 이하로감소하는콜로니를재선별하였다. 이후 ph2.0의 MRS 배지에서 2시간배양한후다시 0.3% 의 oxgall이첨가된 MRS 배지내에서 9시간배양한경우에생존이가능한내산성, 내담즙성락토바실러스균주를분리하였고, 16S rrna 시퀀싱 (sequencing) 으로동정하여락토바실러스가세리종에속하는균주임을확인하였으며 ( 서열번호 1, 도 1 참조 ), 이를 " 락토바실러스가세리 BNR17" 로명명하였다. 실시예 2. 분리된유산균의당이용성확인실험상기에서분리된본발명의유산균주인락토바실러스가세리 BNR17의당이용성을 API50CHL 키트 (Biomerieux, France) 를이용하여다른표준균주들과비교한결과를하기표 1에나타내었다. 표 1에서, 5314는락토바실러스가세리 CECT5714; 5315는락토바실러스가세리 CECT5715; 11413은락토바실러스가세리 LMG11413; 18194는락토바실러스가세리 LMG18194; 4479는락토바실러스가세리 CECT4479; 18176은락토바실러스가세리 LMG18176; 13047은락토바실러스가세리 LMG13047을나타낸다

12 [0087] 표 1 [0088]

13 [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] 표 1에서알수있는바와같이, 본발명의락토바실러스가세리 BNR17 균주는락토바실러스가세리종의다른균주들과비교할때, 몇가지당의이용에있어확연한차이가있음을확인하였다 ( 굵은이탤릭체로표시 ). 실시예 3. 분리된유산균의효소활성상기에서분리된본발명의유산균주인락토바실러스가세리 BNR17의효소활성을 APIZYM 키트 (Biomerieux, France) 를이용하여다른표준균주들과비교한결과를하기표 2에나타내었다 는락토바실러스가세리 LMG13134를나타낸다. 표 2 [0094]

14 [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] 표 2에나타난바와같이, 본발명의락토바실러스가세리 BNR17 균주는락토바실러스가세리종의다른균주들과비교할때, 몇가지효소활성에있어차이가있음을확인하였다 ( 굵은이탤릭체로표시 ). 실시예 4. 내산성및내담즙성확인본발명의균주의내산성및내담즙성을확인하기위하여, 락토바실러스가세리 BNR17을 MRS 액체배지 4 ml에접종하여 37, 18~20시간배양한후, 이배양액의일정량을 ph 2.0으로조절한 MRS 액체배지에초기균수 10 7 CFU/ ml가되도록다시접종하였고, 37 에서 2시간배양한후 MRS 한천평판배지를이용하여생균수를측정하였다. 또한, 내산성실험을실시한배양액을그대로원심분리하여균체만회수한후 0.3% 황소담즙 (oxgall) 이첨가된 MRS 액체배지 (ph 6.8) 에접종하였고, 37 에서 9시간배양한후역시 MRS 한천평판배지를이용하여생균수를측정하였다. 그결과를표 3에나타내었다. 표 3 [0100] [0101] [0102] [0103] 그결과, 본발명의락토바실러스가세리 BNR17은 ph 2.0의강한산성처리에도불구하고생존율이높은것으로확인되었으며, 0.3% 황소담즙함유배지에서도생존이높게나타났다. 실시예 5. 장내부착능확인 RPMI1640 배지 (Gibco) 를이용하여인간의장상피세포인 CaCo-2 세포주를배양한플레이트에본발명의균주를일정균수 ( 약 10 7 CFU/ ml ) 가되도록접종하였다. 이를 37 에서 1시간배양한후인산완충용액으로 3회세척하

15 여비부착세포를제거한후메탄올로검체를고정하였다. 이후크리스탈바이올렛 (crystal violet) 으로염색하 여현미경으로세포를관찰하였다. 그결과, 본발명의락토바실러스가세리 BNR17 이 CaCo-2 세포에잘부착함 을확인하였다 ( 도 2). [0104] [0105] [0106] [0107] 실시예 6. 병원성세균에대한항균력확인 BHI 액체배지 (Difco) 에서 37, 18시간배양한대장균 (E. coli), 황색포도상구균 (S. aureus), 살모넬라균 (S. typhimurium), 바실러스균 (B. cereus), 리스테리아균 (L. monocytogenes), 프로테우스균 (P. mirabilis) 을초기균수 10 5 CFU/ ml가되도록 5 ml의 BHI 한천배지 ( 한천 0.7% 함유 ) 6개에각각접종한후, 이를 BHI 한천배지 (1.5% 한천함유 ) 를부어굳힌 6개의평판배지위에각각겹쳐부었다. 6개의배지를굳힌후각배지에직경이약 4 mm되는웰 (well) 을뚫고그위에 37, 24시간배양한본발명의유산균의배양상층액 (2배농축액 ) 40 μl를첨가하여 37, 5시간배양하였다. 그결과, 웰주위에뚜렷한생육저해환을관찰할수있었으며, 따라서본발명의균주는여러가지병원성세균에대한항균력이있음을확인하였다 ( 표 4 및도 3). 표 4 [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] [0114] [0115] [0116] [0117] 실시예 7. 항생제내성확인 MRS 한천평판배지에면봉으로락토바실러스가세리 BNR17 배양액을도말한후에리스로마이신 (Erythromycin), 페니실린 (Penicillin), 젠타마이신 (Gentamicin), 카나마이신 (Kanamycin), 스트렙토마이신 (Streptomycin), 바시트라신 (Bacitracin), 클로람페니콜 (Chloramphenicol), 반코마이신 (Vancomycin), 테트라사이클린 (Tetracycline), 암피실린 (Ampicillin), 세폭시틴 (Cefoxitin), 리팜핀 (Rifampin), 네오마이신 (Neomycin), 날리딕산 (Nalidixic acid), 시프로플록삭신 (Ciprofloxacin), 폴리믹신 B(Polymixcin B), 트리메토프림 (Trimethoprim) 이첨가되어있는원형디스크를올려놓은후 37, 24시간배양하였다. 그결과, 본발명의락토바실러스가세리 BNR17은젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신및바시트라신, 네오마이신, 날리딕산, 시프로플록사신, 폴리믹신 B, 트리메토프림에대해내성을나타내었다. 실시예 8. 항균펩타이드유전자의검출락토바실러스가세리종이생산하는것으로알려진항균펩타이드인박테리오신유전자의염기서열에특이적인서열번호 3 및서열번호 4로기재되는프라이머 (primer) 를만들고, 본발명의락토바실러스가세리 BNR17의게놈 DNA를주형 (template) 으로이용하는중합효소연쇄반응 (PCR) 법으로박테리오신유전자의유무를조사하였다. 그결과, 락토바실러스가세리 BNR17로부터박테리오신인가세리신 (gassericin) 에해당하는 PCR 산물을확인하였으며, 그염기서열을서열번호 5로기재하였다. 상기염기서열은종래에보고되어있는서열번호 6으로기재되는가세리신 T (NCBI Blast Search No. AB029612) 의염기서열을비교한결과, 약 98% 의상동성을나타내었다. 실시예 9. β-글루쿠로니다제 (glucuronidase) 활성측정장내세균이생산하는 β-글루쿠로니다제는발암효소의하나로알려져있어이효소의활성을나타내는균주는유해한균주로간주된다. 본발명의락토바실러스가세리 BNR17이 β-글루쿠로니다제활성이있는지여부를확

16 인하기위하여에이피아이자임키트 (APIZYM kit)(biomerieux, France) 를사용하여효소활성을조사하였다. [0118] [0119] 그결과, 본발명의균주는 β- 글루쿠로니다제활성을나타내지않는안전한균주임을확인하였다 ( 표 5). 표 5 [0120] [0121] [0122] 실시예 10. 포도당소비와다당류생성 포도당을 2% (w/v) 직접첨가하여제조한 MRS 배지 (Difco) 를제조하여락토바실러스가세리 BNR17 을최종균수 10 6 cfu/ ml가되도록접종한후, 96 시간배양하면서균수변화를측정하였으며, 동시에포도당소비와다당류 (extracellular polysaccharide, EPS) 생성양상을조사하였다. [0123] [0124] [0125] [0126] [0127] [0128] 그결과, 락토바실러스가세리 BNR17은배양 12시간만에최고균수에도달하였으며이후로는생균수가감소하였다. 이때, 포도당농도는배양 7시간이후급격히감소하였으며 36시간이후로는큰차이를보이지않아대부분의포도당이 36시간내에소비되는것으로나타났다. EPS 생성은배양 24시간째에최대농도인 520 mg /l에도달하였다가 36시간째에약간감소하였으나이후다시증가하는양상을보였는데, 이는균체가사멸기에접어들면서자가분해 (autolysis) 현상이나타나균체내부의여러가지다당류성분이배양액내로유출된때문인것으로생각된다 ( 도 4). 실시예 11. 락토바실러스가세리 BNR17이생성하는다당류의소화효소에의한분해여부확인먼저,α-아밀라제(amylase, Sigma) 와판크레아틴 (pancreatin, Sigma) 100 mg을각각 0.05 M 포스페이트버퍼 (ph 7.0) 에녹였다. 락토바실러스가세리 BNR17의배양상층액으로부터추출한다당류 (EPS) 용액 200 μl에상기효소액 50 μl와 0.05 M 포스페이트버퍼 (ph 7.0) 150 μl을첨가한후 37, 1시간반응시켰다. 효소의불활성화를위해 100, 15분간가열한후실온에서식힌다음포도당키트 (Sigma) 를이용하여포도당의농도를측정하였다. 그결과, 각소화효소를처리하기전 BNR17의다당류용액내에서는포도당이검출되지않았으며, 판크레아틴과 α-아밀라제로처리했을경우에는각각 3.70 mg /l, 19.1 mg/l가검출되었다. 상기결과는 BNR17이생성하는다당류가소화효소에의해거의분해되지않음을나타낸다. 실시예 12. 락토바실러스가세리 BNR17의체중증가억제효과확인 8주령된수컷 SD 쥐 (rat) 를두그룹으로나누어한그룹에는 PBS (ph 7.4) 를, 그리고다른그룹에는락토바실러 스가세리 BNR17을최종균수 10 9 CFU/ ml가되도록현탁시킨 PBS액을 8주간매일경구투여하면서일주일에한번씩체중및급이량, 콜레스테롤등의혈액화학치의변화를측정하였다. 또한, 분변량과분변중의 EPS 양을측정함으로써 BNR17의다당류생성능이실제체중증가억제에미치는영향을조사하였다. 8주후에는모든실험동물을해부하여간, 신장, 비장, MLN (mesenteric lymph node) 을적출하여각각그무게를측정하였다. 이와동시에적출한각조직의일부를균질화한후락토바실러스속의선택배지인 LBS 아기 (agar) 에도말, 배양하여나타난콜로니들의 RAPD (random amplified polymorphic DNA)-PCR 프로파일을조사하고, 이를락토바실러스가세리 BNR17 균주의 RAPD-PCR 프로파일과비교함으로써투여군의다른장기로의전이여부를조사하였다. [0129] 그결과, PBS 액을경구투여한대조군의경우 8 주간약 179.1% 의체중증가를보였으나, 락토바실러스가세리 BNR17 을경구투여한실험군은약 171.6% 의체중증가를보였다 ( 표 6). 또한, 1 일체중증가도와식이효율에 있어서도대조군에비해유의적으로낮은수치를나타내었다

17 [0130] 표 6 [0131] [0132] 상기에서, 식이효율비율 (food efficiency ratio, FER) 은체중증가 (g/day)/ 섭취한음식 (g/day) 을나타내며, * P <0.05, ** P<0.05 이다. [0133] [0134] [0135] 대조군과실험군의분변량과분변중 EPS의양을측정한결과는도 5 및도 6에나타내었다. 분변량에있어서는두그룹사이에큰차이를보이지않았으나분변중함유되어있는 EPS의양은 BNR17을섭취시킨실험군에서크게증가하는것으로나타났다. 따라서, 락토바실러스가세리 BNR17이체내로섭취되는당성분을소화되기어려운다당류성분으로전환시켜체외로배출시켜체내흡수율을낮춤으로써체중증가억제를유도할수있음을확인하였다. 한편, 균주의인체섭취시요구되는안전성을알아보기위해혈액화학치와장기무게를측정한결과, 대조군과실험군의두그룹간유의적인차이를보이지않아부작용을유발하지않는것으로나타났다 ( 표 7 및표 8). 표 7 [0136] [0137] 표 8 [0138] [0139] [0140] [0141] [0142] [0143] 상기표 8에서, 각수치는장기의무게 (g)/ 쥐 (rat) 의체중 (g) 으로나타낸다. 또한, 투여한균이소장이외의장기로전이되는지의여부를조사하기위하여, 서열번호 7 내지서열번호 9로기재되는염기서열을갖는프라이머 p1, p2 및 OPL5를이용하여각장기별로 LBS 아가플레이트 (agar plate) 에서자란콜로니들의 RAPD-PCR 프로파일을조사하였다. 상기 PCR 조건은프라이머 p1과 p2의경우, 94 (2분 ), 36 (5분 ), 72 (5분 ) - 4 cycles/94 (1분 ), 36 (1분 ), 72 (2분 ) - 36 cycles이었으며, OPL5의경우 94 (2 분 ) - 1 cycle/94 (40초 ), 45 (1분 ), 72 (1분 ) - 2 cycles/94 (40초 ), 52 (1분 ), 72 (3분 ) - 30 cycles/70 (5분 ) - 1 cycle이었다. 그결과, BNR17과같은프로파일을보이는콜로니는없었다 ( 도7). 따라서, BNR17은인체섭취시소장이외의다른장기로전이되지않는안전한균인것으로나타났다. 제조예 1. 발효유의제조탈지분유를이용하여무지유고형분함량을 8~20 중량 % 로조정한원료유를 72~75 에서 15초간살균하였다

18 살균된원료유를일정온도까지냉각시킨후, 본발명의락토바실러스가세리 BNR17 균주를 10 6 cfu/ ml의농도로접종하여 ph 4~5가될때까지배양하였다. 배양완료후배양액을냉각시켰다. 한편, 과즙농축액 0.1~50 중량 %, 식이섬유 0.1~20 중량 %, 포도당 0.5~30 중량 %, 올리고당 0.1~15 중량 %, 칼슘 0.001~10 중량 %, 비타민 ~5 중량 % 를녹여시럽을제조하였다. 이렇게제조된시럽을살균한후냉각하여상기배양액과일정비율로혼합? 교반하여균질화시킨후용기에포장하여발효유를제조하였다. 이렇게제조된발효유는관능검사결과풍미, 물성, 전체적인맛에있어서양호한결과를보였다. [0144] [0145] 제조예 2. 유산균균말의제조본발명의락토바실러스가세리 BNR17을 MRS 액체배지에 10 6 cfu/ ml의농도로접종하여 37 에서 18~24시간동안 ph-조절발효 (ph-control fermentation) 를실시하였다. ph 조절 (control) 은 30 부피 % NaOH를중화제로하여 ph 5.7±0.2로실시하였다. 배양완료후 4 에서 10,000xg로원심분리하여균체를회수하였다. 전체조성물에대해 5 중량 % 탈지유, 2.5 중량 % 유장 (whey), 5 중량 % 수크로스 (sucrose) 가함유된보호제를준비하고, 상기에서회수한균체를보호제와동량으로혼합한후동결건조기를통해분말화하였다. 이렇게제조된락토바 실러스가세리 BNR17 의건조균말은모두 cfu/g 이상의생균수를나타내었다. 상기보호제는 10 중량 % 트레할로즈 (trehalose), 10 중량 % 말토덱스트린 (maltodextrine), 7.5 중량 % 락토즈 (lactose) 를추가로함유 하고있어도무방하다. [0146] [0147] 제조예 3. 유산균제제제조제조예 2에서제조한유산균균말을이용하여유산균식품, 정장제등의유산균제제를제조하였다. 이를위하여, 락토바실러스가세리 BNR17의건조균말 20 중량 % 에올리고당 10 중량 %, 무수포도당 20 중량 %, 결정과당 5 중량 %, 비타민 C 2 중량 %, 과일분말향 5 중량 %, 알로에 5 중량 %, 식이섬유 15 중량 %, 차전자피 18 중량 % 를혼합하여스틱또는병에일정량분주하여포장하였다. 이렇게제조된유산균제제는 cfu/g 이상의 생균수를유지하였다. [0148] [0149] [0150] [0151] 제조예 4. 사료첨가용조성물의제조락토바실러스가세리 BNR17을포함하는본발명의사료첨가용조성물을하기표 9의조성으로제조하였다. 표 9 사료첨가용조성물의구성비율 ( 단위 : 중량 %) [0152] [0153] [0154] 상기에서, 효소제제는파이타제, 셀룰라제, 자일라나제, 말타제및전환효소의혼합제제를사용하였고, 비병원 성미생물로는아스퍼질러스오리자에를사용하였다

19 도면 도면 1 도면

20 도면 3 도면 4 도면

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2. 탄수화물 (Carbohydrate)

2. 탄수화물 (Carbohydrate) 목차 2-1. 탄수화물의분류 2-2. 부제탄소와입체이성질체 2-3. 단당류의고리구조 2-4. 변선광과환원당 2-5. 주요단당류 2-6. 알도오스의산화-환원반응 2-7. 주요소당류 2-8. 주요다당류 2-9. 검류 2-1. 탄수화물의분류 탄수화물 : 탄소의수화물, C m (H 2 O) n (m > 3) 당질 + 섬유질