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오중 제
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1 J. Appl. Biol. Chem. 54(2), (2011) Article Bacillus licheniformis 로부터분리된 phospholipase D 유전자의발현및생화학특성 강한철 * 윤상홍 이창묵 구본성 농촌진흥청, 국립농업과학원, 기능성물질개발과 Expression and Biochemical Characteristics of a Phospholipase D from Bacillus licheniformis Han-Chul Kang*, Sang-Hong Yoon, Chang-Muk Lee, and Bon-Sung Koo Department of Functional Bio-material, National Academy of Agricultural Science, Rural Development Administration, Suwon , Korea Received April 21, 2011; Accepted May 23, 2011 A gene encoding a putative phospholipase D was isolated from Bacillus licheniformis and cloned into pgem-t easy vector. The gene was expressed in E. coli BL21 (DE3) using a pet-21(a) vector containing His6 tag. Affinity purification of the recombinant phospholipase D with nickelnitrilotriacetic acid (Ni-NTA) resin resulted major one-band by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis. The purified enzyme showed a molecular weight of 44 kda. The optimum activity of enzyme was around ph 7.0 and the enzyme was also the most stable around this condition. The optimum temperature was about o C and the enzyme still showed considerable activities at wide range of temperature. Among various detergents, Triton X-100 significantly increased the enzyme activity, resulting in 181% activity of control at 0.6 mm of the detergent. Calcium ion did not significantly affect the enzyme activity, suggesting that the enzyme might be classified into Ca 2+ -independent PLD. Key words: Bacillus licheniformis, phospholipase D 서 Phospholipase D (PLD; EC ) 는 phospholipase 의일종이며 cardiolipin synthases, phosphatidylserine synthases, 일부 endonucleases 들을포함하는 superfamily 의 member 이다. 다른종류의 phospholipase [A, B, 또는 C] 와달리 D 형인 PLD 는최초에 carrot, cabbage, castor bean 등의식물체로부터분리되고특성이연구되어왔다. PLD 의역할과관련하여과거에는식물체와포유류에서의 signal transduction 에서의중요한역할에대하여많은관심을가져왔다. 그러나 PLD 의기능이점점더밝혀져서 transmembrane signaling 이외에도, intracellular protein trafficking, secretion, cell morphology 의변화, membrane degradation, reorganization 및 cell regulation 등다양한기능을수행하는것으로알려지고있다 [Takami 등, 1994; Exton, 2002; Wang, 2004]. PLD 는두가지반응을수행할수 론 *Corresponding author Phone: ; Fax: hckang09@korea.kr doi: /jabc 있다. 첫번째는 phospholipid 를가수분해시켜 phosphatidic acid 와 free alcohol 을만드는반응. 즉, phosphatidylcholine 과같은 phospholipid 를분해시킬경우 phosphatidic acid 와 choline 이형성된다. 두번째로는 phosphatidyl group 을여러종류의 phosphatidyl alcohols 에부착시키는 transphosphatidylation 반응을수행한다 [Waite, 1999; Liscovitch 등, 2000]. PLD 에의하여생성되는이러한두가지반응은서로경쟁관계에있으며 transphosphatidylation 반응에의해생성된화합물들이종종 PLD 에의해분해가되기도한다 [Juneja 등, 1988]. Glycerophospholipid 의경우에는이효소들이두종류의 acyl ester 분해를촉매시키며 (phospholipase A1 및 A2) 또한두종류의 phosphate ester 결합을분해시킨다 (phospholipase C 및 D). 거의대부분의 PLD superfamily 는잘보존된부위인 HxKxxxxD 를가지고있으며이부위를 HKD motif 라고한다 [Waite, 1999; Jenkins 와 Frohman, 2005]. 식물세포에서발견되는 PLD 는 PX 및 PH 부위를가지고있는데이부분은단백질의 membrane targeting 및 polyphosphoinositide signaling 에관여한다 [Ulbrich-Hofmann, 2000; Qin 와 Wang, 2002; Leeuwen 등, 2004]. 그러나미생물의 PLD 들은이러한조절부위가없는것으로현재까지알려지고있다. 미생물의 PLD 는 94

2 Bacillus licheniformis 의 phospholipase D 특성 95 Streptomyces 로부터비교적연구가많이된편이다 [Shimbo 등, 1993; Iwasaki 등, 1994; Ogino 등, 1999; Hatanaka 등, 2002]. 일부포유류및식물체또는 yeast 의 PLD 종류들 [Qin 등, 1997; Sciorra 등, 1999] 은 phosphoinositide 결합부위를갖추고있으며이는 calcium 과의결합을통하여효소활성에관여하는것으로알려지고있다 [Zheng 등, 2000]. PLD 연구가비교적많이이루어진 bacteria 인 Streptomyces 종으로부터분리된일부의 PLD 는기존의 PLD 와는다르게두종류의금속이온 ( 철및망간 ) 을보효소로함유하는것으로알려지고있다 [Zambonelli 등, 2003]. 대부분의 Streptomyces 의 PLD 들은 Ca 2+ 의농도에무관하게효소반응이이루어지는데반하여 S. chromofuscus 의 PLD 들은 Ca 2+ 에의해효소활성이촉진될정도로미생물자원의 PLD 는그특성이다양한것으로판단되고있다 [Yang 과 Roberts, 2002]. Bacteria 의 PLD 들이대부분세포외배출단백질인경우가많으며 N-terminal signal sequence 를갖추고있으나식물체, 효모, 포유류의 PLD 들은이러한 sequence 가없다. 분자량의경우에있어서 Streptomyces hachijoensis 의 PLD 경우는적은것이 16 kda 에서 [Okawa 과 Yamaguvhi, 1975] 대부분의 kda 까지분포하고있으며 [review; Wang, 2004; Jenkins 와 Frohman, 2005] Homo sapiens 는 120 kda [Sung 등, 1999] 에이를정도로다양하게알려지고있다. 한편 PLD 는생체내에서의다양한역할이외에도생물공정산업에서여러종류의 phospholipid 전이반응을촉매시키는데이용되어오고있다 [Servi, 1999; Ulbrich-Hofmann 2000; Maria 등, 2007]. 그외에도식품가공에서 emulsifier 유사체물질인 lysolecithin 또는 monoglyceride 등의생산에도활용되고있다 [Maria 등, 2007]. 일반적으로식물체에서추출된 PLD 는열에약한경우가많아 [Lambrecht 와 Ulbrich-Hofmann, 1992] 생물공정에활용하기에부적절한것으로알려지고있다. 현재까지 PLD 관련유전자들은 bacteria 에서포유류동물에이르기까지다양한재료에서분리가되었다. 그러나미생물에서는 PLD 가대부분 Streptomyces 에서연구가많이되고상대적으로다른미생물에서의연구는대체로부족한편이다. 지금까지많은종류가알려진고등동식물의 PLD 는비교적생체내에서의기능이많이알려져왔으나 bacteria 의 PLD 는기능이거의알려지지않고있다. 또한박테리아의 PLD 는산업적으로유용하게이용될수있는가능성까지도있다. 따라서본연구에서는 bacteria 의일종인 Bacillus 에서 PLD 유전자를분리하여 E. coli 에서발현시킨다음순수분리하여그생화학특성을조사한결과를보고하고자한다. 재료및방법 균주및배양조건. 본실험에서사용된 Bacillus licheniformis (KACC 10476) 는 Korean Agricultural Culture Collection (KACC) 에서분양을받았으며 beef extract 1.0 g/l, yeast extract 2.0 g/l, peptone 5.0 g/l 및 NaCl 5.0 g/l 로제조된배지에서배양하였다. E. coli 는 tryptone 10 g/l, yeast extract 5 g/l 및 NaCl 10 g/l 으로조성된배지에 100 µg/ml 의 ampicillin 을투여하여배양하였다. E. coli DH5α 는 Bacillus 로부터분 리한 PLD 후보유전자의클로닝에이용되었으며 T7 RNA polymerase 유전자를보유하고있는 E. coli BL21 (DE3) 는분리된유전자의발현에이용되었다. PLD 유전자의클로닝. Bacillus 균주는 30 o C 에서 150 rpm 의속도로 24 시간동안진탕배양한후원심분리에의해회수하였다. 전체의 genomic DNA 는 genomic DNA 분리 kit (Bioneer, Daejon, Korea) 를사용하여분리하였으며 20 o C 에보존하면서실험에사용하였다. Bacillus 로부터의 PLD 후보유전자는 NCBI 유전자은행 (1191 bp; NCBI, GI ) 을참조하여선정하였다. PLD 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로분리하기위하여 sense primer 로서 5-ttg gtg ccg ctt atg att atg gta-3 을그리고 antisense primer 로서 5'- taa aaa gaa tga aat cga ttt cgc-3 를이용하였다. 증폭되는유전자는발현벡터에서 His-6 재조합단백질을만들기위하여 stop codon 을제거하도록프라이머를구성하였다. PCR 반응조건은 94 o C 에서 5 분동안 denaturation, 58 o C 에서 20 초동안 annealing, 72 o C 에서 1 분 30 초동안 amplification 의과정을 25 회반복하여수행하였다. 증폭된유전자를 pet-21(a) 발현벡터에삽입시키기위하여 N-terminal 의시작부위에 Nde I 을부착하기위한 2 차 PCR 을시도하였으며이때 sense primer 로서 5'-cat atg gtg ccg ctt atg att atg-3'( 밑줄부분은 Nde I 적응부위 ) 을이용하였고 antisense primer 는 1 차 PCR 에서와같은 primer 를사용하였으며 PCR 조건도같았다. 이렇게얻어진 PCR 산물은분리하여 pgem-t Easy vector (Promega, Sanfrancisco, CA) 에결합시킨다음에 E. coli DH5α 세포에형질전환시켰다. 형질전환된대장균은 ampicillin (100 µg/ml), isopropyl β-dthiogalacto-pyranoside (IPTG; 0.5 mm) 및 5-bromo-4-chloro-3- indolyl β-d-galacto-pyranoside (75 µg/ml) 를함유하는 agar 함유고체배지에서 37 o C 조건으로 24 시간동안배양하였다. PLD 유전자를함유하는벡터는상업용 plasmid 분리 kit (DyneBio, Daejon, Korea) 를사용하여분리한후 DNA sequence 분석에의하여목적유전자의삽입을확인하였다. 목적하는유전자가삽입된 pgem-t easy vector 는 Nde I 및 Sal I 으로분해시켜삽입유전자를추출한후역시같은제한효소들로절단시킨 pet-21(a) 에결합시켰다. 이렇게만들어진발현벡터는 pet-21-pld 로명명하였다. PLD 유전자의발현및조단백질추출. pet-21-pld 는 E. coli BL21 (DE3) 세포에형질전환시킨후 ampicillin 함유 LBagar 배지에서배양하였다. 선발된 colony 는같은액체배지에서 A 600 가 0.5 가량될때까지배양한후충분한량의단백질을얻기위해 200 ml 의배지에접종하였다. 두시간의추가배양이후 1mM 의 IPTG 를첨가하고 27 o C 에서 50 rpm 의조건으로 10 시간동안배양하였다. 배양된균체는원심분리에의해회수한후완충용액 A (20 mm Tris-HCl, ph 7.9, 500 mm NaCl, 및 5 mm imidazole) 로씻어냈다. 세포들은같은완충액으로현탁시킨후초음파의방법으로파쇄시키고상온에서원심분리 (10,000 g, 10 분 ) 의방법에의해상등액을회수하였다. PLD 의친화크로마토그라피분리. 50 ml 의완충액 A 에녹인조단백질은 Ni(II) 이온으로 charge 시키고같은완충액으로충전시킨 nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) resin column

3 96 강한철 윤상홍 이창묵 구본성 (1 10 cm) 에통과시켰다. 컬럼은완충용액 B (20 mm Tris-HCl, ph 7.9, 500 mm NaCl, 및 80 mm imidazole) 로씻어냈고이어서 resin 에결합된단백질은추출용완충용액 (50 mm Tris-HCl ph 7.9, 500 mm NaCl, 및 mm imidazole linear gradient) 을이용하여 0.5 ml/min 의비교적느린속도로용출시키며단백질분획을회수하였다. PLD 를함유하는단백질분획은효소활성도를측정하여추적하였다. 효소활성도를갖는단백질분획들은완충용액 C (20 mm Tris-HCl, ph 7.5, 200 mm NaCl, 20% glycerol, 및 2mM EDTA) 를이용하여 4 o C 에서 12 시간동안투석시켰다. 이중에서효소활성도가가장높은분획을이용하여전기영동분석및각종생화학실험을수행하였다. PLD 의효소활성측정. PLD 의효소활성도는 D Arrigo 등의방법 [1955] 에따라 spectrophotometry 의방법에의해측정하였다. 즉, 효소반응은 50 mm Tris-HCl (ph 7.0), 10 mm CaCl 2, p-nitrophenylphosphocholine (25 µmol), 2.5 unit 의 phosphatase (from potato, Sigma, St Louis, Missouri) 용액을이용하였다. 효소반응은기질과효소를첨가하여시작하였고 37 o C 에서 30 분간반응시킨후 100 o C 에서 5 분간처리하여효소반응을중단시켰다. Phosphatase 에의하여유리된 p-nitrophenol 의생성량은 400 nm 를측정하여계산하였다. 효소활성도 1unit 은 1 분동안에 1µmol 의 p-nitrophenol 을생산하는효소의량으로정의하였다. 효소의활성도및안정화도에미치는 ph, 온도및양이온의영향. 효소반응에미치는 ph 효과에있어서 ph 은 potassium phosphate 를사용하였고 ph 은 Tris-HCl 완충용액을사용하였다. 이와같이효소반응을위한완충용액만다르게한후효소반응은상기와같이표준효소반응측정법으로활성도를측정하였다. ph 변화가효소의안정성에미치는영향을실험하기위하여분리된효소분획 100 µl 를서로다른완충액에녹였으며이때사용된완충액의 ph 범위는 4.0 에서 10.0 까지였다. ph 4.0 에서 5.0 까지는 citrate phosphate 를 ph 6.0 에서 7.0 까지는 potassium 완충액을그리고 ph 8.0 에서 11.0 까지는 Tris-HCl 완충액을사용하였다. 이렇게서로다른완충용액에녹인효소는실내온도 ( 약 25 o C) 에서 4 시간동안보존하였다. 잔여활성도를측정하기위하여 50 µl 를회수한후 ph 7.0 에서표준효소활성측정방법에의해 PLD 의효소활성도를측정하였다. PLD 의효소활성도에미치는온도효과는최적 ph 조건하에서 15 o C 에서 50 o C 의범위의서로다른온도에서효소반응을시킨후표준효소활성도측정법으로잔여활성도를측정하였다. 나머지모든조건은표준활성도측정법에의하여활성도를측정하였다. PLD 의효소활성에미치는 2 가금속이온의영향은표준활성도측정법의조건에서금속이온을첨가하는방법에의하였고나머지모든조건은같았다. 금속이온으로서는 Mg 2+, Mn 2+, Co 2+, Zn 2+, 및 Fe 2+ 를비금속성양이온으로는 K + 및 Ca 2+ 를사용하였다. 기타분석방법. 단백질농도는 Bradford[1976] 의방법에준했으며표준단백질로 bovine serum albumin 을사용하였다. 전기영동 (SDS-PAGE) 은 Laemmli [1970] 의방법에따라서 5% 의 stacking gel 과 12.5% 의 resolving gel 을사용하였고 Fig. 1. SDS-PAGE analysis of a PLD from B. licheniformis. Lane M, molecular mass markers; lane 1, crude extract from E.coli BL21 (DE3) harboring pet-21 vector without insert gene (i,e., vector control); lane 2, crude extract from E. coli BL21 (DE3) transformed with pet-21-pld; lane 3, the PLD purified by affinity chromatography using Ni-NTA resin. Coomassie Brilliant Blue R-250 으로단백질들을염색하였다. 결과및고찰 PLD 의 E. coli 내에서의발현및단백질분리. 발현벡터에삽입된 PLD 유전자로부터보다충분한양의단백질을얻기위하여발현벡터가삽입된 E. coli BL21 (DE3) 을일반적인배양조건인 200 rpm, 37 o C 에서배양하였고 IPTG 를이용하여단백질을과량발현시켰다. 그러나이조건에서발현시킨 PLD 는응집체가생성되는것으로판단되었다. 따라서 E. coli 는보다낮은온도인 27 o C 의조건에서비교적느린속도인 50 rpm 으로교반하면서배양하였으며이러한조건에서용해성단백질을얻어냈다. 단백질이발현되는균체는 2 시간간격으로 16 시간까지표본을채취하고효소활성도를측정한결과이러한조건에서는 10 시간가량발현시킬때 16.8 U/mg protein 을나타내상대적으로가장많은 PLD 가생성되는것으로판단되었다. 따라서이조건에서발현시킨단백질은세포내에상당히높은비율로축적된상태이기때문에친화크로마토그라피로비교적쉽게분리되었다 (Fig. 1). 분리된단백질분획중에서효소활성도가가장높은분획을환원제인 β-mercaptoethanol 로처리하여전기영동을시도하였으며약 44 kda 의주요단일밴드를나타내고있다. 이러한분자량은 NCBI data bank 에서유추된 Da 과상당히근접된결과를나타내고있다. 분리된단백질은약 16.5 U/mg protein 의 specific activity 를나타내었다. 방선균의일종인 Shewanella sp 또는다른박테리아인 Streptomyces sp. YU100 에서분리된 PLD 의분자량은각각 64 및 70 kda [Tsuruta 등, 2007; Lee 등, 2009] 의분자량을보여본실험에서분리된 PLD 와차이를보이고있다. 그러나다른 bacteria 인 Streptomyces tendae 의 PLD 는 43 kda 의분자량을나타내본실험의 PLD 와상당히비슷한결과를보이고있다

4 Bacillus licheniformis 의 phospholipase D 특성 97 Fig. 2. ph effect on the PLD activity of B. licheniformis. The reaction mixture was consisted of potassiume phosphate for ph and Tris-HCl for ph Maximum activity was considered as 100%, equivalent to 15.4 U/mg protein. [Simkhada 등, 2007]. 한편박테리아의일종인 Corynebacterium pseudotuberculosis 의 PLD 는상당한독성을나타내며인체내에침투할경우 macrophage 의사멸에관련되는것으로알려져있다 [Mckean 등, 2007]. 이와같이 membrane 을공격하는단백질의경우일반적인발현벡터를이용하여 E. coli 에서의발현시킬때어려움을겪는경우가종종있다. 그런데본실험에서는 PLD 가용해성상태로발현되었는데도균주가지속적으로성장한점으로보아본실험의효소와약 41% homology 를보이며독성을나타내는 C. pseudotuberculosis 의 PLD 와는서로다른것으로판단된다. 최적 ph 및 ph 안정성. PLD 의활성도에미치는 ph 효과를시험하기위하여 ph 5.0 에서 11.0 까지의서로다른 ph 조건에서효소활성도를측정하였다 (Fig. 2). 최적활성도는 ph 7.0 근처에서나타났으며 ph 9.0 의조건에서도여전히최대활성도의 65% 를보였다. 약산성인 ph 6.0 에서는약 80% 의효소활성도를나타내었고 ph 5.0 에서는매우낮은효소활성도를나타내고있다. 이와같이전체적으로볼때산성 ph 보다는중성및약알칼리성 ph 조건에서보다높은효소활성도를나타내고있다. 이러한최적 ph 는 Actinomycetes 에서분리된 PLD 와비슷한결과를나타내고있다 [Lim 등, 2002]. 한편 Streptomyces 의 PLD 들은대부분최적 PH 가 7.0 또는 8.0 을나타내어 [Imamura 와 Horiuti, 1979; Simkhada 등, 2007] 본실험에서와약간의차이만을보이고있다. PLD 의안정성에미치는 ph 의효과를여러 ph 범위에서조사하였으며비교적충분한시간인 4 시간동안의처리이후표준효소활성도측정법으로활성도를조사한결과가 Fig. 3 과같다. 잔여활성도를측정하였을때 PLD 는전반적으로산성또는알칼리성보다는중성 ph 에서비교적안정함을보이고있다. 이효소는 ph 7.0 에서가장안정하였으며 ph 8.0 에서도여전히 82% 의잔여활성도를보이고있다. 한편비교적산성인 ph 5.0 또는알칼리성인 ph 9.0 으로 ph 가변화할경우각각 64 및 60% 의잔존활성도를나타내어점점효소의안정도가떨어짐을알수있었다. 최적온도및열안정성. 분리된 PLD 의최적온도를시험하기위하여표준효소활성도측정조건에서온도만다르게효소활성을측정하였다 (Fig. 4). PLD 는 o C 에서최적활성 Fig. 3. ph stability of the PLD from B. licheniformis. The PLD preparation was suspended in different buffers ranging from ph 4.0 to 11.0; 50 mm citrate phosphate buffer for ph , potassium phosphate for ph , and Tris-HCl for ph After 4 h standing, each aliquot was withdrawn and the enzyme activity was measured under standard assay condition. Maximum activity at ph 7.0 was considered as 100% activity equivalent to 14.2 U/mg protein. Each point represents the average of three experiments. Fig. 4. Effect of temperature on the PLD activity of B. licheniformis The PLD activity was measured at different temperatures under the standard assay condition. The maximum activity was observed at 45 o C, thus this activity was considered as 100% activity, which was equivalent to 15.6 U/mg protein. Each point represents the average of three experiments. 도를나타내었고비교적넓은범위의온도에서상당히높은효소활성도를나타내었다. 비교적높은온도인 50 o C 의온도조건에서도최대활성도의약 60% 의효소활성도를나타내었다. 그러나 25 o C 의온도조건에서는약 45% 의효소활성도를나타내었다. 따라서분리된효소는일반적인효소의최적온도인 37 o C 보다조금높은온도에서최적활성도를보이는특성을나타내고있다. 다른 bacteria 인 Streptomyces 종류에서분리된 PLD 들도비교적높은온도에서최적활성을보이고있어본실험과비슷한결과를나타내었다 [Juneja 등, 1988; Hatanaka 등, 2002; Simkhada 등, 2007]. 분리된효소의열안정성은효소를 45, 55, 및 65 o C 의온도에서일정시간동안보존한다음잔여활성도를측정하는방법으로실험하였다 (Fig. 5). 이러한온도에서 20 분동안열처리시킨이후의잔여활성도는각각 73, 51, 33% 의활성도를나타내었다. 그러나 30 분동안의열처리이후에는각각 33, 24 및 12% 의잔여활성도를나타내었다. 따라서분리된효소는열안정성에있어서 Streptomyces 에서분리된 PLD 와비슷한수준으로평가된다 [Shimkada 등, 2007].

5 98 강한철 윤상홍 이창묵 구본성 Table 2. Effect of various detergents on the activity of PLD from B. licheniformis Fig. 5. Thermal stability of PLD from B. licheniformis. The PLD was suspended in Tris-HCl (ph 7.0) at different temperature (- -, 45 o C; - -, 55 o C; - -, 65 o C). After heat treatment for 30 min, residual activities were measured under standard assay condition. Maximum activity of the enzyme was considered as 100%, equivalent to12.5 U/ mg protein. Detergents (0.5 mm) Type of ion Relative activity (%) None 100 Triton X-100 Non ionic 152 Tween 20 Non ionic 87 Tween 80 Non ionic 67 Deoxycholic acid Anionic 21 SDS Anionic 5 CHAPS Zwitter ionic 127 Note: One hundred percent activity of the enzyme was 13.5 U/mg protein. Table 1. Effect of various divalent cations on the activity of PLD from B. licheniformis Reagents Relative activity 2 mm 5 mm None 100 Ca Mg Mn Co Zn Cu Fe Each counter part ion was chloride and 100% enzyme activity was equivalent to 12.2U/mg protein. PLD의활성도에미치는 2가양이온효과. PLD에대하여여러종류의 2가양이온 (2 및 5.0 mm) 존재하에서효소활성도를측정한결과는 Table 1과같다. 여러 2가양이온중에서 Mg 2+ 은효소활성을상당히높이는효과를나타내었는데대조구에비하여 115 및 165% ( 각각 2.0 및 5.0 mm) 의효소활성도를나타내었다. Mn 2+, Co 2+, Zn 2+, Fe 2+ 또는 Cu 2+ 이온은효소활성을상당히억제하는현상을나타내었다. 한편 S. chromofuscus의 PLD는철및망간에의해효소활성이촉진되며 [Zambonelli 등, 2003] Streptomyces sp. CS-57 에서분리된 PLD는 Mn 2+ 또는 Co 2+ 에의하여효소활성이증대되는것으로보고되었는데 [Simkhada 등, 2007] 이러한결과는본실험의 PLD와상반되고있다. Ca 2+ 이온은어느정도의효소활성촉진현상을나타내었으나대조구대비 107 또는 115% 의효소활성도를나타내는것으로보아효소활성에중요하게작용하지는않는것으로판단된다. 이러한결과는 Ca 2+ 이온에의해효소활성이촉진되는경우가많은동물또는식물세포의 PLD [Qin 등, 1997; Zheng 등, 2000; Exton, 2002] 와상반된결과를나타내고있다. 한편 Streptomyces 종류들중에서도 Streptomyces antibioticus, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces halstedii 등의 PLD는 Ca 2+ 이온이효소활성도에큰영향을미치지않아 Ca 2+ 비의존적효소로분류되고있으며이러한점에서본실험의결과와유사하였다. 그러나 Streptomyces tendae Fig. 6. Effect of Triton X-100 on the PLD activity of B. licheniformis The PLD activity was measured at different concentration of Triton X-100. The control activity was considered as 100%, which was equivalent to 14.9 U/mg protein. Each point represents the average of three experiments. [Mander 등, 2009] 또는 S. chromofuscus [Yang 와 Roberts, 2002] 의 PLD 는상당히촉진됨이보고되어 Ca 2+ 의존적효소로분류되고있으며본실험의결과와상반된결과를나타내고있다. 대부분의동, 식물세포유래의 PLD 와달리미생물의 PLD 는 Ca 2+ 의존적또는비의존적효소활성을보이는경우로나뉘어져이에대한지속적인연구가필요하다고생각된다. 여러 detergent 가효소활성도에미치는영향. 여러종류의 non ionic, anionic, 또는 zwitterionic detergent 들이 PLD 의효소활성도에미치는영향에대하여조사하였다 (Table 2). 여러종류의 detergent 중에서 non ionic detergent 인 Triton X-100 이 PLD 의효소활성도를가장많이촉진시켰으며 zwitter ionic detergent 인 CHAPS 에의해서도상당한효소활성촉진효과가있었다. 그러나나머지 detergent 들은효소활성을오히려억제시켰으며 SDS 의첨가에의해서는효소활성도가거의나오지않았다. 따라서 Triton X-100 을여러농도로첨가하여 PLD 의효소활성에미치는영향을다시측정한결과는 Fig. 6 과같다. Triton X-100 을 0.6 mm 까지첨가할경우 PLD 의효소활성도는점진적으로증가하여대조구대비최대 181% 의효소활성도를나타내었다. 그이상의농도에서는효소활성도가점점감소하였다. 대체로 1.0 mm 이상의농도에서는대조구보다낮은효소활성도를나타내어 1.4 mm 에서약 62% 의효소활성도를나타내었다. 동물세포에서분리된 PLD 는 detergent 의일종인 Triton X-100 에의해용해도와활성도모두가증가되는경우가많아 PLD 활성도를측정할경우에 detergent 를첨가하

6 Bacillus licheniformis 의 phospholipase D 특성 99 는경우가종종있다 [Kanoh 등, 1991; Horwitz 와 Davis, 1993]. 따라서본실험에서분리된 bacteria 기원의 PLD 에대하여서도 detergent 효과를측정한결과 Triton X-100 에의하여효소활성도가증대하였다. 이러한결과는다른 bacteria 인 Streptomyces 종에서분리된 PLD 들과비슷한결과를나타내고있어 [Shimkada 등, 2007; Mander 등, 2009] 본실험에서분리된 PLD 와비슷한용해특성을보이는것으로판단된다. 초 Bacillus licheniformis 로부터 phospholipase D (PLD) 로추정되는유전자를 PCR 기술을이용하여분리하여 pgem-t easy 운반체에 cloning 하였다. 분리된유전자는 His6 가붙은 pet- 21 운반체를이용하여 E. coli BL21 (DE3) 에서발현시켰다. 재조합된 PLD 는 nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) resin 을갖는 column 을이용하여 affinity chromatography 로분리하였다. SDS-PAGE 분석결과 PLD 로추정되는단백질은약 44 kda 의주요단일밴드를나타내었다. 분리된효소의최적활성도는 ph 7.0 에서나타났으며이조건에서또한효소가제일안정되었다. 효소활성에미치는최적온도는 o C 의온도에서형성되어비교적높은온도를나타내었으며비교적넓은범위의온도에서상당히높은효소활성도를나타내었다. 여러가지 detergent 중에서 Triton X-100 을 0.6 mm 까지첨가할경우 PLD 의효소활성도는점진적으로증가하여대조구대비최대 181% 의효소활성도를나타내었다. 록 Key words: Bacillus licheniformis, phospholipase D 감사의글 본논문은한국농촌진흥청농업과학원의농업과학기술경상연구 ( 과제번호 PJ006703) 로수행되었습니다. 참고문헌 Bradford MM (1976) A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal Biochem 72, D Arrigo P, Piergianni V, Scarcelli D, and Servi S (1995) A spectrophotometric assay for phospholipase D. Analytica Chimica Acta 304, Exton JH (2002) Phospholipase D: Structure, regulation and function. Rev Physiol Biochem Pharmacol 144, Hatanaka T, Negishi T, Kubota-Akizawa M, and Hagishita T (2002) Study on thermostability of phospholipase D from Streptomyces sp. Biochim Biophys Acta 1598, Horwitz J and Davis LL (1993) The substrate specificity of brain microsomal phospholipase D. Biochem J 295, Imamura S and Horiuti Y (1979) Purification of Streptomyces chromofuscus phospholipase D by hydrophobic affinity chromatography on palmitoyl cellulose. J Biochem 85, Iwasaki Y, Nakano H, and Yamane T (1994) Phospholipase D from Streptomyces antibioticus: Cloning, sequencing, expression and relationship to other phospholipases. Appl Microbiol Biotechnol 42, Jenkins GM and Frohman MA (2005) Phospholipase D: A lipid centric review. Cell Mol Life Sci 62, Juneja LR, Kazuoka T, Yamane T, and Shimizu S (1988) Kinetic evaluation of conversion of phosphatidylcholine to phosphatidylethanolamine by phospholipase D from different sources. Biochim Biophys Acta 960, Kanoh H, Kanaho Y, and Nozawa Y (1991) Activation and solubilization by Triton X-100 of membrane bound phospholipase D of rat brain. Lipids 26, Lambrecht R and Ulbrich-Hofmann (1992) A facile purification procedure of phospholipase D fromcabbage and its characterization. Biol Chem 373, Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, Lee JS, Batochir M, Demirev AV, and Nam DH (2009) Molecular cloning of the phospholipase D gene from Streptomyces sp. YU100 and its expression in Escherichia coli. J Microbiol 47, Leeuwen W, Okresz L, Bogre L, and Munnik T (2004) Learning the lipid language of plant signaling. Trends Plant Sci 9, Lim SK, Choi JW, Chung MH, Lee ET, and Khang YH (2002) Production and characterization of extracellular phospholipase D from Streptomyces sp. YU 100. J Microbiol Biotechnol 12, Liscovitch M, Czarny M, Fiucci G, and Tang X (2000) Phospholipase D: Molecular and cell biology of a novel gene family. Biochem J 345, Mander P, Simkhada JR, Cho SS, Park SJ, Choi HS, Lee HC, Sohng JK, and Yoo JC (2009) A novel Ca 2+ -dependent phospholipase D from Streptomyces tendae, possessing only hydrolytic activity. Arch Pharm Res 32, Maria LD, Vind J, Oxenbell KM, and Svendsen A (2007) Phospholipases and their industrial applications. Appl Microbiol Biotechnol 74, McKean SC, Davies JK, and Moore RJ (2007) Expression of phospholipase D, the major virulence factor of Corynebacterium pseudotuberculosis, is regulated by multiple environ-mental factors and plays a role in macrophage death. Microbiology 153, Ogino C, Negi Y, Matsumiya T, Nakaoka K, Kondo A, and Kuroda S (1999) Purification, characterization and sequence determination of phospholipase D secreted by Strepto-verticillium cinnamoneum. J Biochem 125, Okawa Y and Yamaguvhi T (1975) Studies on phospholipases from Streptomyces: Purification and properties of Streptomyces hachijoensis phospholipase D. J Biochem 78, Qin C and Wang X (2002) The Arabidopsis phospholipase D family. Characterization of a calcium-independent and phosphatidylcholine-selective PLA1 with distinct regulatory domains. Plant Physiol 128, Qin W, Pappan K, and Wang X (1997) Molecular heterogeneity of phospholipase D (PLD): Cloning of PLD-gamma and regulation of plant PLD-gamma, beta and alpha by phosphoinositide and calcium. J Biol Chem 272,

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42(4)-2(p ).fm The Korean Journal of Microbiology, Vol. 4, No. 4, December 006, p. 94-98 Copyright 006, The Microbiological Society of Korea Streptomyces phospholipase D w ey j m v Á½ Á Á k * w w w w Streptomyces somaliensisƒ