Journal of Korean Academy of Oral Health 2017 March 41(1): Original Article Porphyromonas gingivalis

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민종 마
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1 Journal of Korean Academy of Oral Health 2017 March 41(1): Original Article Porphyromonas gingivalis 가일부구강미생물의형광발현에미치는영향 김세연 1,2, 우동협 1, 이민아 1, 김지수 1,2, 이정하 1,2, 정승화 1,2 1 부산대학교치의학전문대학원예방과사회치의학교실, 2 부산대학교치의학전문대학원 BK21 플러스사업단 Red fluorescence of oral bacteria interacting with Porphyromonas gingivalis Se-Yeon Kim 1,2, Dong-Hyeob Woo 1, Min-Ah Lee 1, Ji-Soo Kim 1,2, Jung-Ha Lee 1,2, Seung-Hwa Jeong 1,2 1 Department of Preventive and Community Dentistry, School of Dentistry, Pusan National University, 2 BK21 PLUS Project, School of Dentistry, Pusan National University, Yangsan, Korea Received: December 16, 2016 Revised: January 16, 2017 Accepted: January 26, 2017 Corresponding Author: Seung-Hwa Jeong Department of Preventive and Community Dentistry, Pusan National University School of Dentistry, Busandaehak-ro 49, Meulgeum-up, Yangsan , Korra Tel: Fax: jsh0917@pusan.ac.kr *This research was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Science, ICT & Future Planning (2014R1A1A ). Objectives: Dental plaque is composed of 700 bacterial species. It is known that some oral microorganisms produce porphyrin, and thus, they emit red fluorescence when illuminated with blue light at a specific wavelength of <410 nm. Porphyromonas gingivalis belongs to the genus Porphyromonas, which is characterized by the production of porphyrin. The aim of this study was to evaluate red fluorescence emission of some oral microorganisms interacting with P. gingivalis. Methods: Five bacterial strains (P. gingivalis, Streptococcus mutans, Lactobacillus casei, Actinomyces naeslundii, and Fusobacterium nucleatum) were used for this study. Tryptic soy agar medium supplemented with hemin, vitamin K3, and sheep blood was used as a growth medium. The fluorescence emission of bacterial colonies was evaluated under 405 nm-wavelength blue light using a Quantitative Light-induced Fluorescence Digital (QLF-D) camera system. Each bacterium was cultured alone and cocultured in close proximity with P. gingivalis. The red/green (R/G) ratio of fluorescence image was calculated and the differences of R/G ratio according to each growth condition were compared using the Mann-Whitney test (P<0.05). Results: Single cultured S. mutans, L. casei and A. naeslundii colonies emitted red fluorescence (R/ G ratio=2.15±0.06, 4.31±0.17, 5.52±1.29, respectively). Fusobacterium nucleatum colonies emitted green fluorescence (R/G ratio=1.36±0.06). The R/G ratios of A. naeslundii and F. nucleatum were increased when P. gingivalis was co-cultured with each bacterium (P<0.05). In contrast, the R/G ratios of S. mutans and L. casei were decreased when P. gingivalis was co-cultured with each bacterium (P=0.002, 0.003). Conclusions: This study confirmed that P. gingivalis could affect the red fluorescence of other oral bacteria under 405 nm-wavelength blue light. Our findings concluded that P. gingivalis has an important role for red fluorescence emission of dental biofilm. Key Words: Actinomyces naeslundii, Fluorescence, Fusobacterium nucleatum, Lactobacillus casei, Porphyromonas gingivalis, Red fluorescence, Streptococcus mutans Copyright 2017 by Journal of Korean Academy of Oral Health This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. JKAOH is available at pissn X / eissn

2 23 김세연외 Porphyromonas gingivalis가일부구강미생물의형광발현에미치는영향 서론 치면세균막이란치아표면에부착된당단백질 (glycoprotein) 성분의얇은막에세균들이부착하여형성되는점착성세균덩어리의막을말한다 1). 치면세균막을구성하는세균은현재약 700 여종이상으로보고되고있으며 2), 초기부착에관여하는세균은 mutans streptococci, Lactobacilli, Actinomycetes 등의그람양성균이있고, 후기부착에관여하는세균은 Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis 등의그람음성균이치면세균막형성에중요한역할을하는것으로알려져있다 3). 치면세균막이장기간침착되면양대구강병인치아우식증이나치주질환발생위험이증가하고, 이는치면세균막의세균의양과비례한다 4). 구강내에서오래된치면세균막은특정파장영역의푸른색가시광선을통해붉은색형광으로탐지가가능하고, 오래된치면세균막일수록붉은색형광이강해진다 5). 구강내에서붉은색형광발현의원인은미생물의대사산물인포피린 (porphyrin) 화합물에의한것으로 6,7), 포피린구조는탄소원자간의 11쌍의이중결합과단일결합이존재하는공액계 (conjugated system) 구조이다 8). 자연계에존재하는대부분의유기형광물질은공액계구조이며 9), 이특징적인구조로인해포피린은형광특성을나타낸다. 형광 (fluorescence) 은분자가빛, 엑스선, 전자선따위의단파장의강한에너지자극을받았을때, 분자내전자의에너지준위가들떴다가다시이완 ( 방출 ) 되면서장파장의빛을발광하는현상을말한다. 물질의분자구조가복잡하고공액계구조가많을수록원자간공명 (resonance) 현상이발생하게되고, 이러한공명구조는물질의형광발현의원인중하나로알려져있다 10,11). 배양배지조건과구강내미생물종류에따라붉은색형광뿐만아니라다양한형광발현에대한연구가수행된바있다. Lennon 등 12) 은구강미생물의형광을 R/G 값으로산출하여, Fusobacterium nucleatum, Streptococci (Streptococcus sorbrinus, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus oralis) 는녹색계열의형광, Lactobacilli (Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentans) 는주황색계열의형광, actinomycetes, Prevotella intermedia가붉은색계열의형광을발현하는것을막대그래프로표현하였다. metal-free porphyrin에서붉은색형광을강하게낸다고하였으며, 초기부착균에비해후기부착그람음성혐기성균이짙은붉은색이나다홍색의형광을발현한다고보고하였다 13,14). 배양조건에따라인접배양된부분의붉은색형광발현에대한보고가있다 13,15). 한연구에서 Porphyromonas gingivalis와 Parvimonas micra (Peptostreptococcus micros, P. micros) 가인접하게배양되었을때 Parvimonas micra가붉은색형광발현을하였다 13,15). 이러한결과를통해 Porphyromonas gingivalis의대사작용으로인해인접구강미생물의형광발현에영향을미치는것을알수있다. 혈액과헤민 (hemin) 성분은 Porphyromonas gingivalis의실험실배양을위한필수영양성분으로, 헤모글로빈과헤민은철을 포함하는포피린구조를가진다. Porphyromonas gingivalis의배양환경은포피린생성에영향을미친다고알려져있다 16). 단독배양으로 Porphyromonas gingivalis가형광발현을하지않지만복합배양에서인접균이붉은색형광발현하는것을보아, Porphyromonas gingivalis는치면세균막의붉은색형광발현에있어중요한역할을하는것으로예상된다. 따라서본연구의목적은 Porphyromonas gingivalis가치면세균막을구성하는구강내일부세균의형광발현에미치는영향을알아보는것이다. 본연구의영가설은 Porphyromonas gingivalis 는구강내일부세균의형광발현과관련이없다 이다. 연구재료및방법 1. 실험균주선정및배양본연구실험에사용된균주는한국생명공학연구원미생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, 이하 KCTC ) 에서분양받은그람양성균 Streptococcus mutans KCTC 3065 ( 이하 S. mutans ), Lactobacillus casei KCTC 3109 ( 이하 L. casei ), Actinomyces naeslundii KCTC 5525 ( 이하 A. naeslundii ), 그람음성균 Fusobacterium nucleatum KCTC 2640 ( 이하 F. nucleatum ), Porphyromonas gingivalis KCTC 5352 ( 이하 P. gingivalis ) 총 5종이다 (Table 1). 한국생명공학연구원미생물자원센터에서추천하는배지로 S. mutans는 Brain Heart Infusion (Bacto TM BHI, BD, New Jersey, USA), L. casei는 Lactobacilli MRS (Difco MRS, BD, New Jersey, USA), F. nucleatum은 Scahedler (BBL TM Schaedler, BD, New Jersey, USA), A. naeslundii와 P. gingivalis는혈액을첨가한 Tryptic Soybean-Casein Digest Medium (Bacto TM Tryptic Soy Broth, BD, New Jersey, USA) 을사용하여활성시켰다. 분양받은균주는동결건조상태로앰플에보관되어있었으며, ml 의각각준비된액체배지에현탁하여고체배지에서 2-7일동안균주의집락이육안으로확인될때까지배양하였다. 활성확인후균주의콜로니 (colony) 를 20% glycerol 500 ml에넣어초저온냉동고 ( 76 o C) 에서동결보존하였다. 단일배양과복합배양에사용한배지는선행연구들을참고하여혈액 (Blood) 을첨가한 Tryptic Soy Agar ( 이하 TSAB ) 를사용하였다 13). 실험을시작하기전, 동결보존된균주의활성을위해초저온냉동고에서꺼낸후실온에서액체상태로녹인뒤, 최고의 Table 1. Bacterial strains and culture requirement Strains Straining properties Culture requirement Streptococcus mutans Gram positive Facultative anaerobes Lactobacillus casei Gram positive Facultative anaerobes Actinomyces naeslundii Gram positive Anaerobes Fusobacterium nucleatum Gram negative Anaerobes Porphyromonas gingivalis Gram negative Anaerobes

3 24 J Korean Acad Oral Health 2017;41:22-27 활성상태를유도하여실험에사용하였으며, 균주들은 37 o C 에서 혐기성배양조건을유지하며 2-7일동안균주의집락이육안으로확인될때까지배양하여본실험에사용하였다. 단일균주의배양을위해 TSAB 배지에전배양된균을선형으로그었고, 집락이육안으로확인될때까지 2-7일간혐기성배양기 (anerobic chamber, Coy Lab., Michigan, USA) 에서배양하였다. 복합배양을위해두가지균주를한고체배지에서배양하였으며, 2번반복실험하였다. 배양방법은 van der Veen 등 13) 의방법을본실험에적합하도록수정하여사용하였다. 고체배지에서콜로니로전배양된균중 P. gingivalis를먼저 TSAB 배지에세로로도말하였고, 세로로도말된 P. gingivalis 위에 S. mutans, L. casei, A. naeslundii, F. nucleatum을가로로도말하였다. 도말이완료된 TSAB 배지는 7일간혐기성배양기 (anerobic chamber, Coy Lab., Michigan, USA) 에서배양하였다. 단일배양과복합배양은각 2회반복실험하였다. 2. 실험균주의형광평가실험균주의형광평가를위해 Quantitative Light-induced Fluorescence-Digital ( 이하 QLF-D ) 시스템 (QLF-D Biluminator 2, Inspektor Research systems BV, Amsterdam, The Netherlands) 을사용하였으며, QLF-D 시스템은 DSLR (Digital Single Lens Reflex) camera (EOS 550D, Canon, Tokyo, Japan) 본체앞에 4개의백색광 (white light) 과 12개의청색광 (blue light) LED 가장착된 405 nm 파장영역의푸른색가시광선으로박테리아관련대사산물의붉은색형광을탐지할수있는장비이다. TSAB 배지에배양된단일콜로니와복합배양의발현색상평가를위해, 촬영조건으로백색광은 shutter speed 1/30 s, aperture value 8.0, ISO speed 1600, 청색광은 shutter speed 1/13 s, aperture value 5.6, ISO speed 1600으로고정하였으며, QLF-D 카메라조작용소프트웨어 (C3 v1.25, Inspektor Research systems BV, Amsterdam, The Netherlands) 를사용하였다. Live view 방식으로어두운방에서 7일배양된배양배지를개봉한뒤, 광원튜브가배양배지바로위에위치하도록일정거리를유지하며촬영하였다 통계분석통계분석은 IBM SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 을사용하여정규성분포를확인한뒤, 단일배양균주의평균 R/G 값과복합배양평균 R/G 값의차이를 Mann-Whitney 검정을통해비교하였으며, 유의수준은 5% 로설정하였다. 연구성적 1. 단일배양결과 7일동안 37 o C 혐기성배양기에서배양된후, P. gingivalis를제외한모든균이 405 nm 청색광에서형광을확인할수있었다. S. mutans, L. casei, A. naeslundii는붉은색계열의형광을발현하였으며, F. nucleatum은녹색계열의형광을발현하였다 (Fig. 1). 2. 복합배양결과 S. mutans, L. casei, A. naeslundii, F. nucleatum과 P. gingivalis를복합배양한결과는다음과같다 (Fig. 1). 단일배양에서 R/G 값이 2.15±0.06으로붉은색계열의형광을발현하였던 S. mutans는 P. gingvalis와복합배양에서 R/G 값이 1.73±0.07으로감소되었고붉은색계열의형광이소실되었다. 단일배양에서 R/G 값이 4.31±0.17으로붉은색계열의형광을발현하였던 L. casei는 P. gingivalis와복합배양에서 R/G 값이 3.40±0.58으로감소되었지만붉은색계열의형광을발현하였다. 단일균주배양에서 R/G 값이 5.52±1.29으로붉은색계열의형광을발현하였던 A. naeslundii는 P. gingivalis와복합배양에서 R/G 값이 7.59±1.95으로증가하였고붉은색계열의형광을발현하였다. 단일배양에서 R/G 값이 1.36±0.06으로녹색계열의형광을발현하였던 F. nucletum 은 P. gingivalis 와복합배양에서 R/G 값이 2.61±0.33으로 R/G 값이증가하여붉은색계열의형광을발현하였다 (Table 2, Fig. 1). 3. 결과분석 3.1. 이미지분석 Lennon 등 12) 의분석방법을참고하여디지털의이미지는컴퓨터이미지분석프로그램 (ImageJ/FIJI1.46, National Institute of Mental Health, USA) 을사용하여정량화하였다. Image J 프로그램을통해 Red, Green, Blue (RGB) 값을측정하고평균 R/G 값을계산하였다. 단일균주이미지는한배양배지에서 5개의콜로니를지정하였고, 복합배양에서는겹쳐지는 10 곳을임의지정하여 RGB 값을측정하여평균 R/G 값을계산하여분석하였다. Table 2. Red fluorescence assessment of oral bacteria grown in singleand co-culture Culture status Mean±SD* Red fluorescence P S. mutans 2.15± S. mutans+p. gingivalis 1.73± L. casei 4.31± L. casei+p. gingivalis 3.40± A. naeslundii 5.52± A. naeslundii+p. gingivalis 7.59± F. nucleatum 1.36± F. nucleatum+p. gingivalis 2.61± *: mean R/G vlaue with standard deviation. +: The emission of red fluorescence was detected. -: The emission of red fluorescence was not detected.

25 김세연 외 Porphyromonas gingivalis 가 일부 구강미생물의 형광 발현에 미치는 영향 Fig. 1.

nucleatum culti vated on TSA blood media.

plate, right side were cultivated in close proximity with P.

본 연구에서는 다양한 배지 중 Volgenant 등13)의 연구에서 사 구강 내에는 다양한 미생물이 서로 상호작용 하며

구강 내 모든 미생물의 종류를 파악하기 위해 하였고, van der Veen 등15)의 연구에서도 혈액이 첨가된 배지를 서

최근 사용하였을 때 미생물의 붉은 색 형광이 강하게 발현한다고 보고 구강 내 오래된 치면세균막을 특정 파장 영역의 푸른색

본 연구에서 단일배양 결과는 Volgenant 등13)의 405 nm 을 통해 붉은 색 형광으로 탐지가 가능하고19), 이

화합물에 의한 것으로 알려져 있 났다. 하지만, Lennon 등12)의 연구에서의 결과와 본연구의 단일배 다6-8).

4 25 김세연 외 Porphyromonas gingivalis 가 일부 구강미생물의 형광 발현에 미치는 영향 Fig. 1. The blue-light image of S. mutans, L. casei, A. naeslundii, F. nucleatum culti vated on TSA blood media. Fluorescence images of left side were cultivated single at each plate, right side were cultivated in close proximity with P. gingivalis. 고 안 용을 통해 형광 발현에 영향을 미치는지를 확인하고자 하였다. 본 연구에서는 다양한 배지 중 Volgenant 등13)의 연구에서 사 구강 내에는 다양한 미생물이 서로 상호작용 하며 구강 내에 용한 vitamin K와 헤민, 혈액을 첨가한 Tryptic Soy Agar를 사용 상주하고 있고17,18), 구강 내 모든 미생물의 종류를 파악하기 위해 하였고, van der Veen 등15)의 연구에서도 혈액이 첨가된 배지를 서 유전자 분석과 같은 방법은 많은 시간과 비용이 요구된다. 최근 사용하였을 때 미생물의 붉은 색 형광이 강하게 발현한다고 보고 구강 내 오래된 치면세균막을 특정 파장 영역의 푸른색 가시광선 하였다. 본 연구에서 단일배양 결과는 Volgenant 등13)의 405 nm 을 통해 붉은 색 형광으로 탐지가 가능하고19), 이 형광은 미생물의 파장 영역에서 단일균주의 형광 발현 색상과 모두 동일하게 나타 대사산물인 포피린(porphyrin) 화합물에 의한 것으로 알려져 있 났다. 하지만, Lennon 등12)의 연구에서의 결과와 본연구의 단일배 다6-8). 이에 구강 내 치면세균막 구성 균주 중 형광 발현을 하는 균주 양 결과는 다른 점이 존재하였다. 선행 연구에서는 S. mutans 의 형 를 파악하는 실험실상 연구가 필요하다 사료되었다. 구강 내에 존재 광발현 색상이 R/G 값이 0.91로 녹색 계열 형광을 발현하였지만, 하는 미생물 중 형광발현 균주를 평가하고 구강 내 미생물간 상호작 본 연구에서 R/G 값이 2.15로 붉은 색 계열 형광을 발현하였다.

5 26 J Korean Acad Oral Health 2017;41:22-27 이와같은결과는동일한 S. mutans이지만배지성분에따라형광발현이차이가있음을알수있었다. Lennon 등 12) 의연구에서는 vitamin K와헤민이첨가된 Columbia agar를사용하였다. P. micros는단일배양에서형광을발현하지않았지만 P. gingivalis와인접하게교차배양되었을때, P. micros와 P. gingivalis 가교차하는부분에서붉은색형광을발현한다 15). 본연구에서도 P. gingivalis가치면세균막을구성하는일부구강미생물과인접하게복합배양되었을때의형광발현을관찰하였다. P. gingivalis는대사작용중포피린을생산한다는점에서 Porphyromonas 속으로분류되었고, 강한적혈구응집능과강한부착력을가지고있다 20). 따라서 P. gingivalis가생산한포피린에의해치면세균막을구성하는구강내일부균주의형광에변화가있는것이라고사료된다. 혈액과헤민 (hemin) 성분이 P. gingivalis의실험실배양을위한필수영양성분으로알려져있고, 이러한배양환경은포피린생성에영향을미친다고알려져있다 13,16). 구강내에서치면세균막을구성하는일부균주중 A. naeslundii와 F. nucleatum은 P. gingivalis와복합배양하였을때 R/G 값이증가하였다. 선행연구 13) 에서는 A. naeslundii가분광분석결과붉은색자가형광발현을하였고, 복합배양에서발현파장값 (634 nm) 이단일배양에서발현파장값 (620 nm) 보다증가하였지만, F. nucleatum 은이전연구와상반된결과를나타냈다. 이러한차이는복합배양방법을달리하였기때문이라고생각된다. 선행연구에서는한배양배지안에서두가지균을혼합하여배양하였기때문에각균주들의성장시간이배제된것으로사료된다. 단일배양시간을고려하면 P. gingvalis는 2-3일성장시간이느리다. 본연구의복합배양에서는 van der Veen 등 15) 의연구방법을참고하여배양공간을확보하였다. 반면에, Volgenant 등 13) 의연구에서 S. mutans는 P. gingivalis 와복합배양한결과, 붉은색형광발현을하였으나본연구의경우 S. mutans는 P. gingivalis와복합배양에서형광이소실되었다. L. casei의경우도 R/G 값이감소하였다. 현재, P. gingivalis와복합배양에서붉은색형광이소실되거나감소되었다는보고는없다. 일부균주가 P. gingivalis와복합배양되었을때, 붉은색형광이증가또는감소되는본연구결과를바탕으로, P. gingivalis와의복합배양방식, 배양시간에따른붉은색형광발현에대해서는계속적으로추가적인연구가필요하다. 본연구의한계점으로는다음과같다. QLF-D는치아우식증, 치면세균막, 미생물의활성, 치석, 착색등진료과정에서활용하기좋은장비이지만 QLF-D 광원튜브에서의램프들이배양배지에반사되어객관적인정량화분석에는한계가존재하였다. RGB 값은빛의삼원색인 Red, Green, Blue 세종류의광원을이용하여색을표현하는방식으로본연구에서 B 값은 QLF-D의청색광원으로배제되었지만, 세가지값에따라혼합색이결정된다. 따라서미세분광광도계 (micro spectrophotometer) 를사용하여발현 (emission) 파장을확인하는방법을추가하거나최대한 QLF-D 광원램프의간섭을받지않도록배지중앙부분에콜로니를위치시켜정량화분석의한계를극복하는방법이필요하다. 분석의한계를 극복하여추후연구에서는구강내의치면세균막을구성하는두가지이상균주의복합배양과복합배양후미생물의구조변화분석이필요하다고사료되었다. 결론 본연구는포피린을생성하는 Porphyromonas gingivalis가치면세균막을구성하는구강내일부세균의붉은색형광발현에미치는영향을알아보기위하여, 서로다른 4종의균주와복합배양한결과는다음과같았다. 1. 단일균주배양결과를통해 P. gingivalis를제외하고 S. mutans, L. casei, A. naeslundii는붉은색계열의형광을발현하였고, F. nucleatum은녹색계열의형광을발현하는것을확인하였다. 2. 단일균주붉은색형광을발현하였던 S. mutans와 L. casei 의 R/G 값은 P. gingivalis와복합배양에서감소하였다. S. mutans 는붉은색형광을소실하였고, L. casei는붉은색형광을유지하였다. 3. 단일균주붉은색형광을발현하였던 A. naeslundii의 R/G 값은 P. gingivalis와복합배양에서증가하였다. A. naeslundii는붉은색형광을유지하였다. 4. 단일균주붉은색형광을발현하지않았던 F. nucleatum의 R./G 값은 P. gingivalis와복합배양에서증가하였다. 단일균주배양에서녹색계열의형광발현을하였던 F. nucleatum의경우 P. gingivalis와복합배양으로인해붉은색형광발현을하였다. 치면세균막을구성하는구강내일부미생물들은배지환경에따라형광발현에영향이있었으며, 포피린을합성하는균인 P. gingivalis가인접한구강미생물의형광발현에영향을미치는것을확인하였다. P. gingivalis와복합배양한균주에따라 R/G 값이변화하는것으로치면세균막내의다양한균주들이서로상호작용하여붉은색형광을내는것으로여겨진다. P. gingivalis와복합배양에서붉은색형광이증가또는감소되는결과를바탕으로, P. gingivalis와의복합배양방식, 배양시간에따른연구가계속될필요가있다. References 1. Kim JB, Choi YJ, Paik DI, et al. Preventive dentistry. 4th ed. Seoul:,KMS;2004: Paster BJ, Olsen I, Aas JA, Dewhirst FE. The breadth of bacterial diversity in the human periodontal pocket and other oral sites. Periodontol ;42: Kolenbrander PE, Palmer RJ Jr, Periasamy S, Jakubovics NS. Oral multispecies biofilm development and the key role of cell - cell distance. Nat Rev Microbiol 2010;8: Listgarten MA. The structure of dental plaque. Periodontol ;5: Lee ES, Kang SM, Ko HY, Kwon HK, Kim BI. Association between the cariogenicity of a dental microcosm biofilm and its red fluorescence detected by Quantitative Light-induced Fluorescence-Digital (QLF-D). J Dent 2013;41:

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DBPIA-NURIMEDIA

DBPIA-NURIMEDIA The e-business Studies Volume 17, Number 6, December, 30, 2016:237~251 Received: 2016/11/20, Accepted: 2016/12/24 Revised: 2016/12/21, Published: 2016/12/30 [ABSTRACT] Recently, there is an increasing