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1 대한한방내과학회지제 34 권 4 호 (2013 년 12 월 ) Korean J. Orient. Int. Med. 2013:34(4) LPS 로유도된 RAW cell 의염증반응에서 MAPK 조절에의한加減當歸飮子의항염증효과 김태연세명대학교한의과대학병리학교실 Effect of Gagam-Danguieumja through Regulation of MAPK on LPS-Induced Inflammation in RAW Cells Tae-yeon Kim Dept. of Oriental Pathology, College of Korean Medicine, Se-Myung University ABSTRACT Objectives : Danguieumja is a traditional medicinal prescription to treat skin disease. It was commonly used for the treatment of itching, chronic urticaria and atopic dermatitis in Korea by the addition or omission of several herbs. This study investigated the anti-inflammatory potential of Gagam-Danguieumja (GDE) water extract. Methods : We examined the effects of GDE on the lipopolysaccharide (LPS)-induced production of nitric oxide (NO) in a murine macrophage cell line, RAW cells. Results : GDE inhibited production of NO in a dose dependent manner and also decreased the expression of inducible nitric oxide synthase (inos), cyclooxygenase-2 (COX-2). As a possible molecular mechanism of anti-inflammatory effect increased phosphorylation of mitogen-activating protein kinases (MAPK) by LPS were blocked by GDE treatment. Conclusions : These results suggest that GDE has an anti-inflammatory therapeutic potential through the inhibition of MAPK phosphorylation, thereby decreasing the expression of pro-inflammatory genes. Key words : Gagam-Danguieumja, anti-inflammation, nitric oxide, inducible nitric oxide synthase, cyclooxygenase-2, mitogen-activating protein kinase Ⅰ. 서론 염증은인체에침입한병원체나내인적으로유발되는염증활성인자를인지하고제거하기위해활성화되는인체의적극적인생체방어기전이다. 적절한염증반응은외 내인적인자로부터인체를보호하는필수불가결한반응이나, 과도하고부적 교신저자 : 김태연충북제천시세명로 65 세명대학교한의과대학병리학교실 TEL: FAX: violet805@hanmail.net 절한염증반응은정상조직의파괴와더불어암과대사성질환등다양한질환의원인으로작용할수있다 1. 대식세포를매개로한염증반응에있어 nitric oxdie(no) 생성효소인 inducible nitric oxide synthase (inos), prostaglandin 생합성의속도조절단계효소인 cyclooxygenase-2(cox-2) 의발현조절과이들유전자의발현에있어주요신호전달분자인 mitogen-activated protein kinase(mapk) 의활성조절은염증반응을조절하기위한핵심요소로서인식되고있으며, 이들인자들의활성을조절하여 339

2 LPS 로유도된 RAW cell 의염증반응에서 MAPK 조절에의한加減當歸飮子의항염증효과 염증반응을조절하기위한신규소재발굴연구가활발히진행되어왔다 2. 當歸飮子는嚴의濟生方 3 에처음수록된處方으로 治心血凝滯, 內蘊風熱, 發見皮膚, 遍身瘡疥, 或腫或痒, 或膿水浸淫, 或發赤疹㾦 의목적으로立方되어血燥와風熱로인한瘡疥, 피부소양증, 만성두드러기등의치료에응용되고있다 4. 加減當歸飮子 (Gagam-Danguieumja, GDE) 5 는當歸飮子에淸熱解毒, 發散風熱, 補陰益氣, 理氣燥濕, 溫補脾胃하는數種의약재를가하여陰血損傷, 脾虛氣血不調로쉽게慢性으로傳變되는아토피성피부염 4 에사용하기위하여作方되었다. 當歸飮子에대한연구로는乾癬에활용되는加味當歸飮子에대한실험 6 및임상적고찰 7,8, 當歸飮子水抽出液이抗 allergy 反應과 mouse의免疫細胞機能에미치는영향 9, 加味當歸飮子 10, 當歸飮子加減方 11 과外治方병용 12,13 이아토피동물모델에미치는영향, anticonvulsant hypersensitivity syndrome 치험례보고 14 등이있으나임상에서아토피피부염을치료하는처방으로사용되고있는 GDE 가 MAPK 조절에미치는영향에관한연구는아직까지보고되지않았다. 본저자는염증성질환에대한 GDE의효과를확인하기위하여 GDE 를 RAW cells 에전처리한후 lipopolysaccharide(lps) 로유도된 NO의생성및 inos와 COX-2 발현에미치는영향과 GDE 가염증반응의주요신호전달분자인 MAPK의인산화를차단하여염증매개물질에대한염증억제효과를나타내는지에대하여연구한결과유의한결과를얻었기에이에보고하는바이다. Ⅱ. 재료및방법 1. 재료 1) 약재의추출본실험에사용된 GDE 2첩 (240 g) 은세명대학교제천한방병원에서구입하였으며증류수로水洗한뒤 3 L의증류수를加하여 3 시간동안가열추 출하였다. 추출된용액을원심분리를통하여상층액을취한뒤 Rotary evaporator(ne-1001, EYELA, JAPAN) 로 200 ml가되도록감압농축한후 -80 에서동결시켰다. 이를다시 Freeze dryer system (Labconco, USA) 을이용하여 7일간동결건조시킨후 58.9 g의분말을얻었다. GDE의수득율은 23.75% 로 -20 에보관하였다가실험직전생리식염수나배지에희석하여 microfilter paper(whattman no. 2, μm) 로 syringe filtering 후실험에사용하였다. Table 1. Composition of Gagam-Danguieumja. Herbal name Scientific name Dose (g) 當歸 Angelicae Gigantis Radix 8 白芍藥 Paeoniae Radix Alba 8 川芎 Cnidii Rhizoma 8 生地黃 Rehmanniae Radix Recens 8 麥門冬 Liriopis Tuber 8 白何首烏 Cynanchi Wilfordii Radix 6 甘草 Glycyrrhizae Radix 6 生薑 Zingiberis Rhizoma Recens 6 牛蒡子 Arctii Fructus 4 白蒺藜 Tribuli Fructus 4 大棗 Jujubae Fructus 4 金銀花 Ronicerae Flos 4 五味子 Schizandrae Fructus 4 薏苡仁 Coicis Semen 4 白朮 Atractylodis Macrocephalae Rhizoma 4 肉桂 Cinnamomi Cortex 4 馬齒莧 Portulacea Herba 4 枳實 Aurantii immaturus Fructus 4 連翹 Forsythiae Fructus 3 柴胡 Bupleuri Radix 3 白芷 Angelicae dahuricae Radix 3 地骨皮 Lycii Radicis Cortex 3 山楂 Crataegi Fructus 2 黃連 Coptidis Rhizoma 2 神麯 Massa medicata Fermentata 2 薄荷 Menthae Herba 2 荊芥 Schizonepetae Herba 2 Total

3 김태연 2) 시약본실험에사용된 LPS(Escherichia coli O55:B5), Sodium deoxycholate, NaCl, Tris-HCl, Sodium pyrophosphate는 Sigma-Aldrich, Inc.(St Louis, MO, USA) 으로부터, FBS, penicillin, streptomycin, DMEM 및 trypsin-edta solution 은 Gibco BRL(NY, USA) 로부터, Methylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(mtt), Trizol 및 DMSO 는 Amresco(Cochran Road Solon, OH, USA) 로부터, Nitric Oxide Detection kit는 Intron Biotechnology(Sungnam, Korea) 로부터, EZ-Western Detection Kit 는 Dogen(Seoul, Korea) 으로부터, DC Protein Assay Kit 는 Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA) 로부터, RNeasy protect mini kit, QuantiTect Reverse Transcription kit, QuantiTect SYBR Green PCR kit는 Quagen(Hilden, Germany) 로부터, protein extraction buffer 인 Proprep 은 Intron Biotechnology(Seoul, Korea) 로부터, Rabbit antiphospho-extracellular-regulated protein kinase(erk), anti-erk, anti-phospho-c-jun NH 2-protein kinase (JNK), anti-jnk, anti-phospho-p38, anti-p38 및 anti-β-actin primary antibody는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA) 으로부터, Goat Anti- Rabbit HRP-conjugated secondary antibody 는 ABcam (Cambridge, MA, USA) 으로부터구입하여사용하였다. 2. 방법 1) 세포배양 RAW cells은한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank, KCLB, No )(Seoul, Korea) 에서분양받았으며세포의배양을위하여 10% heatinactivated FBS과 1% penicillin 및 streptomycin 을포함한 DMEM 배양액에서배양하였다. 세포는 37 5% CO 2 조건하에서배양하였고, 2일마다배지를교환하였으며, 세포의증식에따른과밀도현상을해소하기위하여계대배양하였다. 2) MTT assay RAW cells 를 10% FBS 를포함한 DMEM 에현탁시킨후 96 well plate(corning, USA) 에 cells/ml 의세포수가되도록 100 μl씩분주하여 37, 5%, CO 2 incubator 에서 24시간배양한후 GDE 를 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 mg/ml의농도로처리하고 24시간동안배양하였다. 이후 5 mg/ml 의 MTT를각 well에 20 μl 넣고잘섞어준후 4시간동안 37 incubator에서배양한후상층액을제거하고 DMSO 를 200 μl씩분주하여 well에생성된 formazan 이잘녹을수있게충분히흔들어모두녹인후 Synergy 2 microplate reader(biotek, Winooski, VT, USA) 를사용하여 570 nm에서흡광도를측정하였으며, 3회의측정으로그에대한평균값과표준편차를구하였다. 3) NO assay RAW cells 를 10% FBS 를포함한 DMEM 에현탁시킨후 96 well plate(corning, USA) 에 cells/ml 의세포수가되도록 100 μl씩분주하여 37, 5%, CO 2 incubator 에서 24시간배양한후 GDE 를 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 mg/ml의농도로전처리하여 1시간동안배양한후, LPS를 1 μg/ml 의농도로처리하여 24시간동안배양하였다. 이후상등액을 100 μl씩취해새로운 96 well plate에넣은후 Nitric Oxide Detection kit의 N1 buffer 를 50 μl 첨가하고 10분간 incubator 에넣었다가꺼낸후, 다시 N2 buffer 를넣고 10분간상온방치한뒤에 Synergy 2 microplate reader(biotek, Winooski, VT, USA) 를사용하여 540 nm에서흡광도를 3회측정하였으며, 그에대한평균값과표준편차를구하였다. 표준품으로 Nitrite standard 를사용하여표준용량곡선을작성하고질소산화물 (nitrite, NO - 2 ) 의생성을산출하였다. 4) Real time RT-PCR RAW cells를 10% FBS를포함한 DMEM 에현탁시킨후 100 mm cell culture dishes(spl Lifesciences Inc, Korea) 에 cells/ml 의세포수가되도록 10 ml씩분주하여 37 5% CO 2 incubator 341

4 LPS 로유도된 RAW cell 의염증반응에서 MAPK 조절에의한加減當歸飮子의항염증효과 에서 24시간배양하였다. 새로운 DMEM 배지로교환한뒤 GDE(2 mg/ml) 를세포에처리하여 1시간동안배양하고자극제 LPS(1 μg/ml) 를처리하여 24시간동안배양하였다. RNeasy protect mini kit를이용하여 spin column 에추출된총 RNA 는 QuantiTect Reverse Transcription Kit 로역전사 (reverse transcription) 시킨후 QuantiTect SYBR Green PCR kit를이용하여실시간유전자증폭 (Real-time PCR) 을시행하였다. recation mixture는 cdna template 2 μl, SYBR Green PCR master mix 10 μl, primers 각 5 pm에 RNase free water 를넣어총 20 μl의양으로시행하였다. 온도조건은 95 에서 15분간전변성반응후, 94 15초, 55 30초, 72 30초의 3단계를한주기로 55주기를반복하였다. mrna 발현정도는유전자정량증폭장비인 Rotor Gene Q 및 software(qiagen, Hilden, Germany) 를사용하여정량 분석하였으며 inos, COX-2의 mrna 정량분석시 housekeeping 유전자인 Cyclophilin 을 internal control 로삼아표준화시켰다. primer 각각의염기서열은다음과같다 (Table 2). Table 2. The Primers for RT-PCR Analysis. Gene Strand Oligonuclotide sequences (5' to 3' direction) inos Sense GTGTTCCACCAGGAGATGTTG Antisense CTCCTGCCCACTGAGTTCGTC COX-2 Sense TGCATGTGGCTGTGGATGTCATCAA Antisense CACTAAGACAGACCCGTCATCTCCA Cyclophilin Sense ACCCCACCGTGTTCTTCGAC Antisense CATTTGCCATGGACAAGATG 5) Western blot RAW cells를 10% FBS를포함한 DMEM 에현탁시킨후 100 mm cell culture dishes에 cells/ml 의세포수가되도록 10 ml씩분주하여 37 5% CO 2 incubator 에서 24시간배양하였다. 새로운 DMEM 배지로교환한후 GDE(2 mg/ml) 로세포에처리하여 1시간동안배양한후 MAPK 활성을측정하기위하여 LPS(1 μg/ml) 에 10분동안 expose 하였다. 반응이종료된후배지를제거하고 Cold PBS로세척한후 protein extraction buffer인 Proprep 을사용하여 protein 을추출하였다. Protein content를 DC Protein Assay Kit를사용하여정량하여 20 μg의단백질을 l0% sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis(sds-page) 로분리하고, Hypond-PVDF membrane(amersham, Little Chalfont, UK) 으로 transfer 하였다. Transfer 된 membrane 은 Tris-buffered saline Tween 20(TBST ; 20 mm Tris, ph 7.6, 136 mm NaCl, 0.1% Tween 20) 에용해된 5% skim milk 에 1시간동안실온에서 blocking 한후 anti-phospho-erk 와 anti-erk, anti-phospho -JNK 와 anti-jnk, anti-phospho-p38 과 anti-p38 MAP kinase와 β-actin primary antibody(1:1000 dilution) 로 4 에서 overnight 반응한후 TBST 로 3회 washing 하고, HRP-conjugated secondary antibody(1:1000 dilution) 로 1시간동안실온에서반응시켰다. TBST 로 3회세척한후 EZ-Western Detection Kit로면역반응성단백질밴드를발색시킨후, 웨스턴이미지분석시스템인 FUSION-SL WL 및 FUSION- CAPT software(vilber Lourmat, Eberhardzell, Germany) 를사용하여분석하였다. 3. 統計분석각실험군간의통계학적분석은 SPSS 17.0 K for Windows 통계프로그램패키지를사용하여 one 342

김태연 way-analysis of variance를실시하였으며유의수준은 p<0.05로하였다. Ⅲ. 결과 1. 加減當歸飮子의세포독성실험 GDE가 RAW 264.7 cells의생존율에미치는영향을알아보기위하여 MTT assay 를실시하였다. 아무런처리를하지않은대조군의흡광도평균을 100으로정하고각흡광도값을환산하여계산한결과, 0, 0.025, 0.05, 0.

025, 0.05, 0.1, 0.2 mg/ml 농도군에서의 NO 생성량은각각 6.79±0.25, 7.40±0.21, 6.76±0.23, 6.86±0.26 μm로대조군과유의한차이가관찰되지않았으나 0.5, 1, 2 mg/ml 농도군에서의 NO 생성량은 5.79±0.21, 4.54±0.17, 3.28± 0.15 μm 로대조군에비하여유의한감소효과 (* p<0.

5 김태연 way-analysis of variance를실시하였으며유의수준은 p<0.05로하였다. Ⅲ. 결과 1. 加減當歸飮子의세포독성실험 GDE가 RAW cells의생존율에미치는영향을알아보기위하여 MTT assay 를실시하였다. 아무런처리를하지않은대조군의흡광도평균을 100으로정하고각흡광도값을환산하여계산한결과, 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 mg/ml 농도에서의상대적흡광도는 100.0±7.8, 105.3±7.0, 109.6±5.3, 112.2±7.5, 111.1±6.5, 99.9±6.2, 96.7±7.3, 97.1±7.0으로, GDE 처치전농도에서대조군과의유의한차이는관찰되지않았다 (Fig. 1). 의 NO 생성량은 7.02±0.24 μm 이었으며, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 mg/ml 농도군에서의 NO 생성량은각각 6.79±0.25, 7.40±0.21, 6.76±0.23, 6.86±0.26 μm로대조군과유의한차이가관찰되지않았으나 0.5, 1, 2 mg/ml 농도군에서의 NO 생성량은 5.79±0.21, 4.54±0.17, 3.28± 0.15 μm 로대조군에비하여유의한감소효과 (* p<0.05, p<0.001) 를나타내었다 (Fig. 2). Fig. 2. Effects of GDE extract on nitric oxide concentration in RAW cells. Representative sticks show that nitric oxide concentration in RAW cells by GDE extract (25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml, 500 μg/ml, 1000 μg/ml, 2000 μg/ml) treated for 24 h. Nitrite oxide was measured by nitirc oxide detection kit`s method. GDE : Gagam-Danguieumja, NO : nitric oxide * p<0.05, p<0.001 compared with control. Fig. 1. Effects of GDE extract on the cell viability of RAW cells. Representative sticks show that cell viability in RAW cells by GDE extract (25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml, 500 μg/ml, 1000 μg/ml, 2000 μg/ml) treated for 24h at 37. Cell viability was measured by MTT assay as described in materials and methods. GDE : Gagam-Danguieumja, MTT : methylthiazol -2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide. 3. 加減當歸飮子의 inos mrna 발현감소효과 RAW cells 에서 inos mrna 의상대적발현을관찰한결과, 무처치군과 GDE 단독처리군경우각각 0.001±0.0, 0.011±0.001의값을나타내었으며, GDE+LPS 처리군 (0.051±0.012) 의경우 LPS 단독처리군 (0.153±0.012) 의 33.3% 로유의성있는감소를나타내었다 (Fig. 3). 2. 加減當歸飮子의 NO 생성감소효과 LPS 자극에의한 RAW cells의 NO 생성증가기전에미치는 GDE의작용을확인하기위하여 NO assay를실시하였다. LPS만처리한대조군 343

6 LPS 로유도된 RAW cell 의염증반응에서 MAPK 조절에의한加減當歸飮子의항염증효과 Analysis of relative COX-2 mrna expression in RAW cells was done by quantitative Real-time RT-PCR. RAW cells were treated with GDE (2 mg/ml) or without for 24 h in the absence or presence of LPS (1 μg/ml). Cyclophilin was used as internal control genes. GDE : Gagam-Danguieumja, LPS : lipopolysaccharide, COX-2 : cyclooxygenase-2 * p<0.01 compared to the only LPS treated group. Fig. 3. Degree of relative inos mrna expression by GDE in the LPS-stimulated RAW cells. Analysis of relative inos mrna expression in RAW cells was done by quantitative Realtime RT-PCR. RAW cells were treated with GDE (2 mg/ml) or without for 24 h in the absence or presence of LPS (1 μg/ml). Cyclophilin was used as internal control genes. GDE : Gagam-Danguieumja, LPS : Lipopolysaccharide, inos : inducible nitric oxide synthase p<0.001 compared to the only LPS treated group. 4. 加減當歸飮子의 COX-2 mrna 발현감소효과 RAW cells 에서 COX-2 mrna 의상대적발현을관찰한결과, 무처치군과 GDE 단독처리군경우각각 0.006±0.001, 0.103±0.014의값을나타내었으며, GDE+LPS 처리군 (5.128±0.814) 의경우 LPS 단독처리군 (7.718±0.788) 의 66.4% 로유의성있는감소를나타내었다 (Fig. 4). Fig. 4. Degree of relative COX-2 mrna expression by GDE in the LPS-stimulated RAW cells. 5. 加減當歸飮子의 MAPKs 경로의인산화억제효과 RAW cells 에서 MAPKs 경로의인산화정도를 western blot을통해관찰한결과, GDE+LPS 처리군의 P-p38, P-ERK(P-p44 P-p42), P-JNK (P-p54 P-p46) 발현은각각 69.7%, 61.1% 68.2%, 80.0% 91.3% 로 LPS 단독처리군 (100%) 에비하여감소되었음을확인할수있었다 (Fig. 5, 6, 7, 8). p38 P-p38 ERK p44 p42 P-ERK P-p44 P-p42 JNK p54 p46 P-JNK P-p54 P-p46 ß-actin LPS GDE Fig. 5. Effect of GDE on LPS-induced phospholyration (P-) of MAPKs in RAW cells. RAW cells were treated with GDE (2 mg/ml) or without for 1 h before being incubated with LPS (1 μg/ml) for 10 min. Whole-cell lysates were analyzed by western blot analysis. GDE : Gagam-Danguieumja, LPS : lipopolysaccharide 344

김태연 Fig. 6. Effect of GDE on LPS-induced phosphorylation of p38 in RAW 264.7 cells. Fig. 7. Effect of GDE on LPS-induced phosphorylation of ERK in RAW 264.7 cells. Fig. 8.

7 김태연 Fig. 6. Effect of GDE on LPS-induced phosphorylation of p38 in RAW cells. Fig. 7. Effect of GDE on LPS-induced phosphorylation of ERK in RAW cells. Fig. 8. Effect of GDE on LPS-induced phosphorylation of JNK in RAW cells. Ⅳ. 고찰 當歸飮子는嚴의濟生方 3 에처음수록된處方으로四物湯을기본방으로하여補肝腎하는何首烏, 風熱을거하여皮膚搔痒과瘡을치료하는白蒺藜, 風熱을發散시키는荊芥防風, 托瘡生肌하는黃芪, 諸藥을調和시키고解毒作用을하는甘草 를가하여 治心血凝滯, 內蘊風熱, 發見皮膚, 遍身瘡疥, 或腫或痒, 或膿水浸淫, 或發赤疹㾦 의목적으로立方되었으며血燥와風熱로인한瘡疥, 피부소양증, 만성두드러기등의치료에응용되고있다 4. 當歸飮子에대한연구로는乾癬에활용되는加味當歸飮子에대한실험 6 및임상적고찰 7,8, 當歸飮子水抽出液이抗 allergy 反應과 mouse의免疫細胞機能에미치는영향 9, 加味當歸飮子 10 11, 當歸飮子加減方단독사용또는外治方병용 12,13 이아토피동물모델에미치는영향, 열 피부발진 소양감 림프절종대등을특징으로하는 anticonvulsant hypersensitivity syndrome 치험례 14 등이있다. GDE 5 는宋代曹世榮의活幼心書에서아토피피부염의한의학적범주중하나인胎熱의원인으로 此因在胎母受時氣邪毒或外感風熱或食五辛薑麵過多治令熱蘊於內熏蒸胎中 18 이라한것에근거하여當歸飮子에淸熱解毒, 發散風熱, 補陰益氣, 行氣燥濕, 溫補脾胃하는數種의약재를가하여陰血損傷, 脾虛氣血不調로쉽게慢性으로傳變되는아토피성피부염 4 에사용하기위하여作方되었다. 염증신호는세포내에서다양한신호전달분자들을활성화시키는데, 이중 MAPK 는인산화를통하여 nuclear factor-κb(nf-κb), activator protein-1 (AP-1), activating transcription factor-2, campresponsive element binding protein 을포함한다양한전사인자들을활성화시키는핵심신호전달분자로보고되고있다 19,20. 따라서대식세포를매개한염증반응에있어 NO 생성효소인 inos, prostaglandin 생합성의속도조절단계효소인 COX-2의발현조절과이들유전자의발현에있어주요신호전달분자인 MAPK 의활성조절은염증반응을조절하기위한핵심요소로서인식되고있다 2. 대식세포 (macrophage) 는 LPS를비롯한다양한병원체유래인자에의해활성화되며, 외래인자탐식을위하여 NO, prostanoid 등의지방대사체, tumor necrosis factor-α(tnf-α), interleukin(il)-1β, 345

8 LPS 로유도된 RAW cell 의염증반응에서 MAPK 조절에의한加減當歸飮子의항염증효과 IL-6 등의전염증성 cytokine, chemokine 등염증매개인자를유리함으로써외래인자를제거하기위한내재면역계의효능세포로서중요한역할을담당한다 1. 본연구에사용된 RAW cell은항염증약물의효능을검증하고, 전구염증매개인자들의유도를주도하는신호전달경로의억제효능을가진약물을평가하기위한실험모델로가장일반적으로사용하고있다 21. 본연구에서 RAW cell 의생존률과증식을저해하지않는 GDE 의농도를조사한결과 2 mg/ml 이하의농도에서 GDE가정상세포와유의한차이를보이지않았다. LPS는생체내에서염증을일으키는 inflammagen 으로널리사용되어왔다. LPS 는염증반응병원체의중심적역할을하며, nitric oxide(no), prostaglandin E 2(PGE 2) 및 leukotriene 과같은염증매개체의생성을자극하며, 이염증매개체의신호경로를자극한다 22,23. 본연구에서는 GDE의염증성질환에대한효과를확인하기위하여 RAW cells에 LPS를처리함으로써 NO 생성, inos와 COX-2 발현, MAPK의인산화를유도하였다. NO는 nitric oxide syntheses(nos) 효소군에의하여 L-arginine 으로부터합성된다. NOS는인체내생리학적합성조절에서중요한역할을하는데이들은 neuronal NOS(nNOS), inducible NOS(iNOS), endothelial NOS(eNOS) 와같은 3가지의형태로존재한다. 그중, inos는염증조절을일으키는중요한효소중하나이다 23. inos는 Ca 2+ 비의존성경로를통해서장시간에걸쳐증가하여다량의 NO 를형성한다 inos 발현은 murine macrophage, 내피세포, 평활근세포및심근세포등많은세포에서관찰되고있다. 인간의 inos는염증성질환이있는환자의 macrophage 에서다량의 NO를생성하여세균침입을억제하거나혹은 T-세포증식을억제하여국소염증반응을하향시키는방어에중요한역할을하고있는것으로보고되고있다 27. 그러나과도한 inos의발현은 NO의생성량을증가시켜그자체의독성효과에의해주위세포의손상 을야기한다 28. 본연구에서 NO 생성을감소시키는 GDE의농도를조사한결과 500 μg/ml 이상의농도에서유의성있는감소효과를확인할수있었으며 GDE 처리군의 inos mrna 발현또한미처리군에비해억제됨을확인할수있었다. inos 와더불어대표적인전구염증매개효소인 COX 는 arachidonic acid 를염증매개인자인 prostaglandins (PGs) 로전환시키며 COX-1 과 COX-2로존재한다. 그중 COX-2 는정상적인생리조건에서는거의발현되지않으나사이토카인, 박테리아독소, LPS 와같은염증신호에의해발현되어많은양의 PGs를생성하여염증을유도한다. 따라서 COX-2 의억제는염증과통증을감소시킬수있다 본연구에서 GDE 처리군의 COX-2 mrna 발현또한미처리군에비해억제됨을확인할수있었다. 다양한외부자극에의한전사인자의활성화로전구염증매개효소인 COX-2 나 inos 발현이유도되는과정은현재까지비교적잘특성화된주요 MAPK superfamily 에속하는세가지효소인 ERK, JNK 및 serine/threonine-protein kinase 중하나인 p38을통해설명되고있다 33. 이들 MAPKs 는모두다양한세포외자극에반응해 upstream MAPK kinase(mek) 에의해 tyrosine 과 threonine에서인산화가일어남으로써활성화된다. 상기 MAPKs 의활성형은그후에다른 kinase 나전사인자를인산화 활성화시키고, 결국표적유전자의발현을변화시킨다 33. 본실험에서 RAW cells에서 LPS로유도된 JNK1 2, ERK1 2와 p38 MAPK 활성화에어떠한영향을미치는지 westernblot 을통하여확인한결과 GDE 는 MAPKs 신호전달체계에억제효과가있었다. 결과적으로본실험에서 GDE는 LPS로자극된 RAW cells에서 NO생성을억제하였다. 이와같은항염증반응효과는 inos와 COX-2의 mrna 발현을효과적으로감소시킴으로써일어나며, MAPK 경로의억제를통해 NO생성을경감시키는것으로사료된다. 이러한결과들을통해 GDE은항염증 346

9 김태연 효과를지니고있으며향후 GDE가단백질수준에서염증발현에관여하는 inos와 COX-2 의억제효과확인, NF-kB signaling 관련여부, COX-2 에의해생성되는염증매개인자인 PGs 확인등의추가적인연구를통해피부질환을비롯한각종염증질환의효과적인치료처방으로제시될수있을것으로사료된다. Ⅴ. 결론 GDE가염증에관여하는여러인자들에미치는영향을알아보고자, LPS로활성화시킨 RAW cells 에서염증과관련된 NO의양, inos 및 COX-2 의발현에미치는효과와, MAPK 경로에미치는효과에대하여실험한결과다음과같은결론을얻었다. 1. GDE는 NO 생성을억제하였다. 2. GDE는 inos, COX-2의 mrna 발현을감소시켰다. 3. GDE 는 mitogen-activated protein kinase(mapk) 경로인 p38, ERK, JNK의인산화를억제하였다. 이러한결과를바탕으로 GDE는항염증효과가있을것으로사료된다. 감사의글본연구는지식경제부의지역혁신센터사업으로수행되었음 (RIC ). 참고문헌 1. Kindt TJ, Goldsby RA, Osborne BA. Innate immunity : Tenney S. Kuby Immunology. 6th ed. New York: Freeman press; 2007, p 박상미, 변성희, 김영우, 조일제, 김상찬. 桑葉추출물의 LPS로유도된 RAW 세포에서의항염증효과. 대한본초학회지 2012;27(3): 嚴用和. 濟生方. 中國醫學大系券十一. 서울 : 여강출판사 ; 1987, p 차관배, 김윤식, 설인찬. 아토피피부염에관한文獻的考察. 대전대학교한의학연구소논문집 2005;14(2): 세명대학교부속제천한방병원. 원내처방집. 제천 : 인성사 ; 2009, p 이건학, 노석선. 乾癬에활용되는加味當歸飮子에대한실험적연구. 대한외관과학회지 1999; 19(2): 심상신, 김종한, 최정화. 당귀음자가감을응용한건선환자 1례에대한임상적고찰. 대한한방안이비인후피부과학회지 2002;5(1): 민들레, 장성진, 박은정. 當歸飮子加減方과外治法을병용한小兒乾癬치험 1례. 대한한방소아과학회지 2012;26(3): 노석선. 當歸飮子水抽出液이抗 allergy 反應과 mouse의免疫細胞機能에미치는영향. 원광대학교대학원, 한재경, 김윤희. 加味當歸飮子가아토피동물모델에미치는영향. 대한한방소아과학회지 2005; 19(1): 한경훈, 박은정, 이해자. 當歸飮子加減方의처방별 (A, B) 아토피성알레르기반응조절효과비교연구. 대한한방소아과학회지 2005;19(2) : 김성훈, 최정화, 김종한, 박수연. 當歸飮子加減方과外治方병용이 NC/Nga 아토피생쥐에미치는영향. 한방안이비인후피부과학회지 2005; 18(1): 송성필, 손대범, 황치환, 송승현, 황충연. 當歸飮子와三黃洗劑加味方병용이 NC/Nga 아토피생쥐에미치는영향. 동의생리병리학회지 2007; 21(5):

10 LPS 로유도된 RAW cell 의염증반응에서 MAPK 조절에의한加減當歸飮子의항염증효과 14. 류순현, 최요섭, 김정진, 정기현, 김영석, 김태경. 當歸飮子로好轉된中風患者의 anticonvulsant hypersensitivity syndrome 1 例. 대한한방내과학회지 2002;23(2): 이상인. 방제학. 서울 : 영림사 ; 1990, p 이상인, 안덕균, 신민효, 노승현, 이영종, 김선희. 한약임상응용. 서울 : 성보사 ; 1998, p. 90-1, 107-8, 356-7, 전국한의과대학본초학교수. 본초학. 서울 : 영림사 ; 2000, p. 127, 131, 518, 534, 540, 曹世榮. 活幼心書 ( 明本論 ). 上海 : 大東書局 ; 1933, p Robbins SL, Kumar V, Cotran RS. Acute and chronic inflammation : Mitchell S. Pathologic basis of disease. 7th ed. Philadelphia: W. B. Saunders Co.; 2006, p Dong C, Davis RJ, Flavell RA. MAP kinases in the immune response. Annu Rev Immunol 2002;20: 김범회, 이용태, 강경화. LPS로유도된 RAW 염증모델에서 MARK 조절에의한羊乳의항염증효과. 동의생리병리학회지 2010;24(1): Raabe T, Bukrinsky M, Currie RA. Relative contribution of transcription and translation to the induction of tumor necrosis factor-alpha by lipopolysaccharide. J Biol Chem 1998;273(2) : Dawson TM, Dawson VL, Snyder SH. A novel neuronal messenger molecule in brain: The free radical, nitric oxide. Ann. Neurol 1992;32: Yui Y, Hattori R, Kosuga K, Eizawa H, Hiki K, Kawai C. Purification of nitric oxide synthase from rat macrophages. J Biol Chem 1991;266 : Korhonen R, Lahti A, Hämäläinen M, Kankaanranta H, Moilanen E. Dexamethasone inhibits inducible nitric-oxide synthase expression and nitric oxide production by destabilizing mrna in lipopolysaccharide-treated macrophages. Mol Pharmacol 2002;62(3): Vegeto E, Bonincontro C, Pollio G, Sala A, Viappiani S, Nardi F, et al. Estrogen prevents the lipopolysaccharide-induced inflammatory response in microglia. J Neurosci 2001;21(6) : Wang MJ, Lin WW, Chen HL, Chang YH, Ou HC, Kuo JS, et al. Silymarin protects dopaminergic neurons against lipopolysaccharide-induced neurotoxicity by inhibiting microglia activation. Eur J Neurosci 2002;16(11): Hanisch UK. Microglia as a source and target of cytokines. Glia 2002;40(2): Chen W, Tang Q, Gonzales MS, Bowden GT. Role of p38 MAP kinases and ERK in mediating ultraviolet-b induced cyclooxygenase-2 gene expression in human keratinocytes. Oncogene 2001;20(29): Marina L, Kamal RM, Andrew F, Gary B, Jeremy S, Andrew RC. Regulation of Cyclooxygenase 2 mrna Stability by the Mitogen-Activated Protein Kinase p38 Signaling Cascade. Mol Cell Biol 2000;20(12): Mitchell JA, Larkin S, Williams TJ. Cyclooxygenase-2 :regulation and relevance in inflammation. Biochem Pharmacol 1995;50: Crofford LJ, Lipsky PE, Brooks P, Abramson SB, Simon LS, Van de Putte LB. Basic biology and clinical application of specific cyclooxygenase-2 inhibitors. Arthritis Rheum 2000;43(1): 김영선, 이성근, 이기상. 大薊가 LPS로유도된 Mouse BV2 Microglial cells 의염증반응에미치는영향. 대한한방내과학회지 2008;29(4):

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α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를