J Koren So Foo Si Nutr 한국식품영양과학회지 45(4), 51~517(216) http://x.oi.org/1.3746/jkfn.216.45.4.51 산화스트레스가유도된 HepG2 세포에서 Erioityol 의항산화효과 주태우 홍성현 박선영 김거유 주진우 강원대학교동물생명과학대학축산식품과학전공 Antioxint Effets of Erioityol on Hyrogen Peroxie-Inue Oxitive Stress in HepG2 Cells Te-Woo Joo, Sung-Hyun Hong, Sun-Young Prk, Gur-Yoo Kim, n Jin-Woo Jhoo Animl Prouts n Foo Siene Progrm, College of Animl Life Sienes, Kngwon Ntionl University ABSTRACT This stuy ws onute to investigte the ntioxint n heptoprotetive effets of erioityol ompoun ginst hyrogen peroxie-inue oxitive stress in HepG2 ells y mesuring expression levels of ntioxint enzymes, liver funtion inex enzyme tivities, n inhiitory effets ginst retive oxygen speies (ROS) proution. HepG2 ell viility ws ssesse using 3-(4,5-imethyl thizole-2-yl)-2,5-iphenyl tetrzolium romie ssy. In the onentrtion rnge of 1 5 μg/ml, erioityol isplye over 98% ell viility in HepG2 ells. The effets of inrese gene expression on hyrogen peroxie-inue oxitive stress were nlyze y monitoring ntioxint enzyme (superoxie ismutse, SOD; tlse, CAT; glutthione peroxise, GPx) gene expression levels using rel-time PCR. Erioityol ompoun signifintly inrese gene expression levels of SOD, CAT, n GPx in ose-epenent mnner (1 5 μg/ml). Heptoprotetive effets ginst hyrogen peroxie-inue oxitive stress were nlyze y monitoring glutmi oxloeti trnsminse (GOT), ltte ehyrogense (LDH), n gmm-glutmyl trnsferse (GGT) tivities in HepG2 ell ulture meium using iohemistry nlyzer. Erioityol ompoun signifintly reue GOT, LDH, n GGT tivities in ose-epenent mnner in HepG2 ells. ROS level in HepG2 ells ws nlyze y 2',7'-ihlorofluoresein fluoresene iette ssy, n erioityol ompoun effetively reue the intrellulr ROS level in HepG2 ells. The results revel tht erioityol ompoun n e useful for evelopment of effetive ntioxint n heptoprotetive gents. Key wors: erioityol, ntioxint enzyme expression, heptoprotetive, flvonoi, ntioxint tivity 서 생명체는에너지대사를위해산소를이용하지만이는에너지를만드는대사과정, 체내효소계, 환원대사의내적요인및외부인자로인해 superoxie ril, hyroxyl ril, hyrogen peroxie, singlet oxygen 등과같은반응성이높은활성산소종 (retive oxygen speies, ROS) 을형성하게된다 (1). 활성산소종은정상적인환경에서항상성을유지하기위한산화방어기작에의해제거되어생체에큰영향을미치지않지만 (2), 각종물리화학적, 환경적, 또는외적요인에의하여생체내활성산소종의생성과이를제거하는항산화반응간의불균형으로인해활성산소종이증가한상태인산화스트레스상태가되면 DNA, 단백질또는지질과반응하여생체내세포를손상시키며 (3), 이는노화, 암, 심 Reeive 15 Ferury 216; Aepte 4 April 216 Corresponing uthor: Jin-Woo Jhoo, Animl Prouts n Foo Siene Progrm, College of Animl Life Sienes, Kngwon Ntionl University, Chunheon, Gngwon 24341, Kore E-mil: jjhoo@kngwon..kr, Phone: +82-33-25-8649 론 혈관질환, 폐질환 (4,5) 등과같은다양한질환을발생시키는주요원인으로보고되고있다. 환경오염의증가와고령화등과같은여러원인에의해서인체는산화스트레스에많이노출되며이로부터세포손상을조절하기위한기능성소재탐색에관한많은연구가진행되고있다 (3). 합성항산화제인 tert-utylhyroquinone(tbhq), utylte hyroxytoluene(bht), utylte hyroxynisole(bha) 등은높은항산화활성을나타내지만인체의지질변화및발암독성등과같은여러가지부작용때문에합성항산화제의사용은기피하는추세가되어 (6), 천연항산화제개발을위해많은연구가진행되고있다. 천연항산화제로알려진 flvonoi 화합물은식물이만들어내는 2차대사산물로서복잡한생합성경로를가지며, 식물체에서이들 flvonoi 함량은종, 부위에따라다르고계절, 장소, 기후, 재배조건에도영향을받는것으로알려졌다. 현재까지발견된 flvonoi 화합물의종류는약 5,여종이상탐색되었고일반적으로 nthoynins, flvn-3-ols, flvnones, flvones, flvonols, isoflvones 등으로구분할수있다 (7, 8). 생물체에서 flvonoi 화합물의기능성은색을조절하고
Erioityol 화합물의항산화활성 511 HepG2 세포주배양 HepG2 세포주는 ATCC사로부터분양받았으며, DMEM 배지에 1% FBS와 1 U/mL peniillin, 1 μg/ml streptomyin을첨가하여 37 C, 5% CO 2 를유지하는배양기 (HERAell 15, Thermo Eletron Corp., Wlthm, MA, USA) 에서배양하였다. Fig. 1. Chemil struture of erioityol. (9), 자외선을차단하며 (1), 항산화효과 (11) 를나타낸다. Flvonoi 화합물의한종류인 erioityol 화합물 (Fig. 1) 은지질과산화를억제하는효과가있으며 (12), 항염증, 망막보호, 당뇨병에도이로운영향을미친다고보고되어있다 (13-15). 따라서본연구에서는싸리나무 (Lespeez iolor) 잎에서분리한 flvonoi 화합물의한종류인 erioityol의 HepG2 세포에서 hyrogen peroxie 처리에의해유도된산화적스트레스에대한항산화활성및세포보호효과를분석하여기능성물질로서이용가능성을평가하고자실시하였다. 재료및방법실험재료및시약세포배양에사용된 HepG2 세포는 Amerin Type Culture Colletion(ATCC) 사 (Mnsss, VA, USA) 로부터구입하였다. Duleo's moifie Egle's meium(dmem) 및 fetl ovine serum(fbs) 은 Hylone사 (Logn, UT, USA) 로부터구입하였으며, hyrogen peroxie(h 2O 2), imethylsulfoxie(dmso), 3-(4,5-imethyl thizole-2- yl)-2,5-iphenyl tetrzolium romie(mtt), 2',7'-ihlorofluoresein iette(dcfh-da) 및 trypsin-edta 는 Sigm-Alrih Co.(St. Louis, MO, USA) 로부터구입하였다. Polymerse hin retion(pcr) 분석에서이용된 oligo(t), NTP, RNse-free wter 및 Supersript Ⅲ First-Strn Synthesis는 Invitrogen(Crls, CA, USA) 에서구입하였다. RNesy Mini Kit, Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit은 Qigen(Vleni, CA, USA) 에서그리고 oligonuleotie primer는 Bioneer(Dejeon, Kore) 에서구입하여사용하였다. Ltte ehyrogense(ldh), glutmi oxloeti trnsminse(got), gmm-glutmyl trnsferse(ggt) 분석시약은 Thermo Sientifi (Vnt, Finln) 으로부터구입하였다. 본실험에서사용한 erioityol 화합물은 Lee와 Jhoo(16) 에의해보고된방법에따라싸리나무잎추출물에서컬럼크로마토그래피법을이용하여분리하였으며, 분리된화합물은표준품 (Sigm- Alrih Co.) 과 1 H NMR, 13 C NMR 및 HPLC 분석자료를비교분석후실험에사용하였다. MTT ssy 에의한세포생존율분석 Erioityol 화합물의세포생존율을분석하기위해 MTT 분석법을이용하여측정하였다. 96-well plte에 DMEM 배지를이용하여 5 1 4 ells/well의 HepG2 세포를분주하여 37 C, 5% CO 2 조건에서 24시간동안배양한후상등액제거하고 PBS로 2회세척한다음 DMEM 배지에시료를농도별로처리하여 37 C, 5% CO 2 inutor에서 24시간배양하였다. DMEM 배양액을제거한후 5 mg/ml의 MTT solution 2 μl와 PBS 18 μl를첨가하여 37 C, 5% CO 2 inutor에서 4시간동안반응시켰다. 반응후상등액을모두제거하여 DMSO 2 μl씩을첨가하여생성된 formzn 용해하였으며이를 ELISA reer를이용하여 55 nm에서측정하였다. 세포생존율 (%) 은다음과같은식을사용하여나타내었다. 세포생존율 (%)= 시료처리군의흡광도 1 대조군의흡광도 Totl RNA 추출및 DNA 합성 24-well plte에 DMEM 배지를이용하여 5 1 5 ells/ well의 HepG2 세포를분주하여 37 C, 5% CO 2 조건에서 24시간동안배양한후각 well에 2 μm hyrogen peroxie와농도별 erioityol 화합물을 24시간처리하였다. 이후상등액을제거하고수집한세포로부터 RNesy Mini Kit(Qigen) 을이용하여제공된 protool에따라 RNA를추출하였으며, genomi DNA를제거하기위해 RNse-free DNse set(qigen) 를이용하였다. 생성된 totl RNA에 Oligo T와 NTP를첨가하여 65 C에서 5분, 아이스에서 1분동안반응후 Supersript Ⅲ First-Strn(Invitrogen) 를이용하여제공된 protool에따라 DNA를제조하였다. PCR의반응조건은 25 C에서 1분, 5 C에서 1분, 55 C에서 5분그리고 4 C에서유지하는순으로수행하였으며, 반응후 Esherihi oli RNse H 1 μl를첨가하여 37 C에서 2분동안반응하였다. 최종적으로합성된 DNA 는사용하기전까지 -2 C에서보관하였다. Rel-time PCR을이용한유전자발현분석 Erioityol 화합물이항산화효소들의유전자발현에미치는영향을검토하기위하여 superoxie ismutse-1 (SOD-1, Cu-Zn SOD), superoxie ismutse-2(sod- 2, Mn SOD), tlse(cat) 및 glutthione peroxise (GPx) 의 mrna 발현량을 rel-time PCR을이용하여분석
512 주태우 홍성현 박선영 김거유 주진우 Tle 1. Sequenes of primer use for rel-time PCR Primer Oligonuleotie sequene SOD-1 SOD-2 GPx CAT β-atin 5'-ACGGTGGGCCAAAGGATGAA-3' 5'-TCATGGACCACCAGTGTGCG-3' 5'-AGAAGCACAGCCTCCCCGAC-3' 5'-GGCCAACGCCTCCTGGTACT-3' 5'-TCGGTGTATGCCTTCTCGGC-3' 5'-CCGCTGCAGCTCGTTCATCT-3' 5'-CCAACAGCTTTGGTGCTCCG-3' 5'-GGCCGGCAATGTTCTCACAC-3' 5'-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3' 5'-GGACTCCATGCCCAGGAAGG-3' 하였다. 항산화효소의 primer 염기서열은 Tle 1에제시하였다. Rel-time PCR 반응액은 Rotor-Gene SYBR Green PCR Mster Mix(Qigen), 항산화유전자의 -F, -R primer(1 pmol/μl), H 2O를혼합한후추출한 DNA에첨가하여사용하였다. Rel-time PCR은 Qigen의 Rotor-Gene Q 2 plex를사용하였으며, 반응조건은 two step yling protool을기준으로 95 C에서 5분동안 pre-enturtion을실시한후 95 C에서 5초, 6 C에서 1초씩 4 yles을반복하고, 6 C에서 95 C까지 3분동안증가하는 melting 단계순으로수행하였다. Rel-time PCR을통해증폭된산물은 Delt elt Ct metho를이용하여정량하였으며, 각시료는 β-tin의발현량으로보정하였다. 간기능지표효소활성측정 Erioityol 화합물이간세포보호에미치는영향을검토하기위하여간기능지표효소인 LDH, GGT, GOT를분석하였다. 24-well plte에 DMEM 배지를이용하여 5 1 5 ells/well의 HepG2 세포를분주하여 37 C, 5% CO 2 조건에서 24시간동안배양하였다. 배양된 HepG2 세포에 2 μm hyrogen peroxie를농도별 erioityol 화합물과함께처리하여 24시간을배양시켰으며, 이후 4, rpm에서 1분간원심분리하여상등액을회수한다음생화학분석기 (Konel 2B, Thermo Sientifi) 를이용하여 LDH, GGT 및 GOT 활성을측정하였다. DCFH-DA 에의한세포내 ROS 측정 Erioityol 화합물처리에의한세포내활성산소종생성억제효과를측정하기위하여 DCFH-DA ssy를이용하여측정하였다. 24-well plte에 DMEM 배지를이용하여 5 1 5 ells/well의 HepG2 세포를분주하여 37 C, 5% CO 2 조건에서 24시간동안배양후상등액을제거하였으며, 이를 PBS로 2회세척하고 2 µm DCFH-DA를각 well에분주하여 37 C, 5% CO 2 inutor에서 2분간 pre-inution 하였다. 각 well에농도별시료및 2 µm hyrogen peroxie를처리하여시간대별로 DCF fluoresene 를 exittion 488 nm, emission 53 nm에서 Gemini XPS miroplte spetrofluorometer(moleulr Devies, Sunnyvle, CA, USA) 를이용하여측정하였다. 통계분석실험결과는 SPSS 22.(SPSS In., Chigo, IL, USA) 을이용하여 ANOVA로분석하였고, 집단간비교를위한사후분석은 Tukey로검증하였으며 P<.5 이상일때만통계적유의성이있는것으로판단하였다. 모든분석항목은 3회이상반복시험하여얻은결과를평균 ± 표준편차로나타내었다. Cell viility (%). 11 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 Conentrtion (μg/ml) Fig. 2. Effets of erioityol on HepG2 ell viility. Vlues re men±stnr evition of three replite etermintions (n=3). Different letters ove the rs inite sttistilly signifint ifferenes (P<.5). Cell viility (%). 11 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 결과및고찰 세포생존율 Erioityol 화합물의 HepG2 세포주세포생존율에미치는영향을분석하여 Fig. 2와 Fig. 3에나타내었다. Erioityol 화합물 1~5 μg/ml 처리농도에서 HepG2 세포는약 98% 이상의생존율을보였으며, 세포의산화스트레스상태를유도하기위한 hyrogen peroxie(2 µm) 및 Con 1 2 3 4 5 (μg/ml) H 2 O 2 (2 μm) + + + + + + Fig. 3. Effets of erioityol n hyrogen peroxie tretment on HepG2 ell viility. Vlues re men±stnr evition of three replite etermintions (n=3). Different letters ove the rs inite sttistilly signifint ifferenes (P<.5).
Erioityol 화합물의항산화활성 513 erioityol 화합물을처리한실험군의세포생존율은약 96% 이상으로나타나는것을확인할수있었다. 따라서 erioityol 화합물이 HepG2 세포의세포생존율에영향을크게미치지않는농도범위에서후속실험을진행하였다. 항산화효소발현저해효과 HepG2 세포주에서 hyrogen peroxie에의해유발된산화스트레스및간세포손상으로부터 erioityol 화합물처리에의한주요항산화효소들의유전자발현량을 reltime PCR로분석하였다 (Fig. 4~7). SOD-1의경우 hyrogen peroxie를단독처리한대조군보다 erioityol 화합물 2 µg/ml의처리농도에서약 1% 높은발현량이분석 되었으며, 5 µg/ml의처리농도에서는 hyrogen peroxie 처리군보다약 3% 높은발현량이분석되었다. 농도가증가함에따라 SOD-1의발현량이유의적으로증가하는것을확인하였다 (Fig. 4). SOD-2의경우 3, 4, 5 µg/ml 처리농도별발현량이각각 73.5%, 88.7%, 89.8% 로 hyrogen peroxie를단독처리한대조군에비해유의적으로증가하는것으로나타났다 (Fig. 5). CAT의경우 1 µg/ml 의처리농도에서 hyrogen peroxie 처리군보다약 27% 의높은발현량이분석되었으며, 처리농도가증가함에따라 CAT의발현량이유의적으로증가하였다 (Fig. 6). GPx 발현의경우 1 µg/ml의처리농도에서 hyrogen peroxie 처리군보다약 26.7% 높은발현량이분석되었다 (Fig. 7). SOD-1 β-tin CAT β-tin % of ontrol. 12 1 8 6 4 e e % of ontrol. 12 1 8 6 4 2 2 Con Con 1 2 3 4 5 (μg/ml) H 2 O 2 (2 μm) - + + + + + + Fig. 4. Effets of erioityol on superoxie ismutse-1 (SOD- 1) gene expression ginst hyrogen peroxie-inue oxitive stress in HepG2 ells. Vlues re men±stnr evition of three replite etermintions (n=3). Different letters ove the rs inite sttistilly signifint ifferenes (P<.5). Con Con 1 2 3 4 5 (μg/ml) H 2 O 2 (2 μm) - + + + + + + Fig. 6. Effets of erioityol on tlse (CAT) gene expression ginst hyrogen peroxie-inue oxitive stress in HepG2 ells. Vlues re men±stnr evition of three replite etermintions (n=3). Different letters ove the rs inite sttistilly signifint ifferenes (P<.5). SOD-2 β-tin GPx β-tin % of ontrol. 12 1 8 6 4 % of ontrol. 12 1 8 6 4 2 2 Con Con 1 2 3 4 5 (μg/ml) H 2 O 2 (2 μm) - + + + + + + Fig. 5. Effets of erioityol on superoxie ismutse-2 (SOD- 2) gene expression ginst hyrogen peroxie-inue oxitive stress in HepG2 ells. Vlues re men±stnr evition of three replite etermintions (n=3). Different letters ove the rs inite sttistilly signifint ifferenes (P<.5). Con Con 1 2 3 4 5 (μg/ml) H 2 O 2 (2 μm) - + + + + + + Fig. 7. Effets of erioityol on glutthione peroxise (GPx) gene expression ginst hyrogen peroxie-inue oxitive stress in HepG2 ells. Vlues re men±stnr evition of three replite etermintions (n=3). Different letters ove the rs inite sttistilly signifint ifferenes (P<.5).
514 주태우 홍성현 박선영 김거유 주진우 Ali 등 (17) 은 tert-utyl hyroperoxie를이용하여산화스트레스가유발된 HepG2에 queretin을처리하여항산화효소활성을측정하였으며, tert-utyl hyroperoxie만처리한처리군과 queretin을처리한군을비교하였을때항산화효소인 SOD, CAT, GPx의활성이유의적으로증가하는것을보고하였다. Morin 등 (18) 은 ethnol을투여후 queretin 급여가마우스의항산화효소활성에미치는영향을보고하였으며, ethnol만급여한군과비교하여 queretin을급여한군에서 SOD, CAT, GPx의활성이유의적으로증가하였고 queretin을높은농도로급여할수록 SOD, CAT, GPx의활성이증가하는것을보고하였다. Mnju와 Nlini(19) 는쥐에게 1,2-imethylhyrzine을피하조직에투여하여스트레스및발암을일으키게한후 flvonoi 성분인 luteolin을공급하여 SOD, CAT, GPx, 활성을측정한결과 luteolin을공급하지않은 ontrol 군보다항산화효소활성이현저히증가하는것을보고하였다. Wong 등 (2) 은쥐에게 D-gltosmine을투여하여산화스트레스를유도한후 α-toopherol과 flvonoi의한종류인 izein을투여하여항산화활성을평가하기위하여 totl SOD 와 SOD-1 활성을측정하여보고한바있다. 이처럼 flvonoi 화합물은다양한기작을통해산화스트레스로부터항산화효소활성을증가시키는것으로보고되고있으며, 본실험에서검토한 flvonoi 화합물인 erioityol 또한 hyrogen peroxie에의해유발된산화스트레스로부터 SOD-1, SOD-2, CAT, GPx 등과같은항산화유전자발현을증가시켜간세포의손상을억제하여간세포를보호할수있는것으로분석되었다. 간기능지표효소분석을통한세포보호효과본실험에서는 hyrogen peroxie를처리하여산화적스트레스가증가한 HepG2 세포주에 erioityol 화합물을처리하여상등액내 GOT, LDH 및 GGT를분석하였다 (Fig. 8~1). GOT는간과심장, 횡문근, 혈액내에존재하여아미 노기전이반응을촉매하는효소로서 (21), sprti i에서 mino group을 ketoglutri i로치환하여 oxloeti i를생성한다 (22). GOT는간세포의손상정도에따라혈액내로빠져나와간염, 간경변등의지표로널리사용된다 (21). HepG2 세포에 hyrogen peroxie로단독처리한대조군의 GOT 활성은처리하지않은대조군에비해유의적으로증가하는것을확인할수있었으며, erioityol 화합물을처리한처리군 (1~5 µg/ml) 에서 GOT 활성이유의적으로감소하는것을확인할수있었다 (Fig. 8). LDH 는 niotinmie enine inuleotie(nad) 의존재하에혐기적해당작용의최종산물인 L-ltte와 pyruvte 간의가역적산화환원반응을촉매하는효소로서간, 심장, 근육내에다량존재한다 (23). 심장질환, 간질환, 용혈성및악성빈혈등에서증가하며, 급성간염에서 GOT와같이간세포로부터유리되어증가하고황달을동반한독성간염에서약 1배정도증가하는것으로알려졌다 (24). LDH 활성을측정한결과 hyrogen peroxie로단독처리한대조군의경우약 965 U/L로분석되었으며, hyrogen peroxie를처리하지않은대조군의경우약 43 U/L의 LDH 활성을나타내어 hyrogen peroxie 처리에따른 LDH 활성의유의적증가를확인할수있었다. 이때 HepG2 세포에 erioityol 화합물처리 (1~5 µg/ml) 에의해 LDH 활성이농도의존적으로감소하는것으로분석되었다 (Fig. 9). GGT 는 glutmyl peptie를가수분해하여 gmm-glutmyl기를다른 peptie와 mino i에전이시키는효소로서 (24) 간, 신장, 비장췌장등체내에널리분포되어있지만혈청 GGT의대부분은간과담관상피세포에서유래한다 (25, 26). 혈청 GGT 수치는알코올섭취로인한간질환의진단에이용된다. 알코올섭취이외에도흡연에의한폐질환, 활동량에따른생활요인, 췌장질환, 신경질환및당뇨병등의병적요인에도관련되어있으며 (25,27), 간세포와담도상피세포에존재하여간담도질환유무의지표가되며알코올성간질환에의해증가하는것으로알려졌다 (25). HepG2 세포 8 7 6 5 f e 12 1 8 U/L. 4 3 2 1 U/L. 6 4 2 g e f Con Con 1 2 3 4 5 (μg/ml) H 2 O 2 (2 μm) - + + + + + + Fig. 8. Effets of erioityol on glutmi oxloeti trnsminse (GOT) tivity ginst hyrogen peroxie-inue oxitive stress in HepG2 ells. Vlues re men±stnr evition of three replite etermintions (n=3). Different letters ove the rs inite sttistilly signifint ifferenes (P<.5). Con Con 1 2 3 4 5 (μg/ml) H 2 O 2 (2 μm) - + + + + + + Fig. 9. Effets of erioityol on ltte ehyrogense (LDH) tivity ginst hyrogen peroxie-inue oxitive stress in HepG2 ells. Vlues re men±stnr evition of three replite etermintions (n=3). Different letters ove the rs inite sttistilly signifint ifferenes (P<.5).
Erioityol 화합물의항산화활성 515 H 2 O 2 (2 μm) - + + + + + + DCF Fluoresene (Counts). U/L. 16 14 12 1 8 6 4 2 2 15 1 5 f Con Con 1 2 3 4 5 (μg/ml) H 2 O 2 (2 μm) - + + + + + + Fig. 1. Effets of erioityol on gmm-glutmyl trnsferse (GGT) tivity ginst hyrogen peroxie-inue oxitive stress in HepG2 ells. Vlues re men±stnr evition of three replite etermintions (n=3). Different letters ove the rs inite sttistilly signifint ifferenes (P<.5). 주에서 hyrogen peroxie로단독처리한대조군의경우이를처리하지않은대조군에비해 GGT 활성이유의적으로증가하였으며, 1~5 µg/ml 농도의 erioityol 화합물처리구는 GGT의활성이유의하게감소하는것으로나타났다 (Fig. 1). 이러한결과 HepG2 세포에서 hyrogen peroxie 처리에의해증가한 GOT, LDH 및 GGT의활성이 erioityol 화합물을처리에의해유의적으로감소하는것으로분석되어 erioityol 화합물이간세포보호효과에대한활성을가질수있을것으로기대된다. 세포내 ROS 생성저해효과 HepG2 세포에서 erioityol 화합물처리가세포내활성산소종생성에미치는영향을 DCFH-DA ssy로확인하였다 (Fig. 11). DCFH-DA는세포내에서 ROS에의해산화되어형광을나타내는 DCF로전환된다. HepG2 세포에 hyrogen peroxie로단독처리하여산화적스트레스를유도한대조군의경우 9분간처리후 fluoresene의값은 on Con H2O2H 2 O 2 1 2 3 4 5 3 6 9 Time (min) Fig. 11. Inhiitory effet of erioityol on ROS proution ginst hyrogen peroxie-inue oxitive stress in HepG2 ells. Vlues re men±stnr evition of three replite etermintions (n=3). e 1,519로나타내는반면, erioityol 화합물 5 µg/ml 농도로처리한처리군의 fluoresene의값은 752로나타나는것으로분석되어 erioityol 처리에의해증가한 ROS 생성이감소하는것으로나타났다. 특히 erioityol 화합물처리시 9분후의 fluoresene 측정결과, ROS 생성억제가 hyrogen peroxie로단독처리한대조군에비해 1 µg /ml의농도에서 8.3%, 2 µg/ ml의농도에서 24.7%, 3 µg/ml의농도에서 31.1%, 4 µg/ml의농도에서 37.7%, 5 µg/ml의농도에서 48.5% 감소하는것으로나타났다. Li 등 (28) 은 DCFH-DA ssy를이용하여 EA.hy926 세포에서 hyrogen peroxie로산화스트레스를유도한후 erioityol 처리에의한활성산소종을측정한결과 erioityol 화합물이유의적으로활성산소종생성을억제하는결과를나타내었다고보고하였다. Areis 등 (29) 은 DCFH- DA ssy를이용하여 retinl ell에서 sorte/fe 2+ 를처리하여산화적스트레스를유도한후 flvonoi 성분인 luteolin, queretin, erioityol, txifolin 화합물의활성산소종억제효과를측정한실험에서이들화합물을처리한군과 sorte/fe 2+ 만처리한군을비교하였을때화합물을처리한모든군에서유의적으로활성산소종을감소시켰고, 그중 erioityol 화합물을처리한군이다른처리군보다더높은효과를나타내는것으로보고하였다. Lee 등 (3) 은 HCT ell에 UV 조사를하여산화적스트레스를발생시켜활성산소종을발생시켰다. 이러한반응중 erioityol 화합물을처리하여활성산소종을유의적으로억제한결과를보여본연구결과와일치하는경향을보였다. 따라서본결과로부터 hyrogen peroxie 처리에의해세포내에증가한산화적스트레스를 erioityol 화합물에처리에의해억제할수있을것으로생각된다. 요약본연구는싸리나무잎에서분리한 flvonoi 화합물인 erioityol의항산화활성을평가하기위해 hyrogen peroxie로산화적스트레스를유도한 HepG2 세포에서 erioityol 화합물의처리가 SOD-1, SOD-2, CAT 및 GPx 의유전자발현에미치는영향을분석하였으며, 또한간기능지표효소인 GOT, LDH 및 GGT 활성을분석하였다. 그리고세포내활성산소종생성억제효능을분석하기위하여 DCFH-DA ssy를실시하여 erioityol 화합물의기능성소재로서의가능성을알아보고자본실험을하였다. Erioityol 화합물의세포독성을확인하기위하여 HepG2 세포주를이용하여실시한결과 erioityol 화합물을 1~5 μg/ml의농도로처리한모든실험군에서약 98% 이상의세포생존율을나타내었다. 항산화효소유전자발현량을통한산화스트레스억제효과를분석하기위하여 HepG2 세포주에 hyrogen peroxie를처리하여산화스트레스가증가시킨조건에서 erioityol 화합물을처리하여 SOD-1, SOD
516 주태우 홍성현 박선영 김거유 주진우 -2, CAT 및 GPx 발현량을분석한결과 erioityol 화합물의처리농도가증가할수록 hyrogen peroxie 처리에의해감소한 SOD-1, SOD-2, CAT 및 GPx 발현량이유의적으로증가하는것을확인할수있었다. 간기능지표효소활성을측정하기위해 GOT, LDH 및 GGT 활성을분석한결과 hyrogen peroxie로단독처리한대조군과 erioityol 화합물을처리한군을비교하였을때 erioityol 화합물을처리한군에서 hyrogen peroxie 처리에의해증가한 GOT, LDH 및 GGT 활성이유의적으로감소하였다. HepG2 세포주에 erioityol 화합물을처리하여세포내활성산소종생성에미치는영향을 DCFH-DA ssy로확인한결과 erioityol 화합물의농도가증가함에따라세포내활성산소종의생성을억제하는것을확인할수있었다. 따라서본실험을통하여 erioityol 화합물은산화적스트레스로부터항산화효소활성을증가시키며, 활성산소종의생성을억제하는효과를확인할수있었다. 또한간기능지표효소의활성을감소시켜세포보호효과를나타내어항산화활성및세포보호효과를나타내는기능성소재로써이용가능성이높을것으로판단되며, 후속연구를통해싸리나무유래 erioityol 화합물의세포내항산화단백질발현에미치는영향및동물실험을통한항산화효과를검증하는것이필요할것으로생각된다. 감사의글 본연구는 213년도강원대학교학술연구조성비 ( 과제번호 : C1985-1-1) 로수행되었습니다. REFERENCES 1. Kwk IS. 28. Comprison of ifferent ssys for evluting ntioxint tivity of polyphenols n te extrts. PhD Disserttion. Chonuk Ntionl University, Jeonju, Kore. 2. Hlliwell B. 1991. Retive oxygen speies in living systems: soure, iohemistry, n role in humn isese. Am J Me 91: 14S-22S. 3. Sies H. 1991. Oxitive stress: from si reserh to linil pplition. Am J Me 91: 31S-38S. 4. Cienewiki J, Trivei S, Kleeerger SR. 28. Oxints n the pthogenesis of lung iseses. J Allergy Clin Immunol 122: 456-468. 5. Ames BN, Shigeng MK, Hgen TM. 1993. Oxints, ntioxints, n the egenertive iseses of ging. Pro Ntl A Si USA 9: 7915-7922. 6. Yng HS, Choi YJ, Oh HH, Moon JS, Jung HK, Kim KJ, Choi BS, Lee JW, Huh CK. 214. Antioxitive tivity of mushroom wter extrts fermente y lti i teri. J Koren So Foo Si Nutr 43: 8-85. 7. Yng YY, Kim JY, Kwon O. 212. Development of flvonoi tse for ommonly onsume foos y Korens. Koren J Nutr 45: 283-292. 8. Holen JM, Bhgwt SA, Hytowitz DB, Gehrt SE, Dwyer JT, Peterson J, Beeher GR, Elrige AL, Blentine D. 25. Development of tse of ritilly evlute flvonois t: pplition of USDA's t qulity evlution system. J Foo Compos Anl 18: 829-844. 9. Lim SH, Kim JK, Kim DH, Sohn SH, Lee JY, Kim YM, H SH. 211. Flower olor moifition y mnipulting flvonoi iosyntheti pthwy. Kor J Hort Si Tehnol 29: 511-522. 1. Kim MJ, Ryu MJ. 212. Inhiition of melnogenesis n nti-uv properties Reynoutri ellipti. Kor J Aesthet Cosmetol 1: 961-968. 11. Gri-Alonso M, e Psul-Teres S, Sntos-Buelg C, Rivs-Gonzlo JC. 24. Evlution of the ntioxint properties of fruits. Foo Chem 84: 13-18. 12. Lee SJ, Chung HY, Lee IK, Yoo ID. 1999. Isoltion n ientifition of flvonois from ethnol extrts of Artemisi vulgris n their ntioxint tivity. Koren J Foo Si Tehnol 31: 815-822. 13. Ismili H, Sos S, Brki D, Fkih-Tetouni S, Ilirissi A, Touti D, Aquino RP, Turo A. 22. Topil nti-inflmmtory tivity of extrts n ompouns from Thymus roussonettii. J Phrm Phrmol 54: 1137-114. 14. Zhng WY, Lee JJ, Kim Y, Kim IS, Hn JH, Lee SG, Ahn MJ, Jung SH, Myung CS. 212. Effet of erioityol on gluose uptke n insulin resistne in vitro. J Agri Foo Chem 6: 7652-7658. 15. Buolo C, Leggio GM, Drgo F, Slomone S. 212. Erioityol prevents erly retinl n plsm normlities in streptozotoin-inue ieti rts. Biohem Phrmol 84: 88-92. 16. Lee JH, Jhoo JW. 212. Antioxint tivity of ifferent prts of Lespeez iolor n isoltion of ntioxint ompoun. Koren J Foo Si Tehnol 44: 763-771. 17. Ali M, Rmos S, Mteos R, Grno-Serrno AB, Brvo L, Goy L. 26. Queretin protets humn heptom HepG2 ginst oxitive stress inue y tert-utyl hyroperoxie. Toxiol Appl Phrmol 212: 11-118. 18. Molin MF, Snhez-Reus I, Iglesis I, Benei J. 23. Queretin, flvonoi ntioxint, prevents n protets ginst ethnol-inue oxitive stress in mouse liver. Biol Phrm Bull 26: 1398-142. 19. Mnju V, Nlini N. 25. Chemopreventive potentil of luteolin uring olon rinogenesis inue y 1,2-imethylhyrzine. Itl J Biohem 54: 268-275. 2. Wong MC, Portmnn B, Sherwoo R, Niemel O, Koivisto H, Prkkil S, Trik K, L'e MR, Wilson J, Dsh PR, Srirjsknthn R, Preey VR, Wisemn H. 27. The ytoprotetive effet of lph-toopherol n izein ginst -gltosmine-inue oxitive mge in the rt liver. Metolism 56: 865-875. 21. Green RM, Flmm S. 22. AGA tehnil review on the evlution of liver hemistry tests. Gstroenterology 123: 1367-1384. 22. Ahn SY, Prk SY. 212. A ignosti pproh to norml liver funtion tests in symptomti ptients. Koren J Me 82: 134-142. 23. Lim TS, Kim JS, Kim JM. 1984. Eletrophoreti ptterns of GGT, ALP n LDH isoenzyme in vrious hepti iseses. Kyungpook Univ Me J 25: 268-285. 24. Yu KH. 214. Effets of fermente queous extrts from Ligulri fisheri leves y using lti i teri on improving liver funtion. PhD Disserttion. Kngwon Ntionl University, Chunheon, Kore. 25. Kim KS, Jeon DS, Kim JS, Kim JM. 1982. GGT, ALPI n LDH in vrious liver iseses. Kyungpook Univ Me J 23: 325-333.
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