(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C07K 19/00 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01) C12N 15/70 (2006.01) (52) CPC 특허분류 C07K 19/00 (2013.01) C12N 15/63 (2013.01) (21) 출원번호 10-2015-0076340 (22) 출원일자 2015 년 05 월 29 일 심사청구일자 (56) 선행기술조사문헌 JP2013535207 A KR1020130055894 A 2015 년 05 월 29 일 Meng L. et al., JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 288(48):pp.34680-34698 (2013.11.29.)* * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2016년10월19일 (11) 등록번호 10-1667677 (24) 등록일자 2016년10월13일 (73) 특허권자 한국생명공학연구원 대전광역시유성구과학로 125 ( 어은동 ) (72) 발명자 오두병 대전광역시유성구과학로 125 임세종 대전광역시유성구과학로 125 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 손민 전체청구항수 : 총 1 항심사관 : 김정아 (54) 발명의명칭재조합 ST6Gal1 단백질을활성형으로제조하는방법 (57) 요약 본발명은 ST6Gal1 (ST6 beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltransferase 1) 을미생물에서활성형으로발현하는방법에관한것으로, 구체적으로 ST6Gal1 및 sfgfp (superfolder green fluorescent protein) 의융합단백질을코딩하는유전자를포함하는재조합 ST6Gal1 단백질발현카세트, 상기발현카세트를포함하는발현벡터, 상기발현벡터가도입된재조합미생물, 상기미생물을이용하여재조합 ST6Gal1 단백질을제조하는방법, 및상기방법으로제조된재조합 ST6Gal1 단백질을이용하여당사슬에시알산을부가하는방법에관한것이다. 본발명을이용하여 ST6Gal1 을조작이용이하고경제성이높은대장균에서 α(2,6)- 시알산부가활성을가진형태로생산이가능하다. 따라서그동안비용문제로제작하기어려웠던 α(2,6)- 시알산이부가된고부가가치의당사슬및당단백질을저렴하게생산할수있다. 대표도 - 도 10-1 -
(52) CPC 특허분류 C12N 15/70 (2013.01) C12Y 204/99001 (2013.01) C07K 2319/01 (2013.01) C07K 2319/60 (2013.01) (72) 발명자 강지연 대전광역시유성구과학로 125 권오석 대전광역시유성구과학로 125 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 10048311 부처명 연구관리전문기관 지식경제부 연구사업명기술료사업 ( 지경부 ) 연구과제명 기여율 60/100 한국산업기술평가관리원 바이오의약품최적화를위한당사슬핵심기술개발 주관기관 한국생명공학연구원 연구기간 2014.06.01 ~ 2015.05.31 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 2014067509 부처명 교육과학기술부 연구관리전문기관한국연구재단 ( 대전 ) 연구사업명원천기술개발사업 ( 바이오의료기술 ) 연구과제명 기여율 30/100 글리칸구조분석및리모델링을이용한바이오의약품최적화기술개발 주관기관 한국생명공학연구원 연구기간 2014.11.20 ~ 2015.11.19 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 KGM2121521 미래창조과학부 국가과학기술연구회 연구사업명주요사업 (2015-2018) 연구과제명 기여율 10/100 바이오부품 / 회로및합성생물학기술개발사업 주관기관 한국생명공학연구원 연구기간 2015.01.01 ~ 2015.12.31-2 -
명세서청구범위청구항 1 삭제청구항 2 삭제청구항 3 삭제청구항 4 삭제청구항 5 삭제청구항 6 삭제청구항 7 삭제청구항 8 (a) 서열번호 1의아미노산서열을가지는 ST6Gal1 (ST6 beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltransferase 1) 및 sfgfp (superfolder green fluorescent protein) 의융합단백질의분비발현카세트를포함하는재조합대장균을배지에서배양하여, 상기융합단백질을분비발현하고, 상기대장균으로부터분비발현된융합단백질을회수하는단계 ; 및 (b) 상기회수된융합단백질을목적당단백질과반응시키는단계를포함하는, 목적당단백질의당사슬에시알산 1 개를부가하는방법. 청구항 9 삭제청구항 10 삭제청구항 11 삭제청구항 12 삭제청구항 13 삭제 - 3 -
청구항 14 삭제 발명의설명 [0001] 기술분야본발명은 ST6Gal1을미생물에서활성형으로발현하는방법에관한것으로, 구체적으로 ST6Gal1 (ST6 betagalactosamide alpha-2,6-sialyltransferase 1) 및 sfgfp (superfolder green fluorescent protein) 의융합단백질을코딩하는유전자를포함하는대장균에서재조합 ST6Gal1 단백질을분비발현하기위한카세트, 상기발현카세트를포함하는발현벡터, 상기발현카세트또는발현벡터를포함하는재조합미생물, 상기미생물을이용하여재조합 ST6Gal1 단백질을제조하는방법, 및상기방법으로제조된재조합 ST6Gal1 단백질을이용하여목적당단백질에시알산을부가하는방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] 배경기술당단백질들은현재전세계재조합단백질의약품시장의 60 % 이상을차지하고있으며, 여기에부착되어있는당사슬은당단백질의약품들의치료효능과체내지속성, 타겟팅및면역반응등에서중요한역할을하고있어서의약품의품질을결정하는주요인자로부각된다. 당사슬이부가되는반응은크게 N-결합또는 O-결합당질화 (N-linked or O-linked glycosylation) 의두가지형태가있으며, 이중 N-결합당질화를통해서부가되는당사슬을 N-당사슬 (N-glycan) 이라부르며소포체에서시작된다. 이와같이소포체에서이루어지는 N-당사슬의초기생합성과정은진핵미생물인효모에서고등동물인포유류에이르기까지거의동일한과정으로보존되어있다. 그러나, 골지체로이동된당사슬은각종마다가지는특이적인당사슬수식과정을거치게되며, 그결과로써효모, 곤충, 식물및동물등에서각각다른형태의당사슬들이만들어지게된다. 특히, 고등동물에서는골지체로들어온당단백질의당사슬들에 GlcNAc이부가되어안테나골격이만들어지는데, 이후에골지체에존재하는 β-갈락토스전달효소 (β-galactosyltransferase) 와 α-시알산전달효소 (α-sialyltrasnferase) 등이작용해서 GlcNAc 위에갈락토즈와시알산 (sialic acid) 이부가된복합형 (complex type) 당사슬구조가만들어진다. 당사슬말단에부가된시알산은당단백질의체내수명을결정하는중요한인자로써, 시알산이캡핑 (capping) 되지않은당사슬이부가된당단백질은체내에서빠르게제거된다. 또한, 미국록펠러대학의 Ravetch 교수연구팀은 IgG 불변영역의당사슬에부가되는시알산은체내지속성보다는항염증작용을위한스위치로작용한다는연구결과를발표하였다 (Kaneko et al., 2006, Science 313: 670-673). 특히, α(2,6)-시알산을재조합항체또는 Fc의당사슬에부가함으로써류마티스관절염, 루푸스및크론병등과같은자가면역질환을치료할수있다는것을모델동물실험으로확인하여새로운치료제로서개발될가능성을보여주었다. 그러나현재 Fc의당사슬에 α(2,6)-시알산을부가하는기술개발에는어려움을겪고있으며, 특히 Fc에효과적으로 α(2,6)-시알산을부가하기위해서는고활성을가진많은양의 α(2,6)-시알산전달효소가필요하다 (Adam et al., 2009, Biochemistry 48: 9705-9707). 하지만현재까지고등동물유래 α(2,6)-시알산전달효소인 ST6Gal1을활성형으로발현하기위해서는동물세포와같은고가의발현시스템이필요한것으로알려져있으며, ST6Gal1을경제성이높은발현시스템을이용하여생산하려는시도들이있었으나고활성의형태로발현하기에는어려움들이있었다. 이에본발명자들은 ST6Gal1을미생물에서활성형으로발현시키기위해예의노력한결과, 인간유래 ST6Gal1을 sfgfp와융합한융합단백질을대장균에서분비발현하는경우, 활성형으로 ST6Gal1을생산할수있음을확인함으로써본발명을완성하였다. 발명의내용 [0007] 해결하려는과제본발명의하나의목적은 (a) ST6Gal1 (ST6 beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltransferase 1) 및 sfgfp (superfolder green fluorescent protein) 의융합단백질의분비발현카세트를포함하는재조합미생물을배지에서배양하여, 상기융합단백질을분비발현하는단계 ; 및 (b) 상기미생물로부터분비발현된융합단백질 - 4 -
을회수하는단계를포함하는, 재조합 ST6Gal1 단백질을제조하는방법을제공하는것이다. [0008] [0009] [0010] [0011] 본발명의다른하나의목적은상기방법으로제조된재조합 ST6Gal1 단백질을목적당단백질과반응시키는단계를포함하는, 목적당단백질에시알산을부가하는방법을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은 ST6Gal1 및 sfgfp (superfolder green fluorescent protein) 의융합단백질을코딩하는유전자를포함하는, 대장균에서재조합 ST6Gal1 단백질을분비발현하기위한카세트를제공하는것이다. 본발명의또다른목적은상기대장균에서재조합 ST6Gal1 단백질을분비발현하기위한카세트를포함하는, 재조합 ST6Gal1 단백질발현벡터를제공하는것이다. 본발명의또다른목적은상기재조합 ST6Gal1 단백질발현벡터를포함하는, 재조합미생물을제공하는것이다. [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명은하나의양태로서 (a) ST6Gal1 (ST6 beta-galactosamide alpha-2,6- sialyltransferase 1) 및 sfgfp (superfolder green fluorescent protein) 의융합단백질의분비발현카세트를포함하는재조합미생물을배지에서배양하여, 상기융합단백질을분비발현하는단계 ; 및 (b) 상기미생물로부터분비발현된융합단백질을회수하는단계를포함하는, 재조합 ST6Gal1 단백질을제조하는방법을제공한다. (a) 단계는 ST6Gal1 및 sfgfp의융합단백질의분비발현카세트를포함하는재조합미생물을배지에서배양하여, 상기융합단백질을분비발현하는단계이다. 본발명에서용어 "ST6Gal1 (ST6 beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltransferase 1) 은 α(2,6)-시알산전달효소를의미한다. 본발명에서상기 ST6Gal1은, 구체적으로포유동물유래인것일수있고, 보다구체적으로인간유래일수있다. 상기 ST6Gal1은전장단백질또는이의단편, 이의변이체를모두포함하는개념이다. 구체적으로상기 ST6Gal1은 N-말단의 1-89 번또는 1-108 번아미노산이결손된것일수있다. 또한, 상기 ST6Gal1은 N-말단의 149, 151, 161 및 / 또는 163 번아미노산이아스파르트산또는글루탐산으로치환된것일수있다. 그예로, 상기 ST6Gal1은서열번호 1의아미노산서열을갖는것일수있으나, 시알산부가활성을가진것이라면야생형 ST6Gal1 또는이에임의의아미노산을부가, 결손, 치환한어떠한것이라도무방하고그유래나서열에특별히제한되지않는다. 본발명에서용어 "sfgfp (superfolder green fluorescent protein)" 는 superfolder 녹색형광단백질을의미한다. 본발명에서상기 sfgfp는 ST6Gal1 단백질에융합되는단백질을말한다. 본발명에서는 ST6Gal1의수용성을증가시키기위하여 sfgfp를 N-말단의 1-89 번아미노산이결손된 ST6Gal1과융합시켜재조합 ST6Gal1 단백질 ("sfgfp-s6g(-89)" 로명명함 ) 을제조하였다. 본발명에서용어 " 융합단백질 " 은원래개별단백질을암호화하는 2 개이상의단백질-암호화핵산의연결을통해생성되는융합단백질또는키메라단백질을말한다. 이러한융합유전자의번역에의해, 원래단백질각각으로부터유래되는기능적특성을갖는단일의폴리펩티드가야기된다. 상기융합단백질은생물학적연구또는치료에사용하기위해재조합 DNA 기술에의해인공적으로생성되며, 융합되는유전자의유전자조작을통해생성될수있다. 본발명에서기술된융합단백질은적어도 2 개의폴리펩티드, 즉, sfgfp 및 ST6Gal1 단백질을포함하며, 선택적으로제3 구성요소, 2 개의폴리펩티드사이에링커를포함할수있다. 재조합융합단백질의생성은당해분야에공지되어있으며, 전형적으로제1 단백질또는폴리펩티드를암호화하는 cdna 서열로부터종결코돈을제거한다음, 라이게이션또는중첩연장을 PCR을통해제2 단백질의 cdna 서열을프레임내부가하는과정을포함할수있다. 그다음, DNA 서열은세포에의해단일단백질로서발현될수있다. 단백질은원래단백질또는폴리펩티드모두의전체서열또는어느하나의일부분만을포함하도록조작될수있다. 본발명에서는 ST6Gal1의활성을지니는 ST6Gal1 및 sfgfp의융합단백질을제조하는방법을제공하며, "ST6Gal1 및 sfgfp의융합단백질 " 과 " 재조합 ST6Gal1 단백질 " 은혼용되어사용될수있다. 본발명은또다른양태로서 ST6Gal1 및 sfgfp (superfolder green fluorescent protein) 의융합단백질을코 - 5 -
딩하는유전자를포함하는, 재조합 ST6Gal1 단백질발현카세트를제공한다. [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] ST6Gal1 및 sfgfp의융합단백질, 및이를코딩하는유전자에대하여는상기설명한바와같다. 본발명에서용어 " 발현카세트 " 란, 프로모터, 및 ST6Gal1 및 sfgfp의융합단백질을코딩하는유전자를포함하고있어서, 프로모터하류에작동가능하게연결되어있는융합단백질을생산하기위해발현시킬수있는단위카세트를의미한다. 이와같은발현카세트의내부또는외부에는상기융합단백질의효율적인생산을도울수있는다양한인자가포함될수있다. 상기발현카세트는통상폴리뉴클레오티드에작동가능하게연결되어있는프로모터 (promoter), 전사종결신호, 리보좀결합부위및번역종결신호를포함할수있다. 상기재조합 ST6Gal1 단백질발현카세트는구체적으로, 프로모터서열하류에 ST6Gal1 및 sfgfp (superfolder green fluorescent protein) 의융합단백질을코딩하는유전자가작동가능하게연결된것일수있다. 본발명에서용어 " 작동가능하게연결 " 이란상기융합단백질을코딩하는유전자의전사를개시및매개하도록, 상기유전자서열과프로모터서열이기능적으로연결되어있는것을의미한다. 작동가능한연결은당업계의공지된유전자재조합기술을이용할수있으며, 부위-특이적 DNA 절단및연결은당업계의전달및연결효소등을사용하여제작할수있으나, 이에제한되지않는다. 상기분비발현카세트는시그널펩타이드 (signal peptide) 서열을포함하는것일수있다. 본발명에서용어 " 시그널펩타이드 (signal peptide)" 는단백질의 N-말단에존재하는짧은길이의펩타이드로 (5 내지 30 아미노산 ), 단백질을특정위치로이동시키는역할을하는펩타이드를의미하며, 본발명에서상기시그널펩타이드는특히상기융합단백질을미생물의주변세포기질 (periplasm) 으로분비시키는것일수있다. 구체적으로상기시그널펩타이드는 PelB leader sequence일수있으나, 단백질을주변세포기질로분비시킬수있는것이라면종류에특별히제한되지않고당업자에의해적절히선택될수있다. 본발명의용어 " 발현벡터 " 는적합한숙주내에서목적유전자를발현시킬수있도록유전물질을보유하는인위적 DNA 분자로, 구체적으로적합한조절서열에작동가능하게연결된유전자의뉴클레오티드서열을함유하는 DNA 제조물을의미한다. 상기발현벡터는상기기술된발현카세트를포함할수있다. 상기조절서열은전사를개시할수있는프로모터, 그러한전사를조절하기위한임의의오퍼레이터서열, 적합한 mrna 리보좀결합부위를코딩하는서열, 및전사및해독의종결을조절하는서열을포함할수있으나, 이에제한되지않는다. 본발명의목적상상기발현벡터는 ST6Gal1 및 sfgfp의융합단백질을코딩하는유전자를포함하므로숙주세포에도입되어상기융합단백질, 즉재조합 ST6Gal1 단백질을발현할수있다. 본발명에서사용되는벡터는숙주세포내에서복제가능한것이면특별히한정되지않으며, 당업계에알려진임의의벡터를이용할수있다. 통상사용되는벡터의예로는천연상태이거나재조합된상태의플라스미드, 코스미드, 바이러스및박테리오파지를들수있다. 예를들어, 파지벡터또는코스미드벡터로서 pwe15, M13, λbl3, λbl4, λⅨii, λashii, λapii, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을사용할수있으며, 플라스미드벡터로서 pbr계, puc계, pbluescriptii계, pgem계, ptz계, pcl계및 pet계등을사용할수있다. 본발명에서사용가능한벡터는특별히제한되는것이아니며공지된발현벡터를사용할수있다. 그예로 pet26, peccg117, pdz, pacyc177, pacyc184, pcl, puc19, pbr322, pmw118, pcc1bac, pces208, pxmj19 벡터등을사용할수있으나, 이에제한되지않는다. 상기벡터는이에제한되는것은아니나, 구체적으로 pet26-s6g(-89), pet26-s6g(-89)_dd, pet26-s6g(-89)_d, pet26-s6g(-89)_ee, pet26-s6g(-89)_e, pet26-s6g(-108)_s, pet26-s6g(-108)_dd, pet26-s6g(-108)_d, pet26- S6G(-108)_EE, 또는 pet26-s6g(-108)_e일수있다. 상기벡터는형질전환에의해미생물에도입될수있으며, 본발명에서용어 " 재조합미생물 " 은형질전환된미생물을의미한다. 본발명에서용어 " 형질전환 " 은본발명에따른융합단백질의분비발현카세트또는이를포함하는벡터를숙주세포내에도입하는것을의미한다. 또한, 형질전환된융합단백질을코딩하는유전자는숙주세포내에발현될수있기만한다면, 숙주세포의염색체내에삽입되어위치하거나염색체외에위치할수있다. 본발명의벡터를형질전환시키는방법은핵산을세포내로도입하는어떤방법도포함되며, 숙주세포에따라당분야에서공지된바와같이적합한표준기술을선택하여수행할수있다. 예를들어, 전기천공법 - 6 -
(electroporation), 인산칼슘 (CaPO 4 ) 침전, 염화칼슘 (CaCl 2 ) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 법, DEAE- 덱스트란법, 양이온리포좀법, 및초산리튬 -DMSO 법등이있으나, 이에제한되지않는다. [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] 본발명에서미생물은본발명의융합단백질을코딩하는유전자가도입되어상기융합단백질을발현할수있는미생물이라면제한없이포함될수있다. 구체적으로상기미생물은에스케리치아 (Escherichia) 속미생물, 그예로대장균일수있으나, 이에제한되지않는다. 본발명에서용어 " 배양 " 은미생물을적당히인공적으로조절한환경조건에서생육시키는것을의미한다. 본발명에서상기재조합미생물을이용하여재조합 ST6Gal1 단백질을제조하는방법은당업계에널리알려져있는방법을이용하여수행할수있다. 구체적으로, 상기배양은배치공정, 주입배치또는반복주입배치공정 (fed batch or repeated fed batch process) 에서연속식으로배양할수있으나, 이에제한되는것은아니다. 배양에사용되는배지는적절한방식으로특정균주의요건을충족해야한다. 예를들면, 대장균에대한배양배지는공지되어있으며, 사용될수있는당원으로는글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와같은당및탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유등과같은오일및지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과같은지방산, 글리세롤, 에탄올과같은알코올, 글루콘산, 아세트산, 피루브산과같은유기산이포함될수있으나, 이에제한되는것은아니다. 이들물질은개별적으로또는혼합물로서사용될수있다. 사용될수있는질소원으로는펩톤, 효모추출물, 육즙, 맥아추출물, 옥수수침지액, 대두밀및요소또는무기화합물, 예를들면황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄및질산암모늄이포함될수있으나, 이에제한되는것은아니다. 질소원또한개별적으로또는혼합물로서사용할수있다. 사용될수있는인원으로는인산이수소칼륨또는인산수소이칼륨또는상응하는나트륨-함유염이포함될수있으나, 이에제한되는것은아니다. 또한, 배양배지는성장에필요한황산마그네슘또는황산철과같은금속염을함유할수있다. 마지막으로, 상기물질에더하여아미노산및비타민과같은필수성장물질이사용될수있다. 또한, 배양배지에적절한전구체들이사용될수있다. 상기된원료들은배양과정에서배양물에적절한방식에의해회분식으로또는연속식으로첨가될수있다. 이러한다양한배양방법은예를들어문헌 ("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176) 에개시되어있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와같은기초화합물또는인산또는황산과같은산화합물을적절한방식으로사용하여배양물의 ph를조절할수있다. 또한, 지방산폴리글리콜에스테르와같은소포제를사용하여기포생성을억제할수있다. 호기상태를유지하기위해배양물내로산소또는산소-함유기체 ( 예, 공기 ) 를주입할수있다. 배양물의온도는보통 20 내지 45, 바람직하게는 25 내지 40 일수있으나, 조건에따라변경이가능하며, 이에제한되지않는다. (b) 단계는상기재조합미생물로부터생산된융합단백질을회수하는단계로서, 재조합 ST6Gal1을분리하는단계이다. 본발명의융합단백질을제조하는방법은, 미생물또는배양물로부터융합단백질을회수하는단계를포함할수있으며, 미생물또는배양물로부터융합단백질을회수하는방법은당업계에알려진방법, 예컨대원심분리, 여과, 음이온교환크로마토그래피, 결정화및 HPLC 등이사용될수있으나, 이들예에한정되는것은아니다. 상기회수단계는정제공정을포함할수있으며, 당업자는공지된여러정제공정중필요에따라선택하여활용할수있다. 본발명의구체적인일실시예에서는먼저, ST6Gal1을활성형으로발현시키기위하여, ST6Gal1에서 N-말단의 1-89 번아미노산이결손된아미노산서열을사용하였다 ( 도 1, 서열번호 1). 상기서열을 pcoldii 벡터에클로닝하여 pcoldii-s6g(-89) 벡터를제조하였고 ( 도 2), 이를대장균에형질전환으로도입하여수용성단백질을제조하였으나 ( 도 3 내지도 5), 상기과정에서제조한단백질은시알산부가활성을보이지않는것을확인하였다 ( 도 6). 본발명자들은이러한결과가상기제조된단백질에서이황화결합이제대로형성되지않았기때문으로판단하고, 단백질을분비발현할수있도록시그널펩타이드서열을가지는벡터를제조하였으며, 이때단백질의수용성을증가시키기위하여 sfgfp와의융합단백질을제조하고자하였다. 본발명의다른구체적인일실시예에서는, N-말단의 1-89 번아미노산이결손된 ST6Gal1 및 sfgfp의융합단백질을코딩하는유전자를포함하고, 시그널펩타이드서열이존재하는벡터를제조하였다 ( 도 7). 상기벡터를대장균에형질전환으로도입하여단백질을발현시킨결과, 융합단백질 sfgfp-s6g(-89) 가수용성형태로발현되는것을확인하여 ( 도 8), 이를정제하였다 ( 도 9). 상기정제한단백질의시알산부가활성을분석한결과, 분 - 7 -
비발현된 sfgfp-s6g(-89) 단백질이시알산부가활성을가지는것을확인하였다 ( 도 10). [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] 본발명의또다른구체적인일실시예에서는재조합 ST6Gal1 단백질을보다수용성이좋은상태로분비발현하기위하여당사슬이부착되는위치의아미노산서열에변화를주거나, 또는 STGal1에서 N-말단의 1-108 번아미노산이결손된형태를사용하여융합단백질을제조하였으나, 상기제조방법으로제조된 sfgfp-s6g(-89) 단백질과유사한수준의수용성발현효율을보였다 ( 도 11 내지도 20). 결론적으로본발명의재조합 ST6Gal1 단백질을제조하는방법을통해제조된 sfgfp-s6g(-89) 융합단백질은미생물에서분비발현되어활성형으로제조되는것이며, 이는시알산부가활성을가지므로이를통해시알산이부가된고부가가치의당사슬및당단백질을저렴하게생산할수있다. 본발명은다른하나의양태로서, 상기방법으로제조된재조합 ST6Gal1 단백질을목적당단백질과반응시키는단계를포함하는, 목적당단백질에시알산을부가하는방법을제공한다. 재조합 ST6Gal1 단백질에대하여는상기에서설명한바와같다. 상기목적당단백질은이에제한되지않지만예를들어병원체단백질 (pathogen protein), 라이소좀단백질 (lysosomal protein), 성장인자 (growth factor), 사이토카인 (cytokine), 케모카인 (chemokine), 항체또는이의항원-결합단편 (antigen-binding fragment), 또는융합단백질 (fusion protein) 일수있다. 본발명은또다른양태로서상기발현카세트를포함하는, 재조합 ST6Gal1 단백질발현벡터를제공한다. 발현카세트, 발현벡터및재조합 ST6Gal1 단백질에대하여는상기설명한바와같다. 상기발현벡터는구체적으로시그널펩타이드 (signal peptide) 서열을포함할수있고, 그예로 pet26-s6g(- 89), pet26-s6g(-89)_dd, pet26-s6g(-89)_d, pet26-s6g(-89)_ee, pet26-s6g(-89)_e, pet26-s6g(-108)_s, pet26-s6g(-108)_dd, pet26-s6g(-108)_d, pet26-s6g(-108)_ee, 또는 pet26-s6g(-108)_e일수있으나, 이에제한되는것은아니다. 본발명은또다른양태로서상기발현벡터를포함하는, 재조합미생물을제공한다. 발현벡터및재조합미생물에대하여는상기설명한바와같다. 상기미생물은구체적으로에스케리치아 (Escherichia) 속미생물일수있고, 더욱구체적으로대장균일수있으나, 이에제한되는것은아니다. [0055] 발명의효과본발명을이용하여 ST6Gal1을조작이용이하고경제성이높은대장균에서 α(2,6)-시알산부가활성을가진형태로생산이가능하다. 따라서그동안비용문제로제작하기어려웠던 α(2,6)-시알산이부가된고부가가치의당사슬및당단백질을저렴하게생산할수있다. [0056] 도면의간단한설명도 1은 ST6Gal1의아미노산서열을나타낸그림이다. 1-89번의아미노산이결손된부위를 S6G(-89) 로명명하고 ( 실선화살표 ), 1-108번의아미노산이결손된부위를 S6G(-108) 로명명하였다 ( 점선화살표 ). N-당질화부위의아미노산서열들은이탤릭체로표시하였다. 도 2는 pcoldii-s6g(-89) 벡터맵을나타낸것이다. 도 3은 S6G(-89) 발현결과를 SDS-PAGE로분석한결과이다. 1: 발현유도전시료의세포용해물, 2: 발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 3: 발현유도후얻어진세포용해물의상등액. 도 4는 S6G(-89) 발현결과를웨스턴블랏으로분석한결과이다. 1: 발현유도전시료의세포용해물, 2: 발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 3: 발현유도후얻어진세포용해물의상등액. 화살표는 S6G(-89) 밴드를나타낸다. 도 5는 S6G(-89) 를정제한후각과정의시료를 SDS-PAGE로분석한결과이다. 1: 발현유도전시료의세포용해물, 2: 발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 3: 발현유도후얻어진세포용해물의상등액, 4: 세포용해물의상층액을컬럼에로딩 (loading) 하고받은용액, 5: 컬럼에세척완충액을흘려얻은용출액 _1, 6: 컬럼에세척완충액을흘려얻은용출액 _2, 7: 컬럼에용출완충액을흘려얻은용출액-1, 8: 컬럼에용출완충액 - 8 -
을흘려얻은용출액-2, 9: 컬럼에용출완충액을흘려얻은용출액-3, 10: 컬럼에용출완충액을흘려얻은용출액-4. 화살표는 S6G(-89) 의밴드를나타낸다. 도 6은 AA로표지된 G2 당사슬을기질로하여 S6G(-89) 의 α(2,6)-시알산을부가하는활성을 HPLC로분석한결과이다. (A) G2-AA 당사슬피크이다. (B) 포토박테리움담셀라 (Photobacterium damsela) 유래시알산전달효소 (NCBI accession number BAA25316) 로 30 분간반응한실험결과이다. (C) S6G(-89) 로 30 분간반응한결과이다. G2: Gal 2 GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 S1: SiaGal 2 GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 S3: Sia 2 Gal 2 GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 미국 Consortium for Functional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/) 의기호를이용하여표시하였다 ( 노랑원 : 갈락토스, 파란네모 : GlcNAc, 녹색원 : 만노스, 보라색마름모 : 시알산 ). 도 7은 pet26-s6g(-89) 벡터맵을나타낸것이다. 도 8은 sfgfp-s6g(-89) 발현결과를웨스턴블랏으로분석한결과이다. 1: 발현이유도된후얻어진세포용해물의침전물, 2: 발현이유도된후얻어진세포용해물의상등액. 도 9는 sfgfp-s6g(-89) 를정제한후각과정의시료를 SDS-PAGE로분석한결과이다. 1: 발현유도전시료의세포용해물, 2: 발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 3: 발현유도후얻어진세포용해물의상등액, 4: 세포용해물의상층액을컬럼에로딩하고받은용액, 5: 컬럼에세척완충액을흘려얻은용출액, 6: 컬럼에용출완충액을흘려얻은용출액. 화살표는 sfgfp-s6g(-89) 밴드를나타낸다. 도 10은 AA로표지된 G2 당사슬을기질로하여 sfgfp-s6g(-89) 의 α(2,6)-시알산을부가하는활성을 HPLC로분석한결과이다. (A) G2-AA 당사슬피크이다. (B) 포토박테리움 (Photobacterium) sp JT-ISH-224 유래재조합시알산전달효소 (NCBI accession number BAF92026) 로 30 분간반응한실험결과이다. (C) sfgfp-s6g(-89) 로 30 분간반응한결과이다. 도 11은 pet26-s6g(-89)_dd, _D, _EE, _E의벡터맵을나타낸것이다. 도 12는 sfgfp-s6g(-89)_dd와 sfgfp-s6g(-89)_d의발현결과를 SDS-PAGE로분석한결과이다. 1: sfgfp-s6g(- 89)_DD의발현유도전시료의세포용해물, 2: sfgfp-s6g(-89)_dd의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 3: sfgfp-s6g(-89)_dd의발현유도후얻어진세포용해물의상등액, 4: sfgfp-s6g(-89)_d의발현유도전시료의세포용해물, 5: sfgfp-s6g(-89)_d의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 6: sfgfp-s6g(-89)_d 의발현유도후얻어진세포용해물의상등액. 도 13은 sfgfp-s6g(-89)_dd와 sfgfp-s6g(-89)_d의발현결과를웨스턴블랏으로분석한그림이다. 1: sfgfp- S6G(-89)_DD의발현유도전시료의세포용해물, 2: sfgfp-s6g(-89)_dd의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 3: sfgfp-s6g(-89)_dd의발현유도후얻어진세포용해물의상등액, 4: sfgfp-s6g(-89)_d의발현유도전시료의세포용해물, 5: sfgfp-s6g(-89)_d의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 6: sfgfp- S6G(-89)_D의발현유도후얻어진세포용해물의상등액. 도 14는 sfgfp-s6g(-89)_ee와 sfgfp-s6g(-89)_e의발현결과를 SDS-PAGE로분석한그림이다. 1: sfgfp-s6g(- 89)_EE의발현유도전시료의세포용해물, 2: sfgfp-s6g(-89)_ee의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 3: sfgfp-s6g(-89)_ee의발현유도후얻어진세포용해물의상등액, 4: sfgfp-s6g(-89)_e의발현유도전시료의세포용해물, 5: sfgfp-s6g(-89)_e의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 6: sfgfp-s6g(-89)_e 의발현유도후얻어진세포용해물의상등액. 도 15는 sfgfp-s6g(-89)_ee와 sfgfp-s6g(-89)_e의발현결과를웨스턴블랏으로분석한그림이다. 1: sfgfp- S6G(-89)_EE의발현유도전시료의세포용해물, 2: sfgfp-s6g(-89)_ee의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 3: sfgfp-s6g(-89)_ee의발현유도후얻어진세포용해물의상등액, 4: sfgfp-s6g(-89)_e의발현유도전시료의세포용해물, 5: sfgfp-s6g(-89)_e의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 6: sfgfp- S6G(-89)_E의발현유도후얻어진세포용해물의상등액. 화살표는 sfgfp-s6g(-89) 의밴드를나타낸다. 도 16은 pet26-s6g(-108)_s, _DD, _D, _EE, _E 벡터맵을나타낸것이다. 도 17은벡터 pet26-s6g(-108)_s와 pet26-s6g(-108)_dd, pet26-s6g(-108)_d들의 sfgfp-s6g(-108) 의발현결과를 SDS-PAGE로분석한그림이다. 1: sfgfp-s6g(-108)_s 의발현유도전시료의세포용해물, 2: sfgfp-s6g(- 108)_S 의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 3: sfgfp-s6g(-108)_s 의발현유도후얻어진세포용해물의상등액, 4: sfgfp-s6g(-108)_dd의발현유도전시료의세포용해물, 5: sfgfp-s6g(-108)_dd의발현유 - 9 -
도후얻어진세포용해물의침전물, 6: sfgfp-s6g(-108)_dd의발현유도후얻어진세포용해물의상등액, 7: sfgfp-s6g(-108)_d의발현유도전시료의세포용해물, 8: sfgfp-s6g(-108)_d의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 9: sfgfp-s6g(-108)_d의발현유도후얻어진세포용해물의상등액. 도 18은벡터 pet26-s6g(-108)_s와 pet26-s6g(-108)_dd, pet26-s6g(-108)_d들의 sfgfp-s6g(-108) 의발현결과를웨스턴블랏으로분석한그림이다. 1: sfgfp-s6g(-108)_s 의발현유도전시료의세포용해물, 2: sfgfp- S6G(-108)_S 의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 3: sfgfp-s6g(-108)_s 의발현유도후얻어진세포용해물의상등액, 4: sfgfp-s6g(-108)_dd의발현유도전시료의세포용해물, 5: sfgfp-s6g(-108)_dd의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 6: sfgfp-s6g(-108)_dd의발현유도후얻어진세포용해물의상등액, 7: sfgfp-s6g(-108)_d의발현유도전시료의세포용해물, 8: sfgfp-s6g(-108)_d의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 9: sfgfp-s6g(-108)_d의발현유도후얻어진세포용해물의상등액. 화살표는 sfgfp-s6g(-108) 밴드를나타낸다. 도 19는벡터 pet26-s6g(-108)_ee와 pet26-s6g(-108)_e의 sfgfp-s6g(-108) 의발현결과를 SDS-PAGE로분석한그림이다. 10: sfgfp-s6g(-108)_ee의발현유도전시료의세포용해물, 11: sfgfp-s6g(-108)_ee의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 12: sfgfp-s6g(-108)_ee의발현유도후얻어진세포용해물의상등액, 13: sfgfp-s6g(-108)_e의발현유도전시료의세포용해물, 14: sfgfp-s6g(-108)_e의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 15: sfgfp-s6g(-108)_e의발현유도후얻어진세포용해물의상등액. 도 20은벡터 pet26-s6g(-108)_ee와 pet26-s6g(-108)_e의 sfgfp-s6g(-108) 의발현결과를웨스턴블랏으로분석한그림이다. 10: sfgfp-s6g(-108)_ee의발현유도전시료의세포용해물, 11: sfgfp-s6g(-108)_ee의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 12: sfgfp-s6g(-108)_ee의발현유도후얻어진세포용해물의상등액, 13: sfgfp-s6g(-108)_e의발현유도전시료의세포용해물, 14: sfgfp-s6g(-108)_e의발현유도후얻어진세포용해물의침전물, 15: sfgfp-s6g(-108)_e의발현유도후얻어진세포용해물의상등액. 화살표는 sfgfp- S6G(-108) 밴드를나타낸다. 발명을실시하기위한구체적인내용 [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] 이하실시예를통하여본발명을더욱상세하게설명하기로한다. 이들실시예는단지본발명을예시하기위한것으로본발명의범위가이들실시예에의해제한되는것으로해석되지는않는다. 실시예 1. 대장균세포질에서 N-말단 1-89번이제거된 ST6Gal1의발현및활성확인인간유래 ST6Gal1 (NCBI accession number P15907) 중 N-말단의 1-89번의아미노산이결손된부위를 S6G(- 89) 라명명하였으며 ( 서열번호 1), 대장균의세포질에서상기부위의발현을시도하였다. 실시예 1-1. pcoldii-s6g(-89) 벡터제작대장균에서 S6G(-89) 발현을위해서 Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA, USA) 에대장균코돈 (codon) 에최적화되도록디자인된해당유전자의합성을의뢰하였다 ( 서열번호 2). 상기합성한유전자부위를저온에서발현이유도되는 cspa 프로모터를가진 pcoldii 벡터 (Takara, Otsu, Shiga, Japan) 에클로닝하기위해서, C_89-F와 C_89-R 프라이머 ( 서열번호 4 및서열번호 5) 를이용하여중합효소연쇄반응 (Polymerase chain reaction, PCR) 으로증폭하였다. 이렇게얻어진유전자를 NdeI과 EcoRI 제한효소를사용하여 pcoldii 벡터에클로닝하여, pcoldii-s6g(-89) 를제작하였다 ( 도 2). 표 1 [0062] 프라이머서열 1 C_89-F ggtaggcatatggaagcatcttttcaggtttg ( 서열번호 4) 2 C_89-R acaagcttgaattcacagtggatggtgcgg ( 서열번호 5) 3 E_89ST-F ctcgagtgcggccgcaagcttttaacagtggatggtgcggaaac ( 서열번호 6) 4 E_89ST-R ggtggtggtgggtcggaagcatcttttcaggtttggaac ( 서열번호 7) 5 E_GFP-F cagaacttccagcgacccaccaccaccagaaccacctttttcgaactg ( 서열번호 8) 6 E_GFP-R ccaccaccaccaccaccaccaccacagcaaaggtgaagaactgtttac ( 서열번호 9) 7 E_GFP-F2 gatgcttccgacccaccaccaccgggcccctggaacagaacttccagcgacccacc ( 서열번호 10) 8 E_GFP-R2 gatatcggaattaattcggatccccaccaccaccaccaccacc ( 서열번호 11) - 10 -
9 E_DD89ST-R gttgaagttactgactttccatttgatacagatgagtgggagggctatct ( 서열번호 12) 10 E_DD89GFP-F atggaaagtcagtaacttcaaccatgtcgacatccacatggtcacgcaggtg ( 서열번호 13) 11 E_EE89ST-R gttgaagttactgactttccatttgagacagaagagtgggagggctatct ( 서열번호 14) 12 E_EE89GFP-F atggaaagtcagtaacttcaaccatctcgacttccacatggtcacgcaggtg ( 서열번호 15) 13 E_D89ST-R gttgaagttactgactttccatttgatacatcggagtgggagggctatc ( 서열번호 16) 14 E_D89GFP-F atggaaagtcagtaacttcaaccatactgacatccacatggtcacgcag ( 서열번호 17) 15 E_E89ST-R gttgaagttactgactttccatttgagacatcggagtgggagggctatc ( 서열번호 18) 16 E_E89GFP-F atggaaagtcagtaacttcaaccatactgacttccacatggtcacgcag ( 서열번호 19) 17 E_108ST-F ctcgagtgcggccgcaagcttttaacagtggatggtgcggaaac ( 서열번호 20) 18 E_108ST-R1 ccaggggcccggtggtggtgggtcgctgcaaaagatttggaaaaa ( 서열번호 21) 19 E_108ST-R2 cgctggaagttctgttccaggggcccggtggtggtg ( 서열번호 22) 20 E_108GFP-F aacagaacttccagcgacccaccaccaccagaaccacctttttcgaact ( 서열번호 23) 21 E_108GFP-R gatatcggaattaattcggatccccaccaccaccaccaccacc ( 서열번호 24) [0063] [0064] 실시예 1-2. pcoldii-s6g(-89) 의수용성발현확인상기실시예 1-1에서제작된 pcoldii-s6g(-89) 벡터를대장균 BL21 (DE3) 균주에형질전환으로도입하였다. 형질전환된균주는암피실린 (100 μg / ml ) 이포함된 LB (Luria-Betani) 배지에접종하여 37 에서 16 시간배양한후, 다음날이를 TB (Terrific Broth) 배지에접종하여본배양을하였다. 본배양에서도 37 를유지하다가 600 nm에서흡광도 (OD 600 ) 가 0.8에도달하였을때, 1 mm IPTG (isopropyl b-d-1-thiogalactopyranoside) 를첨 가하고 15 로옮겨서유전자발현을유도한후, 24 시간을더배양하고원심분리를통해서세포를수확하였다. 수확한세포침전물을용해완충액 (50 mm NaH 2 PO 4, ph 8.0, 300 mm NaCl, 0.1 % 2 x complete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack [protease inhibitor cocktail, Roche, Basel, Switzerland], 0.1 mg/ ml lysozyme) 에녹여초음파분해로세포를용해시켰다. 세포용해물을 13,000 rpm, 4 에서 20 분동안원심분리하여수용성부분과불용성부분으로나누었다. 상기실험의각단계에서얻은시료들은웨스턴블랏으로분석을하였다 ( 도 4). 웨스턴블랏에서 1 차항체는 His-prove 마우스모노클로날 IgG (Santa Cruz biotechnology, Dallas, Texas, USA) 를 1 : 1000으로사용하였고, 2차항체는항-마우스 IgG (whole molecule)-페록시다제항체 (produced in goat, SIGMA-ALDRICH, Louis, MO, USA) 를 1 : 5000으로사용하여분석하였다. SDS-PAGE와웨스턴블랏분석으로확인한결과수용성발현을확인할수있었다 ( 도 3 및도 4). 발현한 S6G(-89) 의활성을확인하기위하여다음실험들을진행하였다. [0065] [0066] 실시예 1-3. S6G(-89) 효소의정제 상기실시예 1-2 를통해서얻은세포용해물의상등액을정제완충액 (50 mm NaH 2 PO 4, ph 8.0, 300 mm NaCl, 10 mm imidazole) 으로미리평형화해둔 Ni-NTA 컬럼 (Qiagen, USA) 에로딩 (loading) 하였다. 컬럼부피의 20 배에해당하는정제완충액으로세척한후, 용출액 (50 mm NaH 2 PO 4, ph 8.0, 300 mm NaCl, 250 mm imidazole) 으로컬럼에흡착되어있던 S6G(-89) 를용출하였다. 상기정제의각단계에서용출된분획들은 SDS-PAGE로분석하였다 ( 도 5). 화살표는단백질 S6G(-89) 밴드를나타낸다. [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] 실시예 2. S6G(-89) 의 α(2,6)-시알산부가활성분석상기실시예 1-3을통해서분리정제된 S6G(-89) 의 α(2,6)-시알산부가활성을분석하였다. 실시예 2-1. 형광표지된당사슬기질의제조 α(2,6)-시알산부가활성분석을위한기질로 N-당사슬인비시알산이갈락토스당사슬 (Asialo galactosylated biantennary, G2) 을 Prozyme (Hayward, CA, USA) 으로부터구매하였다. 안트라닐산 (anthranilic acid) 은 SIGMA-ALDRICH (Louis, MO, USA) 로부터구매하였으며, 이를이용하여 G2 당사슬을표지하여 G2-AA를제조하였다. AA를이용한표지는통상적인방법을따라서수행하였으며 (Mun et al., 1992, Anal Chem 85: 7462-7470), 이를간략히기술하면다음과같다. 우선 DMSO (dimethyl sulfoxide) 350 μl에아세트산 (acetic acid) 150 μl를섞은후 100 μl를취해 6 mg의 AA 가들어있는 1.5 ml튜브에넣어녹였다. 이반응물 100 μl를취해 6 mg의 NaCNBH 2 (sodium cyanoborohydride) 가들어있는튜브에넣고 65 에서약 1 내지 2 분가량반응하여형광표지용액을만들었다. 이형광표지 용액 5 μl를건조된당사슬시료에넣고 37 에서 16 시간반응시킨후, 반응하지않고남은 AA 들로부터 G2-AA - 11 -
를 cyano SPE 컬럼 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 을이용하여정제하였다. 정제된 G2-AA 용액 을모두취해서건조한후 100 μl정제수로녹여시료를준비하여이를기질로사용하였다. [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] 실시예 2-2. S6G(-89) 의시알산부가반응상기실시예 1-3에서얻은 S6G(-89) 1 μg을 1 μm G2-AA가포함된반응액 (100 mm Tris-HCl, ph 8.0, 0.5 mm CMP-NeuAc) 20 μl에넣어준후 30 에서 30 분간반응한후, 100 에서 5 분간방치하여반응을멈추었다. 실시예 2-3. HPLC를이용한 S6G(-89) 반응의반응물분석상기실시예 2-2에서얻어진효소반응물은 HPLC (high performance liquid chromatography) 를이용하여분석하였다. 이동상으로용액 A (2 % acetic acid, 1 % THF in ACN) 와용액 B (5 % acetic acid, 3 % TEA, 1 % THF in water) 를사용하였으며, 1 ml / 분의유속으로용액 B를 30 % 로안정화시켜주었다. 그다음 100 % 까지 20 분간구배조건으로흘려주고 5 분동안유지시켜준후다시용액 B를 30 % 로 5 분간흘려주었다. Waters Alliance HPLC 시스템 (Milford, MA) 과 Waters 2475 형광검출기를사용하였으며, 전하와크기에의해서분리가되는아민컬럼인 Shodex Asahipak NH2P-50 4E(Showa Denko, Tokyo, Japan) 을사용하여 360 nm의여기파장과 425 nm 방출파장에서분석을수행하였다. 분석결과대장균세포질에서발현하였던 S6G(-89) 는시알산부가활성을보이지않았다 ( 도 6). 실시예 3. 대장균에서분비발현한 sfgfp-s6g(-89) 의발현및정제상기실시예 1에서대장균세포질에서발현한 S6G(-89) 는시알산부가활성을보이지않았기때문에활성을가지지않은형태로생각되었다. 이에, S6G(-89) 를세포질에서발현하는것이아닌, 분비발현하면서 sfgfp를 S6G(-89) 의 N-말단에융합하고자하였다. 이에, sfgfp와 S6G(-89) 를융합한융합단백질 sfgfp-s6g(-89) 를대장균에서분비발현하기위한실험을수행하였다. 실시예 3-1. pet26-s6g(-89) 벡터제작상기실시예 1-1에서합성한유전자를주형으로하고, E_89ST-F와 E_89ST-R 프라이머 ( 서열번호 6 및서열번호 7) 를사용한 PCR을수행하여 S6G(-89) DNA 절편을얻었다. 그리고 sfgfp 유전자는우선 E_GFP-F와 E_GFP-R 프라이머 ( 서열번호 8 및서열번호 9) 를사용하여 1 차 PCR을진행하여 DNA 절편을얻었고, 이유전자를주형으로 E_GFP-F2와 E_GFP-R2 프라이머 ( 서열번호 10 및서열번호 11) 를사용하여 S6G(-89) 유전자와겹치는부분을가지는 sfgfp DNA 절편을얻었다. 이렇게하여얻어진유전자들을시그널펩타이드 (signal peptide) 서열이존재하여주변세포기질 (Periplasm) 로분비발현이가능한 pet26(+) 벡터 (Novagen, Wisconsin, USA) 에클로닝하기위하여, New englan biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA) 사의 Gibson assembly Master Mix를사용하였다. 상기벡터에 HindIII와 BamHI 제한효소를사용하여클로닝을수행하였고, NEB에서제공하는프로토콜 (Gibson assembly Master Mix Instruction Manual) 을따라실험을진행하여 pet26-s6g(-89) 을제작하였다 ( 도 7). 실시예 3-2. sfgfp-s6g(-89) 의발현및정제상기실시예 3-1에서클로닝한 pet26-s6g(-89) 벡터를발현용대장균 BL21 (DE3) 균주에형질전환으로도입하여단백질을발현하였다. 상기형질전환균주의배양을통해서얻은세포침전물을실시예 1-2과동일한방식으로웨스턴블랏으로분석하여융합단백질 sfgfp-s6g(-89) 가수용성형태로발현이되는것을확인하였다 ( 도 8). 세포용해물의상등액으로부터실시예 1-3과동일한방법으로 sfgfp-s6g(-89) 을정제하였다. 정제의각단계에서용출된용출액등을 SDS-PAGE로분석하였다 ( 도 9). 화살표는융합단백질 sfgfp-s6g(-89) 밴드를나타낸다. 실시예 4. 대장균에서분비발현한융합단백질 sfgfp-s6g(-89) 의활성확인다음으로, 상기실시예 3에서분비발현하고정제하여얻은융합단백질 sfgfp-s6g(-89) 의 α(2,6)-시알산부가활성을분석하였다. 시알산부가활성의분석은실시예 2에서와동일한방법으로수행하였다. 분석결과, G2 당사슬에시알산을 1 개를부가한 S1 당사슬과 2 개를부가한 S2 당사슬피크들이검출되어 ( 도 10), 대장균세포질에서발현한 S6G(-89) 와는달리분비발현하여얻은 sfgfp-s6g(-89) 는시알산부가활성을보인다는것을확인하였다. 실시예 5. 융합단백질 sfgfp-s6g(-89) 의수용성을높이기위한당사슬부착위치의아미노산변화본발명자들은당사슬두개가부착되는 ST6Gal1이대장균에서발현되기때문에수용성을높여주던당사슬이부 - 12 -
착되지못하여서불수용성및비활성형형태로발현된다고추정하였다. 따라서 N- 당사슬이부착되는위치 (149 번및 161 번 ) 와 +3 의위치 (151 번및 163 번의 ) 아미노산을 Asp 또는 Glu 로치환하여분비발현시수용성이높 아지는지를확인해보았다 ( 표 2) [0089] Vector name 1st Sequon (149-151) 2nd Sequon (161-163) (A) pet26-s6g(-89) NVS NTS (B) pet26-s6g(-89)_dd NVS -> DVD NTS -> DTD (C) pet26-s6g(-89)_d NVS -> DVS NTS -> DTS (D) pet26-s6g(-89)_ee NVS -> EVE NTS -> ETE (E) pet26-s6g(-89)_e NVS -> EVS NTS -> ETS 표 2 [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] 실시예 5-1. pet26-s6g(-89)_dd, _D, _EE, _E 벡터제작상기실시예 3에서제작한 pet26-s6g(-89) 벡터를주형으로하여각각 E_89ST-F ( 서열번호 6) 와 E_DD89ST-R ( 서열번호 12), E_89ST-F ( 서열번호 6) 와 E_EE89ST-R ( 서열번호 14), E_89ST-F ( 서열번호 6) 와 E_D89ST-R ( 서열번호 16), E_89ST-F ( 서열번호 6) 와 E_E89ST-R ( 서열번호 18) 의프라이머들을이용한 PCR을통하여 N-당사슬이부착되는아미노산서열이교환된 S6G(-89) 유전자를얻었으며, sfgfp 유전자도각각 E_DD89GFP-F ( 서열번호 13) 와 E_GFP-R2 ( 서열번호 11), E_D89GFP-F ( 서열번호 17) 와 E_GFP-R2 ( 서열번호 11), E_EE89GFP-F ( 서열번호 15) 와 E_GFP-R2 ( 서열번호 11), E_E89GFP-F ( 서열번호 19) 와 E_GFP-R2 ( 서열번호 11) 의프라이머들을이용하여 S6G(-89) 와겹치는서열을가진 sfgfp DNA 절편을얻었다 ( 표 2의 (B), (C), (D), 및 (E)). 이렇게하여얻어진유전자절편들을실시예 3-1과동일한방법으로실험을진행하여벡터들을클로닝하여 pet26-s6g(-89)_dd, pet26-s6g(-89)_d, pet26-s6g(-89)_ee, pet26-s6g(-89)_e 벡터들을얻었다 ( 도 11). 실시예 5-2. 융합단백질 sfgfp-s6g(-89)_dd, D, _EE, _E들의분비발현상기실시예 5-1에서클로닝한 pet26-s6g(-89)_dd, _D, _EE, _E 벡터들을발현용대장균 BL21 (DE3) 균주에형질전환으로도입하여단백질을발현하였다. 각각실시예 1-2와동일한방법으로배양및발현확인실험을진행하였고, SDS-PAGE ( 도 12 및도 14) 와웨스턴블랏 ( 도 13 및도 15) 으로분석을하였다. 이때 pet26-s6g(- 89)_DD에서얻어진 sfgfp-s6g(-89) 은 sfgfp-s6g(-89)_dd라명명하고, pet26-s6g(-89)_d에서얻어진 S6G(-89) 은 sfgfp-s6g(-89)_d, pet26-s6g(-89)_ee에서얻어진 S6G(-89) 은 sfgfp-s6g(-89)_ee, pet26-s6g(-89)_e에서얻어진 S6G(-89) 은 sfgfp-s6g(-89)_e라고명명하였다. 이들은 sfgfp-s6g(-89) 과유사한수준의수용성발현효율을보였다. 실시예 6. 대장균에서의분비발현한융합단백질 sfgfp-s6g(-108) 의수용성발현확인다음으로, 본발명자들은같은부위를대장균에서분비발현할때, 보다수용성및활성이높은형태로발현되는지를확인하기위한실험을수행하였다. 실시예 6-1. pet26-s6g(108)_s, _DD, _D, _EE, _E 벡터제작상기실시예 3에서클로닝한 pet26-s6g(-89) 와실시예 5에서클로닝한 pet26-s6g(-89)_dd, _D, _EE, _E 벡터들에서각각 E_108ST-F ( 서열번호 20) 와 E_108ST-R1 ( 서열번호 21) 프라이머를사용하여 DNA 절편을얻었고, 이 DNA 절편을주형가닥으로 E_108ST-F ( 서열번호 20) 와 E_108ST-R2 ( 서열번호 22) 프라이머를사용하여 PCR을수행하였다. 또한, E_108GFP-F ( 서열번호 23) 와 E_108GFP-R ( 서열번호 24) 프라이머를이용한 PCR을통해각각의 S6G(-108) 유전자들과겹치는서열을가지는 sfgfp DNA 절편을얻을수있었고, 실시예 3-1과동일한방법으로클로닝을진행하였다. 이렇게하여각각의 pet26-s6g(-108)_s, pet26-s6g(-108)_dd, pet26-s6g(-108)_d, pet26-s6g(-108)_ee, pet26-s6g(-108)_e 벡터들을제작하였다 ( 도 16). 실시예 6-2. sfgfp-s6g(108)_s, _DD, _D, _EE, _E의수용성발현확인상기실시예 6-1에서클로닝한 pet26-s6g(-108)_s, _DD, _D, _EE, _E 벡터들을발현용대장균 BL21 (DE3) 균주에형질전환으로도입하여단백질을발현하였다. 각각실시예 1-2와동일한방법으로배양및발현확인실험을진행하였고, SDS-PAGE ( 도 17 및도 19) 와웨스턴블랏 ( 도 18 및도 20) 으로분석을하였다. 이때 pet26-s6g(- 108)_DD에서얻어진 sfgfp-s6g(-108) 은 sfgfp-s6g(-108)_dd라명명하고, pet26-s6g(-108)_d에서얻어진 S6G(- 108) 은 sfgfp-s6g(-108)_d, pet26-s6g(-108)_ee에서얻어진 S6G(-108) 은 sfgfp-s6g(-108)_ee, pet26-s6g(- - 13 -
108)_E 에서얻어진 S6G(-108) 은 sfgfp-s6g(-108)_e 라고명명하였다. 이들도 sfgfp-s6g(-89) 와유사한수준의 수용성발현효율을보였다. [0100] [0101] [0102] 상기결과를종합하면, 본발명에서는폴딩 (folding) 이잘되며수용성 (solubility) 이높은단백질 (sfgfp; superfolder green fluorescent protein) 을 ST6Gal1의 N-말단에융합한형태로대장균의주변세포질로분비발현하여활성을가진융합단백질 sfgfp-s6g(-89) 을분리, 정제하였고, 상기단백질의시알산부가활성을확인하였다. 나아가, 상기융합단백질 sfgfp-s6g(-89) 에서 N-당사슬이부착되는위치또는주변의아미노산을 Asp 또는 Glu로치환한 sfgfp-s6g(-89)_dd, sfgfp-s6g(-89)_d, sfgfp-s6g(-89)_ee, 및 sfgfp-s6g(-89)_e와 ST6Gal1의 N-말단의 1 내지 108 번아미노산이결손된 sfgfp-s6g(-108)_s, sfgfp-s6g(-108)_dd, sfgfp-s6g(- 108)_D, sfgfp-s6g(-108)_ee, 및 sfgfp-s6g(-108)_e 역시상기융합단백질 sfgfp-s6g(-89) 와유사한수용성발현효율을가지는것을확인할수있었다. 따라서본발명을이용하여 ST1Gal1 단백질을조작이용이하고경제성이높은대장균에서생산할수있으며, 이를통해시알산이부가된고부가가치의당사슬및당단백질을저렴하게생산할수있다. 이상의설명으로부터, 본발명이속하는기술분야의당업자는본발명이그기술적사상이나필수적특징을변경하지않고서다른구체적인형태로실시될수있다는것을이해할수있을것이다. 이와관련하여, 이상에서기술한실시예들은모든면에서예시적인것이며한정적인것이아닌것으로이해해야만한다. 본발명의범위는상기상세한설명보다는후술하는특허청구범위의의미및범위그리고그등가개념으로부터도출되는모든변경또는변형된형태가본발명의범위에포함되는것으로해석되어야한다. 도면 도면 1-14 -
도면 2 도면 3 도면 4-15 -
도면 5 도면 6 도면 7-16 -
도면 8 도면 9 도면 10-17 -
도면 11 도면 12 도면 13-18 -
도면 14 도면 15 도면 16-19 -
도면 17 도면 18 도면 19 도면 20-20 -
서열목록 <110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Method for preparing recombinant ST6Gal1 protein as an active form <130> KPA150549-KR <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 317 <212> PRT <220><223> S6G(-89) a.a. <400> 1 Glu Ala Ser Phe Gln Val Trp Asn Lys Asp Ser Ser Ser Lys Asn Leu 1 5 10 15 Ile Pro Arg Leu Gln Lys Ile Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys 20 25 30 Tyr Lys Val Ser Tyr Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala 35 40 45 Glu Ala Leu Arg Cys His Leu Arg Asp His Val Asn Val Ser Met Val 50 55 60 Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe Asn Thr Ser Glu Trp Glu Gly Tyr Leu 65 70 75 80 Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr Lys Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala 85 90 95 Val Val Ser Ser Ala Gly Ser Leu Lys Ser Ser Gln Leu Gly Arg Glu 100 105 110 Ile Asp Asp His Asp Ala Val Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr Ala 115 120 125 Asn Phe Gln Gln Asp Val Gly Thr Lys Thr Thr Ile Arg Leu Met Asn 130 135 140 Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu Lys Arg Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr 145 150 155 160-21 -
Asn Glu Gly Ile Leu Ile Val Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp 165 170 175 Ile Pro Lys Trp Tyr Gln Asn Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr 180 185 190 Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His Pro Asn Gln Pro Phe Tyr Ile Leu Lys 195 200 205 Pro Gln Met Pro Trp Glu Leu Trp Asp Ile Leu Gln Glu Ile Ser Pro 210 215 220 Glu Glu Ile Gln Pro Asn Pro Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile Ile 225 230 235 240 Ile Met Met Thr Leu Cys Asp Gln Val Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro 245 250 255 Ser Lys Arg Lys Thr Asp Val Cys Tyr Tyr Tyr Gln Lys Phe Phe Asp 260 265 270 Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala Tyr His Pro Leu Leu Tyr Glu Lys Asn 275 280 285 Leu Val Lys His Leu Asn Gln Gly Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu 290 295 300 Gly Lys Ala Thr Leu Pro Gly Phe Arg Thr Ile His Cys 305 310 315 <210> 2 <211> 951 <220><223> S6G(-89) n.t. <400> 2 gaagcatctt ttcaggtttg gaacaaggac agcagttcaa agaatctgat cccgcgtctg 60 caaaagattt ggaaaaatta cctgagtatg aacaaatata aagtgagtta taaaggtcct 120 gggccgggta ttaagttttc cgccgaggca ctgcgctgcc acctgcgtga ccatgtgaac 180 gtcagtatgg ttgaagttac tgactttcca tttaatacat cggagtggga gggctatctc 240 ccaaaggaat ccattcgtac gaaagcgggc ccgtgggggc gttgcgcggt ggtgagttcc 300-22 -
gctggctcac tgaagtcttc ccaactgggt cgggaaattg acgaccacga cgcagtgctg 360 cgttttaatg gggctccgac agctaatttc cagcaggacg ttggcactaa aactaccatc 420 cgtttaatga atagccagct ggtcaccact gaaaaacgtt ttttaaagga ttctttgtat 480 aatgaaggca tcctgattgt gtgggaccct agtgtttatc actccgatat tcctaaatgg 540 tatcagaacc ctgactataa cttctttaat aactacaaga cctatcgcaa actgcaccct 600 aatcagccgt tctatatttt gaagccgcag atgccatggg aactgtggga tatcttacag 660 gaaatttcac cagaagagat ccagccgaac ccaccgagta gtgggatgtt gggaattatt 720 attatgatga cgttatgcga tcaggttgac atctacgaat ttttacctag caaacgtaaa 780 accgacgttt gctattatta ccagaaattt tttgatagtg cttgtacgat gggcgcgtat 840 catccgttac tgtacgagaa aaatctggtt aaacatttga accaaggcac cgatgaagac 900 atttatcttt tgggcaaagc gactctcccg ggtttccgca ccatccactg t 951 <210> 3 <211> 298 <212> PRT <220><223> S6G(-108) a.a. <400> 3 Leu Gln Lys Ile Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val 1 5 10 15 Ser Tyr Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu Ala Leu 20 25 30 Arg Cys His Leu Arg Asp His Val Asn Val Ser Met Val Glu Val Thr 35 40 45 Asp Phe Pro Phe Asn Thr Ser Glu Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu 50 55 60 Ser Ile Arg Thr Lys Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser 65 70 75 80 Ser Ala Gly Ser Leu Lys Ser Ser Gln Leu Gly Arg Glu Ile Asp Asp 85 90 95 His Asp Ala Val Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr Ala Asn Phe Gln 100 105 110 Gln Asp Val Gly Thr Lys Thr Thr Ile Arg Leu Met Asn Ser Gln Leu - 23 -
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