(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2010-0103000 (43) 공개일자 2010년09월27일 (51) Int. Cl. C12N 9/10 (2006.01) C12N 15/54 (2006.01) C07K 14/415 (2006.01) A01H 1/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2009-0021349 (22) 출원일자 2009 년 03 월 12 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 8 항 2009 년 03 월 12 일 (71) 출원인 경희대학교산학협력단 경기도용인시기흥구서천동 1 경희대학교국제캠퍼스내 (72) 발명자 박영두 경기도용인시수지구성복동성동마을수지자이 1 차아파트 108 동 702 호 이기호 부산광역시동래구온천 1 동 153-8 SK 허브스카이 102 동 2206 호 (74) 대리인 특허법인다울 (54) 도드람국화유래의메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질및이를코딩하는유전자 (57) 요약 본발명은도드람국화 (Dendranthema grandiflorum cv. Dodram) 유래의메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 (mrcapto-pyruvate sulfertransferase 1) 단백질에관한것이다. 또한, 메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질검출용프라이머를제작하고이를사용하여메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질을코딩하는유전자를분리하는방법을제공한다. 대표도 - 도 1-1 -
이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 20070501080002 부처명 농촌진흥청 연구관리전문기관 연구사업명 현장협력기술개발사업 연구과제명 저항성유전자의개발및이용 기여율 주관기관 경희대학교 연구기간 2007.04.29~2009.04.24-2 -
특허청구의범위청구항 1 서열번호 4의아미노산서열을가지는, 도드람국화 (Dendranthema grandiflorum cv. Dodram) 유래의메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 (mrcapto-pyruvate sulfertransferase 1) 단백질. 청구항 2 제 1 항의메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1 단백질을코딩하는핵산서열로이루어지는유전자. 청구항 3 제 2 항에있어서, 상기핵산서열은서열번호 3 의핵산서열을가지는것인유전자. 청구항 4 제 2 항의유전자를포함하는재조합벡터. 청구항 5 제 4 항의재조합벡터로형질전환된형질전환체. 청구항 6 제 5 항의형질전환체를이용한, 노화가지연되고저장기간이증가된형질전환국화. 청구항 7 (i) 서열번호 1 내지 2에기재된프라이머를제작하는단계 ; (ii) 도드람국화의 RNA로부터합성한 cdna를, 상기제작된서열번호 1 내지 2로이루어지는프라이머쌍을사용하여 RT-PCR을수행하여메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질에대한유전자를분리하는단계 ; 및 (iii) 상기분리된유전자를이용하여메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1의전체서열을확인하는단계를포함하는, 도드람국화로부터메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질을코딩하는유전자를분리하는방법. 청구항 8 서열번호 1 내지 2 에서선택되는메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질검출용프라이머. 명세서 발명의상세한설명 [0001] 기술분야 본발명은스프레이국화도드람 (Dendranthema grandiflorum cv. Dodram) 의노화및해독작용과관여하는메 캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1(mercapto-pyruvate sulfertransferase 1) 의단백질을도드람국화로부 - 3 -
터분리하는방법과, 분리된메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 및이를코딩하는유전자에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] 배경기술썰퍼트랜스퍼라아제 (sulfertransferase, ST) 는동물, 식물뿐만아니라미생물등에서도황원자를수용기질에게전달하는역할을하는가장대표적인효소이다. ST에속하는유전자로는 thiosulfate:cyanide ST(rhodanese, EC 2.8.1.1), 3-mercapto pyruvate:(di)thiol ST(EC 2.8.1.2), thiosulfate:thiol ST(EC 2.8.1.3) 와 thiosulfate:dithiol ST(EC 2.8.1.5) 가있다. ST의주요생리적특징은시아나이드 (cyanide) 의해독작용을가지고있는것으로알려져있고, 활성산소를이용하는생물에서산소조직부위의세포독성을조절한다. 그뿐만아니라황대사과정에관여하며, Fe-S 클러스터의생합성및수복을위한황의전달과정에관여하는중요한효소이다. 특히본효소의가장큰특징은, 티오-썰페이트 (thiosulfate) 의황을시아니아드 (cyanide) 로옮겨주어티오-시아나이드로바꾸어주는것이다. 해당기작은다음과같다 (Westley, 1973 Rhodanese. Adv. Enzymol. 39, pp. 327-368). 2-2- S 2 O 3 +Rhod SO3 +Rhod-S Rhod-S + CN - Rhod+SCN - 또한 Papenbrock와 Schmidt(2000, Characterization of two sulfurtransferase isozymes from Arabidopsis thaliana. Eur. J. Biochem., 267, 5571-579.) 에의하여식물체가노화가진행될수록 ST 효소의활성이증가함이보고되었다. 현재까지이현상에관한가장자명한사실로인정되는가설로는, 식물체의노화가진행됨에따라노화된잎에존재하는황원소를새로자라나는잎또는과실과종자에전달하기위함으로알려져있다. ST는식물의노화와관련있는여러유전자중하나이다. 특히 ST는식물체의노화가진행되면서발생되는가스상태의식물호르몬인에틸렌 (ethylene) 이합성되는가운데부산물로만들어지는독성물질인시아나이드 (cyanide) 를해독하는역할을한다. 즉, 에틸렌생합성과정의 ACC(1-aminocyclopropane-1 -carboxylicacid) 가 ACC 옥시다아제 (oxidase) 에의한산화반응의결과시아노포믹산 (cyanoformic acid) 이만들어지고, 이것이 CO 2 와공유결합반응이일어나서시아나이드 (cyanide, HCN) 가합성된다고알려져있다 (Yang과 Hoffmann, 1984 Ethylene biosynthesis and its regulation in higher plants. Annu Rev Plant Physiol. 35:155-89.; Kende, 1993, Ethylene biosynthesis. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 44, 283-307). Kende(1993, Ethylene biosynthesis. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 44, 283-307) 의보고에따르면시아나이드의합성이아미노산의산화과정등여러곳에서일어나지만에틸렌의생합성과정에서발생하는것이가장많다고하였다. [0008] [0009] [0010] 시아나이드 (cyanide) 는세포내에서강한독성물질로알려져있다. 시아나이드는금속이온효소 (metalloenzyme) 을강하게억제할뿐만아니라, 광합성과정중의전자전달계 (photosynthetic electron transport) 를막아버리고, 리블로오즈-비스포스페이트카르복실라아제 (ribulose-bisphosphate carboxylase) 와카탈라아제 (cathlase) 의활성을 50% 정도감소시킨다고알려져있다. 즉시아나이드는식물의여러대사과정에중요한영향을미치는물질로볼수있다. 또한시아나이드가호흡급등형 (climacteric) 작물인아보타도에서에틸렌과같은효과를나타낸다는보고가있었으며, Pirrung과 Brauman(1987, Involvement of cyanide in the regulation of ethylene biosynthesis, Postharvest Biol. Tec. (25) pp. 55-61.) 은호흡급등형조직에서시아나이드가에틸렌의합성을촉진하는것을확인하였다. 시아나이드의축적은대체호흡과정인시아나이드저항대사과정 (cyanide-resistance pathway) 을촉진하여, 식물체내자유라디칼 (free radical) 을증가시키게되고, 이것이 ACC 옥시데이제 (oxidase) 를촉진하게되어에틸렌합성이증가되는것으로알려져있다. 또한증가된자유라디칼은노화와큰관련이있다고생각되는활성산소종 (active oxygen species, AOS) 과밀접한관련이있다. AOS는미토콘드리아활성의영향으로식물체의노화를야기시키게되는데, 이는미토콘드리아의노화로인하여 AOS가효과적제거하지못하여생기는산화적피해이다. 이를방어하기위해, 식물체는자가방어시스템을작동하여보호하지만, 그한계를넘을경우식물체는노화하기시작되는것이다. - 4 -
[0011] [0012] [0013] [0014] [0015] 시아나이드는위와같이식물체의생장및노화에큰영향을미치기때문에조속한해독이필요하다. 식물에서의이역할을수행하는것이메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1(mercapto-pyruvate sulfertransferase 1; ST1) 과 β-시아노-l-알라닌-합성효소 (β-cyano-l-alanine synthase, CAS, EC 4.4.1.9) 이다. 특히 ST1의경우독성시아나이드를저독성인티오시아네이트 (thiocyanate) 로전환시켜줌으로써해독작용을하는것으로보고되어있다 (Nagahara 등. 1999, Mercaptopyruvate sulfurtransferase as a defense against cyanide toxication: molecular properties and mode of detoxification. Histol Histopathol. 14(4):1277-86; Ressler과 Tatake, 2001 Vicianin, prunasin, and beta-cyanoalanine in common vetch seed as sources of urinary thiocyanate in the rat. J Agric Food Chem. 49(10):5075-80.). 세계 4대절화 (cut flower) 중하나인국화는주재배지역이경남, 경기, 부산, 충남, 전남등인데, 그중스프레이국화의재배량이총재배량의 1/3정도인것으로추산되고있다. 또한스프레이국화는측아를제거할필요가없어 10a당 250시간의노동력이절감되며, 생육이왕성하고, 재배기간이짧아경영상이점이많다. 스프레이국화는자연개화기가 9 11월인추국이지만, 차광재배에의해연중생산이가능하며일교차가큰고냉지에서재배하면절화품질향상에효과적이다 ). 절화국화의수확후관리로절화수명연장제로 STS를 18시간흡수시켜서잎의황화와꽃잎의위조를방지시킨다. 또한유통과정상의품질저하를막기위해예냉후 1-2 로저온유통을실시한다. 이에따라국화의대량생산및품질의고급화, 그리고저장과유통비용의절감을위하여, 국화의노화방지및저장기간의연장기술의개발이필요하다. 그러나국화에서노화지연, 노화방지및해독작용에관여하는메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1을코딩 (coding) 하는유전자에관해서는보고된바가없다. 본발명자들은국화유래의메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 을코딩하는유전자를규명하고, 이를이용하여노화지연및노화방지와해독작용에효과적인기능성국화를제공하고, 이로인하여국화의분화및절화수명연장으로경제적으로유용한국화품종육성을개발하기위해연구를계속하였다. 발명의내용 [0016] [0017] 해결하고자하는과제본발명은도드람국화유래의메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질및이를코딩하는유전자를제공하기위한것이다. 또한, 본발명은상기메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질검출용프라이머및이를이용하여도드람국화로부터메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1을코딩하는유전자를분리하는방법을제공하기위한것이다. [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] 과제해결수단본발명은서열번호 4의아미노산서열을가지는, 도드람국화유래의메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질에관한것이다. 본발명의 " 메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질 " 분리를위해프라이머쌍을제작하여사용하였다. 제작된프라이머쌍을사용하여도드람국화로부터메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질에해당하는유전자를분리하기위해 RT-PCR을수행하여메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질을코딩하는유전자의전체서열을확보하였다. 본발명의메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질은서열번호 4로기재된아미노산서열을가진다. 또한, 하나이상의위치에서일부아미노산서열이결실, 삽입, 비보전적또는보전적치환또는이들의조합에의한변이된변이체도본발명의범주에포함한다. 또한, 본발명은서열번호 4의아미노산서열을가지는도드람국화유래의메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질을코딩하는핵산서열을포함하는유전자에관한것이다. 본발명의서열번호 4의아미노산서열을가지는메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질을코딩하는 - 5 -
유전자는, 바람직하게는서열번호 3 의핵산서열을가지는유전자이다. [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] 메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질을코딩하는핵산서열은하나이상의염기가치환, 결실, 삽입또는이들의조합에의해변이될수있다. 상기핵산서열변이체또한, 본발명의범주에포함된다. 또한, 본발명은메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질을코딩하는핵산서열을포함하는유전자를포함하는재조합벡터에관한것이다. 본발명에서 " 재조합벡터 " 란유전자삽입물이발현되도록작동가능하게연결된필수적인조절요소를포함하는유전자작제물로, 플라스미드벡터, 코스미드벡터, 박테리오파지벡터및바이러스벡터등을포함한통상의모든벡터를포함한다. 본발명의벡터는메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질을코딩하는핵산서열이발현조절서열과기능적으로연결되어있다. 예를들어, 벡터는프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화시그널, 인핸서같은발현조절요소외에도막표적화또는분비를위한신호서열또는리더서열을포함하며목적에따라다양하게제조될수있다. 벡터는선택성마커를포함할수있다. 또한, 벡터는자가복제하거나숙주 DNA 에통합될수있다. 본발명의벡터는당해기술분야에서잘알려진유전자재조합기술을이용하여제조할수있으며, 부위-특이적 DNA 절단및연결은당해기술분야에서일반적으로알려진효소등을사용한다. 또한, 본발명은메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질을코딩하는핵산서열을포함하는유전자를포함하는재조합벡터로형질전환된형질전환체에관한것이다. 구체적으로, 본발명에의해메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질과이에대한유전자의서열을이용하여, 노화가지연되고저장기간이증가된형질전환국화를만들수있다. 숙주세포로의벡터도입은숙주세포에적합한방법을선택하여수행할수있다. 예를들어, 전기충격유전자전달법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO 4 ) 침전, 염화칼슘 (CaCl 2 ) 침전, 실리콘카바이드섬유이용한교반, 아 그로박테리아매개된형질전환, 입자총법, 원형질세포법, 텍스트란설페이트, 리포펙타민등의공지된방법으 로수행할수있다. [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] 숙주세포로는에스케리치아콜라이 (Escherichia coli), 바실러스서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 슈도모나스 (Pseudomonas), 프로테우스미라빌리스 (Proteus mirabilis) 또는스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 와같은원핵숙주세포가있으나, 이로제한되는것은아니다. 또한, 진균 ( 예를들어, 아스페르길러스 (Aspergillus)), 효모 ( 예를들어, 피치아파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로마이세스세르비시애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 (Schizosaccharomyces), 뉴로스포라크라사 (Neurospora crassa), 곤충세포, 식물세포, 포유동물등의진핵생물유래의세포가있으나, 이로제한되는것은아니다. 또한, 본발명의메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질을코딩하는유전자는식물개체내로형질전환될수있다. 식물로의형질전환법은바람직하게아그로박테리움법, 원형질세포법, 입자총법등이있다. 형질전환되는식물은바람직하게는국화이다. 또한, 본발명은서열번호 4의아미노산서열을가지는메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질의세포내발현수준을증가또는감소시켜식물, 바람직하게는국화의노화를지연시키고저장기간을증가시켜서국화의분화및절화 (cut flower) 의수명을연장시키는기능성국화를제공한다. 예를들어, 메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질을코딩하는재조합벡터로식물, 보다구체적으로국화를형질전환시킴으로써메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질의세포내발현수준을증가시킬수있다. 메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질을코딩하는재조합벡터는상술한바와같다. 또한, 메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질을코딩하는게놈유전자의엑손으로하나이상의외생핵산서열을도입시켜유전자를불활성화시켜메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질의세포내발현수준을억제및차단시킬수있다. 본발명에서용어, 외생 (Exogenous) 핵산서열 이란숙주세포에서정상적으로발견되지않는핵산서열을의미하고, 외생핵산서열을유전자게놈의엑손으로삽입함으로써유전자의불활성을유도할수있다. 상기에서예시한방법으로, 목적에맞게식물, 바람직하게는도드람국화의메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질의발현을효과적으로조절할수있다. 또한, 본발명은 (i) 서열번호 1 내지 2에기재된프라이머를제작하는단계 ; (ii) 도드람국화의 RNA로부터합 - 6 -
성한 cdna를, 상기제작된서열번호 1 내지 2로이루어지는프라이머쌍을사용하여 PCR을수행하여메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질에대한유전자를분리하는단계 ; 및 (iii) 분리된유전자를이용하여메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 유전자의전체서열을확인하는단계를포함하는, 도드람국화로부터메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1 단백질을코딩하는유전자를분리하는방법에관한것이다. [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] 각단계를각각살펴보면다음과같다. 상기단계 (i) 전에, 식물에대한공지된메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1 단백질을코딩하는유전자단백질의유전자에대한서열을수집하고유전자코딩서열을정렬하는단계와상기정렬된서열중상동성이높은영역을선택하는단계를먼저수행할수있다. 이때식물에대한공지된메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1 단백질의유전자에대한서열은 NCBI GenBank 등으로부터획득할수있으며, 상동성비교는육안으로나비교프로그램을이용하여수행할수있다. 그다음에상기 (i) 단계의프라이머를제작하게되는데, 상기상동성이높은영역에특이적인프라이머쌍을제작하게된다. 본발명에서, 주형가닥복사를위한시작지점으로기능을하는프라이머의길이는특별히제한되지않으며, 10 내지 50, 보다바람직하게는 10 내지 40개의염기서열을가진다. 구체적으로, 본발명에서사용된프라이머의서열은서열번호 1 내지 2로기재되었다. 단계 (ii) 에서, 시료로부터 RNA 분리와 RT-PCR은일반적인방법으로수행할수있다. 상기단계 (iii) 에서는분리된유전자단편을이용하여 T-벡터에넣어이것을이용하여염기서열을확인할수있는데, 상기유전자단편의 T-벡터의도입은공지된일반적인방법으로수행할수있다. 본발명의방법으로메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1 단백질분리에사용될수있는식물의종류는특별히제한되지않는다. 예를들어, 식량작물류, 채소작물류, 특용작물류, 과수류, 화훼류및사료작물류에속하는다양한식물체를시료로사용할있다. 구체적으로, 본발명에서메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1의분리에사용된도드람국화 (Dendranthema grandiflorum cv. Dodram) 는기내의무균상태에서키운것에서샘플을채취하여 RNA를분리하였다. 또한, 본발명은서열번호 1 내지 2에서선택되는메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1 단백질검출용프라이머를제공한다. 본발명에서제공하는프라이머들은식물의메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1 단백질간에상동성이높은영역을선택적으로인지하므로, 다양한식물에서메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1 단백질의검출에효율적으로사용될수있는프라이머들이다. 서열번호 1 내지 2의정방향프라이머및역방향프라이머쌍은적절한완충용액및온도에서중합반응을위한효소및상이한 4가지뉴클레오사이드트리포스페이트의존재하에서 cdna 합성을개시하게된다. 본발명의프라이머서열은분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적또는화학적수단에의해직접적으로또는간접적으로검출가능한표지를포함할수있다. 표지로는호스래디쉬퍼옥시다제, 알칼린포스파타아제등 과같은효소 ; 33 P 과같은방사성동위원소 ; cy3, cy5 등의형광성분자 ; 바이오틴과같은화학그룹을예로들 수있다. [0045] 효과본발명의방법으로메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1 단백질을식물체로부터효과적으로분리할수있다. 또한, 본발명에따른메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1 단백질은시아나이드 (cyanide) 에대한해독능력촉진및그로인한노화지연에관계가있으므로, 이를이용하여과발현벡터 (over-expression vector) 를만들어식물형질전환시, 노화가지연되고저장기간을증가시킬수있는형질전환된기능성국화를제공할수있다. 또한국화의분화및절화수명연장으로경제적으로유용한국화품종을제공하는효과를얻을수있다. 발명의실시를위한구체적인내용 - 7 -
[0046] 이하에서는, 본발명의구성을실시예를들어더욱상세히설명하지만본발명의권리범위가하기실시예로만 한정되는것은아니다. [0047] [0048] [0049] 실시예 1: 메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 (mercapto-pyruvate sulfertransferase 1) 단백질유전자를분리하기위한프라이머의작성메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 유전자의공통된부분을찾기위하여기존에발표되어있는작물별메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1의유전자를 "National Center for Biotechnology Information(NCBI) Genbank" 에서검색하였다. 유전자의전체염기서열을수집하기위해 Entrez 프로그램을사용하였다. 검색방법으로는유전자명으로메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1(mercapto-pyruvate sulfertransferase 1) 를검색어로선정하였다. 수집된메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질의유전자가운데, 모델식물인배추과의애기장대 (Arabidopsis thaliana) 의염기서열을선발, 염기서열의상동성을많이보이는부분을 BLAST 프로그램으로찾은뒤그부분을중심으로프라이머를제작하였다. 제작된프라이머들의서열은표 1에기재된바와같다. 표 1 [0050] 프라이머 염기서열 cst1-f ( 서열번호 1) 5'-ATA TGG CTT CGA CCC TTT TC-3' cst1-r ( 서열번호 2) 5'-TCA TGA AGA AGA ATC TTC CCC-3' [0051] [0052] [0053] [0054] 실시예 2: 메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질의유전자분리도드람국화 (Dendranthema grandiflorum cv. Dodram) 로부터 RNA의분리는 GibcoBRL회사에서제공된트리졸 (Trizol) 시약을사용하여수행하였다. 도드람국화의잎을액체질소를이용하여파쇄한다음, 1ml 트리졸 (Trizol) 용액을첨가하고잘섞은후 5분동안상온에두었다. 다음, 200 μl의클로로포름 (chloroform) 을첨가하여섞은다음다시 4 에서 13,000 rpm으로 10분동안원심분리한뒤그혼합액의상등액을새튜브로옮겼다. 이소프로페놀 (isopropanol) 을 500 μl를넣고 13,000 rpm으로 15분간원심분리하여침전시켰다. 다음, 이소프로페놀을제거하고침전물을 75% 에탄올로세척한다음, 에탄올이없도록잘건조시킨후 DEPC 처리된멸균증류수에녹여사용하였다. 메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 유전자의분리는확보된 RNA를주형으로올리고 dt 프라이머 (primer) 와역전사효소 (reverse transcriptase) 를이용, cdna를합성한뒤작성한프라이머로 PCR하여분리하였다. cdna합성프로그램조건은 1μg의 RNA를올리고 dt 프라이머와 70 에서두어 RNA 이차구조를제거한뒤 45 에서 30분간역전사시키고그사용된역전사효소를불활성화시키기위해 94 에서 5분간두었다. 그후합성된 cdna 1 마이크로그램을사용, 작성한프라이머와태크중합효소 (tag polymerase) 로 PCR하였는데그프로그램은 94 에서 2분간초기변성시간을둔뒤 94 에서 30초, 56 에서 30초, 72 에서 2분으로 40 반복 (cycle) 실행하고마지막으로 72 에서 10분간최종연장시킨후 4 를유지하여전체반응을종료하였다. 각각의프라이머들로증폭된단편들은그각각의염기서열을분석하기위해 PCR 산물용벡터 pcr 4-TOPO 벡터에클로닝하고, 올바른유전자의삽입여부를확인하기위하여 EcoRI을이용하였다. 그결과는도 1b와같다. 이후상기유전자가삽입된자리에근접한 T7 프로모터와 T3 프로모터에결합하는 T7과 T3 프라이머를이용하여염기서열을분석하였다. [0055] [0056] 실시예 3: 메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질유전자의전체염기서열확인 염기서열분석용 pcr 4-TOPO 벡터내부에클로닝된 PCR 단편의염기서열분석은 GenBank BLAST 프로그램을 사용하여이루어졌다. 그결과 cst1-f( 서열번호 1) 와 cst1-r( 서열번호 2) 프라이머로증폭된 1142bp 산물의염 - 8 -
기서열 ( 도 1) 과아미노산서열을분석한결과, 배추 (Brassica rapa ssp. pekinensis) 와애기장대 (Arabidopsis thaliana) 식물의메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 유전자와상동성을보였으며, 특히배추의메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 유전자와는 97% 의상동성을보였다. 즉, RNA를대상으로 cst1-f( 서열번호 1) 와 cst1-r( 서열번호 2) 프라이머를이용해 RT-PCR을수행한결과도드람국화의메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 유전자의전체유전자가증폭된다는것을확인할수있었다. [0057] 또한 NCBI Conserved Domain 프로그램을이용하여 ( 도 5 참고 ), 분리한메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 유전자에티오썰페이트썰퍼트랜스퍼라아제 (Thiosulfate sulfurtransferase: TST) 의 N-터미널 (N-terminal) 부분과 C-터미널 (C-terminal) 부분이각각의 E-값이 5e-42, 7e-37로정확하게존재하며, 로덴제이즈관련썰퍼트랜스퍼라아제 (Rhodanese-related sulfurtransferase) 의도메인의 E-값이 4e-72로정확하게포함되는것을통해, 그정확도가높음을확인하였다. 확인된메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 유전자염기서열을바탕으로시작코돈 (codon) 과종료코돈을결정한후, 이를도드람국화로부터분리된전체메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 유전자로결정하고, 메캅토피루베이트썰퍼트랜스퍼라아제 1 단백질의아미노산서열은서열번호 4에나타내었다. 그리고상기단백질에대한유전자서열은서열번호 3에나타내었다. [0058] [0059] 도면의간단한설명도 1은각 cst1-f와 cst1-r을사용한 RT-PCR에의해 도드람 국화로부터증폭된메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1(mrcapto-pyruvate sulfertransferase 1) 을코딩하는유전자의단편을전기영동한사진이다. 도 2는 cst1-f( 서열번호 1) 와 cst1-r( 서열번호 2) 을사용한 RT-PCR에의해 도드람 국화로부터증폭된메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1 (mrcapto-pyruvate sulfertransferase 1) 을코딩하는유전자를 pcr 4- TOPO 벡터에넣은후정확한삽입을확인하기위해 EcoRI 을처리하여확인한사진이다. [0060] [0061] [0062] 도 3은 RT-PCR에의해분리된 도드람 국화의메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1 (mrcapto-pyruvate sulfertransferase 1) 을코딩하는유전자의시퀀스를 GenBank BlastX 프로그램을사용하여배추 (Brassica rapa ssp. pekinensis) 시퀀스간에상동성비교결과이다. 도 4는 RT-PCR에의해분리된 도드람 국화의메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1 (mrcapto-pyruvate sulfertransferase 1) 을코딩하는유전자의시퀀스를 GenBank BlastX 프로그램을사용하여애기장대 (Arabidopsis thaliana) 시퀀스간에상동성비교결과이다. 도 5는 RT-PCR에의해분리된 도드람 국화의메캅토피루베이트썰퍼트렌스퍼라아제 1 (mrcapto-pyruvate sulfertransferase 1) 을코딩하는유전자를 NCBI Conserved Domain 프로그램을이용하여분석한결과이다. - 9 -
도면 도면 1 도면 2-10 -
도면 3 도면 4-11 -
도면 5 서열목록 <110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> MERCAPTO-PYRUVATE SULFERTRANSFERASE 1 PROTEIN OF Dendranthema grandiflorum cv. Dodram AND A GENE ENCODING THE SAME <130> P09-045 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cst1-f Primer <400> 1 atatggcttc gacccttttc 20-12 -
<210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cst1-r Primer <400> 2 tcatgaagaa gaatcttccc c 21 <210> 3 <211> 1140 <212> DNA <213> Dendranthema grandiflorum cv. Dodram <220> <221> CDS <222> (1)..(1137) <400> 3 atg gct tcg acc ctt ttc tcc aga act ttt cta gct gca acc cac cgc 48 Met Ala Ser Thr Leu Phe Ser Arg Thr Phe Leu Ala Ala Thr His Arg 1 5 10 15 ttg atc act cct tct ctt ctc cct caa aag ccc ctt cat ctc gcc tcc 96 Leu Ile Thr Pro Ser Leu Leu Pro Gln Lys Pro Leu His Leu Ala Ser 20 25 30 ttt ctt act agg aga ggg ttc ttc tct cag tta ggc tct tac tct aca 144 Phe Leu Thr Arg Arg Gly Phe Phe Ser Gln Leu Gly Ser Tyr Ser Thr 35 40 45 gct tat aga tca gct cga gct atg gct tct gct gga att ggg gca aga 192 Ala Tyr Arg Ser Ala Arg Ala Met Ala Ser Ala Gly Ile Gly Ala Arg 50 55 60 gca ggc tac tcg act tca tca tct gta gca act aat gag cct gtt gtt 240 Ala Gly Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Val Ala Thr Asn Glu Pro Val Val 65 70 75 80-13 -
tct gtt gat tgg ctt cat tct aat ctt aga gag cct gat ttg aag gtt 288 Ser Val Asp Trp Leu His Ser Asn Leu Arg Glu Pro Asp Leu Lys Val 85 90 95 ttg gat gcg tca tgg tac atg cca gat gag cag agg aat ccc atc caa 336 Leu Asp Ala Ser Trp Tyr Met Pro Asp Glu Gln Arg Asn Pro Ile Gln 100 105 110 gaa tat cag gtt gct cat att cct ggt gct ctc ttc ttt gat ttg gat 384 Glu Tyr Gln Val Ala His Ile Pro Gly Ala Leu Phe Phe Asp Leu Asp 115 120 125 gga ata tca gat cga tca aca agt ttg cca cat atg ttg ccg tct gag 432 Gly Ile Ser Asp Arg Ser Thr Ser Leu Pro His Met Leu Pro Ser Glu 130 135 140 gaa gct ttt gct gct ggt tgc tct gct ctt gga att gag aac aag gat 480 Glu Ala Phe Ala Ala Gly Cys Ser Ala Leu Gly Ile Glu Asn Lys Asp 145 150 155 160 gga gtg gtt gtt tat gat gca aag ggt gtc ttt agt gca gct cgt gta 528 Gly Val Val Val Tyr Asp Ala Lys Gly Val Phe Ser Ala Ala Arg Val 165 170 175 tgg tgg acg ctc cga gtt ttt gga cat gac aaa gtg tgg gtg ctt gat 576 Trp Trp Thr Leu Arg Val Phe Gly His Asp Lys Val Trp Val Leu Asp 180 185 190 gga gga cta ccg aga tgg cgt gct tca gga tat gat gtt gaa tct agt 624 Gly Gly Leu Pro Arg Trp Arg Ala Ser Gly Tyr Asp Val Glu Ser Ser 195 200 205 gca tca ggt gat gct att ttg aaa gcc agt gct gca agt gag gct att 672 Ala Ser Gly Asp Ala Ile Leu Lys Ala Ser Ala Ala Ser Glu Ala Ile 210 215 220 gag aaa atc tat caa gga cat tcc gtg agt cca ata acc ttt cag acc 720 Glu Lys Ile Tyr Gln Gly His Ser Val Ser Pro Ile Thr Phe Gln Thr 225 230 235 240 aag ttc cag cca cat cta gtg tgg aca ctt gat cag gtg aag aac aat 768 Lys Phe Gln Pro His Leu Val Trp Thr Leu Asp Gln Val Lys Asn Asn 245 250 255 atg gag gat caa aca tat caa cac gta gac gca cgt tcc aag gcc agg 816-14 -
Met Glu Asp Gln Thr Tyr Gln His Val Asp Ala Arg Ser Lys Ala Arg 260 265 270 ttt gat ggt aca gct cca gaa ccc cgt aag gga ata aga agt ggt cat 864 Phe Asp Gly Thr Ala Pro Glu Pro Arg Lys Gly Ile Arg Ser Gly His 275 280 285 atc cct gga agc aag tgt gtc cct tat cct cag ttg ttt gat tct gct 912 Ile Pro Gly Ser Lys Cys Val Pro Tyr Pro Gln Leu Phe Asp Ser Ala 290 295 300 tct caa aca ctg tta cca gca gaa gac ctg aag aaa cgg ttt gaa caa 960 Ser Gln Thr Leu Leu Pro Ala Glu Asp Leu Lys Lys Arg Phe Glu Gln 305 310 315 320 gaa gag atc tca ttg gac aag cct att ctg gcc tcg tgt ggc act ggt 1008 Glu Glu Ile Ser Leu Asp Lys Pro Ile Leu Ala Ser Cys Gly Thr Gly 325 330 335 gta aca gct tgc atc ctg gca atg ggg ctt cac cga gtg gga aaa act 1056 Val Thr Ala Cys Ile Leu Ala Met Gly Leu His Arg Val Gly Lys Thr 340 345 350 gat gtg cca gtc tac gat ggc tcg tgg act gaa tgg gca aca caa cca 1104 Asp Val Pro Val Tyr Asp Gly Ser Trp Thr Glu Trp Ala Thr Gln Pro 355 360 365 gac ttg cct atg gag ggg gaa gat tct tct tca tga 1140 Asp Leu Pro Met Glu Gly Glu Asp Ser Ser Ser 370 375 <210> 4 <211> 379 <212> PRT <213> Dendranthema grandiflorum cv. Dodram <400> 4 Met Ala Ser Thr Leu Phe Ser Arg Thr Phe Leu Ala Ala Thr His Arg 1 5 10 15 Leu Ile Thr Pro Ser Leu Leu Pro Gln Lys Pro Leu His Leu Ala Ser 20 25 30 Phe Leu Thr Arg Arg Gly Phe Phe Ser Gln Leu Gly Ser Tyr Ser Thr - 15 -
35 40 45 Ala Tyr Arg Ser Ala Arg Ala Met Ala Ser Ala Gly Ile Gly Ala Arg 50 55 60 Ala Gly Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Val Ala Thr Asn Glu Pro Val Val 65 70 75 80 Ser Val Asp Trp Leu His Ser Asn Leu Arg Glu Pro Asp Leu Lys Val 85 90 95 Leu Asp Ala Ser Trp Tyr Met Pro Asp Glu Gln Arg Asn Pro Ile Gln 100 105 110 Glu Tyr Gln Val Ala His Ile Pro Gly Ala Leu Phe Phe Asp Leu Asp 115 120 125 Gly Ile Ser Asp Arg Ser Thr Ser Leu Pro His Met Leu Pro Ser Glu 130 135 140 Glu Ala Phe Ala Ala Gly Cys Ser Ala Leu Gly Ile Glu Asn Lys Asp 145 150 155 160 Gly Val Val Val Tyr Asp Ala Lys Gly Val Phe Ser Ala Ala Arg Val 165 170 175 Trp Trp Thr Leu Arg Val Phe Gly His Asp Lys Val Trp Val Leu Asp 180 185 190 Gly Gly Leu Pro Arg Trp Arg Ala Ser Gly Tyr Asp Val Glu Ser Ser 195 200 205 Ala Ser Gly Asp Ala Ile Leu Lys Ala Ser Ala Ala Ser Glu Ala Ile 210 215 220 Glu Lys Ile Tyr Gln Gly His Ser Val Ser Pro Ile Thr Phe Gln Thr 225 230 235 240 Lys Phe Gln Pro His Leu Val Trp Thr Leu Asp Gln Val Lys Asn Asn 245 250 255 Met Glu Asp Gln Thr Tyr Gln His Val Asp Ala Arg Ser Lys Ala Arg 260 265 270-16 -
Phe Asp Gly Thr Ala Pro Glu Pro Arg Lys Gly Ile Arg Ser Gly His 275 280 285 Ile Pro Gly Ser Lys Cys Val Pro Tyr Pro Gln Leu Phe Asp Ser Ala 290 295 300 Ser Gln Thr Leu Leu Pro Ala Glu Asp Leu Lys Lys Arg Phe Glu Gln 305 310 315 320 Glu Glu Ile Ser Leu Asp Lys Pro Ile Leu Ala Ser Cys Gly Thr Gly 325 330 335 Val Thr Ala Cys Ile Leu Ala Met Gly Leu His Arg Val Gly Lys Thr 340 345 350 Asp Val Pro Val Tyr Asp Gly Ser Trp Thr Glu Trp Ala Thr Gln Pro 355 360 365 Asp Leu Pro Met Glu Gly Glu Asp Ser Ser Ser 370 375-17 -