(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2015년01월14일 (11) 등록번호 10-1481902 (24) 등록일자 2015년01월06일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C07K 14/435 (2006.01) A61K 38/17 (2006.01) A61P 31/04 (2006.01) A61P 31/10 (2006.01) (21) 출원번호 10-2013-0081166 (22) 출원일자 2013 년 07 월 10 일 심사청구일자 (56) 선행기술조사문헌 2013 년 07 월 10 일 Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2010 Jul,156(3):168-73. Epub 2010 Mar 27. PLoS One. 2013,8(1):e53343. Epub 2013 Jan 4. 기술이전희망 : 기술양도, 실시권허여, 기술지도 (73) 특허권자 동아대학교산학협력단 부산광역시사하구낙동대로 550 번길 37, 동아대학교내 ( 하단동 ) (72) 발명자 진병래 경기도수원시영통구태장로 35 번길 64, 101 동 1204 호 ( 망포동, 극동아파트 ) 김보연 부산광역시사하구하신번영로 400, 102 동 2502 호 ( 하단동, SK view 아파트 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 위병갑전체청구항수 : 총 12 항심사관 : 이현지 (54) 발명의명칭항균및항진균활성을갖는신규폴리펩티드 (57) 요약 본발명은항균및항진균활성을갖는신규폴리펩티드, 이를코딩하는핵산서열, 상기폴리펩티드를유효성분으로함유하는항균및항진균용조성물에관한것이다. 본발명에따른항균및항진균활성을갖는신규폴리펩티드는서브틸리신 A 및프로테아제 K 에대한저해활성을통해세균, 병원성곰팡이균과같은미생물의성장을효과적으로억제할수있는바, 의약품, 세정제, 식물병방제제, 코팅제또는화장품과같은다양한분야의소재로서유용하게사용될수있다. 대표도 - 도 3-1 -
(72) 발명자 이광식 부산광역시사하구하신번영로 400, 102 동 2502 호 ( 하단동, SK view 아파트 ) 이정관 부산광역시사하구하신번영로 400, 106 동 1304 호 ( 하단동, SK 뷰 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 PJ009031022013 부처명 농촌진흥청 연구관리전문기관 동물유전체육종사업단 연구사업명 차세대바이오그린21사업 연구과제명 토종벌독관련유전자원의발굴및기능분석 기여율 1/1 주관기관 동아대학교산학협력단 연구기간 2012.05.01 ~ 2014.12.31-2 -
특허청구의범위청구항 1 서열번호 1로표시되는아미노산서열로이루어지며, 항균및항진균활성을갖는폴리펩티드. 청구항 2 제1항에있어서, 상기폴리펩티드는토종벌 (Apis cerana) 로부터유래된카잘타입세린프로테아제저해단백질의카잘도메인인것을특징으로하는항균및항진균활성을갖는폴리펩티드. 청구항 3 제1항에있어서, 상기폴리펩티드는서브틸리신 A 및프로테아제 K에대한저해활성을통해미생물의성장을억제하는효과를갖는것을특징으로하는항균및항진균활성을갖는폴리펩티드. 청구항 4 제3항에있어서, 상기폴리펩티드가성장을억제할수있는미생물은바실러스서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스튜린기엔시스 (Bacillus thuringiensis), 보베리아바시아나 (beauveria bassiana) 및푸사리움그래미니아룸 (Fusarium graminearum) 로이루어진군으로부터선택된 1종이상인것을특징으로하는항균및항진균활성을갖는폴리펩티드. 청구항 5 제1항의폴리펩티드를코딩하는핵산분자. 청구항 6 제5항에있어서, 상기핵산분자는서열번호 2로표시되는폴리뉴클레오티드로이루어진것을특징으로하는핵산분자. 청구항 7 서열번호 1로표시되는아미노산서열로이루어진폴리펩티드 ; 또는상기폴리펩티드를암호화하는폴리뉴클레오티드가포함된발현벡터를유효성분으로함유하는항균및항진균용조성물. 청구항 8 제7항에있어서, 상기조성물은서브틸리신 A 및프로테아제 K에대한저해활성을통해세균및곰팡이병원균의성장을억제하는효과를갖는것을특징으로하는항균및항진균용조성물. 청구항 9 제8항에있어서, 상기세균은바실러스서브틸리스 (Bacillus subtilis) 또는바실러스튜린기엔시스 (Bacillus thuringiensis) 인것을특징으로하는항균및항진균용조성물. 청구항 10-3 -
제8항에있어서, 상기곰팡이병원균은보베리아바시아나 (beauveria bassiana) 또는푸사리움그래미니아룸 (Fusarium graminearum) 인것을특징으로하는항균및항진균용조성물. 청구항 11 제7항에있어서, 상기폴리뉴클레오티드는서열번호 2로표시되는염기서열로이루어진것을특징으로하는항균및항진균용조성물. 청구항 12 제7항내지제11항중어느한항에있어서, 상기조성물은의약품, 세정제, 식물병방제제, 코팅제또는화장품에적용하는것을특징으로하는항균및항진균용조성물. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은항균및항진균활성을갖는신규폴리펩티드, 이를코딩하는핵산서열, 상기폴리펩티드를유효성 분으로함유하는항균및항진균용조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] 배경기술벌 (bees) 은동물이나곤충과같은침략자또는포식자로부터그들의집단을보호하기위해효과적인방어수단인벌독 (bee venom) 을가지고있다. 벌독은여러종류의독액단백질또는펩티드로구성되어있으며, 멜리친 (melittin)[gauldie et al., Eur. J. Biochem., 61:369-376(1976)], 포스포리파제 A2 (PLA2)[Six & Dennis, Biochim. Biophys. Acta 1488:1-19(2000)], 아파민 (apamin)[banks et al., Nature 282:415-417(1979)], 하이알루로니다아제 (hyaluronidase)[kreil, Protein Sci., 4:1666-1669(1995)], 세린프로테아제 (serine protease)[winningham KM et al. J Allergy Clin Immunol 2004;114:928-33] 등이알려져있다. 특히, 다양한생물에서발견되는세린프로테아제와세린프로테아제저해단백질은면역반응, 보체활성, 지혈, 혈액응고기작, 섬유소용해기능, 그리고염증제거와같은다양한생리작용을가지기때문에많은관심속에있다. 세린프로테아제저해단백질은플라스민 (plasmin), 트립신 (trypsin), 키모트립신 (chymotrypsin), 엘라스타제 (elastase) 또는프로테아제 (protease) 등의활성을저해한다고알려져있으며, 이러한이유로인하여새로운약제개발의잠재성과함께많은주목을받고있다. 곤충과다른절지동물유래세린프로테아제저해단백질은다기능적인역할을보이는데, 거미유래세린프로테아제저해단백질은트립신이나키모트립신, 플라스민및엘라스타제저해효과뿐만아니라칼륨이온저해기능이알려져있으며, 또한호박벌 (Bombus ignitus) 에서쿠니츠타입세린프로테아제저해단백질의항섬유소용해기능이보고된바있다 [Yuan CH et al., PLoS ONE. 3:e3414(2008); Wan H et al., PLoS ONE 8:e53343(2013), Comp. Biochem. Physiol. B 165:36-41(2013), Choo YM et al. PLoS ONE 7:e10393(2012)]. 한편, 세린프로테아제저해단백질의하나인, 카잘-타입세린프로테아제저해단백질 (Kazal-type serine protease inhibitor, KTSPI) 은세개의이황화결합구조와함께하나또는여러개의카잘도메인 (Kazal domain) 을가진다. 현재까지알려진카잘-타입프로테아제저해단백질은흡혈곤충, 모기, 누에, 초파리, 메뚜기및딱정벌레등의곤충유래인것으로보고되었으나 ([Friedrich et al., J. Biol. Chem. 22:16216-16222(1993); Mende et al., Eur. J. Biochem. 266:583-590(1999), Insect Biochem. Mol. Biol. 34:971-979(2004)], [Watanabe et al., Biochimie 92:933-939(2010), Biochimie 93:618-623(2011)], [Gandhe et al., BMC Genomics 7:184(2006); Zheng et al., Comp. Biochem. Physiol. B 146:234-240(2007)], [Niimi et al., Eur. J. Biochem. 266:282-292(1999)], [Brillard-Bourdet et al., Biochem. J. 400:467-476(2006)], [Horita et al., J. Biol. Chem. 285:30150-30158(2010)]), 아직까지벌유래카잘-타입프로테아제저해단백질의기능에대해서는보고된바가 - 4 -
없다. [0007] 이에본발명자들은동양종꿀벌인토종벌 (Apis cerana) 유래카잘-타입세린프로테아제저해단백질을코딩하는 cdna 유전자를최초로클로닝하였으며, 상기 cdna 중카잘도메인을암호화하는폴리뉴클레오타이드를벡터에삽인후곤충세포주에도입하여생산한재조합단백질이서브틸리신 A 및프로테아제 K의활성을저해함과동시에, 그람양성균과식물병원성및곤충병원성곰팡이에항균및항진균효과가우수함을확인함으로써, 본발명을완성하게되었다. 선행기술문헌 [0008] 특허문헌 ( 특허문헌 0001) 한국공개특허제 10-2013-0049382 호 발명의내용 [0009] [0010] [0011] 해결하려는과제따라서본발명의목적은항균및항진균활성을갖는신규폴리펩티드를제공하는것이다. 본발명의다른목적은상기폴리펩티드를코딩하는핵산분자를제공하는것이다. 본발명의또다른목적은상기폴리펩티드를유효성분으로함유하는항균및항진균용조성물을제공하는것이다. [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] 과제의해결수단상기와같은본발명의목적을달성하기위해서, 본발명은서열번호 1로표시되는아미노산서열로이루어지며, 항균및항진균활성을갖는폴리펩티드를제공한다. 본발명의일실시예에있어서, 상기폴리펩티드는토종벌 (Apis cerana) 로부터유래된카잘타입세린프로테아제저해단백질의카잘도메인 (Kazal domain) 일수있다. 본발명의일실시예에있어서, 상기폴리펩티드는서브틸리신 A 및프로테아제 K에대한저해활성을통해미생물의성장을억제하는효과를가질수있다. 본발명의일실시예에있어서, 상기폴리펩티드가성장을억제할수있는미생물은바실러스서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스튜린기엔시스 (Bacillus thuringiensis), 보베리아바시아나 (beauveria bassiana) 및푸사리움그래미니아룸 (Fusarium graminearum) 로이루어진군으로부터선택된 1종이상일수있다. 또한, 본발명은상기폴리펩티드를코딩하는핵산분자를제공한다. 본발명의일실시예에있어서, 상기핵산분자는서열번호 2로표시되는폴리뉴클레오티드로이루어질수있다. 또한, 본발명은서열번호 1로표시되는아미노산서열로이루어진폴리펩티드 ; 또는상기폴리펩티드를암호화하는폴리뉴클레오티드가포함된발현벡터를유효성분으로함유하는항균및항진균용조성물을제공한다. 본발명의일실시예에있어서, 상기조성물은서브틸리신 A 및프로테아제 K에대한저해활성을통해세균및곰팡이병원균의성장을억제하는효과를가질수있다. 본발명의일실시예에있어서, 상기세균은바실러스서브틸리스 (Bacillus subtilis) 또는바실러스튜린기엔시스 (Bacillus thuringiensis) 일수있다. 본발명의일실시예에있어서, 상기곰팡이병원균은보베리아바시아나 (beauveria bassiana) 또는푸사리움그래미니아룸 (Fusarium graminearum) 일수있다. 본발명의일실시예에있어서, 상기조성물은의약품, 세정제, 식물병방제제, 코팅제또는화장품에적용할수있다. - 5 -
[0023] 발명의효과본발명에따른항균및항진균활성을갖는신규폴리펩티드는서브틸리신 A 및프로테아제 K에대한저해활성을통해세균, 병원성곰팡이균과같은미생물의성장을효과적으로억제할수있는바, 의약품, 세정제, 식물병방제제, 코팅제또는화장품과같은다양한분야의소재로서유용하게사용될수있다. [0024] 도면의간단한설명도 1은본발명의토종벌유래카잘-타입세린프로테아제저해단백질과다른카잘-타입세린프로테아제저해단백질과상동성을나타낸것이다 [ 밑줄 : 카잘도메인 (Kazal domain) 부위 ; 별표 (asterisk): P1 영역 ; 검정색원 (solid circle): 보전된이황화결합을이루는시스테인잔기 ]. 도 2는본발명의토종벌유래카잘-타입세린프로테아제저해유전자의카잘도메인 (Kazal domain) 부위만을발현시킨재조합단백질의전기영동결과를나타낸사진이다. 도 3은본발명의재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna의카잘도메인 ) 의세균및곰팡이병원균에대한결합능을나타낸웨스턴블랏분석및공초점현미경사진이다. [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] 발명을실시하기위한구체적인내용하나의양태로서, 본발명은서열번호 1로표시되는아미노산서열또는이와 90% 이상의상동성을가지며, 항균및항진균활성을갖는신규폴리펩티드에관한것이다. " 카잘-타입세린프로테아제저해단백질 (Kazal-type serine protease inhibitor, KTSPI)" 는세개의이황화결합구조와함께하나또는여러개의카잘도메인 (Kazal domain) 을가진다. 상기와같은특성을갖는카잘-타입세린프로테아제저해단백질은흡혈곤충, 모기, 누에, 초파리, 메뚜기및딱정벌레에서그기능이보고되었으며, 이러한곤충유래의카잘-타입세린프로테아제저해단백질은키모트립신, 트립신, 플라스민, 트롬빈, 엘라스타제, 프로테아제등의활성을저해한다고알려져있다. 본발명자들은토종벌 (Apis cerana) 로부터카잘-타입세린프로테아제저해단백질을코딩하는 cdna 유전자를최초로클로닝하였으며, 그결과, 상기 cdna 유전자는 128개의아미노산을암호화하는 384개 ( 종결코돈포함 387 개 ) 의핵산서열로이루어져있음을확인할수있었다. 또한, 본발명의상기단백질은 56개의아미노산으로구성된 P1 영역과 6개의시스테인구조를포함한카잘도메인 (Kazal domain) 을가지는것을확인할수있었다. 본발명의상기유전자는토종벌에서처음분리된것으로아직까지그특징이보고되고있지아니한바, 상기유전자는 NCBI GenBank database에승인번호 KF219696 (cdna) 을 2013년 6월 11일에등록하였다. 본발명에서는상기 cdna 유전자의핵산서열및추정아미노산서열을각각서열번호 3 및서열번호 4로나타내었다. 한편, 본발명의항균및항진균활성을갖는신규폴리펩티드는, 이러한토종벌 (Apis cerana) 로부터유래된카잘-타입세린프로테아제저해단백질의카잘도메인 (Kazal domain) 에해당한다. 본발명에서는상기카잘도메인의아미노산서열및핵산서열을각각서열번호 1 및서열번호 2로나타내었다. 본발명자들은상기토종벌유래의신규카잘-타입세린프로테아제저해단백질의활성을검증하기위하여, 상기단백질의카잘도메인부분을암호화하는폴리뉴클레오티드를재조합벡터에삽입한후이를곤충세포주에도입하여재조합단백질을생산한다음, 이렇게생산된재조합단백질을이용서브틸리신 A 또는프로테아제 K 저해활성과항미생물활성을각각실험하였다. 그결과, 상기재조합단백질 ( 카잘도메인부분 ) 이서브틸리신 A 및프로테아제 K의활성을저해함과동시에, 그람양성균과식물병원성및곤충병원성곰팡이에항균및항진균효과를갖는것을확인하였다. 본발명에서항균및항진균활성을갖는신규폴리펩티드는, 야생형뿐만아니라 90% 이상의아미노산상동성을가지고효소활성을가지는기능적상동체를포함할수있다. 본발명에서용어 " 상동성 " 이란야생형 (wild type) 단백질의아미노산서열과의유사한정도를나타내기위한것으로서, 본발명의신규한폴리펩티드는서열번호 1의서열로정의되는야생형아미노산서열과 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱바람직하게는 95% 이상동일한아미노산서열을포함한다. 이러한상동성의비교는육안으로나구입이용이한비교프로그램을이용하여수행할수있다. 시판되는컴퓨터프로그램은 2개이상의서열간의상동성을백분율 (%) 로계산할수있으며, 상동성 (%) 은인접한서열에대해계산될수있다. - 6 -
[0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] 본기술분야의당업자라면이러한인위적인변형에의해 90% 이상의상동성이유지되고본발명에서효소활성을보유하는한균등한폴리펩티드임을쉽게이해할것이다. 본발명의신규한폴리펩티드는항균및항진균활성을보유하는한이들의아미노산서열변이체를포함할수있다. 여기서변이체란천연아미노산서열과하나이상의아미노산잔기가결실, 삽입, 비보전적또는보전적치환또는이들의조합에의하여상이한서열을가지는단백질 ( 폴리펩티드 ) 을의미한다. 이러한변이체는야생형과실질적으로동등한활성을갖는기능적상동체또는물리화학적성질을증가또는감소시키는변형을가지는폴리펩티드를포함한다. 바람직하게는폴리펩티드의물리화학적성질이변형된변이체이다. 예를들어, 온도, 수분, ph, 전해질, 환원당, 가압, 건조, 동결, 계면장력, 광선, 동결과해동의반복, 고농도조건등의물리적요인과산, 알카리, 중성염, 유기용매, 금속이온, 산화환원제, 프로티아제등의화학적요인의외부환경에대한구조적안정성이증대된변이체이다. 또한아미노산서열상의변이로효소활성이증대된변이체일수있다. 본발명의신규한폴리펩티드는토종벌 (Apis cerana) 유래의카잘-타입세린프로테아제저해단백질로부터직접분리하여제조하거나, 화학적으로합성하거나, 유전자재조합기술을이용하여얻을수도있다. 먼저, 본발명의신규한폴리펩티드는토종벌 (Apis cerana) 유래의카잘-타입세린프로테아제저해단백질로부터직접분리하여제조할수있다. 세포에함유된카잘-타입세린프로테아제저해단백질의분리및정제는많은공지방법에의해실시할수있다. 또한본발명의폴리펩티드는화학적으로합성할수있다. 화학적으로합성하여제조하는경우, 당분야에널리공지된폴리펩티드합성법을이용하여얻을수있다. 폴리펩티드는통상의단계적인액체또는고체상합성, 단편응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법을이용하여제조할수있다. 특히, 바람직한폴리펩티드의제조방법은고체상합성방법 (solid phase syntheses) 을이용하는것이다. 본발명의신규한폴리펩티드는보호된아미노산간의응축반응 (condensation reaction) 에의하여통상의고체상방법으로, C-말단으로부터시작하여그서열에따라순차적으로진행하면서합성할수있다. 응축반응후보호기및 C-말단아미노산이연결된담체를산분해 (acid decomposition) 또는아미놀리시스 (aminolysis) 와같은공지의방법에의해제거할수있다. 상기언급된폴리펩티드합성법은관련서적에상세히기술되어있다. 또한본발명의신규한폴리펩티드는유전자재조합기술을이용하여얻을수도있다. 유전자재조합기술을이용할경우, 본발명의신규한폴리펩티드를코딩하는폴리뉴클레오티드 ( 핵산 ) 를적절한발현벡터에삽입하고, 벡터를숙주세포로형질전환 ( 도입 ) 하여본발명의신규한폴리펩티드가발현되도록숙주세포를배양한뒤, 숙주세포로부터상기단백질을회수하는과정으로수득할수있다. 단백질은선택된숙주세포에서발현시킨후, 분리및정제를위해통상적인생화학분리기술, 예를들어단백질침전제에의한처리 ( 염석법 ), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체크로마토그래피 ( 겔여과 ), 흡착크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 친화도크로마토그래피등의각종크로마토그래피등을이용할수있으며, 통상적으로순도가높은단백질 ( 폴리펩티드 ) 을분리하기위하여이들을조합하여이용한다. 또다른양태에서, 본발명은상기항균및항진균활성을갖는폴리펩티드를코딩하는핵산분자에관한것이다. 본발명의상기핵산분자는바람직하게는서열번호 2로표시되는염기서열을가질수있으며, 이와 90% 이상의상동성을갖는핵산서열을포함할수있다. 본발명의핵산분자는이들과기능적으로동일한작용을수행하는이의작용성등가물을포함하는데, 상기작용성등가물은인위적인변형에의해뉴클레오타이드의일부염기서열이결실 (deletion), 치환 (substitution), 삽입 (insertion) 또는이들의조합 (combination) 에의해변형된변이체 (variants) 또는동일한작용을수행하는상기핵산분자의작용성단편 (fragments) 을포함할수있다. 본기술분야의당업자라면이러한인위적인변형에의해 70% 이상상동성이유지되는염기서열이본발명에서목적하는유전자발현을위한항균및항진균활성활성을보유하는한, 본발명의핵산분자와균등물로서본발명의권리범위에속함을쉽게이해할수있을것이다. 또다른양태로서, 본발명은상기핵산분자를포함하는벡터에관한것이다. 본발명의신규항균및항진균활성을갖는폴리펩티드를코딩하는핵산분자는이를발현하는벡터에의해제 - 7 -
공되어단백질로발현될수있다. [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] [0057] 본발명에서용어 " 벡터 " 는적합한숙주내에서목적유전자를발현시킬수있도록적합한조절서열에작동가능하게연결된유전자의염기서열을함유하는 DNA 제조물을의미하는것으로, 상기조절서열은전사를개시할수있는프로모터, 그러한전사를조절하기위한임의의오퍼레이터서열, 적합한 mrna 리보좀결합부위를코딩하는서열, 및전사및해독의종결을조절하는서열을포함한다. 본발명에서 " 작동가능하게연결된 (operably linked)" 는일반적기능을수행하도록핵산발현조절서열과목적하는단백질을코딩하는핵산서열이기능적으로연결되어있는것을말한다. 예를들어프로모터와단백질또는 RNA를코딩하는핵산서열이작동가능하게연결되어코딩서열의발현에영향을미칠수있다. 재조합벡터와의작동적연결은당해기술분야에서잘알려진유전자재조합기술을이용하여제조할수있으며, 부위-특이적 DNA 절단및연결은당해기술분야에서일반적으로알려진효소등을사용한다. 본발명의벡터는프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화시그널및인핸서같은발현조절엘리먼트, 분비시그널등을포함할수있으며, 목적에따라다양하게제조될수있다. 개시코돈및종결코돈은유전자작제물이투여되었을때개체에서반드시작용을나타내야하며코딩서열과인프레임 (in frame) 에있어야한다. 본발명에서사용되는벡터는숙주중에서복제가능한것이면특별히한정되지않으며당업계에알려진임의의벡터를이용할수있다. 예컨대비바이러스성벡터또는바이러스성벡터를사용할수있다. 상기비바이러스성벡터로는플라스미드가대표적이다. 플라스미드발현벡터는사람에게사용할수있는 FDA의승인된유전자전달방법으로사람세포에직접적으로플라스미드 DNA를전달하는방법으로, 플라스미드 DNA는바이러스벡터와는달리균질하게정제될수있는장점이있다. 본발명에서사용할수있는플라스미드발현벡터로는당업계에공지된포유동물발현플라스미드를사용할수있다. 예를들면, 이에한정되지는않으나 prk5( 유럽특허제307,247호 ), psv16b( 국제특허공개제91/08291호 ) 및 pvl1392(pharmingen) 등이대표적이다. 또한본발명의발현벡터로바이러스벡터를사용할수있다. 바이러스벡터는예를들어, 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노바이러스-연관바이러스, 허피스바이러스 (herpes virus) 및아비폭스바이러스 (avipoxvirus) 등이포함된다. 바이러스벡터는다음의기준을충족해야한다 : (1) 목적하는세포에감염할수있어야하며이에따라적합한숙주범위를갖는바이러스벡터가선택되어야하고, (2) 전달된유전자가적절한기간동안세포에서보존되고발현될수있어야하며, (3) 벡터가숙주에안전해야한다. 상기레트로바이러스벡터는바이러스유전자가모두제거되었거나또는변경되어비-바이러스단백질이바이러스벡터에의해감염된세포내에서만들어지도록제작된것이다. 유전자요법을위한레트로바이러스벡터의주요장점은다량의유전자를복제세포내에전달하고, 세포 DNA 내로전달된유전자를정확하게통합하며, 유전자형질감염후연속적인감염이유발되지않는것이다. FDA에서인증받은레트로바이러스벡터는 PA317 암포트로픽레트로바이러스패키지세포를이용하여제조한것이다 (Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec. Cell Biol., 6:2895-2902, 1986). 비-레트로바이러스벡터로는상기에서언급한바와같은아데노바이러스가있다. 아데노바이러스의주요장점은다량의 DNA 단편 (36kb 게놈 ) 을운반하고, 매우높은역가로비-복제세포를감염시킬수있는능력이있다는것이다. 또한, 허피스바이러스도사람유전자요법을위해유용하게사용될수있다 (Wolfe, J.H., et al., Nature Genetics,1:379-384, 1992). 이외에도, 공지된적절한바이러스벡터를사용할수있다. 세포내로유전자전달을위해사용할수있는다른바이러스벡터로는뮤린백혈병바이러스 (MLV), JC, SV40, 폴리오마, 엡스타인-바르바이러스파필로마바이러스, 백시니아, 폴리오바이러스, 헤르페스바이러스, 신드비스바이러스, 렌티바이러스, 기타사람및동물바이러스가포함될수있다. 본발명에따른상기발현벡터는당업계에공지된방법을사용하여세포에도입할수있다. 예를들어이에한정되지는않으나, 일시적형질감염 (transient transfection), 미세주사, 형질도입 (transduction), 세포융합, 칼슘포스페이트침전법, 리포좀매개된형질감염 (liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된형질감염 (DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된형질감염 (polybrene-mediated transfection), 전기침공법 (electropora tion), 유전자총 (gene gun) 및세포내로핵산을유입시키기위한다른공지의방법에의해세포내로도입할수있다 (Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988). 또한, 본발명의벡터는선별마커 (selection market) 를추가로포함할수있다. 선별마커는벡터로형질전환 - 8 -
된세포를선별, 즉, 목적유전자의삽입여부를확인하기위한것으로, 약물내성, 영양요구성, 세포독성제에대한내성또는표면단백질의발현과같은선택가능표현형을부여하는마커들이사용될수있다. 선택제 (selective agent) 가처리된환경에서는선별마커를발현하는세포만생존하거나, 다른표현형질을나타내므로, 형질전환된세포를선별할수있다. [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] 또다른양태로서, 본발명은상기벡터로형질전환된형질전환체를제공하는것이다. 본발명의형질전환체는벡터를프로모터가작용할수있는양태로숙주세포내에도입시키는것에의해구축될수있다. 본발명에서용어 " 형질전환 " 은 DNA를숙주로도입하여 DNA가염색체외인자로서또는염색체통합완성에의해복제가능하게되는것을의미한다. 형질전환은핵산분자를유기체, 세포, 조직또는기관에도입하는어떤방법도포함되며, 당분야에서공지된바와같이숙주세포에따라적합한표준기술을선택하여수행할수있다. 이런방법에는전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 법, DEAE-덱스트란법, 양이온리포좀법, 및초산리튬-DMSO법등이포함될수있으나이들로제한되는것은아니다. 발현벡터로형질전환되는숙주세포에따라서단백질의발현량과수식등이다르게나타나므로, 목적에가장적합한숙주세포를선택하여사용하면된다. 본발명에서이용될수있는숙주세포로는곤충세포주, 효모, 진균, 세균또는조류가가능하며, 예를들면, 곤충세포주 Sf9(Spodoptera frugiperda 9) 바람직하나, 이에제한되는것은아니다. 본발명의하기실시예에서는서열번호 2로표시되는염기서열로이루어진폴리뉴클레오티드를포함하는곤충베큘로바이러스전이벡터 (pbac8) 를곤충세포주 Sf9(Spodoptera frugiperda 9) 에공-형질감염 (cotransfection) 시키고 5일후에배양액을수거하여토종벌유래의카잘-타입세린프로테아제저해단백질중카잘도메인 (Kazal domain) 을발현하는재조합베큘로바이러스를제작하였다. 재조합베큘로바이러스는 Sf9 세포주에서증식하였고, 본발명의재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna의카잘도메인 ) 은 MagneHisTM protein purification system (Promega사, 미국 ) 을이용하여분리하였다. 또다른양태로서, 본발명은서열번호 1로표시되는아미노산서열로이루어진폴리펩티드 ; 또는상기폴리펩티드를암호화하는폴리뉴클레오티드가포함된발현벡터를유효성분으로함유하는항균및항진균용조성물에관한것이다. 본발명에서, 서열번호 1로표시되는아미노산서열로이루어진폴리펩티드야생형뿐만아니라 90% 이상의아미노산상동성을가지고동일한항균및항진균활성을가지는기능적상동체를포함할수있다. 또한, 본발명의상기폴리펩티드를암호화하는폴리뉴클레오티드는자연에서분리되거나인위적으로합성또는변형된것일수있는데, 서열번호 1로표시되는아미노산서열로이루어진폴리펩티드를암호화하는염기서열은하나이상의핵산염기가치환, 결실또는삽입에의해변형될수있으며, 이러한변형에의해발현된단백질은이의생물학적작용성에유의한변화를포함하지않아야한다. 상기한변형은이종의상동성유전자로의변형을포함한다. 따라서상기폴리펩티드를암호화하는폴리뉴클레오티드는서열번호 2의염기서열로표시되는것을특징으로하되, 이에한정되지않고상기의핵산서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다바람직하게는 90% 이상의상동성을갖는염기서열로표시되는것을특징으로한다. 바람직하게는, 본발명의서열번호 2로표시되는폴리뉴클레오티드는이를발현하는벡터에작동가능하게연결된재조합발현벡터의형태로제공될수있다. 상기발현벡터로는이에한정되지않지만바람직하게는당업계에공지된플라스미드, 파지, 코스미드, 바이러스벡터또는기타매개체를의미한다. 벡터는자가복제하거나숙주 DNA에통합될수있다. 본발명의조성물은항균및항진균용도 ( 효과 ) 를가지므로의약품, 세정제, 식물병방제제, 코팅제또는화장품과같은제품의소재로서유용하게사용될수있다. 먼저, 본발명의조성물은항균및항진균활성이우수한폴리펩티드또는이를암호화하는폴리뉴클레오티드가포함된발현벡터를유효성분으로함유하므로, 수의학적또는인간을대상으로하는항균치료제또는예방제로서의용도를위하여사용될수있다. 예를들어, 일반적으로항균성폴리펩티드는치료용세포 ( 세포치료제 ) 의생착관련수용체및부착분자의기능을향상시킬수있기때문에, 이러한항균성폴리펩티드를이용할경우임플란트되거나이식된세포치료제의목표장기 ( 골수, 손상조직, 림프절, 종양조직등 ) 에생착되는비율을현저 - 9 -
히증가시킬수있다. 따라서본발명의조성물은유효성분으로서항균성폴리펩티드를포함하고있는바, 생체 내생착기능을증가시키는용도로세포치료제를사용하여치료되는다양한질병의예방및치료에유용하게사 용될수있다. [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] 또한, 본발명의조성물은항균및항진균활성이우수한폴리펩티드또는이를암호화하는폴리뉴클레오티드가포함된발현벡터를유효성분으로함유하므로, 식물을대상으로하는병원균방제제, 해충기피제, 비료제로서의용도를위하여사용될수있다. 예를들어, 본발명의조성물을식물세포또는식물종자에접촉또는처리함으로써식물세포나식물종자표면에존재하는병원균을현저하게억제시킬수있다. 특히, 본발명의조성물은유효성분으로서항균성폴리펩티드를포함하고있으며, 상기폴리펩티드는그람양성균으로서바실러스서브틸리스 (Bacillus subtilis) 또는바실러스튜린기엔시스 (Bacillus thuringiensis) 의성장을억제함과동시에, 식물병원균으로널리알려진푸사리움그래미니아룸 (Fusarium graminearum) 의성장을효과적으로억제할수있음을실험으로입증하였는바, 본발명의조성물은생물학적식물병방제제로유용하게사용될수있다. 또한, 본발명의조성물은항균및항진균활성이우수한폴리펩티드또는이를암호화하는폴리뉴클레오티드가포함된발현벡터를유효성분으로함유하므로, 항균이필요한물품에코팅제의용도를위하여사용될수있다. 예를들어, 본발명의조성물을항균도마, 항균치약용기, 항균칫솔갑, 항균화장품용기, 항균쓰레기통, 항균대야, 항균컵, 항균병, 항균쌀통, 항균김치통, 항균바가지, 항균포장지, 항균식품저장용기, 항균박스, 항균양념통, 항균물통, 항균음료용병, 항균부직포, 항균섬유, 항균행주, 항균걸레, 항균수세미, 항균이불커버, 항균침대커버, 항균식탁매트, 항균변기시트커버, 항균불고기판, 항균기저귀, 항균생리대, 항균마스크, 항균붕대, 항균밴드, 항균의료물품, 항균과일포장지, 항균꽃포장지, 항균벽지, 항균장판및항균타일등과같은물품을코팅할수있는코팅용항균조성물의소재로서유용하게사용될수있다. 또한, 본발명의조성물은항균및항진균활성을더욱증진시키기위해, 현재까지알려진다른항균물질과병용하여사용할수도있다. 본발명의이점및특징, 그리고그것들을달성하는방법은상세하게후술되어있는실시예들을참조하면명확해질것이다. 이하, 본발명을실시예에의해상세히설명하기로한다. 그러나이들실시예들은본발명을구체적으로설명하기위한것으로서, 본발명의범위가이들실시예에한정되는것은아니다. [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] [0079] < 실시예 1> 토종벌유래의카잘타입세린프로테아제저해단백질을코딩하는유전자클로닝토종벌유래의카잘타입세린프로테아제저해단백질을코딩하는유전자를클로닝하기위하여, 토종벌 (Apis cerana) 충체로부터추출한 poly(a) 및 mrna를이용하여상용화된키트인 Uni-ZAP XR 벡터와 Gigapack III Gold Packing Extract(Stratagene 사, 미국 ) 에의해 cdna 라이브러리를제작하고, 유전자발현꼬리표 (expressed sequence tags, ESTs) 를분석하였다. DNA 추출은상용화키트인 Wizard mini-preparation 키트 (Promega 사, 미국 ) 를사용하였다. DNA 염기서열은자동화 DNA 서열분석기 (Applied Biosystems 사, 미국 ) 로서열을분석하였다. 그염기서열들은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 의 BLAST 프로그램에의해비교하였다. 밝혀진일부서열을기준으로 DNA Walking SpeedupTM Premix Kit(Seegene, Korea) 를이용하여 5 말단및 3 말단의염기서열을모두밝혔다. 그결과, 토종벌유래의카잘타입세린프로테아제저해단백질을코딩하는유전자는 128개의아미노산을암호화하는 384개 ( 종결코돈포함 387개 ) 의핵산서열로이루어져있음을확인할수있었고 ( 도 1 참조 ), 본발명자들은분석한핵산서열이종래규명된바없는신규한핵산서열임을확인하였으며, 이를 NCBI GENE BANK database 에등재하였다 (KF219696). 또한, 상기규명한유전자의핵산서열및아미노산서열은각각서열번호 3 및서열번호 4로나타내었다. 또한, 상기서열의 BLAST 프로그램에의해분석결과를도 1에나타내었다. 도 1에나타난바와같이, 본발명에서규명한토종벌유래의카잘타입세린프로테아제저해단백질은기존벌로부터보고된카잘타입세린프로테아제저해단백질들과비교적높은상동성을보이며, 3개의이황화결합 - 10 -
(disulfide bond) 을이루는시스테인 (cysteine) 잔기및 P1 영역이잘보전되어있음을확인할수있었다. [0080] [0081] [0082] [0083] < 실시예 2> 본발명의토종벌유래의카잘타입세린프로테아제저해단백질을발현하는재조합벡터의제조및곤충세포주에서발현확인본발명의토종벌유래카잘타입세린프로테아제저해단백질을발현하기위하여, 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna의카잘도메인부분을곤충베큘로바이러스 (Autographa californica nucleopolyhedrovirus) 전이벡터 pbac8(clontech 사, 미국 ) 에삽입한뒤, 전이벡터 (500 ng) 와비에이시고자 (bacgoza) 바이러스 DNA (100 ng) [Je et al., Biotechnol. Lett., 23:575-582(2001)] 를함께리포펙틴 (Lipofectin; Clonetech 사 ) 을이용하여곤충세포주 Sf9(Spodoptera frugiperda 9) 에공-형질감염 (cotransfection) 하였다. 5일후배양액을수거하여토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna의카잘도메인부분을발현하는재조합베큘로바이러스를제작하였다. 재조합베큘로바이러스는 Sf9 세포주에서증식하였고, 재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna의카잘도메인 ) 은 MagneHisTM protein purification system (Promega 사, 미국 ) 을이용하여분리하였다. 분리된재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna의카잘도메인 ) 의전기영동사진은도 2에나타내었다. 그결과도 2에나타난바와같이, 재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna의카잘도메인 ) 은전기영동상에서 10 kda의분자량을갖는단백질임을확인할수있었다. [0084] [0085] [0086] < 실시예 3> 본발명의재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna의카잘도메인 ) 의활성검증본실험에서는실시예 1을통해규명된본발명의토종벌유래카잘타입세린프로테아제저해단백질의특성을검증하기위하여, 상기실시예 2를통해생산된재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna의카잘도메인 ) 의다양한효소에대한저해활성을측정하고, 미생물결합능및항미생물활성을확인하였다. [0087] [0088] [0089] [0090] <3-1> 서브틸리신 A 또는프로테아제 K 저해활성확인세린프로테아제를저해하는단백질로서의특성을검증하기위해, 세린프로테아제의트립신 (trypsin), 키모트립신 (chymotrypsin), 엘라스타제 (elastase), 트롬빈 (thrombin), 조직플라스미노겐활성인자 (tissue plasminogen activator, tpa), 펙터 Xa(factor Xa), 서브틸리신 A 및프로테아제 K를저해하는지확인하기위하여 20 nm의트립신 (Sigma 사, 미국 ), 알파키모트립신 (Sigma 사, 미국 ), 엘라스타제 (Sigma 사, 미국 ), 트롬빈 (Sigma 사, 미국 ), 조직플라스미노겐활성인자 (Sigma 사, 미국 ), 펙터 Xa(Novagen 사, 독일 ), 서브틸리신 A(Sigma 사, 미국 ) 또는프로테아제 K(Sigma 사, 미국 ) 에 AcKTSPI 재조합단백질을여러농도별로 20 mm CaCl2 와 0.05% Triton X-100를포함하는 100 mm Tris-HCl(pH 8.0) 완충액에서처리하였다. 37 에서 30 분간기질없이반응시킨후, 트립신기질 0.5 mm BApNA(Sigma 사, 미국 ), 키모트립신, 서브틸리신 A 및프로테아제 K 기질 0.5 mm Suc-AAPF-pNA(Sigma 사, 미국 ), 엘라스타제기질 0.5 mm S4760(Sigma 사, 미국 ), 트롬빈기질 S2238(Chromogenix 사, 스웨덴 ), 조직플라스미노겐활성인자기질 0.5 mm S2288(Chromogenix 사, 스웨덴 ) 과펙터 Xa 기질 0.5 mm S2222(Chromogenix 사, 스웨덴 ) 를첨가하여 37 에서 30분동안반응시켰다. 그결과본발명의재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna의카잘도메인 ) 은트립신, 알파키모트립신, 엘라스타제, 트롬빈, 조직플라스미노겐활성인자와펙터 Xa에는저해활성을나타내지않았지만, 세균및곰팡이유래세린프로테아제인서브틸리신 A 및프로테아제 K에저해활성을보이는것으로나타났다. 자세하게는, 하기표 1에서나타낸바와같이본발명의재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna의카잘도메인 ) 은서브틸리신 A에서 50% 저해농도 IC 50 은 67.03 nm이고프로테아제 K의 IC 50 은 91.53 nm 인것을확인할수있었다. - 11 -
[0091] 표 1 본발명의재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna 의카잘도메인 ) 의서브틸리신 A 및 프로테아제 K 에대한저해활성 효소 농도 (nm) a IC 50 (nm) Ratio b Ki(nM) 서브틸리신 A 10 67.03 0.67 83.39 프로테아제 K 10 91.53 0.92 127.28 [0092] [0093] a: 본실험에서사용된효소들의농도 b: 효소농도에대한 IC 50 의몰비 [0094] [0095] [0096] <3-2> 미생물결합능확인본발명의재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna의카잘도메인 ) 의항미생물제로서의사용가능성을확인하기위하여, 미생물에대한상기단백질의결합능을확인하였다. 자세하게는, Bacillus subtilis, B. thuringiensis, 및 Escherichia coli를 Luria-Bertani (LB) 배지에그리고 Beauveria bassiana 및 Fusarium graminearum는 potato dextrose broth에서배양하였다. 배양액이 OD 600 에서 0.4에이르렀을때, 세균및곰팡이를수거하여 PBS를이용하여세척하고 0.8 μg의본발명의재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna의카잘도메인 ) 을포함한 40 μl에미생물과혼합하여상온에서 10분간반응시켰다. 10분후, 원심분리하여상등액과미생물을분리시키고미생물을다시 PBS로세척하여각각의미생물과상등액을 15% SDS-PAGE를실시하고 His-tag 항체를이용하여웨스턴블랏분석을실시하였다. [0097] 그결과도 3 에서나타낸바와같이, 본발명의재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna 의카잘도메인 ) 은 E. coli 를제외한세균 B. subtilis 및 B. thuringiensis, 그리고곰팡이 B. bassiana 및 F. graminearum 에결합하는것을확인할수있었다. [0098] [0099] <3-3> 항미생물활성확인본발명의재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna의카잘도메인 ) 의항미생물활성을확인하기위하여, 그람양성균 B. thuringiensis 및 B. subtilis와그람음성균 E. coli에대한성장억제활성을조사하였다. 96-웰플레이트에다양한농도의본발명의재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해 단백질 cdna의카잘도메인 ) 과세균 (10 5 cfu/ml) 200 μl를혼합하여 37 에서 24시간동안 220 rpm의속도로진탕배양하고 595 nm에서세균성장저해활성을측정하였다. 거기에더하여곰팡이에대한항진균활성을조사하기위하여, 2 10 4 conidia/ml 200 μl의 B. bassiana 및 F. graminearum를다양한농도의본발명의재조합단백질과혼합하여 22 에서 48시간동안 220 rpm의속도로진탕배양하고 595 nm에서곰팡이성장저해활성을측정하였다. [0100] 그결과하기표 2 에서나타낸바와같이, 그람음성균인 E. coli 에서는성장억제활성을확인할수없었으나, 그람양성균인 B. thuringiensis 및 B. subtilis 의 50% 성장억제활성 MIC 50 은각각 53.33 과 43.83 로나타났 으며곤충병원균인 B. bassiana 및식물병원균인 F. graminearum 의 50% 성장억제활성 IC 50 은각각 12.44 및 92.15 로확인되었다. [0101] 표 2 본발명의재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna 의카잘도메인 ) 의세균및곰팡이 - 12 -
에대한항균활성 종류 미생물 억제활성 그람-양성세균 B. subtilis 43.83 MIC 50 (μm) B. thuringiensis 53.33 MIC 50 (μm) 그람 - 음성세균 E. coli ND 곰팡이 B. bassiana 12.44 IC 50 (μm) F. graminearum 92.15 IC 50 (μm) [0102] ND, not detected. [0103] 상기의결과, 본발명의재조합단백질 ( 토종벌유래의세린프로테아제저해단백질 cdna 의카잘도메인 ) 은서 브틸리신 A 및프로테아제 K 에대한저해활성이우수함을확인하였고, 이를이용하여미생물의성장을효과적 으로억제할수있음을확인하였다. [0104] 이제까지본발명에대하여그바람직한실시예들을중심으로살펴보았다. 본발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진자는본발명이본발명의본질적인특성에서벗어나지않는범위에서변형된형태로구현될수있음을이해할수있을것이다. 그러므로개시된실시예들은한정적인관점이아니라설명적인관점에서고려되어야한다. 본발명의범위는전술한설명이아니라특허청구범위에나타나있으며, 그와동등한범위내에있는모든차이점은본발명에포함된것으로해석되어야할것이다. 도면 도면 1 도면 2-13 -
도면 3 서열목록 <110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> Novel polypeptide having antibacterial and antifungal activity <130> PN1306-207 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Novel kazal domain polypeptide <400> 1 Asp Gln Cys Val Ala Thr Cys Arg Thr Thr Pro Glu Tyr Asn Pro Val 1 5 10 15 Cys Gly Thr Asp Gln Ile Asp Tyr Lys Asn Pro Gly Gln Leu Ser Cys 20 25 30 Ala Ser Met Cys Gly Lys Asp Val Ser Leu Lys His Tyr Gly Arg Cys 35 40 45 Thr Thr Thr Lys Ile Arg Gly Arg 50 55-14 -
<210> 2 <211> 171 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Novel kazal domain polynucleotide <400> 2 gatcaatgtg ttgcaacatg tcggacgaca cccgaatata atcctgtatg tggaacagac 60 caaatcgact ataaaaatcc tgggcaacta agctgtgcat ctatgtgtgg aaaagatgtt 120 tcattaaaac attatggacg ttgcacgact acgaaaataa gaggaagata a 171 <210> 3 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Kazal-type serine protease inhibitor cdna sequence <400> 3 atgtggtttt ttctaatatt agctattgct gcgaatagga atgtaatcgc atttccacag 60 aatgacttga gcgataacaa tattgagatt caaacgctac ctaccacatt cgaagtagat 120 ggatttattt ttgatggacc agcaaataga ccattacggc aaacttccac aattataaca 180 actactacta cagcagctac agttgatcct caattcgatc aatgtgttgc aacatgtcgg 240 acgacacccg aatataatcc tgtatgtgga acagaccaaa tcgactataa aaatcctggg 300 caactaagct gtgcatctat gtgtggaaaa gatgtttcat taaaacatta tggacgttgc 360 acgactacga aaataagagg aagataa 387 <210> 4 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Kazal-type serine protease inhibitor amino acid sequence <400> 4 Met Trp Phe Phe Leu Ile Leu Ala Ile Ala Ala Asn Arg Asn Val Ile 1 5 10 15 Ala Phe Pro Gln Asn Asp Leu Ser Asp Asn Asn Ile Glu Ile Gln Thr 20 25 30-15 -
Leu Pro Thr Thr Phe Glu Val Asp Gly Phe Ile Phe Asp Gly Pro Ala 35 40 45 Asn Arg Pro Leu Arg Gln Thr Ser Thr Ile Ile Thr Thr Thr Thr Thr 50 55 60 Ala Ala Thr Val Asp Pro Gln Phe Asp Gln Cys Val Ala Thr Cys Arg 65 70 75 80 Thr Thr Pro Glu Tyr Asn Pro Val Cys Gly Thr Asp Gln Ile Asp Tyr 85 90 95 Lys Asn Pro Gly Gln Leu Ser Cys Ala Ser Met Cys Gly Lys Asp Val 100 105 110 Ser Leu Lys His Tyr Gly Arg Cys Thr Thr Thr Lys Ile Arg Gly Arg 115 120 125-16 -