(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2013-0074658 (43) 공개일자 2013년07월04일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A23L 1/212 (2006.01) A23L 1/30 (2006.01) A23L 3/44 (2006.01) (21) 출원번호 10-2011-0142823 (22) 출원일자 2011 년 12 월 26 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 11 항 2011 년 12 월 26 일 (71) 출원인 재단법인금산국제인삼약초연구소 충청남도금산군금산읍인삼광장로 25 (72) 발명자 도은수 서울특별시서대문구남가좌 2 동 376 현대아파트 105 동 1901 호 장준복 대구광역시남구대명역 4 길 14-1 ( 대명동 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 유환열 (54) 발명의명칭인삼또는홍삼의발효방법및이로부터제조된발효인삼또는홍삼 (57) 요약 본발명은인삼또는홍삼의발효방법및이로부터제조된발효인삼또는홍삼에관한것으로, 보다상세하게는피부직삼및홍삼을특정유효발효균으로발효시킴으로써긴존인삼과홍삼제품에비해다양한생리활성을갖는진세노사이드대사체의함량이증가되면서고온처리가없어유효성분의손실이나원치않는성분의변성을초래하지않으며전체적인공정또한간편하여생산성을향상시킬수있는인삼과홍삼의발효방법및이로부터제조된발효인삼과홍삼에관한것이다. 본발명에의하면인삼또는홍삼의생리활성물질인진세노사이드대사체의함량이일정수준이상증가된발효인삼또는발효홍삼을제조할수있는새로운방법을제공할수있다. 대표도 - 도 1-1 -
(72) 발명자 이건희 경기도포천시가산면우금 1 리 373 번지 지윤선 대전광역시동구용전동일흥아트 A 동 102 호 표미경 충청남도금산군금산읍인삼약초로 29-3, 방원한방타운 1507 호 유지현 대전광역시동구가오동 435 번지 301 호 유남희 대전광역시서구조달청길 70, 대운빌라 301 호 ( 도마동 ) 성낙술 충청남도금산군금산읍비호산로 57, 101 동 508 호 ( 삼호아파트 ) - 2 -
특허청구의범위청구항 1 홍삼또는인삼추출액을제조하는단계 ; 상기홍삼또는인삼추출액을여과하고난후, 80~90 에서 25~45분간살균하는살균단계 ; 상기살균단계에서살균된홍삼또는인삼추출액을냉각한후, 미리배양하여준비된발효균주를 3~5%(v/v) 첨가하여 25 내지 30 에서 3 ~ 7일간발효시키는단계 ; 상기발효균주가배양된발효추출액을여과한후, 45 수용액상에서회전진공농축기 (rotary vaccum evaporator) 를이용하여농축하는농축단계 ; 및상기농축단계의농축물을초저온냉동고 (deep freezer) 에 10~15시간보관후, 꺼내어동결건조기로동결건조하는단계를포함하여이루어지는것을특징으로하는인삼또는홍삼의발효방법. 청구항 2 제 1 항에있어서, 상기홍삼또는인삼추출액은홍삼및인삼을증류수에 20~50 g/l포함하도록첨가후, 85~90 온도조건하에 48~72시간교반하여, 이것을거즈로 1차여과하고, 그 1차여과액을여과지를이용하여 2차여과한열수추출액이거나, 또는홍삼및인삼을 70% 에탄올에희석비율 1~2:10(w/v) 로하여 70~75 온도조건하에 20~24시간침출한다음, 이것을거즈로 1차여과하고, 그 1차여과액을여과지를이용하여 2차여과한알콜침출액인것을특징으로하는인삼또는홍삼의발효방법. 청구항 3 제 1 항에있어서, 상기발효균주는사카로미세스세레비제 (Saccharomyces cerevisiae KCCM 50549) 또는아스페르질러스오리제 (Aspergillus oryzae KCCM 60241) 중어느하나인것을특징으로하는인삼또는홍삼의발효방법. 청구항 4 제 1 또는 2 항에있어서, 상기인삼또는홍삼추출액은인삼또는홍삼을미분쇄한다음그분쇄된인삼또는홍삼분말을열수추출또는알콜추출한것을특징으로하는인삼또는홍삼의발효방법. 청구항 5 제 1 항에있어서, 상기농축단계의농축물은고형분함량 38~52% 인것을특징으로하는인삼또는홍삼의발효방법. 청구항 6 제 1 항에있어서, 상기살균처리단계후, 증류수 100 중량부에대하여인삼또는홍삼추출액 5~6 중량부, 조효소 0.7~1.0 중량부를 - 3 -
혼합한추출액을 45~55 의온도조건하에 2~2.5 시간효소반응시키고, 반응이완료된추출액을 90~95 에서 5~15 분간살균한후, 상온에서서서히냉각시키는효소반응단계를더포함하는것을특징으로하는인삼또는홍삼 의발효방법. 청구항 7 제 6 항에있어서, 상기효소는 α-허브자임 (α-herbzyme) 3 g에증류수 100 ml를가하고 50 에서 2시간침출한다음거즈로 1차여과한후얻어진여과액을여과지로 2차여과시킨여액을조효소액으로사용하는것을특징으로하는인삼또는홍삼의발효방법. 청구항 8 청구항 1 내지 4 중에서선택된어느한항에의하여제조된발효인삼. 청구항 9 제 8 항에있어서, 상기발효인삼은진세노사이드대사체 Rg1 의함량이 16 ~ 21 mg /g 인것을특징으로하는발효 인삼. 청구항 10 청구항 1 내지 4 중에서선택된어느한항에의하여제조된발효홍삼. 청구항 11 제 10 항에있어서, 상기발효홍삼은진세노사이드대사체 Rg1 의함량이 4.3 ~ 5.5 mg /g 인것을특징으로하는발효홍삼. 명세서 [0001] 기술분야본발명은인삼또는홍삼의발효방법및이로부터제조된발효인삼또는홍삼에관한것으로, 보다상세하게는피부직삼및홍삼을특정유효발효균으로발효시킴으로써기존인삼과홍삼제품에비해다양한생리활성을갖는진세노사이드대사체의함량이증가되면서고온처리가없어유효성분의손실이나원치않는성분의변성을초래하지않으며전체적인공정또한간편하여생산성을향상시킬수있는인삼과홍삼의발효방법및이로부터제조된발효인삼과홍삼에관한것이다. [0002] [0003] 배경기술인삼은소련의과학자 C.A.meyer가 1843년에만병을치료한다는의미로학명을 Panax ginseng C.A.Meyer로명명된식물학적으로는오가과 (Araliaceae) 인삼속 (Panax) 에속하는식물로뿌리를약용으로이용하고있다. 이러한인삼은자연건강식품으로널리이용되고있으며, 약리효능의과학적입증과전통의학을임상을근거로인식과신뢰가높으며, 의약품및기능성식품으로그수요가증가하고있다. 한편, 세계시장에서의인삼점유율은 1990년 22.9% 에서 2002년에는 9.6% 로대폭감소하는등인삼종주국으로서의명성을점차잃어가고있는현실이며, 1996년이후부터인삼농축액, 인삼차등의백삼류제품의소비는꾸준 - 4 -
히감소하는반면농축홍삼류, 홍삼차류, 홍삼캡슐제품과같은홍삼가공제품의생산과소비는증가하고있는 실정이다. [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] 이에, 유용한미생물을이용하여수삼을발효하고, 미생물의당분해효소등을이용하여인삼사포닌 (ginsenoside) 을전환하여영양학적, 기능적가치를높이고자하는진세노사이드 (ginsenoside) 전환이가능한인삼발효미생물의선별에관한연구가진행된바있고 (Kim et al., 2007), 유산균을이용한발효인삼제조에가장적합한유산균주및최적공정을확립하여차후건강기능성식품소재로서의유산균발효인삼제품화가능성을조사한연구가수행된바있으며 (Park et al., 2006), 백삼, 홍삼과대비하여발효인삼의일반성분에대한성분특성에대한연구가보고된바있다 (Kong et al., 2008). 또한, 인삼을비롯한다양한소재들을활용하여발효하거나또는첨가하여식품의기능성강화, 관능적품질을향상시켜발효식품으로서개발하려는연구가시도되고있으며 (Kim and Han, 2005), 다양한미생물이존재하는사람의장내에서우세균으로분포하고체내유익균의성장을촉진하는생균활성제 (probiotics) 로서당류를발효하여젖산을생성하는세균인락토바실리 (Lactobacilli) 및비피도박테리움 (Bifidobacterium) 과같은유산균이보고된바있다 (Goldin,1998). 발효인삼은살아있는유용한미생물을프로바이오틱스 (probiotics) 으로공급할수있는장점과배당체구조인진세노사이드의당을분해진세노사이드의구조를전환하여일반수삼에서섭취할수있는사포닌보다고효율의사포닌을섭취할수있는장점이있다. 이러한발효인삼은미생물혹은효소를이용한발효를통하여특정성분을강화시키거나소화흡수가용이하도록가공한가공인삼으로서최근기능성식품으로서각광받고있다. 즉, 인삼의발효에가장우수한균주를선발 ( 수집 ) 하여발효를통하여효능을증진시키는새로운물질의분리나효능을증진시키고인체내흡수를최대화시킴으로써인삼의효과를최대화시킬수있도록제조공정을개발할필요가있으며, 선발및수집된발효균을이용하여고체및액체발효한인삼의이화학적특성을조사하여기능성의효과를검정하고향후임상생화학적효과를토대로하여기능성식품으로개발하는데필요한기초자료를확보할필요가있다. 또한, 발효인삼의표준화및발효인삼의제조공정표준화로제품의안정성을확보할수있는방법이필요하나, 지금까지발효인삼이나발효홍삼의제조방법에대한표준화된제조공정이확보되지않은실정이므로이에대한연구가시급히필요하다. 선행기술문헌 [0009] 특허문헌 ( 특허문헌 0001) 1. 대한민국등록특허공보제 10-0789678 호 " 김치유산균을이용한발효인삼또는발효홍삼의제 조방법 " ( 특허문헌 0002) 2. 대한민국등록특허공보제10-0935362호 " 발효인삼또는홍삼의제조방법 " ( 특허문헌 0003) 3. 대한민국등록특허공보제10-0945586호 " 상황버섯균사체로발효시켜다양한생리활성을갖는진세노사이드대사체를다량함유하는발효인삼또는발효홍삼의제조방법 " ( 특허문헌 0004) 4. 대한민국등록특허공보제10-0856790호 " 발효인삼또는홍삼의제조방법 " ( 특허문헌 0005) 5. 대한민국등록특허공보제10-0945587호 " 동충하초균사체로발효시켜다양한생리활성을갖는진세노사이드대사체를다량함유하는발효인삼또는발효홍삼의제조방법 " ( 특허문헌 0006) 6. 대한민국등록특허공보제10-0950978호 " 발효인삼및그제조방법 " 발명의내용 [0010] 해결하려는과제 본발명은, 인삼의또는홍삼의발효에우수한균주를선발 ( 수집 ) 하여발효를통하여효능을증진시키는새로운 물질의분리나효능을증진시키고인체내흡수를최대화시킴으로써인삼과홍삼의효능의최대화가가능한발효 - 5 -
방법을제공하는것을그해결과제로한다. [0011] 또한, 본발명은발효인삼또는발효홍삼의표준화및발효공정의표준화로발효인삼과발효홍삼제품의안정성 을확보할수있는발효방법을제공하는것을다른해결과제로한다. [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] 과제의해결수단상기한과제를해결한본발명의인삼또는홍삼의발효방법은홍삼또는인삼추출액을제조하는단계 ; 와상기홍삼또는인삼추출액을여과하고난후, 80~90 에서 25~45분간살균하는살균단계 ; 와상기살균단계에서살균된홍삼또는인삼추출액을냉각한후, 미리배양하여준비된발효균주를 3~5%(v/v) 첨가하여 25 내지 30 에서 3 ~ 7일간발효시키는단계 ; 와상기발효균주가배양된발효추출액을여과한후, 45 수용액상에서회전진공농축기 (rotary vaccum evaporator) 를이용하여농축하는농축단계 ; 및상기농축단계의농축물을초저온냉동고 (deep freezer) 에 10~15시간보관후, 꺼내어동결건조기로동결건조하는단계를포함하여이루어지는것을특징으로한다. 여기서, 상기홍삼또는인삼추출액은홍삼및인삼을증류수에 20~50 g/l포함하도록첨가후, 85~90 온도조건하에 48~72시간교반하여, 이것을거즈로 1차여과하고, 그 1차여과액을여과지를이용하여 2차여과한열수추출액이거나, 또는홍삼및인삼을 70% 에탄올에희석비율 1~2:10(w/v) 로하여 70~75 온도조건하에 20~24시간침출한다음, 이것을거즈로 1차여과하고, 그 1차여과액을여과지를이용하여 2차여과한알콜침출액인것을특징으로한다. 여기서, 상기발효균주는사카로미세스세레비제 (Saccharomyces cerevisiae KCCM 50549) 또는아스페르질러스오리제 (Aspergillus oryzae KCCM 60241) 중어느하나인것을특징으로한다. 여기서, 상기인삼또는홍삼추출액은인삼또는홍삼을미분쇄한다음그분쇄된인삼또는홍삼분말을열수추출또는알콜추출한것을특징으로한다. 여기서, 상기농축단계의농축물은고형분함량 38~52% 인것을특징으로한다. 여기서, 상기살균처리단계후, 증류수 100중량부에대하여인삼또는홍삼추출액 5~6중량부, 조효소 0.7~1.0중량부를혼합한추출액을 45~55 의온도조건하에 2~2.5시간효소반응시키고, 반응이완료된추출액을 90~95 에서 5~15분간살균한후, 상온에서서서히냉각시키는효소반응단계를더포함하는것을특징으로한다. 여기서, 상기효소는 α-허브자임 (α-herbzyme) 3 g에증류수 100 ml를가하고 50 에서 2시간침출한다음거즈로 1차여과한후얻어진여과액을여과지로 2차여과시킨여액을조효소액으로사용하는것을특징으로한다. [0019] [0020] 본발명에서는상기개시되는발효방법중어느하나의방법에의해제조되며인삼및홍삼의생리활성물질이진세노사이드대사체의함량이일정수준이상증가된것을특징으로하는발효인삼또는발효홍삼이제공된다. 이때, 상기발효인삼은진세노사이드대사체 Rg1의함량이 16~21/g인것을특징으로하며, 상기발효홍삼은 4.3 ~ 5.5/g의함량을가지는것을특징으로한다. [0021] [0022] [0023] 발명의효과본발명에의하면, 선발및수집된발효균을이용하여고체및액체발효한인삼의이화학적특성을조사하여기능성의효과를검정하고향후임상생화학적효과를토대로하여기능성식품으로개발하는데필요한기초자료로활용할수있는효과를기대할수있다. 또한본발명에의하면, 모든계층의소비자가만족할수있는인삼류의신제품및신소재개념의제품개발에필요한자료를제공할수있는효과를기대할수있다. 또한, 본발명에의하면발효기술의발달, 발효기기의대량생산등에따른인삼의부가가치증대와 2차적인산업발달을가능하게하여생산기반이열악한인삼산업계의변화를가져올수있는부가적인효과를기대할수 - 6 -
있다. [0024] [0025] 또한, 본발명에의하면, 발효인삼의표준화및발효인삼의제조공정표준화로제품의안정성을확보할수있는발효방법을제공할수있다. 또한, 본발명의방법은발효인삼을식품재료로하여제품이있음에도불구하고곧바로체내흡수가가능하고여러가지약리활성을가진발효인삼제품을개발하여인삼의소비진작을유도하고아울러관련산업의발전을기할수있다. [0026] 도면의간단한설명 도 1 은본발명의인삼또는홍삼의발효방법의일예를나타낸블럭도이다. 도 2 및 3은본발명의방법에따라발효된인삼과홍삼의폴리페놀함량을측정한결과를나타낸그래프이다. 도 4 및 5는본발명의방법에따라발효된인삼과홍삼의플라보노이드함량을측정한결과를나타낸그래프이다. 도 6 및 7은본발명의방법에따라발효된인삼과홍삼의 DPPH radical 소거활성을측정한결과를나타낸그래프이다. 도 8 및 9는본발명의방법에따라발효된인삼과홍삼의 SOD 유사활성을측정한결과를나타낸그래프이다. 도 10 내지 15는본발명의방법에따라발효된인삼과홍삼의진세노사이드함량의변화를측정한결과를나타낸그래프이다. 도 16 은본발명의방법에따라발효된인삼과홍삼을투여한항당뇨유발흰쥐의체중변화를측정한결과를나타낸그래프이다. 도 17 은본발명의방법에따라발효된인삼과홍삼을투여한흰쥐의혈당의변화를측정한결과를나타낸그래프이다. 도 18 은본발명의방법에따라발효된인삼과홍삼을투여한흰쥐의혈청글루코스, 인슐린및 HbA1c 의함량변화를측정한결과를나타낸그래프이다. 도 19 는본발명의방법에따라발효된인삼과홍삼을투여한흰쥐의인삼및발효인삼의혈청중성지방, 총 cholesterol 및 HDL cholesterol 함량의변화를측정한결과를나타낸그래프이다. 도 20 은본발명의방법에따라발효된인삼의진세노사이드함량의변화를나타낸 HPLC측정그래프이다. [0027] [0028] [0029] [0030] 발명을실시하기위한구체적인내용이하, 본발명을보다상세히설명하기로한다. 본발명은인삼또는홍삼의발효방법및이로부터제조된발효인삼또는홍삼에관한것으로, 본발명에서는피부직삼및홍삼을특정유효발효균으로발효시킴으로써기존인삼과홍삼제품에비해다양한생리활성을갖는진세노사이드대사체의함량이증가되면서고온처리가없어유효성분의손실이나원치않는성분의변성을초래하지않으며전체적인공정또한간편하여생산성을향상시킬수있는인삼과홍삼의발효방법및이로부터제조된발효인삼과홍삼을제공하고자한다. 본발명에따른인삼또는홍삼의발효방법의일예는첨부도면도 1에도시된바와같이, 홍삼또는인삼추출액을제조하는단계 (S10); 와상기홍삼또는인삼추출액을여과하고난후, 80~90 에서 25~45분간살균하는살균단계 (S20); 와상기살균단계에서살균된홍삼또는인삼추출액을냉각한후, 미리배양하여준비된발효균주를 3~5%(v/v) 첨가하여 25 내지 30 에서 3 ~ 7일간발효시키는단계 (S30); 와상기발효균주가배양된발효추출액을여과한후, 45 수용액상에서회전진공농축기 (rotary vaccum evaporator) 를이용하여농축하는농축단계 (S40); 및상기농축단계의농축물을초저온냉동고 (deep freezer) 에 10~15시간보관후, 꺼내어동결건조기로동결건조하는단계 (S50) 를포함하여이루어진다. 이때, 상기홍삼또는인삼추출액은열수추출법을이용한열수추출액또는알콜침출법을이용한알콜침출액일수있으며, 보다바람직하게는홍삼및인삼을증류수에 20~50 g/l포함하도록첨가후, 85~90 온도조건하에 - 7 -
48~72시간교반하여, 이것을거즈로 1차여과하고, 그 1차여과액을여과지를이용하여 2차여과한열수추출액이거나, 또는홍삼및인삼을 70% 에탄올에희석비율 1~2:10(w/v) 로하여 70~75 온도조건하에 20~24시간침출한다음, 이것을거즈로 1차여과하고, 그 1차여과액을여과지를이용하여 2차여과한알콜침출액을제조하여사용하는것이다. [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] 또한, 상기인삼및홍삼추출액은준비된인삼또는홍삼을충분히건조한다음그건조인삼및홍삼을미분쇄여인삼또는홍삼분말을준비하고, 분쇄된인삼분말또는홍삼분말을열수추출또는알콜추출한것을사용할수있다. 본발명에따르면, 사기발효단계에서사용되는발효균주는사카로미세스세레비제 (Saccharomyces cerevisiae KCCM 50549) 또는아스페르질러스오리제 (Aspergillus oryzae KCCM 60241) 중어느하나를사용하며, 보다바람직하게는아스페르질러스오리제 (Aspergillus oryzae KCCM 60241) 를사용하는것이좋다. 본발명에따르면, 상기농축단계에서얻어지는농축액은인삼또는홍삼의고형분함량 38~52% 가되도록농축하는것이바람직하다. 본발명에따르면, 상기살균처리단계 (S20) 후, 증류수 100중량부에대하여인삼또는홍삼추출액 5~6중량부, 조효소 0.7~1.0중량부를혼합한추출액을준비하고, 상기추출액을 45~55 의온도조건하에 2~2.5시간효소반응시키고, 반응이완료된추출액을 90~95 에서 5~15분간살균한후, 상온에서서서히냉각시키는효소반응단계를더포함할수있다. 여기서, 상기효소는식품공전에서규정하는식품의제조에적합한효소라면어느것을사용하여도무방하며, 보다바람직하게는 α-허브자임 (α-herbzyme) 3 g에증류수 100 ml를가하고 50 에서 2시간침출한다음거즈로 1차여과한후얻어진여과액을여과지로 2차여과시킨여액을조효소액으로사용하는것이좋다. 이상에서설명된바와같은본발명에따른발효방법에따라인삼및홍삼의생리활성물질이진세노사이드대사체의함량이일정수준이상증가된발효인삼및발효홍삼을얻을수있으며, 상기발효인삼및발효홍삼은모든계층의소비자가만족할수있는인삼류의신제품및신소재개념의제품개발에필요한재료로사용되어질수있다. 특히, 상기발효인삼과발효홍삼은인삼과홍삼의진세노사이드대사체인 Rg1, Rg3, Rd, Rg5의함량이일정수준이상증가된다. 특히, 발효인삼의경우진세노사이드대사체 Rg1의함량이 16~21/g 정도의증대된함량을가지며, 상기발효홍삼은진세노사이드대사체 Rg1의함량이 4.3 ~ 5.5/g으로증대된함량을가지게된다. 이러한함량의증가는발효전인삼또는홍삼대비발효인삼은약 62~67% 의함량이증대된것이고, 발효홍삼은 14.5 ~ 31.7% 의함량이증대된것이다. 이러한결과는하기에기술되는실험방법의결과에서알수있다. [0039] 이하에서는바람직한실험방법을통해본발명을보다구체적으로설명하겠는바, 하기의실험예및그에따른 실험결과로본발명이한정되는것은아니며, 본발명을범위를벗어나지않는범위내에서얼마든지변형가능 한것이다. [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [ 실험방법 ] 가. 발효균주및재료발효에사용된균주는 Saccharomyces cerevisiae KCCM 50549(SA), L. delbrueckii subsp. bulgaricus KCCM 35463(LD), Aspergillus niger KCCM 60381(AN), A. oryzae KCCM 60241(AO) 등 4개균주를한국미생물보존센터에서분양받아사용하였다. 인삼은충남금산군에서생산된피부직삼이며, 홍삼은상기인삼을통상의홍삼제조방법에따라제조된것을준비하여사용하였다. 나. 인삼발효 1) 홍삼액의조제 - 8 -
[0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] 액체발효를위한홍삼농축액은다음과같이제조하였다. 홍삼과증류수를희석비율을 50, 35, 20 g/l (5.0, 3.5 and 2.0%) 로각각만든후 85 에서 3일동안교반하였다. 이것을거즈로 1차여과후여과지 (Whatman No 2.) 를이용하여 2차여과한다음 80 에서 30분간살균하여액체발효액으로사용하였다. 2) 피부직삼추출액의조제피부직삼을분말화한다음액체발효에사용하였다. 액체발효를위한추출액은다음과같이제조하였다. 피부직삼을분말화시킨다음 70% EtOH을용매로피부직삼분말과용매의희석비율을 1:10(W/V) 로하여 75 에서 24시간동안침출하였다. 이것을거즈로 1차여과후여과지 (Whatman No 2.) 를이용하여 2차여과한다음 45 수욕상에서 rotary vaccum evaporator로농축후농축액을 80 에서 30분간살균하여액체발효농축액으로사용하였다. 3) 조효소의조제 α-herbzyme 3 g에증류수 100 ml를가하고 50 에서 2시간침출한다음거즈로 1차거른후여과지로여과시킨여액을조효소액으로사용하였다. 상기 α-herbzyme은한국효소주식회사에서소맥피 (100%) 를원재료로하여개발한한방발효제 ( 식품첨가물 ) 이다. 4) 발효 홍삼농축액의발효 4-1) 홍삼 5.0%, 3.5%, 2.0% 농축액으로각각만든후 95 에서 10분간살균후실온에서서서히식힌다음미리활성화시킨종의발효균주 L. delbrueckii subsp. bulgaricus KCCM 35463, Saccharomyces cerevisiae KCCM 50549, Aspergillus niger KCCM 60381, A. oryzae KCCM 60241등 4개균주을각각 4% 씩넣은후 L. delbrueckii subsp. bulgaricus KCCM 35463는 37, S.cerevisiae KCCM 50549 30 에서, Aspergillus niger KCCM 60381와 A. oryzae KCCM 60241는 25 에서 3, 5, 7일동안각각배양하였다. 배양후배양액을여과한후 45 수욕상에서 rotary vaccum evaporator를이용하여농축후 -45 deep freezer에 12시간두었다가 freeze dryer에넣고동결건조하였다. 4-2) 상기홍삼농축액 50 ml와조효소 7 ml를증류수 993 ml에넣어서피부직삼농축액농도를 5% 로만든후 50 에서 2시간효소반응시켰다. 이것을 95 에서 10분간살균후실온에서서서히식힌것을제외하고는상기방법과동일하게농축액을발효시켜준비하였다. 피부직삼농축액의발효피부직삼농축액 50 ml와조효소 7 ml를증류수 993 ml에넣어서피부직삼농축액농도를 5% 로만든후 50 에서 2시간효소반응시켰다. 이것을 95 에서 10분간살균후실온에서서서히식힌다음미리활성화시킨 2종의발효균주 S. cerevisiae KCCM 50549, A. oryzae KCCM 60241을각각 4% 씩넣은후 S. cerevisiae KCCM 50549 30 에서, A. oryzae KCCM 60241 25 에서 3, 5, 7일동안각각배양하였다. 배양후배양액을여과한후 45 수욕상에서 rotary vaccum evaporator를이용하여농축후 -45 deep freezer에 12시간두었다가 freeze dryer에넣고동결건조하였다. 5) 당도, ph 측정당도측정은인삼과발효인삼추출액을 0.3% 로조정한다음디지털당도계 (Refractometer PAL-1, Atago Co., Ltd, Japan) 를이용하여측정하였으며, ph는 ph meter(schott, Swiss) 로직접측정하였다. 6) 항산화활성 Total polyphenol 총폴리페놀함량은 Folin-Denis법 (Folin and Denis, 1912) 을응용하여측정하였다. 방법으로는시료추출물 1mg을 95% 에탄올 1mL에용해시키고 Folin-Ciocalteau 1mL를첨가하여 27 수욕조에서혼합한다. 5분정도경과후 Na 2 CO 3 포화용액 1mL를가하여혼합하고실온에서 1시간동안방치하고 UV/VIS spectrophotometer (Cary 500,Varian, USA) 를사용하여 725 nm에서흡광도를측정하였다. 이때, tannic acid 를이용한표준곡선은최종농 도가 0, 12.25, 25, 50, 100 μg /ml 이되도록작성하여 725 nm에서흡광도를측정하여작성하였다. - 9 -
[0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] DPPH free radical 소거활성측정시료추출물을 Choi 등의방법 (2003) 에의한수소전자공여능에의해항산화활성을측정하였다. 여러농도의시료를에탄올에용해하여, 900μl의 DPPH 용액 (100μm과각시료 100μl를혼합하여교반하였다. 이혼합시료를암소에서 30분간반응시킨후 517nm에서흡광도를측정하였다. 수소전자공여능은각실험을 3회반복하여평균을낸다음대조구에대한흡광도의감소정도를다음식에의하여계산하였다. An = (A0-A) / A0 100 An : DPPH radical 소거능에대한항산화활성 (%) A0 : 시료가첨가되지않은 DPPH 용액의흡광도 A : 반응용액중의 DPPH와시료의반응흡광도 [0069] [0070] Total flavonoid 시료중총플라보노이드함량은 Zhishen 등 (1999) 이개발한분광분석법을이용하여측정하였다. 즉, 증류수 4 ml 가들어있는시험관에시료 1 ml 을가하고 5 분이경과한다음 5% NaNO 2 0.3 ml 와 10% AlCl 3 0.3 ml 를차례로 가한다. 대조군은시료대신증류수 1 ml 을가한다. 시작시간으로부터 6 분이경과한시간에 1 M NaOH 2mL 을가 하고증류수를추가로가하여 10 ml 으로만든다음, 골고루섞었다. 분홍색을띄는시료를 510nm 파장에서흡광 도를측정하여 L 당 catechin equivalent(ce)mg 으로환산하여플라보노이드함량을표시하였다. [0071] [0072] SOD 유사활성측정 SOD 유사활성측정은 Marklund 와 Marklund(1974) 의방법에따라과산화수소 (H 2 O 2 ) 로전환시키는반응을촉매하 는 pyrogallol의생성량을측정하여 SOD 유사활성으로나타냈다. 즉일정농도의시료 0.2 ml에 ph 8.5로보정한 tris HCl buffer[50 mm tris (hydroxymethyl) amino-methane + 10 mm EDTA] 3 ml와 7.2mM pyrogallol 0.2 ml 를가하고 250 에서 10분간방치후, 1 N HCl 1 ml를가하여반응을정지시킨다. 반응액중산화된 pyrogallol 의양은 420 nm에서흡광도를측정하였다. SOD 유사활성은시료용액의첨가구와무첨가구사이의흡광도의차이를백분율 (%) 로나타냈다. [0073] [0074] [0075] 7) 발효전 후인삼의성분분석 총조사포닌분획제조시료약 3 g을물포화 n-부탄올 50 ml를가하여 1시간동안환류냉각기를부착하여 70~80 로 1시간가열추출한다음냉각한후여과하고, 남은잔사는물포화 n-부탄올 100 ml를가하여위와같은조작을한번더반복한후여과지는물포화 n-부탄올 10 ml로세척하였다. 여액과세액을 60 의수욕중에서감압농축한후, 증류수 50 ml로녹이고물포화 n-부탄올 50 ml로분액하여부탄올층을회수하고, 물층은 n-물포화부탄올로 2회더분액하여부탄올층을얻었다. 물포화 n-부탄올층을 70~80 의수욕중에서감압농축한후, 잔류물에에테르 50 ml를가하고 30분간탈지시킨후에테르를완전히제거한것을총조사포닌으로하였다. [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] Total saponin함량조사포닌이들어있는농축플라스크를 105 건조기에 2시간동안건조한후데시케이터에서 30분간방랭한다음무게를달아, 다음식에따라조사포닌함량을구하였다. 조사포닌 (mg/g) = (W1-W2)/S W1: 물포화 n-부탄올층을농축건조한후농축플라스크의무게 (mg) W2: 빈농축플라스크의항량무게 (mg) - 10 -
[0081] S: 시료채취량 (g) [0082] [0083] [0084] Ginsenoside 정량분석홍삼물추출물발효물은조사포닌 5 mg 메탄올 1 ml에녹여 2시간초음파추출후, 피부직삼및홍삼의에탄올추출물발효물은 10 mg을메탄올 1 ml에녹여 2 시간초음파추출후 0.45μm membrane filter로여과하여 HPLC (Waters. USA) 에서분석하였다. Ginsenoside 함량은 Waters-PAD (Waters 1525, detector 2998, USA) 를활용하여 water (A액) 와 acetonitrile (B액) 의다음과같은 gradient 조건으로 flow rate 1.0 ml/min으로 HPLC 분석하였다. 하기표 1은 HPLC에의한진세노사이드함량에대한용매조건 (Solvent condition for ginsenoside contents by HPLC) 을나타낸것이고, 표 2는 HPLC에의한진세노사이드함량에대한분석조건 (Analysis condition for ginsenoside contents by HPLC) 이다. 표 1 [0085] 표 2 [0086] [0087] [0088] [0089] 8) 항당뇨 ( 제1형당뇨 ) 효과검증 Wister rat의당뇨유발수컷 Wistar rat (5 주령, 몸무게 200 g) 을오리엔트바이오 ( 성남 ) 로부터구입하여표준사료 (Samtako) 를먹이면서온도 (23±2 ) 와습도 (50±10%) 가조절되는시설 (12 h light-and-dark cycle control system) 에서사 - 11 -
육하였다. 사육일주일후, overnight 금식한 Wister rat의복강에 1 ml STZ [60 mg/kg body weight; STZ 용액은 0.01 M citrate buffer (ph 4.5) 를사용하여사용전에제조하여 ice위에보관 ] 를주사하였다. STZ 주사 72 시간후에 Fasting blood glucose level을측정하여혈당이 200 mg/dl 이상인쥐를 STZ-induced rat으로선발하여실험에사용하였다. 실험중흰쥐는사료와물을자유롭게먹게하였다. [0090] 정상및당뇨유발흰쥐 (>200 mg/dl) 을 16 h 금식하고정상대조군 (Normal control; NC), streptozotocin 당뇨유발군 (STZ-control group; DC), 약물대조군 (glibenclamide 10 mg/kg; GBCM), 발효전인삼투여군 (Ginseng 100 mg/kg; G-100, 300 mg/kg; G-300), A. oryzae 발효인삼투여군 (Fermented ginseng with A. oryze 100 mg/kg; A-100, 300 mg/kg; A-300), S. cerevisiae 발효인삼투여군 (Fermented ginseng with S. cerevisiae 100 mg/kg; S-100, 300 mg/kg; S-300) 등 9개군으로각군당 8 마리씩분류하여 1일 1회 4주간경구투여를실시하였고, 1주일에 1번씩체중과혈당 ( 꼬리정맥채혈 ) 을측정하였다. 5주째에틸에테르마취후심장채혈하여다음과같은분석을실시하였다. [0091] [0092] Serum glucose 및 insulin 함량, hemoglobin A1c (HbAlc) 분석 Glucose는 glucose assay kit (Asanpham, Korea), insulin은 enzyme-linked immunosorbent assay kit (TMB) (AKRIN/010S, Japan) 로제조사가지시한방법에따라분석하였다. Glucose의흡광도는 540 nm에서 spectrophotometer를이용하여, insulin의흡광도는 450 nm에서 Anthos 2020 microplate autoreader를이용하여측정하였다. 전혈혈당측정은 blood glucose meter (Accu-Chek Go, Roche Diagnostics GmbH, Germany) 를사용하여측정하였다. HbAlc는혈액을채취하여한국동물의과학연구소 (KAMSI) 에의뢰하여실험하였다. [0093] 혈청 triglyceride, total cholesterol, HDL-cholesterol 측정 [0094] 혈청 triglyceride, total cholesterol, HDL-cholesterol 측정용 kit 사의지시한방법에따라측정하였다. (Asanpham, Korea) 를이용하여제조 [0095] 9) 통계분석 [0096] [0097] [0098] [0099] [0100] 모든실험결과는평균치와표준오차로계산하였고, 각평군치간차이에대한유의성은 SPSS 19.0 프로그램을이용하여 ANOVA를실시한후, Turkey multiple comparison test로각군의평균차이에대한사후검정을하였으며, 통계적유의성을 5% 수준에서분석하였다. [ 실험결과 ] 1. 당도및 ph측정 1) 당도발효홍삼과발효직삼을당도계를이용하여측정한결과는표 3과같다. 5%, 2% 발효홍삼에서발효전보다발효후조금씩당도가떨어지는것을볼수있었으며, 시간의경과에따른당도에는큰차이가없는것으로나타났다. - 12 -
표 3 [0101] [0102] [0103] 2) ph 발효홍삼과발효직삼을 ph를측정한결과, AN과 AO, LD는발효후 ph가상승하였는데, 이는 AN, AO, LD 발효균주가잘자라는 ph는중성 (ph 6.0-7.5) 이므로처음 ph보다상승하였고, SC 발효균주는약산성 (ph 4.0-4.5) 에서잘자라므로 ph가약간감소하였다 ( 표 4). 표 4 [0104] - 13 -
[0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] [0114] [0115] 2. 항산화활성 1) Total polyphenol 페놀화합물은식물계에널리분포하는 2차대사물질로수산기를가지는방향성화합물을총칭하는것이다. 대부분의폴리페놀화합물은세포벽다당류, 리그닌등과에스테르결합을이루고있거나중합체로존재하며, 수산기를통한수소공여와페놀고리구조의공명안정화에의하여항산화능을나타낸다. 즉, polyphenol류는체내의항산화체계와함께자유기로부터조직을보호해주는역할을한다 (Choi et al., 2003). 하기표 5와 6은본발명에따른홍삼발효물과피부직삼발효물의폴리페놀함량을나타낸것이며, 도 2 및 3은폴리페놀함량을나타낸그래프이다. 표 5 및도 2는홍삼발효물의폴리페놀함량을나타낸것이고, 표 6 및도 3은피부직삼발효물의폴리페놀함량을나타낸것이다. 홍삼발효물 ( 표5) 의폴리페놀함량은 A. oryzae는농도 2% 의경우발효시간이길어질수록함량이증가하여 7일간발효에서 77.81 mg/ml로나타냈으며, 5% 농도의경우는발효시간이길어질수록폴리페놀함량이감소하였다. A. niger의경우 2% 농도에서는발효시간변화에따른큰변화가없었으나 5% 의경우에는발효시간이길어지면폴리페놀함량이증가하여 7일발효에서 99.30 mg/ml를나타냈다. L. delbrueckiil 의경우 2% 농도에서는발효시간에따라함량이증가하는경향을나타냈으나, 5% 농도에서는발효시간에따른유의차가나타나지않았다. S. cerevisiae는 2% 농도에서는발효시간이길어짐에따라폴리페놀함량이감소하였고 3.5% 와 5% 농도에서는발효시간에따른폴리페놀함량의유의차는없었다. 발효하지않은대조구와비교하면 2% 농도에서 A. oryzae 는 5일이상의발효에서, A. niger는전발효물에서, L. delbrueckiil는 7일간발효물에서, S. cerevisiae는전발효물에서대조구보다높은폴리페놀함량을나타냈다. 3.5% 농도에서는 S. cerevisiae 발효물전체가높은함량을나타냈으며, 5% 에서는 A. niger 7일발효물은제외하고는대조구보다낮은폴리페놀함량을나타냈다. 표 6은 5% 의농도로발효한피부직삼의폴리페놀함량을나타낸것으로 A. oryzae 는발효기간에따른폴리페놀함량의유의차가없었으며, S. cerevisiae는발효기간이길어질수록폴리페놀함량이증가하여 7일발효물은 143.37 mg/ml로최고함량을나타냈다, 균주간에는 A. oryzae 보다 S. cerevisiae가높은폴리페놀함량을나타내발효에효과적인균주로나타났다. 홍삼과피부직삼을비교하면홍삼에비해피부직삼발효물이높은폴리페놀함량을나타냈다. 균주별로는 A. oryzae 보다 S. cerevisiae가높은폴리페놀함량을나타냈다. 식물계에널리분포되어있는페놀성물질은다양한구조와분자량을가지며, 이것들의페놀성수산기가단백질과같은거대분자와결합하여항산화, 항균, 항암등의생리기능을가지는것으로보고되고있다 (Jung et al., 2007). - 14 -
표 5 [0116] 표 6 [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] 2) Total flavonoid 식물에다량존재하는플라보노이드는항산화작용, 순화기질환예방, 항염, 항알러지, 항균, 항바이러스, 면역증강, 모세혈관강화등다양한기능성생리활성효과를보인다 (Kawaguchi et al., 1997). 하기표 7과도 4는홍삼발효물의플라보노이드함량을나타낸것이고, 표 8과도 5는피부직삼발효물의플라보노이드함량을나타낸것이다. 하기표 7 및도 4의홍삼발효물에서대조군의플라보노이드함량은농도가높아질수록함량이낮아진반면 S. cerevisiae균발효홍삼은 3.5% 에서가장높은함량을나타냈으며, 발효시간이길어질수록높은함량을나타냈다. 균주별로는 A. oryzae, A. niger, L. delbrueckii 모두 5% 보다는 2% 농도에서높은플라보노이드함량을나타냈으며, 발효시간별로는 L. delbrueckii 는발효시간이길어지면함량이감소하는경향을나타냈으나, A. oryzae, A. niger는발효시간이길어질수록플라보노이드함량이증가하였다. - 15 -
[0122] [0123] 표 8과도 5는피부직삼발효물의플라보노이드함량을나타낸것으로 5% 농도에서 A. oryzae와 S. cerevisiae 균주발효물모두발효시간이길어질수록플라보노이드함량이감소하였고, 균주별로는 A. oryzae 보다는 S. cerevisiae 균주발효물에서높은플라보노이드함량을나타냈다. 시료별로는 S. cerevisiae 균주발효물을비교하면홍삼보다피부직삼발효물의플라보노이드함량이높게나타났다. 표 7 [0124] 표 8 [0125] [0126] [0127] [0128] 3) DPPH radical 소거활성전자공여능을측정하는방법에는여러가지가있으나그중에서 DPPH가항산화물질에의해탈색되는원리를이용하는방법은비교적간단하면서도대량으로측정이가능한방법이다. 전자공여능은활성라디칼에전자를공여하여지방질산화를억제시키는척도로사용되고있을뿐만아니라인체내에서활성라디칼에의한노화를억제하는작용의척도로이용되고있다 (Choi and Oh, 1985). 하기표 9 와 10은홍삼발효물 ( 표 9) 과피부직삼발효물 ( 표10) 의 DPPH radical 소거활성을나타낸것으로, 표 9 및도 6은홍삼발효물의 DPPH radical 소거활성으로 S. cerevisiae균주발효물의경우대조구에비해소거활성이높게나타났으며홍삼농도별로는 2% 에서높은소거활성을나타냈다. 균주별로는 A. niger 2% 발효물에서높은소거활성을나타냈으나기타균주에서는소거활성의큰차이가없었다. 처리농도에서도 2% 와 5% 의농도차이에따른소거활성차이는나타나지않았으며, 발효처리기간에서도처리기간변화에따른소거활성은큰차이가없었다. 전체적으로는발효처리하지않은대조군에비해발효균주를처리한발효물에서 DPPH radical 소거 - 16 -
활성이높게나타났다. [0129] 표 10 및도 7 은피부직삼발효물의 DPPH radical 소거활성을나타낸것으로 A. oryzae 와 S. cerevisiae 균 주발효물모두발효기간길어질수록소거활성이감소하는경향을나타냈으며. 균주간에는따른소거활성의큰 차이는나타나지않았으면홍삼에비해피부직삼발효물이높은소거활성을나타냈다. 표 9 [0130] 표 10 [0131] [0132] [0133] [0134] 4) SOD유사활성 Superoxide는산소가전자하나를받아환원된형태로체내산화적손상을야기할수있으며이것을산소로전환시키는것이 SOD이다. SOD 유사물질이란 SOD와같이 superoxide를정상의산소로전환시킬수는없으나 superoxide의반응성을억제하여생체를산화적손상으로부터보호할수있는주로 phytochemical의저분자물질을의미한다 (Han and Kim, 1994). 하기표 11 및도 8은홍삼발효물의 SOD 유사활성을나타낸것으로발효하지않은홍삼대조구에비해 S. cerevisiae 균주발효물은매우높은활성을나타냈으며, 대조구에서는농도가높아지면활성이높아졌으나, S. cerevisiae 균주발효물에서는농도및발효기간에따른활성의차이는크지않았다. A. oryzae와 L. - 17 -
delbrueckii 균주처리발효물은대조구에비해활성이동일하거나낮게나타났다. [0135] A. niger 균주발효물도대조구에비해높은활성을나타냈으며, 2% 보다 5% 발효물에서, 발효기간이길어질수록활성이높게나타났다. 홍삼발효물의 SOD 유사활성검토결과 A. niger 및 S. cerevisiae 균주발효물에서대조구보다높은소거활성을나타냈으며 A. niger에서는 5% 농도에서 3일간, S. cerevisiae 에서는 5% 농도에서 3일간처리한발효물에서각각 25.15% 및 24.86% 의높은활성을나타냈다. 표 11 [0136] [0137] [0138] [0139] 하기표 12 및도 9는피부직삼발효물의 SOD 유사활성을나타낸것으로 A. oryzae 발효물과 S. cerevisiae 발효물은각각 13.72%~21.27% 및 62.04%~ 83.46% 로발효기간이길어짐에따라활성이높아졌고, S. cerevisiae 발효물은매우높은활성을나타내 7일간발효물은 83.46% 로가장높은활성을나타냈다. 홍삼발효물보다피부직삼발효물에서매우높은 SOD 유사활성을나타냈다. SOD는사람과동물의장기와혈액내에존재하는생리활성효소로유해산소를제거하는역할을하며 SOD 유사활성물질은 phytochemical에속하는물질이 SOD와유사한역할을하여 superoxide radical의반응성을억제하여생체를보호한다 (Murakami et al., 2003). SOD는superoxide (O2 -) 를전상상태의산소로환원시킴으로써 superoxide가관여하는각종질병이나노화를억제할수있는효소는아니지만 SOD와유사한역할을하는저분자물질로주로 phytochemical에속하며, superoxide의반응성을억제하고 superoxide로부터생체를보호하는것으로보고되고있으며, 이를제거함으로써산화적장애를방어하고노화억제의효과를기대할수있을것으로보고있다 (Kweon et al., 2007). 표 12 [0140] - 18 -
[0141] [0142] [0143] [0144] 3. Ginsenoside 분석결과 1) 발효전후의조사포닌함량분석인삼의발효전후의조사포닌함량은하기표 13에서나타난바와같이, 발효전보다발효후의조사포닌함량이줄어들었는데발효농도가진할수록감소폭이컸다. S. cerevisiae 는모든농도에서발효기간이늘어날수록조사포닌의함량이감소하는경향을보였고, 2% 에서는 L.delbrueckii가 5% 에서는 A. niger에서감소폭이가장컸다. 표 13 [0145] [0146] [0147] [0148] 2) 발효전후의 ginsenoside 함량분석홍삼의발효는피부직삼의발효보다발효속도가느린경향이있었고, 홍삼에서도균주만이용한발효에비하여효소를같이처리했을때발효가현저히많이진행된것을확인할수있었다 [ 표 14-17]. 2% 홍삼물추출액에서 A. niger와 L. delbrueckii에서는 PPT 계열사포닌의주요성분인 ginsenoside Rg1, Re, Rf가시간이갈수록감소하는경향을보였으나 ginsenoside Rh1, Rg2, Rh4의함량증가는확인되지않았다. PPD - 19 -
계열의주요사포닌인 ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd 역시발효가진행됨에따라 ginsenoside Rg3, compound K, Rk1 및 Rg5 값이크게늘어나는경향을보이지는않았다. A. oryzae와 S. cerevisiae는사포닌함량이줄어들거나늘어나는경향을보이지는않았으나 S. cerevisiae에서 Rg3의함량이다소늘어나는경향을보였다 ( 표 14, 도 10 및 11). 3.5% 홍삼물추액의 S. cerevisiae에의한발효에서도 ginsenoside의함량이줄어드는경향을보였으나상대적으로 Rg3의감소폭이낮았다 ( 표 15). 5% 홍삼추출물에서는발효함에따라전체적으로 ginsenoside의함량이감소하는경향을보였는데, A. oryzae와는 PPT계열의주요 ginsenoside의함량폭이 PPD계열의주요 ginsenoside의함량폭보다크게나타났다 ( 표16). [0149] [0150] [0151] PPT계및 PPD계사포닌의함량이많이줄어들지않았으나는발효기간이길어질수록 PPD계와 PPT계가감소하는경향을나타내는반면에 5% 홍삼물추출액 A. niger에서는 PPD계와 PPT계가발효기간이길어질수록증가하였다. 5% 홍삼물추출액 S. cerevisiae에서는발효기간이길어질수록 PPT계가감소하였다 ( 표 16 및도 12 및 13). 3.5% 홍삼물추출액에서는 PPD계증가하였다 ( 표 15). 홍삼물추출액을이용한발효에서 compound K 함량이늘어난경우는 L. delbrueckii에의한 3일발효에서는약간늘어났다. 5% 피부직삼에탄올추출액을효소와같이발효했을때 A. oryzae는 ginsenoside Re가 5일과 7일에서는검출되지않는대신 Rg1의함량이상당히증가하였다. Rf의함량역시시간에따라줄어들었고, 3일에서 Rh1함량이늘었다가점차줄어들었다. Ginsenoside Rb1은 3일에줄어들었다가 5일과 7일에는나타나지않았으며 Rb2와 Rb3 역시시간에따라줄어들었으나 Rc와 Rd는 3일발효에함량이늘었다가시간이늘어남에따라줄어들었고, compound K가검출되지않았다. 피부직삼의 S. Cerevisiae에서는 PPT계열값에변동이없었고, PPD 계열은주요 ginsenoside Rb1, Rb2 및 Rb3 함량이확줄어든반면 Rd 값이많이늘어났고, compound K가시간에따라늘어나는경향을보였다. 홍삼의효소및균주발효는피부직삼만큼현저한 ginsenoside 변화가관찰되지않았으나 S. Cerevisiae에서 ginsenoside Rd값이늘어났고, 5일과 7일에서 compound K 나타났다 ( 표 17, 도 14 및 15). 한편, 표 17과도 14 및 15에도시된바와같은결과에따라, 피부직삼의 ginsenoside Rg1의함량변화를관찰하기위하여 HPLC로측정한결과, 첨부도면도 20에도시된바와같이발효전인삼과발효후의인삼의 Rg1의함량이현저히증가하였음을알수있었다. - 20 -
표 14 [0152] [0153] Ginsenoside content of red ginseng and fermented red ginseng (2% water extract) - 21 -
표 15 [0154] [0155] Ginsenoside content of red ginseng and fermented red ginseng (3.5% water extract) - 22 -
표 16 [0156] [0157] Ginsenoside content of red ginseng and fermented red ginseng (5% water extract) - 23 -
표 17 [0158] [0159] [0160] [0161] [0162] [0163] Ginsenoside content of fermented dried ginseng with skin and red ginseng (5% ethanol extract)-조효소처리 4. 항당뇨효과 1) 체중의변화실험초기의체중은정상군과당뇨유발군과의차이가없었으나시간이갈수록정상군의체중증가율이당뇨유발군에비해유의하게커지는것을확인할수있었다 (p<0.05). 인삼투여군이나 A. oryzae 또는 S.cerevisiae 로발효된인삼투여군은모든투여농도에서당뇨유발군에비해체중증가율이높게나타났으나통계적인유의성은없었다 [ 표 18, 도 16]. 하기표 18의단위는 'g' 이다. - 24 -
표 18 [0164] [0165] [0166] [0167] [0168] [0169] Change of body weight of normal and STZ-induced rat fed with ginseng for 4 weeks. 2) 혈당의변화혈당의변화는흰쥐의꼬리에서채혈하여전혈을이용하여측정하였다. 정상군의혈당은 4주간의실험기간동안일정한수준을유지하였으나당뇨유발군은 streptozotocin 유도 2일 (326 mg/dl) 에측정한혈당값보다시간이갈수록증가하여 3주째에최고 (576 mg/dl) 에도달하여유지되는것을관찰할수있었다. 양성대조군으로사용한 glibenclamide투여군은당뇨유발 1주일째에는유의하게혈당상승을억제하였으나 2주와 3주에는억제폭이감소하였다가 4주째다시유의한차이를나타냈다. 발효전인삼투여군은투여 1주와 2주까지는혈당상승을유의하게억제하지않았으나 3주와 4주부터는유의한차이를보였고, 100 mg/kg으로투여한군보다 300 mg/kg으로투여한군에서혈당상승을크게억제함을관찰할수있었다 [ 표 19, 도 17]. 이에반해 A. oryzae 또는 S. cerevisiae로발효된인삼을투여한군은투여 1주부터혈당상승을유의하게억제하는것을관찰할수있었으며, 특히 A. oryzae 로발효한인삼투여군은시간이지날수록크게증가하는혈당상승을크게억제하는것을관찰할수있었고, 투여농도는높을수록더큰억제를보였으나농도에따른유의한차이는보이지않았다. S. cerevisiae로발효된인삼을투여한군은농도와관계없이투여 1주와 2주에는혈당상승을유의하게억제하였으나 3주째는유의한차이를보이지않다가 4주째에고농도에서유의한혈당억제를보였다. 이상의결과를종합하여볼때인삼의투여는 3주째부터혈당상승을억제하였고, A. oryzae로발효한인삼투여군은투여초기부터혈당상승을효과적으로억제하여시간이지나더라도지속적인효과를보였으며, S. cerevisiae로발효된인삼을투여군은초기에는효과를보이다가 3주정도의시간이지났을때는혈당상승억제능력이다소둔화되는것을확인할수있었다. 일반적으로인삼을발효하였을때생물전환되어나타나는 compound K는 S. cerevisiae로발효하였을때높게나타나고, A. oryzae로발효하였을때는나타나지않았는데도 A. oryzae로발효한인삼투여군에서혈당상승억제효과가높게나타나는것을보면인삼의항당뇨효과는 compound K가아닌다른물질에기인할것으로사료되었다. 하기표 19의단위는 ' mg /dl' 이다. - 25 -
표 19 [0170] [0171] [0172] [0173] Change of blood glucose of normal and STZ-induced rat fed with ginseng for 4 weeks. 3) 혈청 glucose 농도 4주동안경구투여하며전혈을이용하여혈당의변화율을관찰한후, 부검하여혈액을채취하여혈청으로부터혈당을측정하였다. 정상군의혈당 119 mg/dl보다당뇨유발군의혈당은 635 mg/dl로크게상승한상태였으나인삼투여군은저농도 (100 mg/kg) 와고농도 (300 mg/kg) 에서각각 405 mg/dl와 384 mg/dl의혈당을보였고, S. cerevisiae로발효한인삼투여군도저농도와고농도에서각각 405 mg/dl와 365 mg/dl로인삼투여군과비슷한수준으로유의하게혈당상승을억제하였다. 반면에 A. oryzae로발효한인삼투여군에서는저농도와고농도에서각각 376 mg/dl과 333 mg/dl으로가장현저한혈당상승억제효과를보였다. 약물대조군으로사용한 glibenclamide 10 mg/kg 투여군의혈당은 555 mg/dl으로나타나혈당상승억제효과가나타났으나상승억제정도는인삼및발효한인삼투여군에비하여미약한수준이었다 [ 표 20, 도 18의 A]. [0174] [0175] [0176] 4) 혈청 insulin 농도경구투여 4주후의혈청인슐린은정상군이 0.348 ng/ml이었고, 당뇨유발군이 0.222 ng/ml로유의하게낮았다. 양성대조군인 glibenclamide 10 mg/kg 투여군은 0.294 ng/ml로인슐린의감소를유의하게억제하였으나인삼과발효인삼투여군의인슐린 0.319 ng/ml에서 0.333 ng/ml보다는미약한수준이었다 [ 표 20, 도 18의 B]. [0177] [0178] 5) Hemoglobin A1c (HbA1c) 함량 HbA1c는정상군에서 1.10% 였고, 당뇨유발군에서 5.03% 로나타나유의한차이를나타냈으나, 약물대조군, 인삼및발효인삼투여군의 HbA1c는당뇨유발군에서보다는모두낮게나타났으나유의한차이를나타내지는않았다 [ 표 20, 도 18의 C]. 이것은 HbA1c가혈당의과거력을판단하는지표인만큼 4주간의단기적인투여에의해서효과가크게나타나지않았음을미루어추측할수있었다. - 26 -
표 20 [0179] [0180] Serum glucose, insulin, and HbA1c levels of normal and STZ-induced rat fed with ginseng for 4 weeks. [0181] [0182] [0183] [0184] 6) 혈청중성지방, 총 cholesterol 및 HDL cholesterol 함량중성지방은정상군 50.7 mg/dl에비해당뇨유발군이 108.7 mg/dl로크게상승하였으며, 300 mg/kg의고농도인삼투여군은 76.9 mg/dl, S. cerevisiae 발효인삼저농도와고농도투여군은각각 78.5 mg/dl와 71.7 mg/dl, A. oryzae로발효한인삼투여군에서는저농도와고농도에서각각 66.3 mg/dl과 64.5 mg/dl로나타나약물대조군 79.9 mg/dl보다중성지방상승을유의하게억제하였다 [ 표 21, 도 19의 A]. 총콜레스테롤은정상군이 93 mg/dl이었고, 당뇨유발군이 150 mg/dl으로유의하게상승하였으며, 약물투여군을비롯한인삼및발효인삼전투여군에서비슷한수준으로총콜레스테롤의상승을유의하게억제함을관찰할수있었다 [ 표 21, 도 19의 B]. HDL-cholesterol은당뇨유발군 48.3 mg/dl보다정상군에서 52.7 mg/dl로높게나타났으나통계적인유의한차가나타나지않았다 [ 표 21, 도 19의 C]. HDL-cholesterol은약물투여군 < 인삼투여군 < A. oryzae 발효인삼투여군 < S. cerevisiae 발효인삼투여군순으로당뇨유발군및정상군보다모두높게나타났으나통계적인유의성은보이지않았다. - 27 -
표 21 [0185] [0186] Triglyceride, total cholesterol and HDL-cholesterol levels of normal and STZ-induced rat fed with ginseng for 4 weeks [0187] [0188] 이상에서설명된바와같은본발명에따른인삼또는홍삼의발효방법은선택성있는인삼성분전환균주선발로특정성분인삼발효의최적화를기할수있을것으로판단된다. 또한, 본발명의방법에따라제조된발효인삼또는발효홍삼은특정발효균주에의해발효후특정생리활성물질의함량증가로그증가된특정성분중심의인삼의 2차가공품인고기능성식품개발에활용할수있을것으로판단된다. [0189] 이상에서설명한본발명은전술한실험방법및첨부된도면에의해한정되는것이아니고, 본발명의기술적 사상을벗어나지않는범위내에서여러가지치환, 변형및변경이가능함은본발명이속하는기술분야에서 통상의지식을가진자에게명백할것이다. [0190] 부호의설명 도 16 내지 19 에사용된약어는다음과같다. NC: not induced diabetic rat DC: sterptozotocoin(stz)-induced diabetic rats G-100: ginseng 100 mg/kg-administrated rats GBCM: gilbenclamide 10 mg/kg-administrated rats G-300: ginseng 300 mg/kg-administrated rats A-100: fermented ginseng with A. oryzae 100 mg/kg-administrated rats - 28 -
A-300: fermented ginseng with A. oryzae 300 mg/kg-administrated rats S-100: fermented ginseng with S. cerevisiae 100 mg/kg-administrated rats S-300: fermented ginseng with S. cerevisiae 300 mg/kg-administrated rats. 도면 도면 1 도면 2-29 -
도면 3 도면 4-30 -
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