효모에서 온도감수성 Dna2 돌연변이에 대한 억제 유전자의 분리

理學碩士學位請求論文 효모에서온도감수성 Dna2 돌연변이에대한억제유전자의분리 Isolation of genetic suppressors for the temperaturesensitive Dna2 mutations in Saccharomyces cerevisiae. 2006 年 2 月 仁荷大學校大學院 生命科學科 權盛訓 i

理學碩士學位請求論文 효모에서온도감수성 Dna2 돌연변이에대한억제유전자의분리 Isolation of genetic suppressors for the temperaturesensitive Dna2 mutations in Saccharomyces cerevisiae. 2006 年 2 月 指導敎授裵成浩이論文을理學碩士學位論文으로提出함仁荷大學校大學院生命科學科權盛訓 ii

Abstract Saccharomyces cerevisiae Dna2 possesses both helicase and endonuclease activities. In eukaryotes, Dna2 protein plays an important role that remove RNA primer during Okazaki fragment processing. Dna2 protein consists of three domains; endonuclease domain, helicase domain,and regulate domain. Deletions of the N- terminal of Dna2 up to 405 amino acids(dna2 405) resulted in temperature sensitive growth of this mutant cell at 37. In this study, suppressor mutants were isolated that restore the temperature-sensitive phenotype of Dna2 405N mutant cell. Ethyl methane sulfonate induced mutagenesis were carried out, and 157 suppressor mutant strains were isolated that are viable at 37. Among the suppressors, 9 mutant strains were sensitive at low temperature(16 ), and 3 showed growth defect in 0.01% methylmethane sulfonate (MMS). Two of then were sensitive to both low temperature and MMS treatment. In order to identify the suppressor mutation, YMSHK81, this mutant strain was transformed with yeast genomic library DNA, and 4 colonies were obtained that can grow an 0.01% MMS plate. Sequencing analyses of each clone revealed the genes contained in it, and the genes are to be sub-cloned to investigate i

whether they suppress the phenotype of YMSHK81 mutant strain. ii

초록 Saccharomyces cerevisiae Dna2는 edonuclease 와 helicase 활성을가진다. Dna2 단백질은진핵세포에서 Okazaki fragment processing에서 RNA primer를제거하는중요한역할을한다. Dna2 단백질은 3개의도메인으로이루어져있다. Endonuclease 도메인과 Helicase 도메인, 조절 (regulrate) 도메인으로이루어져있다. 효모 Dna2 유전자에서 N- terminal 405개의아미노산이삭제된 Dna2 405을가진반수체효모를 37 에서자라지못하는온도감수성표현형을보인다. 본연구에서는이돌연변이의표현형을회복시키는억제돌연변이를분리하였다. Ethyl methane sulfonate 돌연변이유발물질을 Dna2 405N 돌연변이주에처리하고 37 에서자라는균주를 157가지를분리하였다. 이중에서낮은온도 (16 ) 에서자라지못하는온도감수성표현형을보이는균주와 MMS (methymethane sulfonate) 에민감성을보이는균주를각각 9가지와 3가지를얻었으며, 이중 2 가지는온도감수성과 MMS 감수성을동시에보였다. 이중에서우선 MMS 감수성만을보이는 81번돌연변이주에서억제돌연변이의동정을시도하였다. 효모의 genomic library를사용하여이돌연변이주를형질전환하고 MMS에서자라나는 colony를선별하여 4 개의 clone 을확보하였다. 염기서열분석으로각 clone이포함하고있는유전자를알아내었고, 각유전자를 sub-cloning하여 81번돌연변이주의표현형을회복시키는지를조사하고있다. iii

목차 Abstract ⅰ 초 목 록 ⅲ 차 ⅳ List of Figures ⅵ 서 론. 1 1. Okazaki fragment 합성.. 1 1-1. 원핵세포의 DNA복제시 Okazaki fragment 합성 1 1-2. 진핵세포의 DNA 복제시 Okazaki fragment 합성 1 2. Dna2의기능및구조 2 재료및방법. 5 1. 균주및배지.. 5 2. 돌연변이유발. 5 3. 낮은온도에대한온도감수성조사.. 6 4. MMS에대한민감성조사.. 6 5. 효모의형질전환. 7 6. 유전자스크리닝. 8 7. 효모로부터형질전환된 DNA 추출.. 8 8. 대장균의형질전환. 8 9. 대장균으로부터형질전환된 DNA 추출... 9 10. 유전자클로닝.. 9 결과및고찰. 11 1. 억제돌연변이의분리.. 11 iv

2. 억제돌연변이효모의온도감수성 11 3. 억제돌연변이효모의 MMS에대한감수성 11 4. YMSHK81 돌연변이효모의 MMS 감수성억제하는유전자스크리닝 12 5. Library DNA의염기서열분석 12 그 림 16 참고문헌 24 v

List of Figures Fig.1. Temperature-sensitive growth defect of N-terminal deleted Dna2 mutant. 4 Fig.2. Cold and MMS sensitivity of dna2 strains. 17 Fig.3. Suppression of the MMS sensitive growth phenotype of YMSHK81. 18 Fig.4. Sequence data of YMSHK81-6 and MMS sensitive growth phenotype. 19 Fig.5. Sequence data of YMSHK81-8 and MMS sensitive growth phenotype. 20 Fig.6. Sequence data of YMSHK81-31 and MMS sensitive growth phenotype. 22 Fig.7. Sequence data of YMSHK81-13 and MMS sensitive growth phenotype. 23 vi

서론 모든생물은 DNA 복제를하며, 복제기점을가지게된다. DNA는이중나선구조에역평행한구조를가지고있다. DNA는 DNA중합효소 (DNA polymerase) 에의하여 5 ->3 으로합성된다. 이 DNA의한쪽가닥을 leading strand라고부르며, 다른한쪽은 lagging strand라고부른다 (1). 복제점의움직임에의해이 lagging strand 부위는짧은 DNA가불연속적으로이루어져있다. 이러한 lagging strand에서비연속적으로합성되는짧은 DNA 조각을 Okazaki fragment라고한다. 1. Okazaki fragment 합성과정 1-1. 원핵세포의 DNA복제시 Okazaki fragment 합성원핵세포에서는 DNA 중합효소Ⅲ에의해 DNA는 5 ->3 으로합성되며중합효소Ⅰ이 RNA primer 을제거하여 DNA합성을완성한다. 그후 DNA ligase가 DNA의떨어진부위를결합을시켜 DNA의복제가이루어진다 (1). 1-2. 진핵세포의 DNA 복제시 Okazaki fragment 합성 진핵세포의 Okazaki fragment 합성에는많은요소가작용한다. 중합 효소 α, δ,ε,pcna, 복제요소가필요하다. 중합효소 α 는 DNA primase 1

이며 RNA-DNA의 primer를합성한다 (2.3.4). 이것은 leading strand와 lagging strand 모두작용한다. 중합효소 δ는 RNA-DNA primer를이어서 DNA의주형을따라계속합성을한다. Leading strand에서는중합효소 δ,ε가사용되며, PCNA(sliding clamp), RFC(clamp loader) 두개의복제요소가요구되어진다 (2.4.5). 중합효소 δ는 DNA를합성하며다음 RNA-DNA 조작을밀어낸다. 중합효소 α, δ,ε의어느것도 exonuclease 활성을가지지않는다. 밀려난 RNA-DNA primer를 Dna2가제거를하게되며짧게남은 flap는 Fen1이제거를하게된다. 그후틈이생긴부위는 ligase가봉합을하여 DNA의복제가이루어진다 (5-10). 2. Dna2 의기능및구조 Dna2는진핵세포의 Okazaki fragment 합성과정에매우중요한기능을한다. Dna2는여기에서 helicase 의활성과 endonuclease 활성을가진다 (11-14.16.18). 효모에서 Dna2는 172 kda로이루어진단백질이다. Dna2는 3개의구조로이루어져있는데, 하나는 endonuclease 도매인으로 endonuclease 활성을가지며 RNA primer을제거, 하나는 C-terminal에존재하는 helicase 도매인으로 helicase 활성을가진다 (14.17). 마지막으로 N-terminal에존재하는 regulatory 도메인으로효소활성은가지지않으나 RPA와상호작용을이루는기능을가진다 (15). 이도메인이삭제된효모는온도감수성의특성을가지게된다 (Fig 1.) Dna2의 N-terminal이삭제된 YJA2(Dna2 405) 효모는 25 에서자라는것을관찰할수있었고, 37 에서는자라지못한다 (12). 2

본연구에서는 regulatory 도메인이삭제된온도감수성돌연변이 Dna2 405N 에대한억제유전자를분리하였으며, 이중에서 methymethane sulfonate (MMS) 에민감성을보이는돌연변이유전자를동정하고자하였다. 3

A. B. C. Figure 1. Temperature-sensitive growth defect of N-terminal deleted Dna2 mutant.a. Schematic diagram that Dna2 protein N-terminal is deleted.b,c. Strains containing the wild type DNA2(WT) or dna2 405 allele( 405) were streaked and g rown YPD media in grown for 3 days at 25 (B) and 37 (C). 4

재료및방법 1. 균주및배지야생형효모로서 YPH499(DNA2) 를사용하였다. YJA2는 DNA2 유전자에서 N-terminal 405 아미노산에해당하는부위가삭제된돌연변이 (Dna2 405N) 이다. 이효모는온도감수성으로 25 의온도에서는성장을하나 37 에서는성장을하지못하는표현형을가진다. 효모를배양하기위한배지로는 YPD를사용하였다. 조성은다음과같다. 1차증류수1000 ml에 Bactoyeast extract(1%/l), Bacto-peptone(2%), Glucose(2%), Bactoagar(1.7%) 이다. 최소배지로는 Synthetic drop-out(sd) 배지를사용하였다. 조성은다음과같다. 10X dropout 조성으로 L-Isoleucine (300 mg /L), L- Valine (1500 mg /L), L-Adenine hemisulfate salt (200 mg /L),L-Arginine HCl (200 mg /L), L-Histidine HCl monohydrate (200 mg /L), L-Leucine (1000 mg /L), L-Lysine HCl (300 mg /L), L-Methionine (200 mg /L),L- Phenylalanine (500 mg /L), L-Threonine (2000 mg /L), L-Tryptophan (200 mg /L), L-tyrosine (300 mg /L), L-Uracil (200 mg /L) 이다. 2. 돌연변이유발 YJA2에돌연변이를유발하기위하여 ethyl methane sulfonate(ems) 를처리하였다. YPD 액체배지 3 ml에 YJA2를 25 에서하루동안배양하였다. 배양액을멸균된 1.5 ml시험관에 1 ml을샘플링하였다. 배양액을옮겨담은 1.5 ml의시험관을고속원심분리기 13000 rpm에서 1분간이 5

용하여세포를수확하였다. 멸균수 1 ml넣어배지의성분을씻어내었다. 이단계를 2번반복하였다. 그런다음수확한세포가있는시험관에 50mM sodium phosphate 1 ml을처리하였고, 곧이어 30 μl의 EMS를처리하였다. 그런다음 30 에서 200 rpm으로진탕배양기에서한시간동안배양하였다. 이렇게배양한효모를고속원심분리기를이용수확하여멸균수로잘풀어주었다. 이효모는새로운 1.5 ml의멸균시험관에옮겨담았고, 5% sodium thiosulfate를 1 ml첨가하여잘섞어준다음고속원심분리기를이용하여수확을하였다. 다시 5% sodium thiosulfate를 1 ml을첨가하였다. 이렇게스트레스를준효모를 100 μl씩 YPD배지에분주하여 37 배양기에서하루동안배양을하였다. 그결과 37 에서성장하는돌연변이체를얻었다. 3. 낮은온도 (16 ) 에대한온도감수성조사 37 에서자랄수있는억제돌연변이효모는 SD 액체배지 3 ml에접종하고 25 에서하루동안배양하였다. 배양한돌연변이체를대조군과같이 SD 고체배지에 10-1 10-2 10-3 10-4 배로멸균수로희석하여낮은온도 (16 ) 에서성장하는지를조사하여자라나지못하는균주를얻었다. 4. MMS에대한민감성조사 EMS에의해유전자변이가일어난효모를 SD 액체배지 3 ml에접종하고 25 에서하루동안배양하여 10-1 10-2 10-3 10-4 배로멸균수로희석하여 0.01 % MMS를포함하는 SD 고체배지에서자라는지를야생형효모를대 6

조군으로하여비교조사하였다. 5. 효모의형질전환 MMS에감수성을보이는 YMSHK81 효모를이용하여액체배지 YPD 50 ml에하루동안배양하였다. 배양한효모를 YPD배지 200 ml에 (OD 600 = 0.1~0.3) 이되도록분주하여, 25 에서 4시간배양하여 (OD 600 = 0.5~1) 효모를고속원심분리기에서 3000 rpm에서 5분동안사용하여 50 ml시험관에서수확하였다. 수확한효모를멸균수 50 ml로 2번반복하여깨 끗이씻어주었다. 10 TE buffer (0.1 M Tris-HCl, 10 mm EDTA.PH 7.5.sigma) 150 μl, 10 LiAC (1 M Lithium acetate.sigma) 150 μl, 멸균수1.2 ml을넣어주어효모를잘풀어주었다. 이효모를 1.5 ml시험관에 100 μl씩반응성효모를만들었다. 반응성세포 YMSHK81에 Carrier DNA (BD bioscience) 7 μl와 Library DNA(pRS424 Trp + ) 20 μl첨가하여 30 배양기에서 30분동안배양하였다. 그후 50% PEG(Polyethylene glycol.sigma) 480 μl, 10 LiAC buffer 60 μl, 10 TE buffer 60 μl를첨가하였다. 30 배양기에서 200rpm shaking 30분배양하였다. DMSO(dimethyl sulroxide. Sigma) 70 μl를첨가한후 42 에서 15분동안 heat-shock을주었다. Heat-shock를준후얼음에 2분동안유지하였고, 고속원심분리기 (13000rpm) 를이용하여효모를수확하였다. 수확한시험관에멸균수 200 μl첨가하여효모를풀어주 었다. 그후 SD (Trp - ) 고체배지에풀어 25 배양기에서 20 시간동안 배양하였다. 7

6. 유전자스크리닝 Genomic library DNA로형질전환된 YMSHK81 효모를 25 에서 20시간동안배양한후 0.01% MMS(methymethane sulfonate) 가처리된 SD (Trp - ) 배지에서 Replica plating 하여 25 에서 6일동안배양하였다. MMS 에서자라나는효모를선별하였다. 7. 효모로부터형질전환된 DNA 추출 MMS 0.01 % 가처리된배지에서성장하는효모를 SD (Trp - ) 배지 3 ml에분주하여 25 에서하루동안배양을하였다. 배양한효모를고속원심분리기를이용하여 1.5 ml시험관에수확하였다. 1.5 ml시험관수확된효모에 0.1 ml의 2% Triton x-100, 1% SDS, 100 mm NaCl, 10 mm Tris-Cl(pH 8), 1 mm Na 2 EDTA, 와 0.1 ml의 phenol:chloroform:isoamyl alcohol(25:24:1) 의조성을가진용액을넣어주었다. 그후 0.15g의 glass beads를첨가하였다. 그후 12분동안 vortexing를하였다. Vortexing를한시험관을 13000rpm 5분동안고속원심분리기를이용하여 DNA를분리하였다. 8. 대장균의형질전환효모로부터추출한 DNA를대량으로정제하기위하여대장균 (DH5α) 을이용하였다. LB 액체배지 50ml에대장균을분주하여배양기 37 에서하루동안배양하였다. 배양한대장균을 LB 액체배지 500 ml에 5 ml분주하여 OD 550 값이 0.5~0.6 이될때까지배양하였다. 배양한대장균을 250 8

ml의병에넣어얼음에 30분동안넣어두었다. 30분후 5000rpm 4 에서 5분동안고속원심분리기를이용하여대장균을수확하였다. 수확한대장균에멸균이된 3차증류수 (4 ) 를넣어대장균을잘풀어주어고속원심분리기를이용하여대장균을수확하였다 ( 반복 2회 ). 수확한대장균에 10% glycerol을 40 ml넣어대장균을잘풀어주었다. 그후 5000rpm 4 에서 5분동안사용하여대장균을수확한후, 다시 2 ml의 10% glycerol 를첨가하여잘섞어주었다. 1.5 ml의시험관에대장균을 80 μl씩분주하였다. 이렇게만들어진반응성세포에효모에서추출한 DNA를 2 μl씩 0.2mm cuvette에넣어 2.5 kv의전기충격을주었다. 그후재빨리 LB 액체배지 1 ml을넣어 37 에서 1시간동안배양하였다. 고속원심분리기 13000rpm에서수확한후선택배지 (Amp + ) 에 spreading하여 37 배양기에서하루동안배양하였다. 9. 대장균으로부터형질전환된 DNA 추출 Electrophoration 하여자라는대장균을 LB액체배지 (AMP + ) 3 ml, 37 에서하루동안배양하였다. 배양한대장균에서의 DNA는 Plasmid SV mini kit(generalbio system) 를사용하여추출하였다. 10. 유전자클로닝대장균으로부터추출한 DNA 조각과 prs323 벡터를이용하였다. 추출한 DNA (81-6, 81-13, 81-31, 81-8) 를 5 μl, prs323 벡터 5 μl와 10X BSA,10X NEB 버퍼각 2 μl, 3차증류수 10.5 μl, 각 DNA의제한효소 9

0.5 μl의조성을사용하여 37 에서한시간반응을시켰다. 반응시킨 DNA를 0.7 % agaros gel에전기영동하여 Gel SV kit(generalbio system) 를사용하여 DNA를추출하였다. 제한효소처리된 DNA와벡터를총량 20 μl에 12.5 μl, 5 μl (2.5: 1),T4 ligase 0.5 μl와 T4 ligase 버퍼 2 μl를넣어 16 에서 6시간동안 ligation 하였다. Ligation 한 DNA는선택배지 (Amp + ) 37 에서하루동안배양하였다. 10

결과및고찰 1. 억제돌연변이의분리온도감수성돌연변이 Dna2 405N 을유전자형으로가진효모 YJA2 를이용하여 DNA2 돌연변이에대한억제유전자를동정하고자하였다. 재료및방법에서술한대로 EMS 돌연변이유발물질을 YJA2 배양액에처리하여 37 에서성장하는돌연변이체 157개를얻을수있었고, 이돌연변이체를유전학적으로연구를하기위해, 다른스트레스에영향을받는돌연변이체를선별하였다. 2. 억제돌연변이효모의온도감수성 YJA2 효모의온도감수성을억제하는효모를가지고낮은온도 (16 ) 감수성을조사하였다 (Fig.2.A). 각효모들은멸균수에 10 배씩 4단계로희석하여, YPD 배지에서 25, 16, 37 에서배양을하였다. YJA2 효모는 25, 16 에서성장을하였고, 37 에서는자라지않는것을관찰하였다. YJA2의효모와비교를하였을때 4, 7, 19, 28, 79, 78, 77, 74,86 번돌연변이체는낮은온도 (16 ) 에서자라지않는것을관찰하였다. 19, 86 번돌연변이체는효모는 37 에서는자라지만 16 뿐만아니라 25 에서도자라지않는것을관찰하였다. 3. 억제돌연변이효모의 MMS 에대한감수성 YJA2 효모의온도감수성을억제하는효모를가지고 0.01 % MMS 가첨가 11

된배지에서감수성시험을하였다 (Fig.2.B). YJA2 효모는 0.01 % MMS가처리된배지에서자라는것을볼수있었고, 돌연변이체 YMSHK81, 86, 19 번효모는 MMS에대한감수성을가지는것을관찰하였다. YPD 배지에서 25 (0.01 % MMS), 16, 37 에서배양을하였다. 4. YMSHK81 돌연변이효모의 MMS 감수성을억제하는유전자스크리닝 Replica plating을하여얻은 genomic library DNA를돌연변이체 81번효모에형질전환을시켰다. 이형질전환된효모가 0.01 % MMS배지에서성장하는것을관찰하였다 (Fig. 3). 대조군으로 prs314 plasmid를형질전환된 YMSHK81 +prs314 효모는 25 배지에서 MMS 감수성을가지는것을확인할수있었다. 반면, 돌연변이체 81번에 genomic DNA조각이들어간 (81-8, 81-31, 81-13, 81-6) 는 MMS 감수성인 YMSHK81 효모의표현형을억제하는것을관찰하였다. 그러나 37 에서자라는것으로보아여기서얻은 clone들은 YJA2가 37 에서자랄수있게하는억제돌연변이유전자를포함하는것이아니라, 간접적인방법으로 MMS 감수성을억제한다고판단된다. 5. Library DNA 의염기서열분석 (1) YMSHK81-6 Library DNA YMSHK81-6 의 Library DNA 에는여러개의유전자가존재하였다 (Fig.4). 또한여러개의제한효소부위를가지고있는것을알수있었 12

다. YMSH81-6번의전체유전자와, 제한효소 Not Ι을처리하여 HEM1 유전자에서 PRP42유전자까지를 self-ligation 하고, self-ligation 한유전자부분이 YMSHK81효모의 MMS감수성을억제하는지관찰하였다. 전체 DNA조각이든 81-6돌연변이체와비교하였을때 Self-ligation한유전자부위가 YMSHK81 MMS 감수성의억제유전자가있음을관찰할수있었다. (2). YMSHK81-8 Library DNA YMSHK81-8의 Library DNA에들어있는유전자를지도로나타내며, 여러개의유전자가포함되어있었다 (Fig. 5 A). YMSH81-8번의전체유전자또한여러가지의제한효소부위가존재하고있으며, 전체유전자와, 제한효소 SacΙ을처리한 YLR406C 유전자에서 UTP21까지의유전자부위를 self-ligationg하여돌연변이체 YMSHK81 효모에형질전환하여, selfligation한유전자부분이 YMSHK81효모의 MMS감수성을억제하는지관찰하였다. (3). YMSHK81-31 Library DNA YMSHK81-31의 Library DNA 있는유전자를그림으로나타내었다 (Fig.6A). YMSH81-31번의전체유전자와, 제한효소 SacΙ을처리하여 ATG2 SacΙ 제한효소부위부터 LAP3유전자의부위까지 self-ligation한유전자가 YMSHK81효모의 MMS감수성을억제하는지관찰하였다. 13

(Fig.6 C.D) YMSH81-31번의제한효소 Not Ι 을처리하여 ATG2 유전자와 ZWF1 유전자가들어간부위만 prs323 벡터에클로닝을하여이부위가 YMSHK81 효모의 MMS감수성을억제하는지관찰하였다. 그결과 MMS 감수성을억제하였고, ZWF1 유전자가공통된부위임을암시하는것이다. 이것은따라서 ZWF1 유전자만클로닝하여 MMS 감수성을억제하는지조사할예정이다. (4). YMSHK81-13 Library DNA YMSHK81-13의 Library DNA 있는유전자를그림으로나타내었다 (Fig.7A). YMSH81-13번의전체유전자와, 제한효소 EcoR Ι을처리한 BNS1 유전자에서 PHO81유전자의 EcoR Ι 부위까지유전자를 PRS323 벡터에클로닝을하여이부위가 YMSHK81효모의 MMS감수성을억제하는지관찰하였다. 효모인 Saccharomyces cerevisiae 의단백질인 Dna2는 helicase 와 endonuclease 활성을가지며 Okazaki fragment 처리과정에서 RNA primer 를제거하는중요한역할을하고있다. Dna2는 3개의도메인으로이루어져있는데 N-terminal과 helicase, endonuclease 도메인으로이루어져있다. Dna2유전자의 N-terminal이삭제된효모는온도감수성의특성을가지게된다. 이 N-terminal 삭제된효모의온도감수성의억제자를찾고자 EMS 돌연변이유발물질을이용하여 Dna2유전자의 N-terminal이삭제된효모를억제하는새로운효모의 strain을찾을수있었다. 이러한돌연변 14

이효모를이용하여유전학적으로분석하기위해서낮은온도, MMS에서 DNA에손상을주는요인을가지고연구를하게되었다 (Fig.2). 이러한돌연변이체는 DNA에스트레스를주었을때회복을하지못하는것을알수있었으며, genomic DNA 조각을이용하여돌연변이체가 DNA에손상을받았을경우회복을시키는 DNA의조각을알수있었다. 본연구에서찾고자하는 Dna2의 N-terminal 삭제된효모의억제유전자는찾을수없었으나, DNA에손상을주었을때회복을시키는 DNA 조각을짐작할수있었다. 앞으로 Dna2의 N-terminal이삭제된효모의억제유전자를찾는연구가필요할것이다. 15

A 10-1 10-2 10-3 10-4 B. 16

Figure 2. Cold and MMS sensitivity of dna2 strains. A. Cold-sensitive growth of the mutant strains. Ten-fold serial dilutions of each culture were spotted and incubated at the indicated temperature. Cells were grown at 16 for 7days. B. MMS(0.01%) sensitive growth defect of mutant strains. 17

Figure 3. Suppression of the MMS sensitive growth phenotype of YMSHK81. YJA2 and YMSHK81 were transformed with prs134(plasmid). YMSHK81 was transformed with one of the isolated clone, 81-8,81-31,81-13,or 81-6. Ten-fold serial dilutions of each culture were spotted onto either SD-minimal or YPD plates and cells were grown at 25. 18

A. B. Figure 4. Sequence data of YMSHK81-6 and MMS sensitive growth phenotype. A. The restriction of the clone 81-6. B. YMSHK81 was transformed with clone 81-6 or 81-6 NotΙ-self. Cells were grown 3 days at 25 (SD media) and 37 (YPD media). 19

A. B Figure 5. Sequence data of YMSHK81-8 and MMS sensitive growth phenotype. A. The restriction of the clone 81-8. B. YMSHK81 was transformed with clone 81-8 or 81-8 SacΙ -self. Cells were grown 3 days at 25 (SD media) and 37 (YPD media). 20

A. B. C. D. 21

Figure 6. Sequence data of YMSHK81-31 and MMS sensitive growth phenotype. A.C. The restriction of the clone 81-31. B. YMSHK81 was transformed with clone 81-31 or 81-31 SacΙ -self. D. YMSHK81 was transformed with clone 81-31 or 81-31 NotΙ. Cells were grown 3 days at 25 (SD media) and 37 (YPD media). 22

A. B. Figure 7. Sequence data of YMSHK81-13 and MMS sensitive growth phenotype. A.The restriction of the clone 81-13. B. YMSHK81 was transformed with clone 81-8 or 81-8 EcoRΙ-self. Cells were grown 3 days at 25 (SD media) and 37 (YPD media). 23

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