J Koren So Food Si Nutr 한국식품영양과학회지 43(1), 47~54(2014) http://dx.doi.org/10.3746/jkfn.2014.43.1.047 유방암세포 (EMT6) 이식마우스에서녹차폴리페놀음용이시스플라틴의암조직성장억제에미치는영향 이병래 1 조정일 2 박평심 3 1 조선대학교의과대학생화학교실 2 조선이공대학교식품영양조리과학과 3 조선대학교의학연구원 Effets of Dietry Te Polyphenol on Tumor Growth Inhiition y Cispltin in EMT6 Brest Tumor-ering Mie Byoung-Ri Lee 1, Jung-Il Cho 2, nd Pyoung-Sim Prk 3 1 Dept. of Biohemistry, College of Mediine nd 3 Institute of Medil Siene, Chosun University, Gwngju 501-759, Kore 2 Dept. of Food Nutrient nd Culinry, Chosun College of Siene & Tehnology, Gwngju 501-744, Kore ABSTRACT The im of this study is to evlute the effets of green te polyphenol () on ntiner tretment with ispltin (), using oth n in vitro ell ulture model nd n in vivo mouse model of estlished rest tumor. Mouse rest ner ells (EMT6) were treted with or without nd followed y determintion of the ell viility using n MTT ssy. The reltive ell viility of treted EMT6 ells ws 96% t 20 μg/ml onentrtion of ispltin; however, in omintion with (50 μg/ml), the ell viility deresed to 20% t the sme onentrtion of (20 μg/ml). For the in vivo study, EMT6 ells were inoulted into Bl/ mie for the estlishment of tumor-ering mie model. The tumor-ering mie were treted with (5 mg/kg. i.p.) with or without dietry (0.2% drinking wter). Tumor growth ws monitored y mesurement of tumor size using digitl liper, nd nephrotoxiity ws determined y enzymti nd histologil exmintions. The levels of p53 nd spse-3 in tumor tissues were exmined y Western lot. In tumor-ering mie treted with plus, the inrement of tumor volume showed signifint redution, ompred with or lone. The levels of p53 nd leved spse-3 (spse-3/p17) in tumor tissues of tumor-ering mie were inresed y nd ompred to lone. In treted tumor-ering mie, γ-glutmyltrnspeptidse (GGT) nd lkline phosphtse (AP) tivities were deresed, nd mrked tuulr nerosis nd dilttion were oserved in the kidney. -indued enzymti nd histopthologil hnges in the kidney of tumor-ering mie were redued y omintions of with. The results of these experiments demonstrted tht dietry hs potentiting effet on nti-tumor tivity nd protetive effet ginst -indued renl dysfuntion. Therefore, my e used s modultor in ntiner tretment with. Key words: green te, ispltin, EMT6 ells, rest ner 서 항암화학요법은암의종류나병기에관계없이시행할수있기때문에매우유용한암치료방법으로이용되고있으나 (1), 화학요법제에대한내성암세포의출현과독성부작용은화학요법시행을제한하는큰장애물로알려졌다 (2,3). 암세포에대한항암제내성을극복하기위해항암제의용량을증가시키는고용량화학요법이나항암제몇가지종류를병합하여투여하는방법등이시행되고있으나 (4,5), 고용량 론 Reeived 4 Septemer 2013; Aepted 25 Novemer 2013 Corresponding uthor. E-mil: hlito@hnmil.net, Phone: +82-62-230-6292 화학요법은항암효과는증가되나독성부작용도함께증가되기때문에일반적인암치료방법으로이용하기는제한이있다 (6). 화학요법제의항암작용을증가시키거나항암제의독성부작용을감소시킬수있는화학요법보조제개발은항암화학요법제개발분야에서대단히중요한과제로서천연물을이용하는연구가많이이루어지고있다 (7). 녹차 (Cmelli sinensis L.) 는음료로서널리이용되고있는데, 녹차에함유된기능성물질이건강증진에도움을주고암발생이나치료에도효과적이라는연구결과가발표되어있다 (8). 녹차에함유된폴리페놀류는발암물질에직접작용하거나세포에작용하여발암물질의작용을억제하여암의발생을예방하며암세포에작용하여세포사를유도하
48 이병래 조정일 박평심 는기능이있는것으로알려졌다 (8,9). 녹차폴리페놀이항암제의작용을증강시킨다는연구보고도있는데, 사람자궁암세포에서녹차폴리페놀이시스플라틴 (ispltin: is-diminedihloropltinum II) 에의한세포독성을증가시키는작용이있으며 (10), 마우스유방암세포에서녹차폴리페놀 (-)-epigllotehin-3-gllte(egcg) 가 txol의세포독성을증강시키는작용이있는것으로보고되고있다 (11). 플라티늄 (pltinum) 계화학요법제인시스플라틴은 1970 년대에항암화학요법제로개발되어암치료분야에서화학요법시행의중요한역할을한제제로서 (12), DNA 사슬사이에서교차반응 (interstrnd ross linking) 을일으킴으로써항암작용을나타내며광범위항암화학요법제로서여러가지고형암치료에이용되고있다 (13). 플라티늄계제제인시스플라틴은치료효과가높으며경제적이기때문에암치료를위한화학요법제로우선적으로이용되고있으나신장독성, 청신경독성및골수억제등여러가지독성부작용은이의사용을제한하는요인으로작용하고있다 (14). 유방암은여성에서호발하는암으로수술요법과항암화학요법으로치료하고있는데, 플라티늄계제제가유방암의항암화학요법제로이용되고있다 (15). 유방암에대한역학적조사연구에서녹차의음용이유방암의발생을억제하며, 유방암환자에서병의예후를호전시킨다고하였다 (16). 또한사람유방암세포주를이용한연구에서시스플라틴과녹차폴리페놀을병합하면암세포성장이억제된다고하여 (17) 녹차가유방암의예방과치료에이용될수있을것으로기대되나아직까지 in vivo 실험은많지않다. 본연구는항암화학요법제의항암작용을증강시키거나독성부작용을감소시킬수있는항암치료보조제의개발에관한실험의일환으로유방암세포 (EMT6) 를이용한 in vitro 및 in vivo 실험을통하여시스플라틴항암효과및신장독성에미치는녹차폴리페놀의영향을관찰하였다. 재료및방법세포배양본실험에서사용한유방암세포 (EMT6 ell) 는 Amerin Type Culture Colletion(ATCC, Mnsss, VA, USA) 에서구매하여실험에사용하였다. 마우스유방암세포는 15% fetl ovine serum(fbs), 스트렙토마이신 (100 U/mL) 및페니실린 (100 U/mL) 을함유한 Wymouth's 배지 (Gio BRL, Brooklyn, NY, USA) 를사용하였으며, 37 C 로유지되는 CO 2 배양기에서세포를배양하였다. 세포생존율측정실험에사용한시스플라틴 (ispltin: ) 과녹차폴리페놀 (green te polyphenol:, polyphenon 60) 은 Sigm- Aldrih Co.(St. Louis, MO, USA) 에서구매하여사용하였고, 녹차폴리페놀은 phosphte uffered sline(pbs) 에용 해시켜주사기용필터 (syringe filter 0.22 μm, Millipore, Billeri, MA, USA) 를통과시킨후배양액에첨가하였으며, 시스플라틴은 DMSO(dimethylsulfoxide) 에용해시킨후 PBS에희석시켜배양액에첨가하였다. 실험군은시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 과시스플라틴군 () 으로나누어실시하였다. 세포배양용기 (96 well plte) 의각웰 (well) 에유방암세포 2 10 4 개씩을넣어 24시간동안배양한후시스플라틴 (0, 10, 15, 20, 25, 30, 35 및 40 μg/ml) 과녹차폴리페놀 (50 μg/ml) 을배양액에첨가하고 24시간후세포생존율을 3-(4,5-dimethylthizol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrzolium romide(mtt) 법으로측정하였다 (18). 즉세포배양액에 MTT( 최종농도 : 1 mm) 를첨가하여 4시간경과후배양액을제거하고 Hnk's lned slt solution으로 3회세척한후 DMSO 200 μl를첨가하여 ELISA plte reder(tecan, Männedorf, Switzerlnd) 로 540 nm에서흡광도를측정하였다. 실험은각실험군마다 3 wells의흡광도를각각측정하여평균값을계산하였고 3회반복실험을실시하였으며, 세포생존율은측정한흡광도를다음식에의해서계산하여비교세포생존율로표시하였다. 비교세포생존율 (reltive vitlity) = 실험군흡광도 100 대조군흡광도 실험동물및실험군 실험동물은 Bl/ 마우스 (6주령) 로샘타코 (Smtko, Dejeon, Kore) 에서구매하여 12시간명암주기, 온도 20±2 C로유지하고상대습도 60±5% 의환경에서사육하였다. 유방암의유도는마우스등에배양한마우스유방암세포 (EMT6: 2 10 5 ells) 를피하주사한후사육하여육안으로암조직이발생되는것을관찰하여확인하였고암조직의크기는디지털캘리퍼 (digitl lliper) 를이용해측정하여다음식에의해서크기를계산하였다. Tumor volume (mm 3 )=(width 2 length)/2 실험군은암조직의크기가 250~400 mm 3 된마우스를각각 5마리씩대조군 (), 녹차폴리페놀군 (), 시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 및시스플라틴군 () 으로나누었다 (Tle 1). 대조군 () 과녹차폴리페놀군 () 에는인산염용액 0.2 ml를 3일간격으로 3회복강주사하였고, 시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 과시스플라틴군 () 은시스플라틴 (5 mg/kg) 을 3일간격으로 3 회복강주사하였다. 녹차폴리페놀군 () 과시스플라틴 +녹차폴리페놀군 (+) 에실험시작일부터식수로녹차폴리페놀 (0.2%) 을공급하였고, 암조직의크기를디지털캘리퍼로측정하였다.
녹차폴리페놀음용이시스플라틴의암조직성장억제에미치는영향 49 Tle 1. Experimentl design Groups 1) Tretment 2) IP injetion (0.2 ml) Drinking wter + PBS PBS (5 mg/kg) (5 mg/kg) Tp wter 0.2% 0.2% Tp wter 1), IP injetion of PBS nd tp wter;, IP injetion of PBS nd in drinking wter; +, IP injetion of nd in drinking wter;, IP injetion of nd tp wter. 2) : green te polyphenol, : ispltin, IP injetion: intrperitonel injetion, PBS: phosphte uffered sline. Western lot ssy 실험동물은시스플라틴최종투여 4일째에에테르로마취시켜암조직과신장을적출하였다. 암조직은완충액 (RIPA uffer, Sigm-Aldrih Co.) 을첨가하여균질화시키고 14,000 g로 3분동안원심분리시킨후상층액을취하여 SDS-loding uffer(50 mm Tris-HCl; ph 6.8, 2% SDS, 0.1% romphenol lue, 10% glyerol) 를첨가하여 95 C에서 5분동안가열한후시료 ( 단백질 60 mg) 를취해서전기영동을시행하였다. 전기영동은 10% SDS-PAGE를시행하였고분리된단백질을 nitroellulose memrne에 eletro-lot 법으로이동시켰다. 일차항체로서 nti-rit polylonl nti-p53 A, nti-spse-3 A 및 ntiβ-tin A(Snt Cruz Biotehnology, Dlls, TX, USA) 를사용하였고, 이차항체로는 horserdish peroxidseleled got nti-rit IgG(Snt Cruz Biotehnology) 를이용하였으며, enhned hemiluminesene 용액 (Amershm, London, UK) 을이용하여반응시켜 X-ry 필름에감광시킨후나타난 nd를 imge nlyzer(1d version 2.1, Phrmi ioteh, London, UK) 로분석하였다. 조직병리검사실험동물에서적출한신장조직일부를즉시 10% 포르말린용액에충분히고정한후탈수과정을거처서파라핀포매한후조직을 4 μm 절편을만들어 hemtoxylin과 eosin (H&E) 염색하여광학현미경으로 200배확대하여관찰하였다. 신세뇨관손상은세뇨관괴사 (tuulr nerosis) 와세뇨관확장 (tuulr dilttion) 을다음과같은기준으로평가하여계산하였다. 0: 손상없다, 1: 10% 이하손상, 2: 10~ 25% 손상, 3: 25~50% 손상, 4: 50~75% 손상, 5: 75% 이상손상. 통계처리본연구의실험결과들은평균 ± 표준편차로표시하였고, 실험결과는 SPSS(sttistil pkge for soil sienes, version 12.0, Chigo, IL, USA) 통계프로그램을이용하여 one-wy ANOVA test로분석하였고, 시료간유의성은 Dunn's multiple rnge test에의해서 P<0.05 수준에서비교하였다. 결과및고찰녹차폴리페놀과시스플라틴이 EMT6 세포생존율에미치는영향마우스유방암세포 (EMT6) 생존율에미치는녹차폴리페놀과시스플라틴의영향은 Fig. 1과같다. EMT6 세포생존율은시스플라틴농도 30 μg/ml에서대조군의 22% 로감소되었고, 시스플라틴농도 35 μg/ml에서대조군의 12% 로감소되어 EMT6 세포에대한시스플라틴의세포독성은시스플라틴 30 μg/ml 이상의농도에서나타남을알수있었다. 녹차폴리페놀 50 μg/ml를첨가한실험군에서는시스플라틴농도 15 μg/ml에서흡광도가감소되기시작하였고 효소활성측정실험동물은시스플라틴최종투여 4일째에에테르로마취시켜신장을적출하였다. 적출된신장의일부는효소활성측정을위한시료로이용하고일부는조직병리검사를위한시료로이용하였다. 신장조직약 0.1 g에 10배 (w/v) 의 0.1 M 인산염완충액 (ph 7.4) 을첨가하여균질화시킨후 lkline phosphtse(ap) 와 γ-glutmyl trnspeptidse(ggt) 측정을위한시료로이용하였다. AP는 Tenenhouse 등 (19) 의방법에따라 ρ-nitrophenyl phosphte로부터생성되는 ρ-nitrophenol 양을정량하는방법으로측정하였고, GGT 는 Tte와 Meister(20) 의방법으로 γ-glutmyl-nitronilide로부터생성되는 ρ-nitronilide 양을정량하는방법에따라측정하였으며, 단백질은 Sigm-Aldrih Co. 의단백질정량 kit(totl protein kit) 를이용하여측정하였다. 효소의활성은 μm/mg protein/hour로표시하였다. Reltive vitlity (%). 120 100 80 60 40 20 d 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Cispltin onentrtion (μg/ml) d d Fig. 1. Effets of on ispltin-indued ytotoxiity of mouse rest ner ell (EMT6). EMT6 ells were treted ispltin (0~40 μm) nd (50 μg/ml) for 24 hours nd ell viility exmined y MTT ssy. Reltive vitlity (RV)=(ODExp/ ODCon) 100%, whih is n indition of EMT6 ell viility. Representtive results re shown s the men±sd of triplites. Vlues with sme supersripts re not signifintly different (P<0.05).
50 이병래 조정일 박평심 시스플라틴농도 20 μg/ml에서는대조군의 20% 로급격히감소되어, 녹차폴리페놀첨가로시스플라틴의 EMT6 세포에대한독성이증가됨을알수있었다. Ness 등 (21) 은사람난소암세포 (A2780) 에서폴리페놀종류인 resvertrol 이시스플라틴의세포독성을증가시킨다고하였고, Chn 등 (22) 은난소암세포를이용한실험에서 EGCG가시스플라틴의세포독성을증가시킨다고하였으며, Perismy와 Alshtwi(23) 는사람유방암세포 (MCF-7) 에서녹차폴리페놀이시스플라틴의세포독성을증가시킨다고하였다. 본실험의 EMT6 세포배양실험에서녹차폴리페놀첨가로시스플라틴의세포독성이증가되어 Chn 등 (22) 이나 Perismy와 Alshtwi(23) 의실험결과와유사하였으며, 이는녹차폴리페놀이시스플라틴의항암작용을 in vitro에서증강시키는작용이있는것으로추측된다. 식물에함유된폴리페놀류는 flvonols, flvondiols, flvonoids 및 phenoli ids 등이있는데, 녹차에함유되어있는카테킨은 flvnols류에해당되며, (-)-epitehin(ec), (-)-epitehin-3-gllte(ecg), (-)-epigllotehin(egc), (-)-epigllotehin-3-gllte(egcg) 등여러가지종류가있는데 (24), 본실험에사용한 polyphenon은 EGCG, ECG, EGC 및 EC 등이혼합되어있는카테킨복합물이다. 시스플라틴및녹차폴리페놀이마우스에이식된유방암조직성장에미치는영향녹차폴리페놀과시스플라틴이마우스에이식된유방암조직의성장에미치는실험결과는 Fig. 2와같다. 실험시작시점에비교하여종양크기는대조군 () 이 6일 2.2배, 10 일 3.9배, 녹차폴리페놀군 () 은 6일, 10일에각각 2.2배, 3.6배, 시스플라틴군 () 은 6일, 10일에각각 2.0배, 3.4배로증가되어, 대조군 () 과녹차폴리페놀군 () 및시스플라틴군 () 사이에시간경과에따른종양크기의유의한차이가나타나지않았다. 반면에시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 의종양크기증가는 6일에 1.6배, 10일에 2.7배로증가되어 10일경과시시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 의종양크기는대조군 () 의 79%, 시스플라틴군 () 의 83% 로대조군 () 이나시스플라틴군 () (A) + 0 dy 6 dys 10 dys (B) 1600 1400 + 3 Tumor volume (mm ) 1200 1000 800 600 400 200 0 0 6 10 Dys Fig. 2. Effets of nd on tumor growth of tumor ering mie. (A) Photgrphy of nd treted tumor ering mie. (B) Tumor volume of nd treted tumor ering mie. Brest tumor ering mie were treted (5 mg/kg) with intr-peritonel injetion t every 3 dys for 3 times. 0.2% solution were given s the only soure of drinking wter. Tumors size ws mesured y digitl liper nd tumor volume lulted using the following formul; Tumor volume (mm 3 )=[(width) 2 length]/2. Vlues re men ±SD, n=5. Vlues with different supersripts in sme dy re signifintly different (P<0.05).
녹차폴리페놀음용이시스플라틴의암조직성장억제에미치는영향 51 에비하여시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 의종양크기가유의하게작았다. Thngpzhm 등 (17) 은유방암세포주 (MDA-MB231) 를누드마우스 (nude mouse) 에주사하여실시한실험에서녹차폴리페놀이나 EGCG가암조직의성장을억제한다고하였는데, 본실험에서녹차폴리페놀군 () 의종양크기는대조군 () 과차이를나타내지않아서이들의결과와다르게나타났는데, 이들의실험에서투여한녹차폴리페놀의농도는본실험의녹차폴리페놀농도 0.2% 보다 5배높은 1.0% 를투여하여나타난결과로서폴리페놀농도차이때문에초래된결과로추측된다. 또한시스플라틴과녹차폴리페놀을병합투여할경우시스플라틴단독투여군보다종양크기가작아서녹차폴리페놀투여농도 0.2% 에서시스플라틴의항암작용을증강시키는효과가있는것으로생각된다. Luo 등 (11) 이마우스유방암세포 (4T1) 를이용한 in vivo 실험에서 EGCG와 plitxel을병합투여하면암조직의성장을억제하는데상승효과가있다고한실험결과와본실험결과는유사하였다. EMT6 세포는 Bl/ 마우스유래의유방암세포주로서피하에주사하여종양을유도한후 in vivo 실험에이용되고있는데 (25), 이번실험에서시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 의종양크기가시스플라틴군 () 이나녹차폴리페놀군 () 에비하여작은것은녹차폴리페놀이시스플라틴의항암작용을상승시켜나타난결과로추측된다. 녹차폴리페놀은 in vitro 실험에서시스플라틴의암세포독성을증가시켰고, 마우스에고형암을유발하여실시한 in vivo 실험에서도시스플라틴의암성장억제작용을상승시켜서, 녹차폴리페놀이시스플라틴의항암작용증강을유도하는것으로추측된다. 항암화학요법의시행에서항암작용증강이나부작용감소는매우중요한요소이기때문에녹차폴리페놀의이러한효과는시스플라틴항암요법의유용한치료보조제로서이용가능성을보여주며이에대한지속적인연구가필요할것으로생각된다. 시스플라틴및녹차폴리페놀이마우스에이식된유방암조직의 p53 및 spse-3 에미치는영향녹차폴리페놀과시스플라틴이마우스에이식된유방암조직의 p53과 spse-3에미치는실험결과는 Fig. 3과같다. 종양조직내 p53과 β-tin 을 western lot 하여 nd 의밀도를측정하여 p53/β-tin 비율을 % 로환산한결과대조군 () 71%, 녹차폴리페놀군 () 82%, 시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 107%, 시스플라틴군 () 73% 로나타나서, 대조군 () 과시스플라틴군 () 사이에유의한차이가나타나지않았고녹차폴리페놀군 () 과시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 은종양조직내 p53이증가됨을보여주고있는데, 특히시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 은대조군 () 보다 150% 정도증가되어실험군중에서 p53 증가가가장높았다. (A) P53 Reltive density to β-tin (%). (B) Cspse-3/ p17. Reltive density to β-tin (%). 140 120 100 80 60 40 20 0 60 50 40 30 20 10 0 + P53 β-atin + + Cspse-3/ p17 β-atin + Fig. 3. Effets of nd on p53 nd spse-3 levels in tumor tissue of tumor ering mie. (A) p53, (B) Cleved spse-3 (spse-3/p17). Brest tumor ering mie were treted (5 mg/kg) with intr-peritonel injetion t every 3 dys for 3 times. 0.2% solution were given s the only soure of drinking wter. The levels of p53 nd spse-3/p17 in tumor tissue were determined y western lot nd the intensity of the nds ws quntified y densitometri nlysis. The r represents the stndrd error of the men (n=5). Vlues with different supersripts re signifintly different (P<0.05). 종양조직내 spse-3과 β-tin을 western lot 하여 nd의밀도를측정하여 p53/β-tin/p17 비율을 % 로환산한결과대조군 () 28%, 녹차폴리페놀군 () 33%, 시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 47%, 시스플라틴군 () 33% 로나타나서대조군 () 과녹차폴리페놀군 () 및시스플라틴군 () 사이에유의한차이가나타나지않았고, 시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 은종양조직내 spse-3/p17은대조군 () 보다 167%, 시스플라틴군 () 보다 142% 정도증가되었다. Frser 등 (26) 은난소암세포에서 p53이증가되면 spse가활성화되고 poptosis가유발된다고하였는데, 세포내비활성화상태의 spse-3은분해되어효소활성을갖게되므로 spse-3의활성화는 poptosis 유발과밀접한연관이있는것으로알려졌다 (26,27). Singh 등 (28) 은사람의자궁암세포를배양하여실시한 in vitro 실험에서시스플라틴과녹차폴리페놀이 p53과 spse-3의활성화를증가시켜서 poptosis를유발한다고하였는데, 본실험에서도시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 의종양조직내 p53과 spse-3의활성화형태인 spse-3/p17
이병래 조정일 박평심 52 Tle 2. GGT nd AP tivities of kidney in ispltin nd treted mie Groups GGT AP 15.42±1.13 43.16±2.56 44.40±4.86 14.84±1.93 38.30±4.36 11.56±1.15 32.12±4.13 9.85±1.05 Enzyme tivities re expressed μm/mg protein/hour. Vlues re men±sd (n=5). Different supersripts within sme olumn re signifintly different t the P<0.01 y Dunn's multiple rnge test. GGT: γ-glutmyltrnspeptidse, AP: lkline phosphtse. Tle 3. The sore of tuulr injury under mirosopi findings of kidney in ispltin nd treted mie Groups Tuulr nerosis Tuulr dilttion 0.11±0.33 0.11±0.33 2.22±0.44 3.11±0.60 0.11±0.33 0.11±0.33 2.33±0.50 3.44±0.52 밀접한 연관이 있을 것으로 생각된다. The kidney setions were stined with hemtoxylin nd eosin. Setions were evluted using mirosope t n originl mgnifition of 200. Tuulr injury were evluted y the following soring system: 0=no tuulr injury; 1= 10% of tuules injured; 2=10 25% of tuules injured; 3=26 50% of tuules injured; 4=51 75% of tuules injured; 5= 75% of tuules injured. Vlues re men±sd (n=5). Different supersripts within sme olumn re signifintly different t the P<0.01 y Dunn's multiple rnge test. 시스플라틴 및 녹차폴리페놀 투여 마우스의 신장 독성 변화 장 GGT와 AP 활성이 비타민 C 투여로 효소활성의 감소가 유방암 세포(EMT6) 이식 마우스에 시스플라틴과 녹차폴 둔화되어 신장 세뇨관 손상에 대한 방지 효과가 있다고 하였 리페놀을 투여하고 10일 경과 후 신장 GGT와 AP 활성을 다. 본 실험의 유방암 세포(EMT6) 이식 마우스에서 시스플 측정한 결과는 Tle 2와 같다. 신장 GGT와 AP 활성은 라틴군()에 비하여 시스플라틴 녹차폴리페놀군( 정상 대조군()과 녹차폴리페놀군() 간에 효소활성 )의 신장 GGT와 AP 활성이 높게 나타나서 Khn 등 도 차이가 없었다. 반면에 시스플라틴군()의 신장 GGT (28)의 녹차추출물 투여로 시스플라틴에 의한 신장 GGT와 활성도는 대조군()에 비하여 25%, AP 활성은 36%가 AP 활성의 감소 방지 효과가 있었다는 실험 결과와 유사하 낮게 나타나서 시스플라틴 투여로 신장의 효소활성도가 감 였다. 그러나 Khn 등(28)의 실험에서는 3% 녹차추출물을 소되어 신장 세포 손상이 있음을 보여주고 있다. 시스플라틴 투여하여 효과가 있었으나, 본 실험은 0.2% 녹차폴리페놀 녹차폴리페놀군( )의 신장 GGT와 AP 활성은 시 투여로도 신장효소의 활성 변화에 대한 방지 효과를 나타내 스플라틴군()보다 각각 19% 및 17%가 높았다. 신장에서 서 그들이 실험에 사용한 녹차추출물보다 본 실험의 녹차폴 GGT와 AP는 세뇨관의 솔가장자리막(rush order mem- 리페놀이 더 효과적인 것으로 생각된다. 이 증가된 것으로 나타나서 암 조직 내 세포의 poptosis가 증가된 것으로 추측되며 이는 암 조직의 크기 증가 억제와 rne)에 많이 존재하는 효소로서, Khn 등(28)은 신장 시스플라틴의 신장 독성에 미치는 녹차폴리페놀의 영향 GGT와 AP 활성이 시스플라틴 투여로 감소되었으나 시스플 을 조직학적으로 관찰한 결과는 Tle 3 및 Fig. 4와 같다. 라틴과 녹차 추출물 병합 투여로 효소활성의 감소가 없었다 신세뇨관 확장과 괴사는 시스플라틴군()에서 25~50%로 고 하였고, Ftim 등(29)은 시스플라틴 주사로 감소된 신 나타나서 시스플라틴 투여로 인해 신장 손상이 일어나는 것 + Fig. 4. Histopthologil nlysis of kidney in the groups of mie studied: ontrol (), green te polyphenol (), ispltin green te polyphenol ( ), nd ispltin (). Mie were studied 4 dys fter lst ispltin injetion (hemtoxylin nd eosin stining, mgnifition 200). : Tuulr nerosis, : Tuulr dilttion.
녹차폴리페놀음용이시스플라틴의암조직성장억제에미치는영향 53 으로나타났고, 시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 에서신세뇨관확장과괴사는 10~25% 로시스플라틴군 () 에비하여손상이적게나타남을보여주고있다. 신세뇨관확장이나괴사는세뇨관의손상을알수있는조직학적소견으로, Atesshin 등 (30) 은시스플라틴투여로신세뇨관확장과괴사가증가된다고하였고, El-Mowfy 등 (31) 은 Ehrlih sites rinom tumor를가진 mie에서 EGCG 를복강으로주사하면항암작용이증가되고시스플라틴에의한신장손상예방효과가있다고하였는데, 본실험의유방암세포 (EMT6) 이식마우스에서 0.2% 녹차폴리페놀경구투여로유사한결과가나타나서낮은농도의녹차폴리페놀경구투여로도시스플라틴에의한신장손상을방지하는효과가있음을알수있다. 따라서녹차폴리페놀은시스플라틴의항암작용상승과신장독성부작용억제효과를동시에나타낼수있을것으로추측되어시스플라틴항암화학요법보조제로서이용가능성이클것으로생각되며, 이러한효과를규명하여활용하기위해서는많은부가적인연구와임상연구가필요할것으로사료된다. 요약본연구는녹차폴리페놀이시스플라틴의항암작용과신장독성에미치는영향을유방암세포 (EMT6) 와암세포이식마우스를이용하여 in vitro와 in vivo 실험으로관찰하였다. 배양한 EMT6 세포에서녹차폴리페놀은시스플라틴에의한세포독성을증가시켰다. 마우스에 EMT6 세포를주사하여유발된종양의크기가시스플라틴군 () 보다시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 에서유의하게작았고, 종양조직 p53와 spse-3 활성화가시스플라틴군 () 보다시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 에서유의하게높았으며, 신장 GGT와 AP 활성은시스플라틴군 () 보다시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 에서유의하게높았고, 신장조직학적소견에서신세뇨관확장과괴사가시스플라틴군 () 보다시스플라틴+녹차폴리페놀군 (+) 에서유의하게낮았다. 이상의결과녹차폴리페놀은 EMT6 유방암세포를이용한 in vitro 및 in vivo 실험에서시스플라틴의항암작용을증강시키면서신장에대한독성부작용은감소시키는효과가있는것으로추측된다. 녹차폴리페놀의시스플라틴항암작용증강과신장독성억제및감소효과는시스플라틴에의한암치료시화학요법제의보조제로서이용가치가있는것으로생각되며, 항암화학요법제에대한보조제로의개발을위해서는대규모동물실험을통한효과입증및부작용에대한실험과임상연구가뒷받침되어야할것으로사료된다. 감사의글본논문은 2012학년도조선대학교학술연구비의지원을받 아연구되었으며이에감사드립니다. REFERENCES 1. Mtsuym R, Reddy S, Smith TJ. 2006. Why do ptients hoose hemotherpy ner the end of life? A review of the perspetive of those fing deth from ner. J Clin Onol 24: 3490-3496. 2. Lønning PE. 2010. Moleulr sis for therpy resistne. Mol Onol 4: 284-300. 3. Snho-Mrtinez SM, Prieto-Gri L, Prieto M, López- Novo JM, López-Hernández FJ. 2012. Suellulr trgets of ispltin ytotoxiity: n integrted view. Phrmol Ther 136: 35-55. 4. Brtelink H, Shellens JH, Verheij M. 2002. The omined use of rdiotherpy nd hemotherpy in the tretment of solid tumours. Eur J Cner 38: 216-222. 5. Chuthpisith S, Eremin JM, El-Sheemy M, Eremin O. 2006. Neodjuvnt hemotherpy in women with lrge nd lolly dvned rest ner: hemoresistne nd predition of response to drug therpy. Surgeon 4: 211-219. 6. Vogl DT, Stdtmuer EA. 2006. High-dose hemotherpy nd utologous hemtopoieti stem ell trnsplnttion for metstti rest ner: therpy whose time hs pssed. Bone Mrrow Trnsplnt 37: 985-987. 7. Mishr BB, Tiwri VK. 2011. Nturl produts: n evolving role in future drug disovery. Eur J Med Chem 46: 4769-4807. 8. Yng CS, Wng X. 2010. Green te nd ner prevention. Nutr Cner 62: 931-937. 9. Gupt S, Hussin T, Mukhtr H. 2003. Moleulr pthwy for (-)-epigllotehin-3-gllte-indued ells yle rrest nd poptosis of humn prostte rinom ells. Arh Biohem Biophys 410: 177-185. 10. Singh M, Bhui K, Singh R, Shukl Y. 2013. Te polyphenols enhne ispltin hemosensitivity in ervil ner ells vi indution of poptosis. Life Si 93: 7-16. 11. Luo T, Wng J, Yin Y, Hu H, Jing J, Sun X, Li M, Zhng Y, Jing Y. 2010. (-)-Epigllotehin gllte sensitizes rest ner ells to plitxel in murine model of rest rinom. Brest Cner Res 12: R8. doi: 10.1186/r2473. 12. Hill JM, Loe E, MLelln A, Hill NO, Khn A, King JJ. 1975. Clinil studies of pltinum oordintion ompounds in the tretment of vrious mlignnt diseses. Cner Chemother Rep 59: 647-659. 13. Jordn P, Crmo-Fonse M. 2000. Moleulr mehnisms involved in ispltin ytotoxiity. Cell Mol Life Si 57: 1229-1235. 14. Hrtmnn JT, Lipp HP. 2003. Toxiity of pltinum ompounds. Expert Opin Phrmother 4: 889-901. 15. Shmseddine AI, Frht FS. 2011. Pltinum-sed ompounds for the tretment of metstti rest ner. Chemotherpy 57: 468-487. 16. Shrusole MJ, Lu W, Chen Z, Shu XO, Zheng Y, Di Q, Ci Q, Gu K, Run ZX, Go YT, Zheng W. 2009. Drinking green te modestly redues rest ner risk. J Nutr 139: 310-316. 17. Thngpzhm RL, Singh AK, Shrm A, Wrren J, Gddipti JP, Mheshwri RK. 2007. Green te polyphenols nd its onstituent epigllotehin gllte inhiits prolifertion of humn rest ner ells in vitro nd in vivo. Cner Lett 245: 232-241. 18. Sldowski D, Steer SJ, Clothier RH, Blls M. 1993. An
54 이병래 조정일 박평심 improved MTT ssy. J Immunol Methods 157: 203-207. 19. Tenenhouse HS, Sriver CR, Vizel EJ. 1980. Alkline phosphtse tivity does not medite phosphte trnsport in the renl-ortil rush-order memrne. Biohem J 190: 473-476. 20. Tte SS, Meister A. 1985. γ-glutmyl trnspeptidse from kidney. Methods Enzymol 113: 400-419. 21. Ness MU, Bele P, Chn C, Yu JQ, Huq F. 2012. Comintions of resvertrol, ispltin nd oxlipltin pplied to humn ovrin ner ells. Antiner Res 32: 53-59. 22. Chn MM, Soprno KJ, Weinstein K, Fong D. 2006. Epigllotehin-3-gllte delivers hydrogen peroxide to indue deth of ovrin ner ells nd enhnes their ispltin suseptiility. J Cell Physiol 207: 389-396. 23. Perismy VS, Alshtwi AA. 2013. Te polyphenols modulte ntioxidnt redox system on ispltin-indued retive oxygen speies genertion in humn rest ner ell. Bsi Clin Phrmol Toxiol 112: 374-384. 24. Grhm HN. 1992. Green te omposition, onsumption, nd polyphenol hemistry. Prev Med 21: 334-350. 25. Yee MS, Blkley BW, Begleiter A, Leith M. 2008. Delyed sodium thiosulphte dministrtion redues ispltin effiy on mouse EMT6 tumour ells in vitro. J Otolryngol Hed Nek Surg 37: 638-641. 26. Frser M, Chn SL, Chn SS, Fisus RR, Tsng BK. 2006. Regultion of p53 nd suppression of poptosis y the solule gunylyl ylse/gmp pthwy in humn ovrin ner ells. Onogene 25: 2203-2212. 27. Hstk K, Gupt S, Ahmd N, Agrwl MK, Agrwl ML, Mukhtr H. 2003. Role of p53 nd NF-kppB in epigllotehin-3-gllte-indued poptosis of LNCP ells. Onogene 22: 4851-4859. 28. Khn SA, Priymvd S, Khn W, Khn S, Frooq N, Yusufi AN. 2009. Studies on the protetive effet of green te ginst ispltin indued nephrotoxiity. Phrmol Res 60: 382-391. 29. Ftim S, Arivrsu NA, Mhmood R. 2007. Vitmin C ttenutes ispltin-indued ltertions in renl rush order memrne enzymes nd phosphte trnsport. Hum Exp Toxiol 26: 419-426. 30. Ateşşhín A, Ceríşi AO, Yue A, Bulmus O, Cikim G. 2007. Role of ellgi id ginst ispltin-indued nephrotoxiity nd oxidtive stress in rts. Bsi Clin Phrmol Toxiol 100: 121-126. 31. El-Mowfy AM, Al-Gyyr MM, Slem HA, El-Mesery ME, Drweish MM. 2010. Novel hemotherpeuti nd renl protetive effets for the green te (EGCG): role of oxidtive stress nd inflmmtory-ytokine signling. Phytomediine 17: 1067-1075.