Microarray 기초및분석 이바이오젠
목 차 마이크로어레이기초 정의 / 분류 / 제작기술 / 원리 Gene Expression 실험분석 시료준비 RNA QC 실험분석과정 데이터분석 -2-
바이오칩 & 마이크로어레이 - 정의 1. 유리, 실리콘, 플라스틱등의매체위에생체 분자를집적하여만든것 2. 현재 DNA, 단백질, 화학물질, 유기물질등바 이오소재를집적하여만든 Microarray 를총칭 하여바이오칩이라함 3. 유전자및단백질발현연구, 바이오마커발굴, 진단제품, 바이오센서, 신약개발, 독성물질분석, 환경모니터링, 식품위해성평가등광범위하게응용할수있음. 4. BioChip = BT + NT + IT -3-
바이오칩 - 분류 분류명칭특징 제조형태 탐지물질 응용분야 마이크로어레이칩 마이크로프루딕스칩 DNA 마이크로어레이 Protein 마이크로어레이 Tissue 마이크로어레이 Lab-on-a-chip 연구용바이오칩 질병진단용바이오칩 생체삽입용바이오칩 수천혹은수만개이상의생체물질을고체기질에일정한간격으로배열. 마이크로크기의 3 차원채널을가공해서생체물질을흘러주면서반응을봄. 고체기질에많은종류의 DNA 를일정하게배열. 고체기질에많은종류의 Protein 를일정하게배열. 고체기질에많은종류의 Tissue 를일정하게배열. 마이크로어레이칩과마이크로프루딕스칩이혼합되어일련의실험과정을칩상에서구현. 바이오마커발굴및질병의메커니즘을찾아질병진단제개발및신약개발에응용. 자궁경부암진단용및백혈병, 당뇨병, 각종암등의다양한질병을진단하는목적. 생체내에마이크로바이오칩 ( 바이오센서 ) 를삽입하여각종생체내반응을모니터링함. -4-
DNA 마이크로어레이 - 분류 cdna Short oligo Long oligo System Closed = Out-dated probe Probe cdna ( 200 bp) Oligo (20~30mer) Oligo (60~70mer) Probe source PCR products Synthesis Sensitivity Highest Same as left or less Specificity Low High? Chip making Spotting or inkjet In situ, spotting or inkjet Reliability Less More? Detect splicing variant Application Not Expression Profile, CGH OK? Expression profile, Genotyping, SNP, Resequencing, CGH, ChIP -5-
DNA 마이크로어레이 - 제작기술 In-house Affy Amersham Phalanx NimbleGen Agilent CombiMatrix -6-
DNA 마이크로어레이 - 제작기술 Affymetrix : photolithography -7-
DNA 마이크로어레이 - 제작기술 Nimblegen : photolithography using MAS tech -8-
DNA 마이크로어레이 - 제작기술 Agilent : SurePrint tech -9-
DNA 마이크로어레이 - 제작기술 cdna microarray 제작과정 -10-
DNA 마이크로어레이 - 제작기술 Glass slide type : Amine coated slide -11-
DNA 마이크로어레이 - 제작기술 Glass slide type : Aldehyde coated slide -12-
DNA 마이크로어레이 - 원리 Southern Hybridization (Southern Blot): Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. (1975) 유전자 A Label with radioisotope Hybridization transfer Autoradiography DNA 전기영동 Nitrocellulose -13- X-ray film
DNA 마이크로어레이 - 원리 Reverse Hybridization Assay Similar to DNA Chip Mixture of different mrna (total cellular RNA from sample A) Label with radioisotope 다른종류의 DNA or genes Hybridization Autoradiography Nitrocellulose Membrane Nitrocellulose -14- X-ray film (Autoradiogram)
DNA 마이크로어레이 - 원리 High-Throughput Screening using DNA Chip -15-
DNA 마이크로어레이 - 원리 High-Throughput Screening using DNA Chip -16-
DNA 마이크로어레이 - 원리 Microarray : Competitive Hybridization (I) Reference RNA - Green (Cy3) Test RNA -Red (Cy5) No Change Test = Ref -17-
DNA 마이크로어레이 - 원리 Microarray : Competitive Hybridization (II) Reference RNA - Green Test RNA -Red Up regulation Test > Ref -18-
DNA 마이크로어레이 - 원리 Microarray : Competitive Hybridization (III) Reference RNA - Green Test RNA -Red Down regulation Test < Ref -19-
Microarray Process Planning Sample Acquisition & Extraction Consider : RNA Source Extraction Method Sample Amplification/ Labeling E.g In-vitro Transciption Direct Labeling Data Mining Using Functional Classification Pathway Analysis Q/C Hybridiazation, Detection & Scanning Statistical Analysis /Data Filtering Using Significance Tests Clustering Data Normalization Using Lowess RMA Invariant -20- Feature Extraction Using GenePix Custom Software Imagene
Gene Expression- 시료준비 Total RNA : ~ 5μg TriZol 이용시예상되는 RNA 양 (tissue 1mg, cultured cell 1*106 당 ) Liver and spleen, 6-10 μg Kidney, 3-4 μg Skeletal muscles and brain, 1-1.5 μg Placenta, 1-4 μg Epithelial cells (1 106 cultured cells), 8-15 μg Fibroblasts, (1 106 cultured cells) 5-7 μg RNA 분리 RNA 분리는 InVitrogen 사에서제공하는 TriZol 시약의표준방법으로수행 분리된 RNA 는 RNase free water 나 DEPC DW 에녹여보관 RNA QC Spectrophotometry : OD260/OD280 값 Denaturing agarose gel electrophoresis RNA 의양및농도 RNA Delivery : Dry ice packing -21-
Gene Expression- RNA QC Sample ug/ul 260/230 Total (ug) 1 1.7616 1.86 44.040 2 2.1745 1.99 43.490 3 0.1870 1.24 3.740 4 2.0139 1.81 56.3892 Ratio(28s/18s) RIN 2.1 10.0 2.2 10.0 1.5 N/A 2.3 10.0-22-
Gene Expression- 실험과정 Case 1 : Normal, Treat1, Treat2 Case 2 : Reference, Disease Case 3 : 그룹 A (control, test1, tetst2, ) 그룹 B(control, test1, tetst2, ) -23-
Gene Expression- Data Featuring <Scanning> <Quantification> <Normalization> <Significant data> -24-
Data Analysis- ExDEGA ExDEGA : Excel based Differentially Expressed Gene Analysis tool Add Another GO 기능을통해사용자가원하는 GO 를자유롭게구성할수있습니다. Significant gene 을매우빠르고쉽게데이터를취할수있고그래프로표현할수있습니다.
Data Analysis- ExDEGA Pie chart 를통해 Significant gene 대상으로 BioFunction 분포를확인하고영역을클릭하면해당 up/down 유전자가필터링됨. Bar graph 를통해 BioFucntion 별로 up/down 의분포를확인하고 bar 를클릭하면해당유전자를확인할수있음.
Data Analysis- ExDEGA
Data Analysis- ExDEGA
Data Analysis- Clustering Hierarchical Clustering (HCL) Principal Component Analysis (PCA) K-means clustering (KMC)
Data Analysis- Biological Function GO & Pathway Gene Set Enrichment Network Analysis QuickGO DAVID Cytoscape (ClueGO) KEGG Mapper GSEA IPA (Option)
Data Analysis- Gene Ontology & Pathway Quick GO DB 를이용한 Gene Ontology 분석 KEGG DB 를이용한 Pathway 분석
Data Analysis- Gene Set Enrichment DAVID tool 을이용한 Functional Annotation 분석 String-db tool 을이용한 gene set 분석 MSigDB 기반 GSEA 분석
Data Analysis- Networks PPI(String) GO network (ClueGO) Pathway network (ClueGO) IPA network (Optional) Gene set network (Enrichment map)
Microarray 전문회사 TEL : 02-3141-0791 Email : service@e-biogen.com http://www.e-biogen.com 34