식물생명공학유전자분석의 Tool Lab of Plant Resources & Biotechnology 조준형교수 Dept. of Biological & Environmental Science 상영바이오관 4 층 403
생물의기본단위인세포는다양한종류의 biomolecule 로이루어져있다. 식물세포의경우아래물질로구성. 세포벽 : 다당류셀룰로스등세포막 ( 세포소기관막 ) : 인지질리보좀및효소 : 단백질유전물질 : 핵산 ( 뉴클레오타이드 ) 생물학적유전정보를갖는물질은 DNA 혹은 RNA 등의 nucleotide 이며, 이들의발현에의해단백질 (Protein) 이만들어진다. 핵산은생물개체의유전적정보 (genetic information) 를담고있으며, 생물간의유전적차이를알아보거나, 유전자발현에의해만들어지는단백질에대한연구를위해전기영동기술이필요하다.
Tools for BioTechnology -Preparation of DNA & Electrophoresis- Bio-molecule 의화학적구조적이해 (DNA 와 Protein) 분석방법의원리와결과의해석 Bio-molecule 분석을통한유전정보의이해 목적 생물간의유전적차이연구 : 유전자단편의차이구명단백질의서열차이구명 유전자의기능및발현산물의연구 : 형질전환기술확립도입유전자의확인, 발현구명유전자발현산물 (final product) 연구유전자발현에의한형질의특성변화연구
Extract DNA from the Plant Cell
Extract DNA from the Plant Cell 세포 ( 구성 : Carbohydrates, Lipids, Proteins, & Nucleic acids) 세포의 biomolecules 는종류에따라불용성또는수용성 1. 세포의파괴 막자사발, 액체질소 (-196C ) 2. 세포내물질의용출 추출용액 (SDS, CTAB 세포벽, 세포막분산, 단백질파괴 ) SDS, CTAB extraction buffer 이용 Detergent SDS (Sodium dodecylsulfate) CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide)
단백질제거 3. Phenol/Chloroform treatment 세포찌꺼기와 DNA 의분리 4. Centrifugation 12,000 rpm 당, 단백질, 셀룰로스, DNA, RNA DNA 만있는부분 ETOH 에의한 DNA 응결 ( 침전 ) 5. Supernatant 6. Ethanol precipitation DNA 가있는상등액 세포찌꺼기, cellulose 등 단백질등이녹아있는페놀용액 RNA 제거 7. RNase
DNA 응결 8. Ethanol or isoprophyl alcohol DNA 농축 Ethanol 침전법 다량의 DNA 일경우직접건져내거나원심분리 DNA 희석보관 9. TE buffer DNA 농도정량 DNA 분석 10. PCR 분석 (10-50ng/rxn) Southern blot (1-5ug/rxn)
Extract DNA from the Plant Cell Collect Plant tissue(leaves, shoot, root) Grind Plant tissue Grind the Plant tissues with Liquid nitrogen Eliminate Carbohydrates Treat Extraction Buffer containing CTAB or SDS for 30 mins. at 55 C Centrifugation at 12,000xg and take the supernatant (=upper aqueous phase) DNA, protein / buffer Extraction buffer Plant tissue Extraction buffer Plant tissue
SDS 또는 CTAB 대신가정용세제이용 1. 찬물 1 컵, 소금 ¼ 티스푼 믹서로간다 2. 커피필터또는헌스타킹으로식물조직걸러내고용액만모은다. 3. 걸러진용액에세제희석액 ( 물 : 세제 =4:1, 1/5 컵 ) 넣고잘혼합한후 5 분간방치 4. 용액을시험관에 1/3 정도담아 60-70 도뜨거운물에 15 분간, 찬물에 5 분간넣어둔다. 5. 차가운알코올을동량혼합한후아주천천히흔든다. 6. 유리막대로 DNA 를건져낸다.
Liquid Nitrogen (-196 C) 대기압력하에서 -196 도 물은서서히어는과정에서얼음입자에의해세포를파괴한다. 액체질소에의한급속한세포의동결은세포내얼음결정에의한세포파괴를막거나, 세포내물질 ( 효소 ) 등의활성을급속히정지시킬수있다. 세포의장기저장에이용된다.
강력한 inonic detergent ( 세정제, 계면활성제 ) 세포막을분산시키고단백질을파괴하는기능 = 25 : 24 : 1 Phenol / Chloroform : 두물질은잘섞이며, 단백질제거에쓰인다. Iso-amylalcohol : 거품방지, 넣지않아도무방 EtOH 이용한 DNA 침전시 DNA 가엉기는작용을도움즉, DNA 순도증가역할 추출용액에의해파괴된세포벽파편, 지질성분들을원심력에의한중력힘에의해침강시키는역할 Rpm 단위는분당 rotor 의회전속도를의미하며, Xg 값은중력의몇배임을나타내는단위이다동일속도로회전하는 rotor 라할지라도지름이큰경우 g( 중력값 ) 이크다
12,000rpm Rotor 크기에따라속도와중력가속도 (g) 값이달라진다. 3,000rpm
원심분리기의이용 : 원심분리기는세포의침전, 시료의침전뿐만아니라밀도구배에따른세포내 biomolecule 을구분하여분리정제할수있다. 박테리아세포의침전 CsCl DNA 분리
Eliminate Proteins( 단백질제거 ) Mix with Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol (24:1) for 1min by inversion Centrifugation at 13,000rpm and take the supernatant Collecting DNA Add Ammonium (potassium or sodium) acetate (50ul) and equal volume (500ul) of cold absolute EtOH Gentle mix by inverting tube & take the DNA pellet
에탄올침전법원리 : DNA 는음전하이며, 물에녹아있는상태 Na+ 또는 K+ 등으로음전하를 blocking 하여물에녹지않게하고, 에탄올은물과 DNA 사이의수소결합을끊어주는역할을한다 DNA 가있는상등액 세포찌꺼기, cellulose 등 식물엽조직 7ml 벼의경우약 10 매 단백질등이녹아있는페놀용액 에탄올에의한 DNA 침전 500ng=0.5ug/ul
Bio-molecule : DNA 의구조 DNA 의구조 Na+ Na+ (-) (-) Na+ Na+ (-) (-) Na+ Phospho-diester 결합 Na+ (-) (-) Na+ (-) Na+ (-) Na+
DNA 분석
DNA 의정량 UV/VIS spectrophotometer 분광광도계의이용 260nm/280nm 의빛으로시료를투과시켜농도를측정. 260nm 는 DNA 의퓨린과피리미딘링구조에서최대흡광율을보인다. 자외선인 260nm 에서 1 의측정값을얻었다면 DNA 이중나선 50ug 양이다. 반면단백질의경우 280nm 에서최대흡광율을보인다. 추출한 DNA 시료의흡광도를측정하였을때 260/280nm 에서의비율이 1.8 미만이면 DNA 이단백질등이물질이혼합된경우이다. 260nm
(1) Bio molecule 은 고유의크기와모양이있다. 그리고, 고유의양가 (+) 혹은음가 (-) 의전하 (electric charge) 을갖는다. (2) 초등학교때배운물질의분리 분필의체거름현상 분필 모세관현상에의한물의이동 용매물 분자크기에따른물질의분리
체거름효과 (Sieve Effect)
전기영동원리 크로마토그래피와전기영동의기본원리 동일한용매의이동 ( 크로마토그래피 ) 또는 동일한전기장 ( 전기영동 ) 조건에서 동일한시간에분자의크기및모양에따라 체거름효과에의해 biomolecule 을분리
< 개요 > 전기영동 (electrophoresis) 은 Gel 상의구멍에의한체거름효과 DNA혹은 Protein( 단백질 ) 을크기별로구별할수있는실험방법이다. 전기영동시 Gel은 DNA나 Protein이지나가는도로역할을며, Gel에는미세한구멍이존재한다. 이러한구멍의크기는 gel을만들때 gel의주성분함량조절로바꿀수있다. 즉, 이러한구멍의크기로인해고유의크기 ( 분자량 ) 를갖는 biomolecule 들은일정시간내에도달하는거리가달라지게된다. 이를체거름효과라한다.
전기장과분자량에따른전기영동이동거리 DNA나 Protein은각각 (-) 또는 (+) 전하를띠므로전기영동시 gel의한끝지점에샘플을로딩한후전기장을걸어주면 bio-molecule 들은서로다른전하를향해움직인다. 이러한특성을이용해 DNA 나 Protein 은 gel 상에존재하는여과구멍에의해이동 거리가달라진다. 즉샘플의크기가작을수록구멍을통과할수있는속도가빨 라져서멀리까지가게되며, 클수록이동하는데많은시간이걸리게된다. 분자의모양에따른전기영동이동거리또한, 분자의크기뿐만아니라모양에따라서도이동거리가달라진다. 동일분자량인경우 linear형태이냐, circular형태이냐에따라이동거리가달라지는데, circular 또는 globular 형태가 linear형보다더멀리이동될수있다.
Gel 대신 paper 를이용한전기영동의원리
전기영동시분자이동에관련된 factor 들 분자량 Protein 의경우 ( 달톤, dalton) DNA 의경우 ( 베이스페어, base pair) 분자의모양 Protein 의경우 3 차원구조의특징에따라다름 원형구조, 선형구조 DNA 의경우 linear, circular, or open frame Electric charge Protein 의경우 (+) or (-) DNA 의경우 (-) Gel 의종류 starch, agarose, polyacrylamide gel etc Gel 의농도 pore size 를결정
전기영동 kit 모양에따라 우뭇가사리아가로스의원료 주로단백질 (or DNA) 전기영동에이용 종류 : polyacrylamide (acrylamide+bis-acrylamide) 주로 DNA 전기영동에이용 Gel 종류 : agarose
수평형전기영동장치 (1) Power supplier (+) (-)
수평형전기영동장치 (2)
Gel 을만들기위한 agarose 의정량 최대 10bp~50kb 의 DNA 단편분석 수평형전기영동에는아가로스 gel 이이용된다. 가열하여녹인후틀에붓는다 Comb Gel
전기영동에이용되는 Agarose gel 의전자현미경사진 Agarose 의 pore
Gel 이굳은후전기영동장치에안착한모습 Well ( 홈 ) : Comb 이끼워졌던자리
Well DNA 를 gel 에 loading 시파란색의 dye( 염색시약 ) 을함께넣는데이는전기영동시 DNA 의이동을육안으로관찰하고자함이다.
DNA 희석과정 /TE buffer DNA 농도 : 50-100ng/ul (PCR) PCR 증폭에의한 DNA 의양증가 500ng(0.5ug)-1,000ng(1ug)/ul (RFLP) 제한효소에의한 DNA 절단 (DNA 양증가없음 ) (-) (-) (-) (+)