Korean J Leg Med 2012;36:74-84 Available online at 원 저 Abdominal-B (Abd-B)

Korean J Leg Med 2012;36:74-84 Available online at http://www.kjlm.or.kr 원 저 http://dx.doi.org/10.7580/koreanjlegmed.2012.36.1.74 Abdominal-B (Abd-B) 항상성상자염기서열을이용한시식성파리종의동정 박호국 정욱희 신상언고광수 황적준 고려대학교의과대학법의학교실 접수 : 2012년 4월 17일게재승인 : 2012년 5월 10일 책임저자 : 황적준 (136-701) 서울시성북구안암동 5 가 126-1 번지고려대학교의과대학법의학교실전화 : (02) 2286-1158 FAX : (02) 928-3901 E-mail : jjhwang411@korea.ac.kr DNA- Based Identification of Necrophagous Fly Species Using Abdominal-B (Abd-B) Homeobox Sequence Hu Guo Piao, Ukhee Chung, Shang Eon Shin, Kwang Soo Ko, Juck-Joon Hwang Department of Forensic Medicine, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea In medicolegal investigations, correct identification of the necrophagous fly species collected around and on the corpse is an essential step for estimating the postmortem interval (PMI). Therefore, forensic pathologists and entomologists investigating deaths due to violent crimes need a rapid, easy-to-use protocol to identify fly species found on corpses. A rapid and robust DNA-based tool that can distinguish between various immature and mature species from the Calliphoridae, Muscidae, and Sarcophagidae families would be ideal for such investigations. To date, the DNA barcode initiative is the best approach for identifying species-specific nucleotide sequences. We have developed 3 sequence-characterized amplified region (SCAR)-based identification systems derived from the Abdominal-B homeobox sequences of 17 fly species belonging to the Muscidae and Sarcophagidae. The flies used in this study were collected in Korea. These assay systems can classify 17 forensically important fly species into the dipteran family group and reliably distinguish them from inter- and intraspecific fly species through a 2-step multiplex PCR. This novel approach may also be used as an alternative to conventional DNA-based identification methods. Key words : necrophagous fly, Abdominal-B, identification, postmortem interval 서론사후경과시간 (Postmortem interval; PMI) 추정은법의검시에서해결되지않은중요하고어려운과제이다. 법의실무에서사후경과시간은시반, 시체경직, 체온하강과같은조기시체현상, 그리고위내용물의소화시간, 유리체액, 뇌척수액같은체액의생화학분석등을통해추정하지만시신의부패가진행되면이들을이용할수있는근거마저도점차소실된다. 시신의부패가진행되는과정에는많은미생물과동물들이관여하는데, 그중 85% 이상이곤충들이며특히시식성파리 (necrophagous fly) 들은죽은생물체에불과몇분만에찾아와산란을하고죽은생물체가방치되는동안부화하여성장하므로사후경과시간을추정하는중요한지표로이용될수있다. 1) 시식성파리는종에따라생활습성이나성장주기가다르기때문에시식성파리를이용하여사후경과시간을추정하기위해서는파리의종을정확하게식별하는작업이선행되어야한다. 하지만정확한종의식별은전문지식을갖춘분류학자들만이가능할뿐만아니라, 사건현장에서주로채집되는파리의알, 구더기, 번데기같은미성숙개체의종동정은전문지식을갖춘분류학자들도어려워하는제한이있다. 최근에 Sukontason 등 2) 과 Mendonca 등 3) 은주사전자현미경 (scanning electron microscopy, SEM) 을이용하여검정파리과 (Diptera: Calliphoridae) 에해당하는미성숙개체의종을동정하였다고보고하였으나, 이또한미성숙개체의형태학적전문지식을필요로하므로법의실무에서보편적으로이용하기에는한계가있다. 따라서많은연구자들은분자생물학적종동정법 (DNA-based species identification) 을제안하였고, 특히 74 박호국외 4 인

미토콘드리아시토크롬 C 산화효소 (mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I, CO I) 유전자를이용한시식성파리의종동정에관한연구가많이보고되었다. 4-8) 그러나미토콘드리아 DNA는모계로만유전되는특성때문에진화학적으로최근에분화하여 incomplete lineage sorting을보이는근연관계의종 (sister species) 이나이종간잡종 (hybrid) 의경우에는구분이잘안되거나계통분류학상의위치를정확히파악하기어렵다는제한이있다. 9, 10) 따라서연구자들은또다른유전자마커를찾기위한연구를시도하였고, 시식성파리인 Chrysomya (Diptera: Calliphoridae) 속에서 2nd ribosomal internal transcribed spacer (ITS2) 또는 ribosomal DNA (rdna) 등의핵 DNA를이용한파리종의동정에관한연구 11, 12) 가발표되었다. 이와같이핵 DNA를이용한시식성파리의종동정은충분한가능성이있으나아직까지핵 DNA를이용하여한국에서발견되는시식성파리의종을동정한예가없었고, 과학수사의실무에서시식성파리의다양한종에대한종동정이시급히해결해야할과제이므로본연구에서는새로운핵 DNA를이용한유전자마커를개발하고자하였다. 절지동물 ( 특히, 곤충 ) 에서항상성유전자 (homeotic gene) 는배아발생에서체절특성 (segmental identity) 을조절하는중요한유전자로서, 곤충에서밝혀진항상성유전자는 Labial (Lab), Proboscipedia (Pb), Deformed (Dfd), Sexcombs reduced (Scr), Antennapedia (Antp), Ultrabithorax (Ubx), Abdominal A (Abd-A), Abdominal B (Abd-B), Hox 3 (Zen, Z2, Bicoid), fuzitarazu (Ftz) 등이있다. 13, 14) 이유전자들은 항상성상자 (homeobox) 라고하는진화적으로잘보존되어있는 180개의염기를포함하고있으며, 이염기서열에의해 60개의아미노산으로구성된 homeo domain이존재한다. 이부위는같은종뿐만아니라서로다른종에서도상당히유사한염기서열을갖기때문에생물의진화학적연구에많이이용되고있다. 그중에서 Abd-B는배아의발육과정에서 10-14 복부체절형성에관여하는유전자로서그기능을제거하면복부체절이흉부체절처럼발육하는, 배아발육에치명적인결과를초래한다. 15) 초파리의 Abd-B 유전자는 Exon 7과 Exon 8사이에단백질암호화에관여하지않는 intron 염기서열이존재하는것으로알려져있고이러한 intron의존재는서로다른종간에염기서열변이및길이다형성 (sequence and length polymorphism) 을나타낼것으로예상되므로종동정마커를개발하는데, Abd-B 유전자의항상성상자와그주변부염기서열을이용하고자하였다. 따라서, 본연구에서는시식성파리종을동정하기위한새로운유전자마커를발굴하고자, Abd-B 유전자의항상성상자와그주변부염기서열에대해시식성파리의염기서열을밝히고, 다른파리종간, 그리고동일한파리종내에 DNA 염기서열의다형성을확인한후그다형성을이용하여시식성파리들의 종을간편하게동정할수있는식별력이높은종특이적 DNA 표지자체계 (species-specific DNA marker system) 인 sequence characterized amplified polymorphic regions (SCARs) 을개발하고자하였다. 재료및방법 1. 파리채집및 DNA 추출토끼와돼지를이용한부패실험 ( 고려대학교녹지운동장 2004년, 평택시청북면어연리 2005년 ), 소와돼지의간을이용한유인실험 ( 고려대학교의과대학교정 2006년 ) 에서부패가진행되는동안부패단계별로찾아오는시식성파리종을포충망을이용하여채집하였고, 동일한방법으로제주도 (2008년, 2009년 ) 에서도시식성파리를채집하였다. 채집된파리는즉시알코올솜이든플라스틱용기내에방치하여살상한뒤집게로생식기부분을잡아당겨밖으로잘드러나보이도록처리한후 95% 에틸알코올용액에넣어고정하였다. 알이나유충상태로채집된개체들은부란기에서돼지의간을사료로주면서사육하였고, 야외에서채집된성충파리와동일한방법으로처리하였다. 채집한파리는곤충분류학을전공한전문가에게형태학적동정을의뢰하였다 (Table 1). 종이확인된파리는 2.0 ml Eppendorf tube에넣고액체질소로 5분간급속냉동시킨후 SKMILL-200 (Tokken Inc, Chiba, Japan) 을이용하여파리를분쇄하였다. 분쇄된파리조직으로부터 QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN, Hilden, Germany) 를이용하여제조사지시서 (manufacturer s instruction) 에따라 DNA를추출한후, DU650 spectrophotometer (Beckman, VA, USA) 를이용하여농도를측정하였다. 2. Abd-B 항상성상자염기서열확인검정파리과, 집파리과, 쉬파리과에해당되는시식성파리 31 종 (199개체) 의 Abd-B 항상성상자와그주변부염기서열을증폭하기위해 NCBI GeneBank에등록된초파리 (Drosophila melanogaster, NM_206498.1), 사막메뚜기 (Schistocerca gregaria, X69161.1), 거짓쌀도둑거저리 (Triboliumcastaneum NM_001039430.1), 누에 (Bombyx mori, NM_00146228.1) 의 Abd-B 유전자의항상성상자와그주변부염기서열과아미노산서열을획득한후, Chromas Pro DNAStar 프로그램을사용하여 codon degeneracy가낮은공통염기서열부분을선택한후 Primer 3를이용하여 degenerate primer를제작하였다. 제작된 forward primer는 5 -GLHEW-3 의아미노산서열에근거하여 5 -GGN YTN CAY GAR TGG AC-3 이고, reverse primer는 5 - Abdominal-B (Abd-B) 항상성상자염기서열을이용한시식성파리종의동정 75

DLP.QH-3 (. 은종결코돈 ) 의아미노산서열에근거하여 5 -TT RTC NAY NGG TCA YTG RTG-3 이다. Degenerate PCR의반응용액은각성분을혼합하여최종농도가 1x Gold buffer (Applied Biosystems, Foster, CA, USA), 2.5 mm Gold MgCl 2 (Applied Biosystems), 0.2 mm dntps (Finnzymes, Espoo, Finland), 0.1 μm primers, 0.2 unit AmpliTaq Gold TM polymerase (Applied Biosystems), 20 ng 주형 DNA를포함하도록하였고, 증류수를첨가하여최종부피는 10 μl가되도록하였다. 증폭반응은 94 에서 5분간열처리한후, 94 에서 30초, 42 에서 1분, 72 에서 1분의조건으로순환반응을시작하여매회결합온도를 1 씩낮추어 34 까지낮추는 9회의순환반응을한후, 10회부터다시 94 에서 30초, 42 에서 1분, 72 에서 1분간의순환반응을 35회시행하였다. PCR 산물들을 3% agarose gel (Seakem GTG 2%: Nusieve GTG 1%, FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA) 로크기를확인후, Geneclean III kit (BIO 101 Systems, Table 1. Sample Size and List of Necrophagous Fly Species Used in This Study Family Species Name (symbol) Sample Size Calliphoridae Aldrichina grahami (Gr) 6 (blow fly) Lucilia illustris (Il) 8 Lucilia ampullacea (Am) 5 Lucilia caesar (Ca) 10 Lucilia porphyrina (Po) 5 Paenicia sericata (Se) 5 Phormia regina (Re) 5 Chrysomya megacephala (Mg) 10 Chrysomya pinguis (Pi) 6 Calliphora vicina (Vi) 9 Calliphora lata (La) 7 Hemipyrellia lingurriens (Li) 1 Triceratopyga calliphoroides (Cl) 7 Muscidae Fannia prisca (Pri) 3 (house fly) Muscina angustifrons (Ang) 12 Muscina stabulans (Sta) 10 Muscina pascuorum (Pas) 3 Hydrotaea occulta (Occ) 4 Hydrotaea dentipes (Den) 8 Ophyra chalcogaster (Cha) 4 Ophyra nigra (Nig) 12 Ophyra leucostoma (Leu) 9 Musca domistica (Dom) 4 Phaonia aureola (Aul) 4 Sarcophagidae Boettcherisca peregrina (Per) 7 (flesh fly) Helicophagella melanura (Mel) 3 Parasarcophaga albiceps (Alb) 9 Parasarcophaga harpax (Har) 7 Parasarcophaga kanoi (Kan) 1 Parasarcophaga similis (Sim) 11 Parasarcophaga haemorrhoidalis (Hae) 4 199 Vista, CA, USA) 를이용하여제조사의지시서에따라각 PCR 산물들을정제하고, T&A Cloning Vector kit (RBC Cloning System, Real BioTech Corporation, Taiwan) 를이용하여 cloning 후, ABI PRISM BigDye Terminator ver1.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) 를이용하여 sequencing PCR 하고, ABI Prism TM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) 로염기서열을획득하였다. 획득된염기서열은 Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) 4 프로그램으로분석한후검정파리과, 집파리과, 그리고쉬파리과에해당하는시식성파리들의 Abd-B 항상성상자를포함하는주변부염기서열을직접증폭할수있는 universal primer sets를제작하였다. 16) Forward universal primer는 UF1 (5 - CACGAGTGGACGGGGCAAGT-3 ), UF2 (5 - CATGAATGGACCGGTCAGGT-3 ) 이고, reverse primer 는 UR1 (5 -TGGCATGATGGCCCATGCTC-3 ), UR2 (5 -TTGTCCAAGGGTCACTGATG-3 ) 로설계하였다. 검정파리과는 UF1과 UR1, UF2와 UR1의두종류의primer 조합, 집파리과는 UF2와 UR1, UF2와 UR2의두종류의 primer 조합, 쉬파리과는 UF2와 UR2의한종류의 primer 조합으로각과의모든파리종을 PCR 증폭할수있도록하였다. PCR의반응용액은각성분을혼합하여최종농도가 1x Gold buffer, 2.5 mm Gold MgCl 2, 0.2 mm dntps, 각각의 0.2 μm primer, 0.5 unit AmpliTaq Gold TM polymerase, 10 ng 주형 DNA를포함하도록하였고, 증류수를첨가하여최종부피는 25 μl가되도록하였다. 증폭반응은 95 에서 10분간변성하고, 95 30 초, 58 30초, 72 60초에서 35회순환반응후 72 15분간반응하였다. PCR산물용액 20 μl에 calf intestinal phosphatase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) 0.2 μl, exonuclease I (New Enggland Biolabs) 0.25 μl를첨가하여 37 에서 45분간반응시키고 72 에서 15분간불활성화하였다. 그후 ABI PRISM BigDye Terminator ver1.1 Cycle Sequencing kit를이용하여 sequencing PCR을시행하고, ABI PRISIM TM 310 Genetic Analyzer 를이용하여염기서열을획득하였다. 3. 계통수분석 MEGA-4 프로그램을사용하여초파리및획득된시식성파리들의 Abd-B 항상성상자염기서열을추가하여정렬하고, Neighber-joining 방법으로계통수분석 (phylogenetic analysis) 을시행하였다. 계통수분석을위해 p-distance model을사용하였고, Bootstrap은 1,000회반복하였다. Outgroup은초파리의 Abd-B 항상성상자염기서열을이용하였고, 이를통해계통수의뿌리를설정하여실험대상분류군사이의진화상의상관관계를추정할수있도록하였다. Abd-B 항상성상자의한가운데에 intron 염기서열이존재하므로계통 76 박호국외 4 인

수분석시 complete deletion model을사용하지않고 pairwise deletion model을적용하였다. 4. SCAR marker를이용한 multiplex PCR 체계구축획득된 31종파리를각과별로염기서열을정렬한후, FastPCR 6.0 프로그램을이용하여과특이적인 primer를설계하고이들을조합하여 multiplex PCR체계를구축하였다 (Table 2). 17) PCR 반응용액은각성분을혼합하여최종농도가 1 x Gold buffer, 2.5 mm Gold MgCl 2, 0.2 mm dntps, 1 x primer 혼합액, 0.5 unit AmpliTaq Gold TM polymerase, 20 ng 주형 DNA를포함하도록하였고, 증류수를첨가하여최종부피는 10 μl가되도록하였다. 증폭반응은 95 에서 11분간변성하고, 95 30초, 53 30초, 72 60초에서 30회순환반응후 60 45분간반응하였다. 집파리과와쉬파리과에해당되는시식성파리종을구별할 수있는종특이적인 primer를설계하고이들을조합하여 multiplex PCR 체계를구축하였다 (Table 3). 집파리과의종특이적인 multiplex PCR 반응용액은각성분을혼합하여최종농도가 1.2 x Gold buffer, 2.0 mm Gold MgCl 2, 0.2 mm dntps, 1 x primer 혼합액, 0.25 unit AmpliTaq Gold TM polymerase, 20 ng 주형 DNA를포함하도록하였고, 증류수를첨가하여최종부피는 10 μl가되도록하였다. 증폭반응은 95 에서 11분간변성하고, 95 30초, 53 30초, 72 60초에서 30회순환반응후 60 45분간반응하였다. 쉬파리과의종특이적인 multiplex PCR 반응용액은각성분을혼합하여최종농도가 1.0 x Gold buffer, 2.5 mm Gold MgCl 2, 0.2 mm dntps, 1 x primer 혼합액, 0.25 unit AmpliTaq Gold TM polymerase, 20 ng 주형 DNA를포함하도록하였고, 증류수를첨가하여최종부피는 10 μl가되도록하였다. 증폭반응은 95 에서 11분간변성하고, 95 30초, 53 30초, 72 30초에서 30회순환반응후 60 45분간반응하였다. Table 2. Family-Specific Primer Sets for Calliphoridae, Muscidae and Sarcophagidae Primer Name Sequence (5 3) Conc. (um)* Product Size (bp) Genotype CsF AAYAAYAGTTCAAATAGT 2.42 100 F1A01 MsF GTGTCTTAAYAGTTCRAATTCC 0.90 104 F1A02 SsF AAATTCYCAACGTCAAGCT 1.10 134 F1A03 CMS-R FAM-GCATGATGRCCCATGCTC 0.40 CsF; forward common primer to the families of Calliphoridae and Sacrophagidae flies. MsF; family of Muscidae-specific forward primer, SsF; family of Sarcophagidae specific forward primer, CMS-R: reverse common primer for families of Calliphoridae, Muscidae and Sarcophagidae. Y; C or T, R; A or G. *: optimal concnetraiton for PCR reaction Table 3. Sequences and Concentration of Multiplex PCR Primers for Amplifying Muscidae and Sarcophagidae Species-Specific SCAR Markers Family Primer Sequence (5 3 `) Conc. (um)* Product Size (bp) Genotype Muscidae MsF01 GTGTCTTAAYAGTTCRAATTCC 1.400 104 MsA02 MsF02 AAGGTGAARATTTGGTTYCAG 0.200 178 MsA04 MsF03 AATCACAATCTTAGTCAAGCGC 0.015 81 MsA01 MsF04 GTGTCAGCGTCAGGCCA 0.012 131 MsA03 MsF05 CAAGTAAGTATTTGACAGMAGTC 0.280 243 MsA09 MsF06 AC TTTGTTCCCTTAYTCYAACA 0.080 200 MsA05 MsF07 ACCGA AAGACAAGTAAGTGG C 0.030 251 MsA10 MsF08 TCTTTCTTTTCCTACTTCTTTTAC 0.140 204 MsA06 MsF09 AGTTAGTTAGTCTACGGAAAC 0.040 237 MsA07 MsF10 GTGTCTTAAATCAAAGTCTACAT 0.180 240 MsA08 MsR01 FAM-TGGCATGATGRCCCATGCTG 0.400 Sarcophagidae SsF01 AAATTCYCAACGTCAAGCT 0.030 134 SsA02 SsF02 GTGTCAATAGTTCAAATAGTAAC 0.030 102 SsA01 SsF03 AAGCGTAAACCTTATTCAAAATCC 0.060 369 or 371 SsA07 SsF04 GTGTCTTGACAAGTAAGWTGAT 0.400 259 SsA06 SsF05 GTGTCTATGGTTCCAAAATCGA 0.040 173 SsA03 SsF06 TTGCCTTTGTGTATTAAAC 0.450 240 SsA05 SsF07 GTGTCTTGAAATAAATCTGAT 0.320 233 SsA04 SsR01 FAM-TGGCATGATGRCCCATGCTG 0.200 MsF; Muscidae species-specific forward primer. MsR; Muscidae species-specific reverse common primer. SsF; Sarcophagidae species-specific forward primer. SsR; Sarcophagidae species-specific reverse common primer. Underline; non-template sequences, W; A or T, Y; C or T, R; A or G, *; optimal concnetraion for multiplex PCR reaction Abdominal-B (Abd-B) 항상성상자염기서열을이용한시식성파리종의동정 77

PCR 증폭산물은 loading dye 0.2 μl, GeneScan -500 ROX Size Standard (Applied Biosystems) 0.2 μl, Hi-Di formamid 2.0 μl, PCR 산물 1.0 μl를혼합한후 95 에서 5분간변성시키고얼음에서 2분간냉각시킨후 ABI PRISIM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems) 를이용하여전기영동하였으며, 전기영동결과는 ABI GeneScan 3.1 (Applied Biosystems), Genotyper 2.1 (Applied Biosystems) 프로그램을이용하여분석하였다. 결 과 1. Abd-B 유전자의염기서열분석 염기서열분석에사용한시식성파리는형태학적으로검정파리과 8속 13종, 집파리과 6속 11종, 쉬파리과 3속 7종으로분류되었고, sericata의경우본연구에서는 Paenicia sericata 18, 19) 로분류하였다 (Table 1). 각시식성파리로부터획득한 400~450 bp 크기의 Abd-B Table 4. Sequence Alignment of Abd-B Homeobox in The Calliphoridae, Muscidae and Sarcophagidae Fly Species Dot (.) means the same nucleotide with Drosophila melanogaster sequences. International union of pure and applied chemistry (IUPAC) nucleotide codes, R=A or G; Y=T or C. 78 박호국외 4 인

Dot (.) means the same nucleotide with Drosophila melanogaster sequences. International union of pure and applied chemistry (IUPAC) nucleotide codes, R=A or G; Y=T or C 유전자의염기서열은 Abd-B 항상성상자 180 bp와 intron 그리고그주변부염기서열로각각나누어비교하였으며, 항상성상자염기서열은 NCBI Genebank에등록된초파리의염기서열 (NM_206498.1) 과비교하였다 (Table 4). 또한항상성상자염기서열을아미노산서열로전환하여 NCBI Genebank에등록된초파리의 Abd-B 항상성상자아미노산서열과비교하였다. 그결과시식성파리로부터획득한 60개의아미노산서열중에서 58개의아미노산 (96.7%) 이초파리와동일하였고, 나머지 2개 (3.3%) 의아미노산중초파리의 22 번째 Phenylalanine (F) 은시식성파리종에서는모두 Tyrosine (Y) 으로, 39번째 Glutamine (Q) 은시식성파리종에서는모두 Asparagine (N) 으로전환된것으로확인되었으며, 31종의시식성파리들사이에서는서로다른종간에도모두일치하였다. 형태학적으로검정파리과에해당되는 13종파리의 Abd-B 항상성상자염기서열을 pairwise distance분석을통해비교한결과, 초파리염기서열과는 19.9~23.0% 의차이가있었고, 검정파리과에속하는서로다른파리종간에는 0.0~11.1% 의차이가있었다. 특히, Lucilia 속인파리 4종 (illustris, Abdominal-B (Abd-B) 항상성상자염기서열을이용한시식성파리종의동정 79

ampullaceal, caesar, porphyrina) 은서로 0.0~1.7% 의염기서열차이를보인반면, 기존에 Lucilia 속으로분류되기도하던 sericata는 Lucilia 속인파리 4종과는 2.8~4.5% 의차이를보여본연구에서 sericata를 phaenicia속으로분류하는데근거가될수있었다. 검정파리과의동일한파리종내에 Abd-B 항상성상자염기서열의차이를확인한결과, C. Lata, C. vicina, L. illustris, L. ampullacea는각각의동일한종내에서 0.0~0.6% 차이가관찰되었고, 그외의다른종은각각의종내염기서열이모두일치하였다. H. ligurriens는표본수의제한으로동일한종내염기서열을비교분석하지못하였다. 검정파리과의파리종에서 Abd-B 항상성상자의 intron부위는파리종에따라 68~78 bp의길이다형성이확인되었고, 초파리의염기서열과비교한결과가장많은차이가있는종은 C. vicina (66.0%) 였다. 검정파리과에속하는다른파리종간에는 intron 부위에서 2.8~55.7% 의차이를보였고, L. porphyrina 와 L. ampullacea 간에는차이가없는것으로확인되었다. 한편동일한파리종내에 intron 염기서열을분석한결과 C. lata 는최대 5.3%, A. grahami는 4.2%, L. ampullacea는 4.4%, L. prophyrina는 2.8%, 그리고 C. megacephala는 1.4% 차이를보였지만 C. pinguis, P. sericata, P. regina, L. caesar, C. vicina, L. illustris, T. calliphoroides는동일한종내에서는염기서열의차이가관찰되지않았다. 형태학적분류에서집파리과에해당되는 11종파리의 Abd- B 항상성상자염기서열은초파리염기서열과 18.9~23.0% 의차이를보였고, 집파리과에속하는다른파리종간에는 0.6~13.7% 의차이를보였으나, H. occulta와 F. prisca는서로다른종임에도차이를보이지않았다. 집파리과의동일한파리종내에서 Abd-B 항상성상자염기서열의차이를분석한결과 M. angustifrons는 0.0~3.3%, M. stabulans는 0.0~0.6%, O. nigra와 H. dentipes는각각 0.0~1.7%, O. chalcogaster는 0.0~1.1%, F. prisca는 0.0~2.3%, O. leucostoma는 0.0~0.8%, P. aureola는 0.0~0.6%, 그리고 M. domestica는 0.6~2.2% 차이를보였다. M. pascuorum와 H. occulta는동일한종내염기서열이모두일치한것을확인할수있었다. 집파리과의파리종에서 Abd-B 항상성상자의 intron 부위는파리종에따라 60~92 bp로길이다형성이관찰되었고, 초파리의염기서열과비교한결과 44.0~60.7% 의차이를보였으며, 특히집파리과의파리종들은동일한종내에서도길이다형성이관찰되었다. 그중 F. prisca는종내에서 0.0~39.0% 로가장많은차이를보였고, M. angustifrons, O. chalcogaster, H. dentipes, M. domestica, H. occulta, M. stabulans, O. nigra, P. aureola, O. leucostoma는각각최대 33.3%, 22.4%, 13.6%, 9.2%, 8.7%, 8.6%, 6.7%, 5.5%, 1.7% 의차이가관찰되었으며, M. pascuorum는종내차이가관찰되지않았다. 형태학적분류에서쉬파리에해당되는 7종파리의 Abd-B 항상성상자염기서열은초파리염기서열과 22.0~25.0% 의차 이를보였고, 쉬파리과에속하는다른파리종간에는 0.6~3.4% 의차이를보였으나, P. kanoi 와 B. peregrina는서로다른종임에도차이를보이지않았다. 쉬파리과의동일한파리종내에 Abd-B 항상성상자염기서열의차이를비교한결과 P. albiceps 종내에서최대 1.7% 의차이를보였고그외 5종 (B. peregrina, H. melanura, P. harpax, P. similis, H. haemorrhoidalis) 에서는종내염기서열의차이가관찰되지않았다. 반면, P. kanoi는표본수가적어종내차이를분석할수없었다. 쉬파리과의파리종에서 Abd-B 항상성상자의 intron 부위는 P. harpax 가 72 bp 이고, 나머지 6 종 (H. melanura, P. similis, P. haemorrhoidalis, B. peregrina, P. kanoi, P. albiceps) 은 70 bp 였다. 쉬파리과에서동일종내 intron 염기서열을비교한결과, H. melanura는 0.0~3.0%, B. peregrina 와 P. albiceps는 0.0~1.4% 이고, 나머지 3 종 (P. similis, P. haemorrhoidalis, B. peregrina) 은차이가관찰되지않았다. 2. Abd-B 항상성상자와주변부염기서열의계통수분석 MEGA 4 프로그램을이용하여 Abd-B 항상성상자와 intron 그리고함께증폭한주변부염기서열에대하여초파리 Abd-B 항상성상자의염기서열을 out-group으로설정한후한국에서채집한 31 종시식성파리의염기서열을바탕으로진화적계 Fig. 1. A phylogenetic tree for 31 species of necrophagous flies, based on Abd-B homeobox sequence. Out-group is used that of Drosophila melanogester. 80 박호국외 4 인

통수분석을수행하였다. 그결과대체적으로각과에해당되는파리들이그룹을이루어분류되었지만, 집파리과에속하는 P. aureola, M. pascuorum, M. angustifrons, M. stabulans 등은나머지집파리과와달리쉬파리과와유전적분류가더가까운것으로나타났으며, 이는형태학적분류와는차이가있는것으로보인다 (Fig. 1). 3. SCAR marker를이용한 multiplex PCR 체계과특이적인증폭반응을위해제작된 primer혼합액을이용한 multiplex PCR을수행한결과 13종의검정파리과에서는 F1A01 genotype, 10종의집파리과에서는 F1A02 genotype, 7종의쉬파리과에서는 F1A01과 F1A03 gennotype을확인할수있었다 (Fig. 2). F1A01 genotype의경우 CsF primer는검정파리과와쉬파리과에서모두동일한염기서열부위를포함하고있어, 두과에서동시에증폭반응이일어나므로, 쉬파리과에만특이적으로반응하는 SsF primer를제작하여 FA03 genotype을추가로획득함으로서검정파리과와쉬파리를구별할수있었다. 집파리과와쉬파리과의종특이적인증폭반응을위해제작된 primer혼합액을이용하여각각의 multiplex PCR을수행하였고, 10종의집파리과와 7종의쉬파리과에해당되는파리종을동정할수있었다 (Figs. 3, 4). 집파리과파리들을대상으로구축한 multiplex PCR 체계의재현성을검증하기위해, 염기서열분석에서사용된집파리과의파리들중각파리종마다 3개체에서 5개체씩을임의로선별하여 multiplex PCR을수행한결과동일한종내에서는모두동일한 genotype으로동정이잘되는것을확인하였고, 쉬파리과의경우표본수의제한으로재현성검사를할수없는 P. kanoi를제외한나머지종들에대하 여각파리종마다 3개체에서 5개체씩 multiplex PCR을수행하였으며, 그결과각각의종별 genotype이 100% 일치하는것을확인함으로서 multiplex 체계의안정성을확인하였다. 고찰시식성파리를이용한사후경과시간의추정은파리의종에따라성장주기나생활습성이다르기때문에반드시종동정이선행되어야한다. 20) 전통적인형태학적종동정법은파리의형태학적전문지식이필요하고, 많은경우사건현장에서채집한구더기를성충으로발육시킨후동정을하기때문에시간이오래걸리는등실무적용에제한점이있다. 이에비해 DNA를이용한시식성파리의종동정은보편적인분자생물학적기술만으로간편하게이용할수있어동정에소요되는시간을단축시킬뿐만아니라파리의모든생활주기에서동정이가능하다는장점이있다. 본연구에서는시식성파리의 Abd-B 유전자염기서열을이용하여보다간편한방법으로종동정체계를구축하고자하였으며, 이를위해 Abd-B 항상성상자와주변부염기서열들은밝히는연구를선행하였고, 이에관한연구는국내외에서보고된바가없으므로한국에서채집한시식성파리 3 과 8 속 31 종의 Abd-B 유전자항상성상자와그주변부염기 a b c Fig. 2. Electophoregram showing family-specific SCAR marker for necrophagous flies detected by family identification multiplex PCR system (a; Calliphoridae, b; Muscidae, c; Sarcophagiae). Fig. 3. Electrophoregram showing each species-specific SCAR markers for 10 Muscidae species detected by the multiplex PCR system. Abdominal-B (Abd-B) 항상성상자염기서열을이용한시식성파리종의동정 81

Fig. 4. Electrophoregram showing each species-specific SCAR markers for 7 Sarcophagidae species detected by the multiplex PCR system. 서열을본논문을통해최초로보고함에의미가있다. 한국에서채집한 7종의쉬파리과, 11종의검정파리과 (L. porphyrina 와 L. ampullacea 제외 ), 그리고 10종의집파리과 (F. prisca 제외 ) 의염기서열을분석한결과동일한종내에많은단일염기다형성이발견되었으며, 집파리과의 M. angustifrons, O. nigra, H. dentipes, O. chalcogaster 종의 intron 에서는길이다형성도관찰되었다. 특히 M. angugtifrons 의 intron에서종내변이가 33.3% 나되어다른종들보다변이수준이높지만계통수분석에서같은그룹으로분류되었으며, 이는 Abd-B 항상성상자유전자의단백질전사에관여하지않는 intron에서의변이는종의특성에큰영향이없다는것을설명한다. 검정파리과에서 L. porphyrina와 L. ampullacea는항상성상자뿐만아니라 intron 서열까지일치하였고, 계통수분석을실행한결과두종은서로paraphyly로나타나구별할수없었다. 이는 Wells 등 21) 이미토콘드리아염기서열을바탕으로 L. porphyrina (AY097336), L. porphyrina (AY074900), L. ampullacea (DQ453487) 에대해진화학적계통수분석을통해서로 paraphyly pattern을보인다고발표한것과일치하는결과이다. 우선곤충분류학적관점에서볼때 L. porphyrina 와 L. ampullacea는모두쌍시목 (Diptera) 검정파리과의 Lucillia 속에속하는종으로가슴과등, 그리고 tibiae의색에의해구별되기때문에표본의상태에따라변화가많아형태학적으로는정확한구별이어렵다. 따라서 L. porphyrina와 L. ampullacea가 L. sericata와 L. cupurina같은자매종으로진화적으로아직완전한분리가이루어지지않았을수있고, 이종간잡종일가능성도있으며, 22) 형태학적동정이잘못되었을가능성도배제할수없다. 또한본연구에서분석한 Abd-B 항상성상자염기서열약 380 bp 길이가충분히길지못하여 paraphyly로분석되었을수있기때문에보다많은표본을채집하여 Abd-B 항상성상자유전자에대해집단유전학분석 (population genetic analysis) 을하거나미토콘드리아혹은또다른핵 DNA를추가로검사하여확인해보아야할것이다. 집파리과 11종에서서로다른종간에항상성상자염기서열분석결과를보면, F. prisca 는 H. occulta 와차이가없었고 H. dentipes와 0.6% 의근소한차이를보였으며 intron에서는 H. occulta와일치하였고계통수분석에서위의두종과혼합되어나타났다. 분석한집파리과 11종에서 F. prisca를제외한나머지 10종들은서로분류가되었고, 현재국내에서 F. prisca 와같은 Fannia 속에대한연구가미완성단계에있기때문에 F. prisca 의형태학적동정에대해논쟁이많은것으로보아 F. prisca에대한형태학적동정이잘못되었을가능성을배재할수없다. 따라서, F. prisca 역시보다많은개체에대한지속적인연구가필요하다. 쉬파리과 7종의염기서열을서로다른종과비교한결과 P. similis는 Abd-B 항상성상자에서 B. peregrina와차이가없었고 intron에서는 P. kanoi 와차이가없었지만항상성상자와 intorn 그리고주변부염기서열을모두포함시켜실행한계통수분석에서는각각서로다른종과잘구분되었다. 그동안한국에서채집한시식성파리종의분포를보면, 검정파리과 12속 19종, 집파리과 15속 38종, 쉬파리과 14속 40 종이다. 종분포로볼때집파리과와쉬파리과도시식성파리의중요한구성부분이기때문에쉽고간편한종구별표시자체계가필요하다. SCAR marker는한쌍의 primer를이용하여 PCR 을기본으로게놈의특정부위를선택적으로증폭하기때문에, 식물이나곤충의종구별에이용되고있다. SCAR marker는실험조건에영향을많이받는 RAPD (random amplified polymorphic DNA) 보다는안정적이고재현성이좋으며, RFLP 방법에비해많은양과높은질의 DNA를필요로하지않으며, 또한한번의 PCR로제한효소처리과정이필요없이결과를확인할수있기때문에간편하다. 23) 본연구실에서는이미 Bicoid유전자의항상성상자염기서열을이용하여 12종검정파리과를구분할수있는 SCAR marker를제작하여특허등록하였기때문에이를제외한집파리과와쉬파리과에대한 multiplex PCR체계를구축하였다. PCR 체계를구축하기위한 primer 제작과정에서보존성이좋은항상성상자염기서열의특성을이용하여 3 flanking 부위 82 박호국외 4 인

에검정파리과, 집파리과, 쉬파리과가공통적으로공유하는 1 개의 reverse primer를설계하여 multiplex에포함되는 primer 수를최소화하고, reverse primer에만 FAM 형광물질을부착하여비용을절감하였다. 또한, forward primer 제작시 GC% 가낮은primer의 5 end에 none template 염기서열을추가하여 primer의결합효율을높임으로서 multiplex PCR system을최적화하였다. 뿐만아니라전기영동시간을단축하고, 표본이오래되어분해된 DNA에서도종동정이가능하도록 SCAR marker의증폭산물의크기를최소화하였으며, 모세관전기영동기를이용하여보다정확하고간편한판독이이루어질수있도록하였다. 본연구를통해구축된집파리과와쉬파리과의 SCAR marker를이용한 multiplex PCR system은사건현장에서수거되는시식성파리의미성숙개체들에대하여 DNA에근거한보다정확한동정을가능하게하였다. 한국에서식하는집파리과와쉬파리과에포함되는 17종의시식성파리는 2번의 multiplex PCR로과및종동정이가능하기때문에시식성파리를이용한법의실무에서유용할것으로전망된다. 이미고려대법의학교실에서는 Bicoid를이용한 12종검정파리과의파리종을식별할수있는 genotyping kit를제작하고특허신청하였으나, 이 kit의경우다른방법을통해검정파리과임을확인하는단계가선행되어야세부종동정이가능하다는제한점이있었다. 반면본연구에서구축된집파리과와쉬파리과의종동정법은 1차 multiplex PCR system으로 3개의과 ( 검정파리과, 집파리과, 쉬파리과 ) 에대한감별이가능하게되었으므로 Bicoid genotyping kit의제한점을개선할수있었을뿐아니라, 2단계의 PCR로법곤충학적으로매우중요한 3과 29종의시식성파리들의종을동정할수있는 genotyping kit를개발하기위한기반이되는연구로서의미가있다. 참고문헌 1. Benecke M. Six forensic entomology cases: description and commentary. J Forensic Sci 1998;4:797-805. 2. Sukontason KL, Ngern-Klun R, Sripakdee D, Sukontason K. Identifying fly puparia by clearing technique: application to forensic entomology. Parasitol Res 2007;101:1407-6. 3. Mendonca PM, dos Santos-Mallet JR, de Mello, RP, Gomes L, de Carvalho Queiroz MM. Identification of fly eggs using scanning electron microscopy for forensic investigations. Micron 2008;39:802-7. 4. Sperling FA, Anderson GS, Hickey DA. DNA-based approach to the identification of insect species used for postmortem interval estimation. J Forensic Sci 1994;39:418-27. 5. Wells JD, Sperling FA. A DNA-based approach to the identification of insect species used for postmortem interval estimation and partial sequencing of the cytochrome oxydase b subunit gene I: a tool for the identification of European species of blow flies for postmortem interval estimation. J Forensic Sci 2000;45:1358-9. 6. Harvey ML, Dadour IR, Gaudieri S. Mitochondrial DNA cytochrome oxidase I gene: potential for distinction between immature stages of some forensically important fly species (Diptera) in western Australia. Forensic Sci Int 2003;131:134-9. 7. Chen WY, Hung TH, Shiao SF. Molecular identification of forensically important blow fly species (Diptera: Calliphoridae) in Taiwan. J Med Entomol 2004;41:47-57. 8. Park SH, Zhang Y, Piao H,et al. Sequences of the cytochrome C oxidase subunit I (COI) gene are suitable for species identification of Korean Calliphorinae flies of forensic importance (Diptera: Calliphoridae). J Forensic Sci 2009;54:1131-4. 9. Harvey ML, Gaudieri S, Villet MH, Dadour IR. A global s- tudy of forensically significant calliphorids: implications for identification. Forensic Sci Int 2008;177:66-76. 10. Maddison WP, Knowles LL. Inferring phylogeny despite incomplete lineage sorting. Syst Biol 2006;55:21-30. 11. Song Z, Wang X, Liang G. Species identification of some common necrophagous flies in Guangdong province, southern China based on the rdna internal transcribed spacer 2 (ITS2). Forensic Sci Int 2008;175:17-22. 12. Nelson LA, Wallman JF, Dowton M. Identification of forensically important Chrysomya (Diptera: Calliphoridae) species using the second ribosomal internal transcribed spacer (ITS2). Forensic Sci Int 2008;177:238-47. 13. Akam M. Hox and HOM: homologous gene clusters in insects and vertebrates. Cell 1989;57:347-9. 14. Dhawan S, Gopinathan KP. Phylogeny of the insect homeobox gene (hox) cluster. Genomics Proteomics Bioinformatics 2005;3:42-6. 15. Lamka ML, Boulet AM, Sakonju S. Ectopic expression of UBX and ABD-B proteins during Drosophila embryogenesis: competition, not a functional hierarchy, explains phenotypic suppression. Development 1992;116:841-54. 16. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 2007;24:1596-9. 17. Kalendar R, Lee D, Schulman AH. FastPCR Software for PCR Primer and Probe Design and Repeat Search. Genes, Genomes and Genomics 2009;3:1-14. 18. Guarnera EA, Mariluis JC. Human case of disseminated cutaneous myiasis due to Phaenicia sericata. Bol Chil Parasitol 1986;41:79-82. 19. Debry RW, Timm AE, Dahlem GA, Stamper T. mtdnabased identification of Lucilia cuprina (Wiedemann) and Lucilia sericata (Meigen) (Diptera: Calliphoridae) in the continental United States. Forensic Sci Int 2010;202:102-9. 20. Vanin S, Tasinato P, Ducolin G, et al. Use of Lucilia species for forensic investigations in Southern Europe. Forensic Science International 2008; 77:37-41. 21. Wells JD, Wall R, Stevens JR. Phylogenetic analysis of forensically important Lucilia flies based on cytochrome Abdominal-B (Abd-B) 항상성상자염기서열을이용한시식성파리종의동정 83

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