3 세대 Digital PCR platform 을이용한분자진단기술 l저자l 최수진바이오PD / KEIT 바이오 PD실이남식연구소장 / 솔젠트 ( 주 ) 정인수책임연구원 / KEIT 바이오 PD실권소현선임연구원 / KEIT 바이오 PD실 SUMMARY 목적유전자증폭기술

3 세대 Digital PCR platform 을이용한분자진단기술 l저자l 최수진바이오PD / KEIT 바이오 PD실이남식연구소장 / 솔젠트 ( 주 ) 정인수책임연구원 / KEIT 바이오 PD실권소현선임연구원 / KEIT 바이오 PD실 SUMMARY 목적유전자증폭기술 (Polymerae Chain Reaction, PCR) 을활용한분자진단검사법은미생물배양검사및항원ㆍ항체반응의면역검사법을대체할수있는매우신속정확한검사법으로평가받고있음. 그중제 3세대 PCR 법으로평가되며절대정량측정이가능한 digital PCR 기법의주요현황및적용분야에대해알아봄 주요현황 Frost & Sullivan, Global Life Science Trends and Opportunities 2012~2015 보고서에따르면미국 realtime PCR 시장의최근성장추이는년간약 2.9% 로저성장세를지속하고있는반면, digital PCR 시장은 2012년 125% 의폭발적성장과함께 2015년도에도최소 30% 의성장세보일것으로전망하고있는신규시장임 2012년 Nature method (Vol 9. No. 6) "Digital PCR hits its stride" 의보고에의하면제 3세대 digital PCR 법의가장큰단점은기존 2세대 real-time PCR 법에비해고가의장비활용, 반응당소요비용, 그리고현재 digital PCR 시장이초기라는리스크등이며, 그럼에도불구하고여전히높은시장잠재력을지니고있음 시사점및정책제안현재 digital PCR 의구현을위한장비가고가란점에서저비용, 고효율의장비개발이절실하며, 핵심기술확보를통한상용화를위한연구와지원이필요함 Digital PCR 기술의도입과함께 digital PCR 을활용한분자진단방법도함께개발되어야하지만, 현재 digital PCR을활용한분자진단키트상용화는지연되고있음. 따라서, digital PCR 기술을활용한분자진단키트의개발은향후분자진단기법의자동화와함께분자진단시장을선도할것으로전망되므로, 이에따른관련분야의기술확보및연구지원이필요함

KEIT PD Issue Report PD ISSUE REPORT MARCH 2015 VOL 15-3 1. Digital PCR 개요 정의특정유전자를무한증폭가능한 PCR은 1985년 Mullis 박사에의해개발되었으며, 1세대 PCR 방식은유전자증폭후 agarose gel 전기영동을통해결과를확인하였으며, 형광물질을이용하여검출목표유전자의증폭을실시간확인할수있는 real-time PCR 방식인 2세대 PCR 방법으로발전하였음. 반면 3세대 PCR 방식인 digital PCR 방법은표준물질없이도검출목표유전자의실시간절대정량이가능한새로운접근방식의 PCR 법임 Conventional PCR 제 1 세대 PCR Real-time PCR 제 2 세대 PCR Digital PCR 제 3 세대 PCR 그림 1. 제 3 세대 digital PCR 응용분야 검출민감도가매우높은 Digital PCR 검출법의적용은기존 PCR 적용분야뿐아니라다양한범위에서응용가능함 ( 그림 2) - 종양유전자및변이유전자의검출을위한 rare allele 검출 - low level virus 정량 - 병원성미생물검출 - GMO (Genetically Modified Organism) 존재유무검출 - 특정유전자 copy number 계산 ( 정량화 ) - NGS (Next Generation Sequencing) library 정량확인 - Single cell 분석 - Fusion gene 분석등 32 한국산업기술평가관리원

ISSUE 2 3 세대 Digital PCR platform 을이용한분자진단기술 Rare cancer target detection Low level pathogen detection Absolute quantification of viral load Generation of references and standards GMO detection and monitoring Copy number variation NGS library quantification Confirmation of NGS variant detection 그림 2. Digital PCR 의응용범위 (Life technologies 제공 ) Digital PCR 기술활용사례중하나로, 2013년미국 FDA (Food and Drug Administration) 의 Duncan 박사그룹의연구에서 18종혈액유래감염원 ( 세균, 바이러스, 원충류 ) 의다중동시검출방법을제시하였음. Duncan 박사그룹은 Digital PCR 시스템중 Life technologies 사의 OpenArray Platform에적용하였으며, 48개의 block 으로구성된 OpenArray plate 중단하나만의 block을사용하여한 block 당 3개의샘플처리가가능함을증명하였음. 즉, 이는한개의 plate 당 144명 (48 x 3명 ) 의샘플을동시처리가가능함을증명하였음. 또한 Life technologies 사의 OpenArray Platform 인 QuantStudio 12K Flex system 의경우일회반응당 4개의 plate 를동시사용가능함으로 144 x 4 = 576 명의샘플처리가한번에가능함을증명하였음 ( 그림 3) 상용화장비현황현재상용화되어있는 digital PCR 의구현을위한상용화된장비를판매하는회사는 Fluidigm corporation, Life technologies, Bio-rad Laboratories, 및 RainDance technologies 로 4개회사에불과함 4개사의 digital PCR 구현방식은크게 CHIP과 OpenArray plate 를사용하는 plate format과 Emulsion PCR 방식의 Droplet format의 2가지방식으로구현되고있음 ( 그림 4) Korea Evaluation Institute of Industrial Technology 33

KEIT PD Issue Report PD ISSUE REPORT MARCH 2015 VOL 15-3 OpenArray Final 18 Assay Layout 그림 3. Robert Duncan 박사그룹의 OpenArray Platform 적용결과예시 Reaction partitioning format Plate format Droplet format Vendor Fluidigm Corporation Life Technologies Bio-Rad Laboratories Rain Dance Overview of Commercial Digital PCR systems, Adapted from Baker, 2012. Instrument and list price Biomark HD $200-250K Open Array Real Time PCR System $140K and Quant Studio 12K Flex instrument $90-190K QX100 ddpcr system $89K Rain Drip Digital PCR $100K Consumables and list price $400/chip $150/plate $3/sample 8samples/chip $10-30 sample 8samples/chip 그림 4. 상용화된 digital PCR 장비현황 Number (and volume)of partitions 9,180 (6nl) partitions/chip 3,072 (33nl) partitions/plate 20,000 (1nl) droplets/sample 1,000,000 (5pl) droplets/sample Multiplexing capabilities 5 colors 2 colors 2 colors 2 colors * 출처 : Diagn Microbiol Infect Dis (2013, Vol 75(1) 34 한국산업기술평가관리원

ISSUE 2 3 세대 Digital PCR platform 을이용한분자진단기술 Digital PCR 장점 검출목표유전자의정량적검출이가능한 Digital PCR 법은 conventional PCR 방식및 real-time PCR 의단점을 보완한매우민감도가높은차세대 PCR 검출방식으로평가되고있음 ( 그림 5) 구분 Conventional PCR (1 세대 ) Real-time PCR (2 세대 ) Digital PCR (3 세대 ) 검출예시 반응당사용시약총량 최소 10μl이상 평균 20 ~ 25μl 1pl ~ 33nl 실시간정량분석 불가능 가능 가능 정확도 낮음 높음 높음 민감도 낮음 높음 높음 자동화 완벽한자동화불가능 가은 가능 응용 Sequencing, Genotyping, Cloning 용 DNA 증폭 유전자발현의정량분석 마이크로어레이이의검증 병원체탐지 단일염기이상검사 (SNP genotyping) 바이러스정량 (viral quantization) 바이러스나핵산의정량분석 NGS library 의정량분석 희귀대립유전자검출 유전자발현의정량 혼재된시료의통합적분석가능 그림 5. 제 3 세대 digital PCR * 출처 : KISTI market report, Vol 3 Issue 7, 재작성 Digital PCR 의가장큰장점은기존 2세대 real-time PCR 법이정량화된표준물질과결과값의비교를통해정량화값을산출하는방식에비해정량화된표준물질에의존하지않고실제검출목표유전자의양성검출수산출을통한절대정량이가능하다는점임 Digital PCR 방식과기존 2세대 real-time PCR 법의차이점으로 digital PCR 방식은 10~1000 pico liter 의극소량의시료만으로도분석이가능하며, 개발장비별차이가있으나기존 real-time PCR 방식에비해많은양의시료를동시처리할수있다는장점이있음 Korea Evaluation Institute of Industrial Technology 35

KEIT PD Issue Report PD ISSUE REPORT MARCH 2015 VOL 15-3 Digital PCR 단점 Nature method (2012, Vol 9(6)) "Digital PCR hits its stride" 및 Diagn Microbiol Infect Dis (2013, Vol 75(1)) 의보고에서도언급하였듯, digital PCR 의가장큰단점은기존 real-time PCR 법에비해구현장비가가비싸연구활용장비로서의일반대학연구실및공공연구부분의예산제한으로인한진입이매우제한적임 Digital PCR 의구현을위한장비제조사가현재 4개사에불과하여장비선택의폭이매우제한적임제한적장비사용뿐아니라반응시약및반응당소요비용, 그리고현재 digital PCR 시장이초기라는점에서리스크가있음 2. 분자진단 tool 로서 Digital PCR 시장전망 생명공학분야는경제적부가가치가매우크고시장규모의지속적확대로국가경제발전에기여도가큼. 특히유전체분야는단백체와더불어질환 / 질병에대한응용분야가확대되고있음분자진단기술기반의체외진단응용분야는의학, 식품, 농업, 에너지, 바이오전자, 환경등임상진단분야에비해초기단계지만기술의발전에따라응용상업화가이루어질것으로판단됨생명공학정책연구센터의보고에따르면, 국내의분자진단시장규모는 2011년 900억원에서 2016년 1500억원규모의연평균성장률 10% 를보일것으로전망함. 또한아시아 / 태평양지역의분자진단시장은 2016년약 1.8조원의규모로 16% 의고성장을보일것으로전망함 ( 그림 6) 그림 6. 아태지역감염병기술분야별체외진단시장전망 * 출처 : 2012 년생명공학정핵연구센터, 아태지역감염병체외진단시장 36 한국산업기술평가관리원

ISSUE 2 3 세대 Digital PCR platform 을이용한분자진단기술 Frost & Sullivan, Global Life Science Trends and Opportunities 2012~2015 보고서에따르면미국 real-time PCR 시장의최근성장추이는년간약 2.9% 로저성장세를지속하고있는반면, digital PCR 시장은 2012 년 125% 의폭발적 성장과함께 2015 년도에도최소 30% 의성장세보일것으로전망하고있는신규시장임 ( 그림 7) 미국의 qpcr 시장성장추이 연도 매출액 ( 백만달러 ) 성장률 2012 500 2.9% 2013 515 2.9% 2014 530 2.9% 2015 545 2.9% 미국의 dpcr 시장성장추이 연도매출액 ( 백만달러 ) 성장률기회요인리스크 2012 18 12.5% 2013 28 55.6% 2014 40 42.9% 2015 52 30.0% Digital PCR 응용프로그램개발로인한시장확대 상대적으로저렴하고처리량이낮은제품이개발및보급되어 dpcr 의수요증대예상 대학및공공연구부문의예산제약으로인해 dpcr 장비의지출이억제 3.6% qpcr 과 dpcr 의시장비중전망 2011 qpcr Instruments dpcr Instruments 21.0% 2016 96.4% 79.0% 그림 7. Digital PCR 의시장비중및전망 * 출처 : KISTI market report, Vol 3 Issue 7 KISTI Marker Report (Vol. 3, Issue 7) 의분석에따르면 digital PCR 기법을활용한상용화된분자진단키트가거의 없지만, 전세계많은연구자들에의해다양한적용대상범위및활용도가제시됨에따라기술의우수성과활용성이높을 것으로기대됨 Korea Evaluation Institute of Industrial Technology 37

KEIT PD Issue Report PD ISSUE REPORT MARCH 2015 VOL 15-3 Digital PCR 기법을활용한시장은아직도입기로서다양한분자진단제품의상용화가필요하지만, 여전히맞춤형의료시장의성장, 고령화사회의도래, 개개인의건강에대한관심증가등의이슈와함께기술의활용성과우수성이연구자들을통해입증되고있어시장의수요가증가될것으로예상됨하지만, 성숙기의면역진단시장에비해분자진단시장은도입기라는측면은분자진단시장이여전히제한적이란점을시사함 3. 기대효과및활용성 최근 10대성장동력사업의일환인생명공학기술분야는경제적부가가치가높은막대한시장규모로지속적으로확대되고있으며, 인간의삶과직결된질병의예방, 진단, 치료에이르는거대한의료시장규모는국가경제발전에큰일익을담당하게될것임분자진단기술기반체외진단시약응용분야는의학, 식품, 농업, 에너지, 바이오전자, 환경등에광범위하며임상진단분야에비해아직초기상업화단계이나앞으로활발한기술개발에따라다양한진단분야에서상업화가이루어질것으로판단됨 Digital PCR 기법기반으로하는분자진단검사법의상용화는기존분자진단시장제품의단점인검출민감도, 검출특이도, 시장공급가, 사용자편의성등의시장요구사항을극복한새로운검사법이될것으로기대됨. 차세대분자진단기법으로써 Digital PCR 기법은희귀질환, 종양검사, 개별맞춤유전자검사, 세균이나바이러스감염검사등다양한질환검사검사에기술을적용할수있게됨으로써장기적인관점에서에볼라바이러스등의전염성감염질환으로인해야기될수있는사회문제를줄일수있는계기가될것임 Digital PCR 기법을활용한신속진단기술개발은환자의생명뿐아니라경제적손실을크게줄일수있으며더불어수입품의대부분인진단시약의수입대체, 해외수출등기술경제적파급효과가기대됨 ( 참고문헌 ) 1. Multiplex Screening for Blood-Borne Viral, Bacterial, and Protozoan Parasites using an OpenArray Platform. Duncan RC et al. J Mol Diagn. 2014 Jan;16(1):136-44 2. Digital PCR hits its stride. Monya Baker. Nature Methods, Vol. 9 No.6 3. Viral diagnostics in the era of digital PCR. Keith R. Jerome et al. Diagn Microbiol Infect Dis. 2013 ; 75(1): 1.4. doi:10.1016/j.diagmicrobio.2012.10.009 4. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Frank McCaughan et al. Methods. 2013 Jan;59(1):101-7 5. 아태지역감염병체외진단시장. 생명공학정책연구센터. 2012;57. BioINdustry 6. PCR 기술및시장동향- 분자진단의핵심툴로서의 qpcr, dpcr 주목. 서주환. 2013;3;7. KISTI MARKET REPORT 38 한국산업기술평가관리원