대한병리학회지 : 제 37 권제 4 호 2003 The Korean Journal of Pathology. 2003; 37: 246-54 위장관간질종양에서 c-kit 유전자돌연변이및면역조직화학적발현 강동욱 김주헌 김동훈 김경희박미자 강대영 1 을지대학교의과대학병리학교실충남대학교의과대학병리학교실 c-kit Mutation and Immunohistochemical Expression in Gastrointestinal Stromal Tumors Dong Wook Kang, Joo Heon Kim, Dong Hun Kim, Kung Hee Kim, Mee Ja Park and Dae Young Kang 1 Department of Pathology, Eulji University School of Medicine, Daejeon; 1 Department of Pathology, Chungnam National University College of Medicine, Daejeon, Korea 접수 : 2003 년 4 월 8 일게재승인 : 2003 년 7 월 26 일 책임저자 : 강대영우 301-131 대전광역시중구문화 1 동 6 충남대학교의과대학병리학교실전화 : 042-580-8232 Fax: 042-581-5233 E-mail: dykang@cun.ac.kr * 이연구는 2002 년도범석학술장학재단지원으로이루어졌음. Background : Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common non-epithelial neoplasm arising in the gastrointestinal tract. The aim of this study is to investigate the correlation among the clinicopathologic features, presence of c-kit mutation, and immunohistochemical expression of c-kit in 61 cases of GISTs. Methods : We divided the GISTs into three groups as benign, boderline and malignant, according to histologic grade. Exon 11 of the c-kit was amplified by PCR and sequenced. We performed immunohistochemical study for CD117, CD34, vimentin, SMA, desmin, and S-100 protein. Results : Twenty-one cases were diagnosed as benign GISTs, 14 cases as borderline GISTs, and 26 cases as malignant GISTs. The shape, atypia, cellularity, and necrosis showed good correlations with the histologic grades of the GISTs. Mutations of exon 11 of the c-kit were detected in 3 benign GISTs, 4 borderline GISTs, and 13 (%) malignant GISTs. Sequence analysis confirmed the deletion mutation (n=16) and the single base pair mutation (n=4). The immunohistochemical stainings showed myogenic differentiation (n=20), neurogenic differentiation (n=15), and neither myogenic or neurogenic differentiation (n=34). Conclusions : The GIST is the primitive mesenchymal tumor capable of divergent differentiation, and the mutation of the c-kit is a good parameter for the malignant GIST. Key Words : Gastrointestinal Stromal Tumor-Protooncogene Protein c-kit-immunohistochemistry 위장관간질종양 (gastrointestinal stromal tumor, GIST) 은식도와위장관에서발생하는중간엽종양의대부분을차지하고, 평활근종, 평활근육종및신경집종등과구별되는고유의조직소견과면역조직화학적특징을갖고있다. 1-3 그러나 GIST는형태학적으로평활근종양을포함한다른중간엽종양과유사한조직학적소견이있어이들종양과의감별진단이어렵고, 조직소견만으로종양의양성과악성판별이어렵다. 4-6 또한다양한면역조직화학적표현이인지되어종양세포의기원은끊임없는논란의대상이되어왔다. 7,8 최근위장관고유근층에서관찰되는 Cajal 사이질세포 (interstitial cell of Cajal, ICC) 가 GIST 종양세포와전자현미경적소견이유사하고, CD117 c-kit 단백에대한면역조직화학염색에 ICC와 GIST 모두양성으로발현되며, 위장관의중간엽성전구세포에서 ICC와평활근육세포의분화가관찰되는점 9-12 등으로 보아 GIST 발생에 ICC가연관이있음이알려졌다. 여러문헌들 14-19 에서 c-kit 유전자돌연변이, 특히엑손 11의결손, 첨부및점돌연변이와같은돌연변이가 GIST의발생및악성도와연관이있다고보고된바있다. 국내의 GIST에대한문헌 20-23 들은전자현미경, 면역조직화학염색결과와조직소견을기준으로악성과예후인자와의연관성을연구한것과 CD117 발현이 GIST와평활근종양의감별에유용하다는보고는있으나, c-kit 유전자돌연변이에대한연구는시행된바없다. 이에저자들은지난 10년동안위장관에서발생한 GIST를모아 CD117, CD34, -smooth muscle actin (SMA), desmin 및 S-100 단백항원의면역조직화학염색발현의특징을알아보고, 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 과염기서열분석에의한 c-kit 유전자돌연변이유무및예후와의관련성을알아보기위하여본연구를시행하였다. 246
GIST 에서 c-kit 돌연변이와면역조직화학적발현 247 재료 재료와방법 30초간혼탕후 4, 12,000 rpm에서 15분간원심분리한다음상층액을각각 100% 에탄올과 3 M sodium acetate (ph 5.2) 와혼합하여 -70 에서보관하였다. 1992년 1월부터 2002년 12월까지을지의과대학교병원과충남대학교병원에서적출술과용종절제술을한후, 조직검사가시행된비상피성위장관중간엽종양증례들중두기관의병리의사의진단이일치된 GIST를대상으로하였다. GIST의진단은 Miettinen 3 등이제시한조직소견과, 각기관에서진단시시행한일부면역조직화학염색결과를참고하였다. GIST로진단한증례들은모두 61예로 10% 중성포르말린에고정한후파라핀에포매되어블록으로보관된조직이었고, 슬라이드검색및보관상태가양호하였다. 병리학적검색 증례에대한병리보고서와병력지를검토하여환자의연령, 성, 종양의발생위치, 크기, 육안소견및전이유무를확인하고, 광학현미경 (Olympus BX 50, Japan) 으로유사분열수, 세포모양, 세포밀도및이형성검색을시행하였다. 조직학적악성도는 Amin 등 6 이제시한유사분열수와종양의크기에따른등급별분류를기준으로하였다. 유사분열수는세포밀도가높은부위에서연속하여 5회이상유사분열수를세어고배율시야 ( 대물렌즈 40) 로 50시야당평균값으로하였다. 유사분열수가 5개미만이고종괴의크기가 5.0 cm 미만일경우양성 GIST, 유사분열수가 5개미만이고종괴의크기가 5.0 cm 이상일경우경계성 GIST, 종양의크기와관계없이유사분열수가 5개이상일경우악성 GIST로분류하였다. 종양세포의모양은둥글거나타원형의세포가종양의 25% 미만일때방추형, 25-50% 를차지할때혼합형, 50% 이상을구성할때상피모양으로하였다. 세포밀도는정도에따라저도, 중등도, 고도로구분하였고, 이형성은세포밀도가높은부위를관찰하여없음, 저도, 중등도, 고도의 4등급으로표기하였다. Genomic DNA 추출과 PCR 을통한 c-kit 유전자염기순서분석 DNA 추출파라핀포매조직에서종양의표면적이 80% 이상을차지하고상태가양호한조직을 20 m 두께로절편한다음 Eppendorf 튜브에넣고크실렌을첨가한후 65 에서 1시간부화시켰다. 각각 95%, 70% 에탄올을이용하여검체를세척한후건조시킨다음, 소화완충액 (100 mm Tris-HCl, ph 8.5, 1% SDS, 5 mm EDTA, proteinase K 500 g/ml) 200 L를첨가하여 55 에서하룻밤놓아두었다. DNA 분리를위해 phenol/chloroform/isoamyl alcohol 혼합액 (25:24:1) 1 ml를첨가하여 PCR 시발체는 Lasota 등 19 이 c-kit 유전자의돌연변이유무를알아보기위해사용한것으로 GenBank No. 1817732 (89,603 bp) 에서인트론이포함된엑손 11 (75,594-75,784, 191 bp) 을바이오니아 (Bioneer, Korea) 에의뢰하여합성하였다. 염기서열은전 위와 후위각각 5-CCA GAG TGC TCT AAT GAC TG-3와 5-ACT CAG CCT GTT TCT GGG AAA CTC-3 이었다. PCR은추출한 DNA 5 L, 전위와후위시발체각각 3 L를 premix (Taq DNA 중합효소, dntp, Tris-HCl, KCl, MgCl 2, Bioneer, Korea) 에넣고증류수를첨가하여 50 L를만든다음 PCR thermal cycler (Gene cycler, Biorad, USA) 에서시행하였다. 95 에서 5분간의변성과정을거친다음, PCR은 95 에서 1분, 56 에서 1분, 72 에서 2분간 35회반복시행을하고, 마지막으로 72 에서 2분간두었다. 염기순서분석증폭된 DNA 100 ng, 시발체 1.6 pm, sequencing mix 1 L와 sequencing buffer 2 L를넣고최종부피가 10 L이되도록증류수를첨가하였다. 그리고 95 에서 10초간부화한후 50 에서 5초간 annealing, 72 에서 4분간 extension 과정을 25 회반복하고건조시켰다. 건조된시료에주형억제시약 (template suppression reagent, Perkin Elmer, USA) 20 L를첨가한후자동염기서열분석기 (ABI 310 automatic sequencer, PE biosystem, USA) 를이용하여염기서열을분석하였다. 면역조직화학염색 면역조직화학염색은 anti-rabbit CD117 (1:50, polyclonal, Dako, Japan), anti-mouse CD34 (1:25, QBEnd-10, Novocastra, USA), anti-mouse vimentin (1:50, V9, Novocastra, USA), anti-mouse SMA (1:50, sm-1, Novocastra, USA), antimouse desmin (1:50, DE-R-11, Novocastra, USA) 과 antimouse S-100 단백 (1:200, polyclonal, Novocastra, USA) 항체를사용하였다. 조직절편을 4 m 두께로세절한후 probe-on plus slide (Fisher Scientific, USA) 에부착시켜건조시켰다. 그리고탈파라핀후함수시키고 0.01 M citrate buffer (ph 6.0) 를이용해 microwave oven에 15분간전처리하였다. 조직내과산화효소의작용을억제하기위하여 3% H 2 O 2 에 10분간처리한후, 조직내의항원과비특이적단백결합을억제하기위해정상혈청으로단백질을차단시켰다. 그리고일차단일항체에 1시간동안부착시킨다음완충액으로수세하였다. LSAB kit (ScyTek, USA) 를이용하여 biotin이부착된이차항체에 30분간반응시킨
248 강동욱 김주헌 김동훈외 3 인 다음 streptoavidin-hrp를결합시켰다. 발색은 3-amino-9-ethyl carbazole (ScyTek, USA) 를이용하여 10분간반응시킨후 Mayer s hematoxylin으로 1분간대조염색을시행하였다. CD117과 CD34는종양세포의세포막에, vimentin, SMA, desmin 및 S-100 단백은종양세포의세포질에발현되고전체종양세포의 5% 이상일때면역조직화학염색양성으로판단하였다. 통계학적분석 GIST의조직학적등급별악성도와 c-kit 유전자의돌연변이유무및면역조직화학염색발현의연관성을살펴보기위하여, SPSS version 10.0 (SPSS Inc., Chicago, USA) 통계프로그램을이용한일원분산분석, Pearson의 Chi-square ( 2 ) 검정과 Fisher의정확검정을실시하였다. 통계학적유의성은 p 값이 0.05 이하인것으로하였다. 결과임상및병리학적소견 GIST의평균연령은 55.1세였고연령분포는 21세에서 77세였다. 남녀각각 35예와 26예로남자가 1.4배많았다. 발생부위는위 35예 (57.4%), 작은창자 16예 (26.2%), 큰창자 3예 (4.9%), 창자사이막 3예 (4.9%), 식도 2예 (3.3%), 배막 2예 (3.3%) 였다. 수술소견과추적검사결과, 간전이 8예, 배막전이 5예및재발 1예가있었다. 평균전이기간은 16.3 개월이었다. 조직학적악성도에따른 GIST의분류및임상병리학적소견과의상관관계는 Table 1과같다. GIST 의조직학적악성도와이형성, 세포밀도, 괴사및타장기로의전이사이에는통계학적유의성이있었으나 (p<0.05), 종양세포의모양과는통계학적유의성이없었다 (p=0.105). 악성도에따른 GIST의임상및병리학적소견은다음과같다. 양성 GIST 양성 GIST는 21예였다. 연령분포는 21세에서 75세 ( 평균 54.8 세 ) 였고남녀각각 13예와 8예였다. 발생부위는위 14예 (66.7%), 작은창자 5예 (23.8%), 창자사이막 2예 (9.5%) 였다. 육안소견에서종괴의평균장경은 2.7 cm였고, 절단면상경계가뚜렷하고회백색을띠며충실하고단단하였다 (Fig. 1A). 종양을구성하는세포는핵의이형성이없거나대부분중등도이하였다. 세포모양은방추형 12예, 혼합형 5예, 상피모양 4예였고, 주로짧은다발, 소용돌이모양또는판상구조를보였다. 그리고호산성의길다란세포질과타원형의핵, 세포질에공포가관찰되었다 (Fig. 1B). 유사분열수는 50개의고배율시야당평균 1.9개였다. 경계성 GIST 경계성 GIST는 14예였다. 연령분포는 32세에서 70세 ( 평균 54.5 세 ) 였고남녀각각 8예와 6예였다. 수술당시간전이 1예, 배막전이 1예가있었고, 추적검사중재발 1예와배막전이 1예가있었다. 발생부위는위 8예 (57.1%), 작은창자 3예 (21.4%), 배막 2예 (14.3%), 큰창자 1예 (7.1%) 였다. 위에서발생한종괴는대부분체부에존재하며용종성또는내강으로돌출하는종괴였다. 종괴의장경은평균 8.6 cm였고, 10예 (71.4%) 에서중앙부에출혈또는괴사가존재하였다. 종괴의절단면은경계가뚜렷하고분엽상모습을보이며회백색의생선살또는충실성이대부분이었다 (Fig. 1C). 종양세포모양은혼합형 6예, 이형성은중등도가 4예로가장많았다. 종양세포들은짧은다발, 소용돌이모양, 판상구조등의배열을보였다. 유사분열수는 50개의고배율시야당평균 2.4개였다 (Fig. 1D). 악성 GIST 악성 GIST는총 26예였다. 연령분포는 25세에서 77세 ( 평균 55.8세 ) 였고남녀각각14예와 12예였다. 수술당시간전이2예, 배막전이 1예가있었고, 추적검사중간전이 5예와배막전이 2예가있었다. 종양의발생부위로는위가 13예 (50.0%), 작은창자 8예 (30.8%), 큰창자 2예 (7.7%), 식도 2예 (7.7%), 창자사이 Table 1. Correlation between tumor groups and clinicopathologic findings of GISTs Benign (n=21) Borderline (n=14) Malignant (n=26) Size: maximum diameter; Mitosis: numbers/50 high power fields. a : Fisher s exact test; b : 2 test. Total (%) Age (yeas) 54.8 54.5 55.8 55.1 Sex (male:female) 13:8 8:6 14:12 35:26 Tumor site esophagus 0 0 2 2 (3.8) stomach 14 8 13 35 (57.4) small intestine 5 3 8 16 (26.2) large intestine 0 1 2 3 (4.9) other 2 2 1 5 (8.2) Size±SD (cm) 2.7±1.9 8.6±3.9 8.8±5.1 6.7±4.8 Mitosis±SD 1.9±1.4 2.4±1.3 9.1±3.4 5.1±4.2 Cell shape (p=0.15 a ) spindle 12 5 6 23 (37.3) mixed 5 7 16 28 (45.9) epithelioid 4 2 4 10 (16.4) Cellular atypia (p<0.001 a ) none 7 4 1 12 (19.7) mild 7 3 1 11 (18.0) moderate 7 7 19 33 (54.1) severe 0 0 5 5 (8.2) Cellularity (p=0.017 a ) sparse 4 1 0 5 (8.2) moderate 11 9 9 29 (47.5) dense 6 4 17 27 (44.3) Necrosis/Hemorrhage 7 10 23 40 (65.6) (p<0.001 b ) Metastasis/Recurrence 0 4 10 14 (23.0) (p=0.002 a )
GIST 에서 c-kit 돌연변이와면역조직화학적발현 249 A B C D E F Fig. 1. (A) A benign GIST of the stomach; the cut surface is grayish white, hard and homogeneous. (B) Microscopic features of the benign GIST showing a fascicular arrangement of uniform spindle cells. (C) A borderline GIST of the stomach demonstrates both exophytic and endophytic growing patterns. (D) Microscopic features of the borderline GIST show intersecting fascicles of spindle cells with moderate cellularity and atypia. (E) A malignant GIST of the small intestine demonstrates a bulky, exophytic growing pattern. The cut surface shows diffuse hemorrhage and necrosis. (F) Microscopic features of malignant GIST show high cellularity, atypism and increased mitotic activity. In this case the tumor cells reveal epithelioid features. Wild type 5 CCA-CAG-AAA-CCC-ATG-TAT-GAA-GTA-CAG 3 Wild type 5 TAT-GAA-GTA-CAG-TGG-AAG-GTT-GTT-AGA 3 12 bp deletion tumor Mutation 5 TAT-GAA-GTA-CAG-NGG-AAG-GTT-GTT-AGA 3 Mutation 5 CCA-CAG-AAA-CCC-AAG-TGG-AAA-CCC-ATG 3 T&G in tumor C C A C A G A A A C C C A A G T G G A A T A T G A A G T A C A G N G G A A G G T T 0 50 60 60 70 A B Fig. 2. Sequence analysis of exon 11 of c-kit reveals 12 base pair deletion (A) and single base pair mutation (B). 막 1예 (3.8%) 였다. 종괴는주로점막하층, 또는내강으로돌출하고있었으며중앙부는궤양을형성하고있었다. 절단면에서대부분뚜렷한경계가관찰되었지만, 피막은없었고점막층또는창 자사이막으로침윤성성장이관찰되었다. 종괴는회백색의생선살같은충실성단면을보였으며대부분광범위한괴사및출혈을동반하였다 (Fig. 1E). 종양세포의배열과모양은경계성 GIST
250 강동욱 김주헌 김동훈외 3 인 A B Fig. 3. (A) Immunohistochemical stain for CD117 showing strong positive reaction in the cell membrane and cytoplasm of the tumor cells. (B) Immunohistochemical stain for CD34 showing strong positive reaction in the cell membrane and cytoplasm of the tumor cells. Table 2. Correlation between exon 11 mutation of c-kit and clinicopathologic findings of GISTs a : One-way ANOVA; b : Exon 11 mutation of c-kit p value present (n=20) (%) not present (n=41) (%) Mitosis±SD 7.2±4.4 4.1±3.8 0.062 a Size±SD (cm) 8.3±5.3 5.9±4.3 0.005 a Histologic grade 0.030 b benign 3 (15.0) 18 (43.9) borderline 4 (20.0) 10 (24.4) malignant 13 (65.0) 13 (31.7) Cell shape 0.362 b spindle 8 (40.0) 15 (36.6) mixed 7 (35.0) 21 (51.2) epithelioid 5 (25.0) 5 (12.2) Cellular atypia 0.146 c none 4 (20.0) 8 (19.5) mind 3 (15.0) 8 (19.5) moderate 9 (45.0) 24 (58.5) severe 4 (20.0) 1 (2.4) Cellularity 0.125 c sparse 0 (0.0) 5 (12.2) moderate 8 (40.0) 21 (51.2) dense 12 (60.0) 15 (36.6) Necrosis/Hemorrhage 17 (85.0) 23 (56.1) 0.043 b Metastasis/Recurrence 6 (30.0) 8 (19.5) 0.517 c 2 test; c : Fisher s exact test. 와유사하였으나, 대부분중등도이상의세포밀도와이형성이관찰되었다 (Fig. 1F). 유사분열수는 50개의고배율시야당평균 9.1 개였다. c-kit 유전자엑손 11 의돌연변이 자동염기순서분석기를이용하여 c-kit 유전자엑손 11 염기 순서분석을한결과돌연변이는 20예 (32.8%) 가있었으며이들은, 양성 GIST 3예 (15.0%), 경계성 GIST 4예 (20.0%), 악성 GIST 13예 (65.0%) 였다. c-kit 유전자돌연변이도 6-45개염기의결손돌연변이가 16예 (80.0%) 가있었으며, 나머지 4예 (20.0%) 는단일염기돌연변이였다 (Fig. 2). 본연구에서격자이동돌연변이, 첨가및중복돌연변이는관찰되지않았다. 돌연변이는아미노산 codon 550-580 사이에서관찰되었다. c-kit 유전자의돌연변이와종괴의크기, 악성도, 출혈또는괴사유무는통계학적유의성이있었으나 (p<0.05) 유사분열수, 세포모양, 이형성, 세포밀도및전이와는통계학적유의성이없었다 (p>0.05). c-kit 유전자엑손 11 돌연변이와임상및병리학적소견과의상관관계는 Table 2와같다. 면역조직화학염색소견 CD117 에대한면역조직화학염색에서 54예 (88.5%) 가양성반응을보였으며, 양성 GIST 16예 (76.2%), 경계성 GIST 13예 (92.9%), 악성 GIST 25예 (96.2%) 였다. CD117의발현과종괴의출혈또는괴사와는통계학적유의성이있었으나 (p=0.042), 악성도, 세포모양, 이형성, 세포밀도전이및 c-kit 유전자돌연변이유무와는통계학적유의성이없었다. CD34는 56예 (91.8%) 에서양성반응을보였으며, 양성 GIST 19예 (92.9%), 경계성 GIST 13예 (100.0%), 악성 GIST 24예 (92.3%) 였다. CD117과 CD34는종양세포의세포막또는세포막과세포질을따라진한갈색으로발현되었고, 종양전체에미만성으로발현되었다 (Fig. 3). CD34와 CD117이동시에발현되는예는 50예 (82.0%), CD34와 CD117 모두음성반응을보이는예는 1예였다. GIST의면역조직화학염색결과는 Table 3에요약하였다. CD34는악성도, 세포모양, 이형성, 세포밀도, 괴사, 전이및 c-kit 유전자돌연
GIST 에서 c-kit 돌연변이와면역조직화학적발현 251 Table 3. Summary of immunohistochemical stains in 61 GISTs CD117+/CD34+ (n=50) CD117+/CD34- (n=4) CD117-/CD34+ (n=6) CD117-/CD34- (n=1) Total (n=61; %) SMA+ 13 2 4 0 19 (31.1) Desmin+ 3 1 3 0 7 (11.5) S-100 protein+ 12 1 2 0 15 (24.6) c-kit mutation 18 0 2 0 20 (3.8) +, positive reaction; -, negative reaction; SMA, -smooth muscle actin. c-kit mutation: mutaion of exon 11 of c-kit. Table 4. Correlation between CD117 and CD34 expression with clinicopathologic findings of GISTs CD117 positive (n=54) negative (n=7) p value CD34 positive (n=56) negative (n=5) p value Grade 0.135 1.000 benign 16 5 19 2 borderline 13 1 13 1 malignant 25 1 24 2 Cell shape 0.129 0.461 spindle 18 5 20 3 mixed 27 1 27 1 epithelioid 9 1 9 1 Cellualr atypia 0.054 0.424 none 9 3 12 0 mild 9 2 10 1 moderate 32 1 30 3 severe 4 1 4 1 Cellularity 0.187 1.000 sparse 3 2 5 0 moderate 26 3 26 3 dense 25 2 25 2 Necrosis/Hemorrhage 38 2 0.042 36 4 0.651 Metastasis/Recurrence 14 0 0.187 12 2 0.322 c-kit mutation 18 2 0.409 20 0 1.000 p value: Fisher s exact test. c-kit mutation: mutaion of exon 11 of c-kit. 변이유무등과통계학적유의성이없었다. Vimentin은모두양성반응을보였으며등급별, 종양세포모양별, 위치별염색정도의차이는없었다. SMA은 19예 (31.1%) 의 GIST에서강양성혹은국소적양성반응을보였고, 대장의경우 6예모두양성이었다. Desmin은 7예 (11.5%) 에서양성반응을보였고, SMA 양성이면서 desmin에음성인예는 14예 (18.9%), SMA 음성이면서 desmin에양성인예는 1예였다. 15예 (24.6%) 에서 S-100 단백에양성이었고, 소장에서발생한 GIST는 16예중 8예가 S-100 단백에양성이었다. CD117과 CD34에양성인예에서 c-kit 유전자돌연변이는각각 18예 (33.3%) 와 20예 (35.7%) 였다. CD117 과 CD34의면역화학조직염색과임상및병리학적소견의상관관계는 Table 4에요약하였다. 고찰위장관의원발성비상피성중간엽종양은평활근종양, 신경 성분화를보이는종양, 그리고 GIST로구분된다. 1,2 그러나조직학적소견과생물학적특징이중복되는점이많아이들종양을명확히구분하기어렵다. 현재 GIST는위장관에서순수한평활근또는신경성분화를보이지않는비상피성중간엽종양으로정의되고있다. 1-4 과거에소화기계에서발생한간엽종양대부분이장관벽내에위치하면서방추모양을띠고장관벽내의평활근세포에서유래된종양으로인식되어, GIST는평활근종, 평활근모종, 평활근육종등으로기술되었다. 5 그러나 GIST는면역조직화학염색및전자현미경적연구를통하여종양세포의기원이다양하며복잡한분화를보인다는사실이밝혀졌다. 7-9 Rosai 5 는 GIST 를다섯가지의군으로분류하였다. 제1군은면역조직화학염색과형태학적으로평활근분화를보이는군, 제2 군은상피모양모습을보이는군, 제3 군은전자현미경소견상신경분화를보이는군, 제4군은평활근과신경성분화가동시에표현되는군, 제5 군은면역조직화학염색과전자현미경검사를통하여어떠한분화도확인할수없는군으로분류하였다. 조직학적으로 GIST는평활근종보다세포밀도와상피모양세포들의비율이높고, 고형상, 소
252 강동욱 김주헌 김동훈외 3 인 용돌이모양, 책상배열, 미만성등다양한양상을보이며세포질의호산성이낮다. 3 본연구에서종양세포는대부분중등도이상의세포밀도와이형성이관찰되었고, 방추형과상피모양의세포들이다양한구조를보여평활근종과의구분이비교적가능하였다. GIST의악성도는조직학적소견만으로판별하기어렵다. 여러저자에의하여악성의조직학적기준이제시되었는데, 일반적인중간엽세포에서기원한암종의분류와같이종양의유사분열수, 세포밀도, 이형성, 괴사및출혈유무등으로악성도를나누었다. 5,6 본연구에서 Amin 등 6 이기술한유사분열수와종양의크기에따라 GIST를분류한결과, 조직학적악성도와전이유무와는통계학적유의성이있었으나경계성 GIST에서전이와재발이관찰되었다. 따라서조직학적소견만으로악성도를판단하기에는어렵고임상및다양한예후인자들의종합적인판단으로악성도를결정해야할것으로생각되었다. 객관적인예후판정의지표및세포증식능을이용하여종양의악성도를알아보기위해유세포측정기를이용한 DNA 함량분석, 24 PCNA 발현과은호기성을이용한 Ag-NORs 수측정 25 등이시도되었다. 그러나이러한방법들은측정과정에서개인의주관적요소로인해관찰자간에오차가발생할수있고, 자동화된방법을이용하더라도한종양에서도부위에따라결과의차이가날수있으며, 조직의고정상태, 반응시간등에따라그결과가크게좌우되는단점이있다. CD117과 CD34에대한면역조직화학염색은 GIST의발생기원연구에중요한단서를제공하고있고, 특히 CD117은 GIST의진단에가장중요한표지자로알려져있다. 10,11 CD117은염색체 4 번의장완에존재하는 c-kit 유전자의부산물인타이로신카이네이즈수용체로, 골수섬유증, 만성골수성백혈병, 생식세포종, 비만세포종의표지자이다. 13,14 CD34는조혈줄기세포로알려진항원으로서혈관내피세포, 섬유아세포에서정상적으로도발현되며고립섬유종, 융기성피부섬유육종, 혈관주위세포종, 방추세포지방종, 상피모양육종, 근섬유아종양등과같은원시간엽세포에서기원된종양세포의유용한표지자이다. 26,27 본연구에서 CD117 과 CD34에대한면역조직화학염색결과각각 54예 (88.5%) 와 56예 (91.8%) 에서양성반응을보여국내에서김등 23 의 CD117 발현율 82.1% 와성등 22 의 CD34 발현율 91.3% 와비슷한발현율을보였다. Michael 등 27 은 GIST에서 CD34 발현이악성보다는양성 GIST에서발현이더높았다고보고하였으나, 저자들의 CD117 및 CD34 발현은등급별악성도, 세포모양, 이형성, 세포밀도, 전이유무및c-kit 유전자돌연변이등과통계학적유의성은없었다. SMA 또는 desmin이발현되어평활근세포분화를보이는 GIST는 20예 (32.8%) 였고, S-100 단백에양성인신경세포분화를보이는 GIST는 15예 (24.6%) 였다. S-100 단백과 SMA 또는 desmin에양성인 8예는종양세포가미성숙간엽세포에서평활근세포와신경세포로동시에분화되는 GIST로판단하였다. S-100 단백과 SMA 또는 desmin에대해음성인 34예 (55.7%) 는미분화 GIST로판단하였다. CD117 음성인 GIST는 7예 (11.5%) 로위에 6예, 큰창자에 1예가있었지만타장기는없었 다. 이들종괴는주로양성 GIST(5예 ) 와방추형 (5예) 이많았고, 이형성은 1예를제외하고는없거나중등도미만으로낮았다. CD117 음성인 GIST는 CD117 양성인 GIST보다 desmin, SMA, S-100 단백발현비율이높았고, CD34 음성인 GIST 보다평활근세포또는신경세포로분화함을알수있었으나, 증례수가적어좀더많은예의 CD117 음성 GIST에대한조직학적, 면역조직화학염색및분자생물학적관찰이필요할것으로생각된다. 1990년후반부터 GIST의발생기전을유전자수준에서규명하려는연구가진행되어왔다. 여러문헌들 15-19 은위장관의중간엽성전구세포에서 ICC와평활근육세포의분화가관찰됨에따라 ICC와 GIST의종양세포가생성기원이같고, c-kit 유전자의 gain-of-function mutation이 GIST의발생을유발한다고보고하고있다. c-kit 유전자는타이로신카이네이즈수용체를만드는유전자이며 HZ4 feline sarcoma virus의 v-kit 종양유전자와상동물이다. 13 타이로신카이네이즈수용체구조는리간드와결합하는세포외영역 (extracellular domain), 막영역 (transmembrane domain), 근처막영역 (juxtamembrane domain) 과카이네이즈영역 (kinase domain) 으로구성되어있다. 13,14 타이로신카이네이즈수용체는혈소판유래성장인자 (platelet derived growth factor) 와줄기세포인자 (stem cell factor) 수용체군과구조적으로유사하여이들의아형으로알려져있다. 타이로신카이네이즈와리간드인줄기세포인자의결합은 ICC 의발생과성장, 분화및이주에중요한역할을한다. 13,14,28 ICC는소화기관의소화신경전달의매개체또는신경조율의역할을하는세포로, ICC 전구세포가수용체와리간드결합해위장관근육층으로이주하여 ICC 로분화하고그렇지못한경우바깥쪽고유근층의평활근육으로분화된다. 28 Taniguchi 등 16 은 c-kit 유전자의엑손 11에서결손, 첨가, 중복및점돌연변이등다양한형태의유전자변이가나타났고, 이것이예후결정에중요한인자로작용한다고보고하였다. Lasota 등 19 은평활근종과평활근육종의염기서열분석결과 c-kit 유전자의돌연변이는관찰되지않아, GIST와이들종양의감별진단에중요하다고하였다. 본연구에서 GIST 의염기순서분석결과엑손 11의돌연변이는 20예 (32.8%) 에서발견되었고, 양성 GIST 3예 (15.0%) 와비교하여경계성 GIST (4예, 20.0%) 또는악성 GIST (13예, 65.0%) 에서많은돌연변이가관찰되었다. 또한전이및재발을보인 GIST 중 6예 (42.8%) 가 c-kit 유전자의돌연변이가관찰되어유사분열수, 세포밀도, 핵의이형성, 괴사및출혈유무등과더불어중요한예후인자임을알수있었다. 저자들에따라엑손 11의돌연변이를경계성과악성 GIST에국한하여유전자돌연변이의발생율을 30-60% 로보고하였다. 16,17 본연구에서도경계성과악성 GIST에국한하면 42.5%(17예 ) 에서 c-kit 유전자의돌연변이가관찰되어비슷한결과를얻었다. 현재까지밝혀진 GIST의유전자돌연변이는주로엑손 11에서발견되었고, 드물게엑손 9와엑손 13에서일어났다. 17 비교유전자잡종검사에서염색체 14번과 22번의 DNA 복제수의변이가관찰된점 29 등으로보아 GIST 발생기전이매우다양함을알
GIST 에서 c-kit 돌연변이와면역조직화학적발현 253 수있었다. 저자들은문헌고찰과연구결과를통하여 GIST가다른중간엽종양과발생기원이다르고, 미성숙중간엽세포에서유래되어평활근육및신경분화가있음을관찰할수있었으며, 엑손 11의돌연변이는유사분열수, 크기, 세포밀도, 출혈및괴사등과더불어예후와관련된중요한지표임을알수있었다. 향후 c-kit 유전자의모든엑손에대한염기서열분석과돌연변이의유무, 다른원종양유전자의돌연변이의발견및발생학적계통연구가기대된다. 참고문헌 1. Hamilton SR, Aaltonen LA. Pathology and genetics of tumours of the digestive system. World health organization classification of tumours. Lyon: IARC, 2000; 62-5. 2. Lewin KJ, Appelman HD. Tumors of the esophagus and stomach. Atlas of tumor pathology. Washington DC: AFIP, 1996; 401-56. 3. Miettinen M, Sarlomo-Rikala M, Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors: recent advances in understanding of their biology. Hum Pathol 1999; 30: 1213-20. 4. Trupiano JK, Stewart RE, Misick C, Appelman HD, Goldblum JR. Gastric stromal tumors: a clinicopathologic study of 77 cases with correlation of features with nonaggressive and aggressive clinical behaviors. Am J Surg Pathol 2002; 26: 705-14. 5. Rosai J. Ackerman s surgical pathology. 8th ed. St. Louis: Mosby, 1996; 645-7. 6. Amin MB, Ma CK, Linden MD, Kubus JJ, Zarbo RJ. Prognostic value of proliferating cell nuclear antigen index in gastric stromal tumors. Correlation with mitotic count and clinical outcome. Am J Clin Pathol 1993; 100: 428-32. 7. Mazur MT, Clark HB. Gastric stromal tumors. Reappraisal of histogenesis. Am J Surg Pathol 1983; 7: 507-19. 8. Evans HL. Smooth muscle tumors of the gastrointestinal tract: a study of 56 cases followed for a minimum of 10 years. Cancer 1985; 56: 2242-50. 9. Saul SH, Rast ML, Brooks JJ. The immunohistochemistry of gastrointestinal stromal tumors. Am J Surg Pathol 1987; 11: 464-73. 10. Seidal T, Edvardsson H. Expression of c-kit (CD117) and Ki-67 provides information about the possible cell of origin and clinical course of gastrointestinal stromal tumors. Histopathology 1999; 34: 416-24. 11. Sarlomo-Rikala M, Kovatich AJ, Barusevicius A, Miettinen M. CD117, a sensitive marker for gastrointestinal stromal tumors that is more specific than CD34. Mod Pathol 1998; 11: 728-34. 12. Robinson TL, Kanishka S, Bryan R, et al. Gastrointestinal stromal tumors may originate from a subset of CD34-positive interstitial cells of Cajal. Am J Pathol 2000; 156: 1157-63. 13. Ma Y, Longley BJ, Wang X, Blount JL, Langley K, Caughey GH. Clustering of activating mutations in c-kit s juxtamembrane coding region in canine mast cell neoplasms. J Invest Dermatol 1999; 112: 165-70. 14. Tian Q, Frierson HF Jr, Krystal GW, Moskaluk CA. Activating c-kit gene mutations in human germ cell tumors. Am J Pathol 1999; 154: 1643-7. 15. Hirota S, Isozaki K, Moriyama Y, et al. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science 1998; 279: 577-80. 16. Taniguchi M, Nishida T, Hirota S, et al. Effect of c-kit mutation on prognosis of gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res 1999; 59: 4297-300. 17. Wardelmann E, Neidt I, Bierhoff E, et al. c-kit Mutations in gastrointestinal stromal tumors occur preferentially in the spindle rather than in the epithelioid cell variant. Mod Pathol 2002; 15: 125-36. 18. Lux ML, Rubin BP, Biase TL, et al. KIT extracellular and kinase domain mutations in gastrointestinal stromal tumors. Am J Pathol 2000; 156: 791-5. 19. Lasota J, Jasinski M, Sarlomo-Rikala M, Miettinen M. Mutations in exon 11 of c-kit occur preferentially in malignant versus benign gastrointestinal stromal tumors and do not occur in leiomyomas or leiomyosarcomas. Am J Pathol 1999; 154: 53-60. 20. Ko HM, Kim KS, Lee JH, Juhng WS, Juhng SW. Immunohistochemical and ultrastructural studies of gastric smooth muscle tumor. Korean J Pathol 1996; 30: 245-54. 21. Cho MY, Hong SW, Jung SH, Kim H, Park C. Flow cytometric DNA analysis of gastrointestinal stromal tumors. Korean J Pathol 1997; 31: 608-16. 22. Sung SH, Cho MS, Han WS. CD34 antigen expression in gastrointestinal stromal tumors. Korean J Pathol 1997; 31: 1166-71. 23. Kim JK, Kwon OJ, Kim BH. Immunohistochemical expression of CD117, CD34, vimentin and -smooth muscle actin in gastrointestinal stromal tumors. Korean J Pathol 2001; 35: 506-12. 24. Cooper PN, Quirke P, Hardy GJ, Dixon MF. A flow cytometric, clinical and histological study of stromal neoplasm of the gastrointestinal tract. Am J Surg Pathol 1992; 16: 163-70. 25. Yu CC, Fletcher CD, Newman PL, Goodlad JR, Burton JC, Levison DA. A comparison of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunostaining, nucleolar organizer region (AgNOR) staining, and histological grading in gastrointestinal stromal tumours. J Pathol 1992; 166: 147-52. 26. Natkunam Y, Rouse RV, Zhu S, Fisher C, van De Rijn M. Immunoblot analysis of CD34 expression in histologically diverse neoplasms. Am J Pathol 2000; 156: 21-7. 27. Michael AI, Bacchi CE, Zarbo RJ, Ma CK, Gown AM. CD34 expres-
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