J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 46(8), 910~918(2017) https://doi.org/10.3746/jkfn.2017.46.8.910 홍삼복합추출물의 AMPK 활성화를통한고지혈증개선 정하진 오승택 류천봉 최유라 이성미 전송희 전남대학교의과대학의과학과 Red Ginseng Alters Lipid Metabolism through AMPK Activation in Liver and Adipose Tissues of High-Fat Diet-Fed Mice Ha Jin Jeong, Seung Tack Oh, Quan Feng Liu, Yura Choi, Seoungmi Lee, and Songhee Jeon Department of Biomedical Sciences, Chonnam National University ABSTRACT Hyperlipidemia is known as a glucose and lipid metabolism-related disorder that is increasing in incidence in modern society. Red ginseng (RG) is a natural herb candidate with a positive effect on regulation of cholesterol and lipids. To observe the effects of RG on regulation of lipids, cholesterol, glucose, and oxidative stress, we examined the in vitro and in vivo effects of Chamdahan RG on differentiated 3T3-L1 adipocytes and high-fat diet-fed mice. RG (50 μg/ml) significantly inhibited lipid synthesis in 3T3-L1 cells. In addition, a low concentration of RG (880 mg/kg/d) resulted in the lowest total blood cholesterol level. Moreover, high density lipoprotein-cholesterol quantity increased in RG-treated groups, consequently lowering the cardiovascular risk factor and atherosclerosis index. Moreover, RG increased activity of AMP-activated protein kinase, as a regulator of lipid and cholesterol synthesis, in adipose and liver tissues. Cumulatively, this paper suggests that RG has a positive effect on reducing the amounts of cholesterol and lipids and may be a good candidate for treating hyperlipidemia. Key words: red ginseng, hyperlipidemia, AMPK, high density lipoprotein-cholesterol 서 현대인들의운동부족, 식습관, 음주, 비만등으로인한잘못된생활습관으로인해최근대사성질환을가진사람들이급증하고있으며, 특히심혈관계질환은수십년간지속해서증가하여의학및영양학적측면에서큰이슈가되고있다 (1-3). 대사증후군은동맥경화증, 심장병및고혈압과같은심혈관질병의발병률과사망률을증가시키며 (1,3), 주요요인중하나인고지혈증은저밀도지단백 (low density lipoprotein, LDL) 농도의증가, 고밀도지단백 (high density lipoprotein, HDL) 의감소, 중성지방의증가, 지질분해의감소, 리포단백질의증가와같은지방의생화학대사과정에이상이생겼을때발생한다 (4). 고지혈증의경우죽상동맥경화증등을포함하는심혈관질환의위험요인이며, LDL-콜레스테롤레벨이증가하고고콜레스테롤혈증의결과가발생한다 (5). 이러한질병들을치료하는목적으로약물을장기복용하게되는데이에따른 Received 26 May 2017; Accepted 28 July 2017 Corresponding author: Songhee Jeon, Department of Biomedical Sciences, Center for Creative Biomedical Scientists, Chonnam National University, Gwangju 61469, Korea E-mail: jsong0304@jnu.ac.kr. Phone: +82-61-379-2862 론 여러가지부작용이발생하고있다. 따라서천연물개발이많은각광을받고있는추세이다 (6,7). 홍삼은수삼 (Panax ginseng C.A. Meyer) 을쪄서말릴때손실되는수삼진액을다중제어시스템을사용함으로써유효성분을보존하여건조후에는붉은색보다는흑갈색진액의색을띤다. 실험에사용한홍삼은세포벽 (cellulose) 을깨는초미세분말기술을사용하여세포벽안에있던유효성분의흡수율을높임으로써유효성분의함유량이높다. 쪄서말리는과정에서생산되는 ginsenoside 중 Rg2는혈중콜레스테롤수치저하, 배설촉진, 고콜레스테롤혈증으로인하여발생하는동맥경화의개선효과가보고된바있다 (8). 이뿐만아니라홍삼의유효성분인 ginsenoside는지방이나콜레스테롤의흡수, 이동속도를촉진시키고, 혈청콜레스테롤증가를억제한다는연구결과 (9,10) 와 LDL 수용체의합성억제를완화시켜콜레스테롤을저하시킨다는보고가있다 (11). AMP-activated protein kinase(ampk) 는에너지고갈에의해활성화되어주요한에너지조절인자로서작용한다. AMPK는과도한탄수화물을지방산으로전환시키는 de novo lipogenesis를조절하는주요한전사인자인 sterol regulatory element binding protein-1(srebp-1) 단백질량을감소시켜지방산합성을감소시킨다. 따라서 AMPK는대사증후군의치료표적으로대두되었고, 실제로 AMPK 활
홍삼에의한고지혈증개선 911 성인자는대사증후군과제2형당뇨병에치료효과를보인다 (12,13). 이에본연구는고지방식이를먹이는마우스에홍삼을저, 중, 고농도로 3달간투여하여혈중, 간, 내장지방에서지질, 콜레스테롤, 당농도, 산화스트레스정도및지질대사관련유전자발현등에미치는영향을조사하여홍삼의고지혈증의치료효능을밝히고그작용기전을규명하고자하였다. 재료및방법시료추출실험에사용한홍삼음료는대동인삼 (Busan, Korea) 에서공여받았으며, 홍삼음료제품의구성원재료는중금속및미생물검사를수행하여품질의안전성을확보하였다. 시료의주재료인홍삼은수삼을최적화온도 (110~115 C) 에서일정한시간 (3~10시간) 으로증삼과건조를반복하여제조하였으며, 제조후이를 <30 μm의직경으로초미세분말화한분말을첨가하여사용하였다. 초미세분말을얻기위하여 Jet Mill 공법을사용한시료를제공받았다. 이후이를정제수에분산시켜고형분 6% 인홍삼분말액을제조한다음홍삼분말액 77.67%(w/w), 홍삼농축액 ( 홍삼성분함량 70 mg/g) 4.33%(w/w), 식물혼합농축액 [ 숙지황 35.89% (w/w), 백복령 14.10%(w/w), 두충 13.19%(w/w), 구기자 12.28%(w/w), 대추 12.27%(w/w), 건생강 12.27%(w/w)] 10%(w/w), 자일리톨 8%(w/w) 를첨가하여최종시료를제작하였다. 각실험에사용된시료는모두동일한원료및함량비로제조하여사용하였다. 최종홍삼시료는동결건조후지방세포분화실험과동물실험에사용하였다. 3T3-L1 지방세포분화분석 3T3-L1 지방세포를 6-well 기준 0.8 10 5 cells/well로 seeding 해준후 48시간동안 100% confluency로키우고, 세포분열을막기위하여다시 48시간보관하였다. 그후지방세포 differentiation media(1 μm dexamethasone, 0.5 mm 3-isobutyl-1-methylxanthine, 10 μg/ml insulin and DMEM complete media) 를 72시간처리하고, 분화배지를제거한후지방세포 maturation media(dmem complete media and 10 μg/ml insulin) 로교체하였다. Maturation media는 2일에한번갈아주며, 총 27일동안처리하였다. 최종분화는아래와같이 Oil Red O 염색법을통해확인하였다. 6-well에있는미디어를제거하고 PBS로 washing 하였으며, 10% formalin으로 5분간상온에서고정 (fixation) 시켰다. Formalin을제거하고새 formalin으로교체하여파라필름 (parafilm) 및호일로덮어 1일보관하였다. Formalin 을제거한후 60% isopropanol로 washing 해주고기건 (air dry) 시켰다. Oil Red O working solution을넣고 10분간상온에서보관한후, 증류수로 4번 washing 해준뒤사진을촬영하고 520 nm에서흡광도를측정하였다. 실험동물실험동물은 5주령된 ICR종수컷마우스를 ( 주 ) 코아텍 (Seoul, Korea) 으로부터구입하여 1주일간일반사료로적응시켰다. 그런다음실험군마다평균체중이약 30 g이되도록각군당 10마리씩 5개군으로나누어 5마리씩분리사육하였다. 실험동물사육실의온도는 22±2 C, 상대습도는 50±5% 로유지하였으며명암은 12시간주기로조절하였다. 홍삼의처리는 70 kg 성인이하루에홍삼 50 ml를복용하는것을기준 (0.714 ml/kg) 으로했으며이를마우스로환산하면 8.806 ml/kg이다 (14). 홍삼 50 ml를동결건조하면약 10.3 g( 수득율 20.6%; 0.2 g/ml) 을얻고이를적용하면 1.76 g/kg이며이것을기준으로홍삼중농도투여군 (RG-M) 으로하였다. 본동물실험에서실험군의분류는고지방대조군 (Sham) 은 high-fat diet(hfd) 식이, 홍삼저농도투여군 (RG-L) 은 HDF 사료에홍삼 880 mg/kg/d, 홍삼중농도투여군 (RG-M) 은 HFD 사료에홍삼 1,760 mg/kg/ d, 홍삼고농도투여군 (RG-H) 은 HDF 사료에홍삼 3,520 mg/kg/d, 양성대조군 (Pravastatin) 은 HFD 사료에 pravastatin 40 mg/kg/d를섞어자유롭게섭취하도록군을설정하였다. 본동물실험은동국대학교동물실험윤리위원회승인 (IACUC-2016-026-1) 하에진행되었다. 식이섭취량, 식이효율및체중측정식이섭취량과체중은일주일에한번일정한시간대에측정하였으며, 실험기간의체중증가량을같은기간의총식이섭취량으로나누어식이효율 (%) 을산출하였다. 실험동물의처리 13주간실험사육후최종일에 12시간절식시킨다음 25 mg/kg 졸레틸로마취시켜심장채혈하였으며, 채혈된혈액은 3,000 rpm에서 15분간원심분리시켜혈청을분리하여 -70 C에보관하고분석시에사용하였다. 실험동물의간, 지방및뇌는채혈후즉시분리시켰으며, 생리식염수로혈액을씻은다음흡수지로물기를제거한후중량을측정하였고, -70 C에보관하면서분석용시료로사용하였다. 경구당부하검사및혈당반응면적실험 12주째실험동물을 12시간절식시킨후꼬리정맥에서혈액을채취하고, ACCU-CHEK Active 혈당기 ( 한국로슈진단, Mannheim, Germany) 를이용하여공복혈당을측정하였다. 50% glucose 용액 (0.2 g glucose/100 g) 을경구투여후 30분, 60분및 120분에정맥혈의혈당을측정하여혈당농도의변화를관찰하였다. 경구당부하검사의결과는혈당반응면적 (area under the curve, AUC) 으로나타내었다. 고밀도지단백콜레스테롤측정혈중 HDL-콜레스테롤함량측정은면역화학검사시약법
912 정하진 오승택 류천봉 최유라 이성미 전송희 ( 아산셋트에취디엘콜레스테롤성분정량검사시액, Asan Pharm. Co., Seoul, Korea) 에따라혈청 20 μl와분리시액 20 μl를잘혼합하여 10분간실온에방치후, 3,000 rpm에서 10분간원심분리시켰다. 상층액 10 μl를따서효소시액 300 μl와잘혼합하여 5분간방치한후 60분이내에 500 nm에서흡광도를측정하였다. 과산화지방질측정혈중과산화지방질 (malondialdehyde, MDA) 양을분석하기위하여과산화지방질비색분석법 (BioVision Lipid Peroxidation Colorimetric Assay Kit, BioVision Inc., Mountain View, CA, USA) 에따라혈청샘플 10 μl를 42 mm 황산 500 μl와잘혼합한후 13,000 g에서 10분간원심분리하였다. 125 μl phosphotungstic acid 용액을넣고 vortex 한후 5분간상온에서방치한다음, 13,000 g에서 3분간원심분리하였다. 펠렛을수집하여얼음위에서 100 μl 증류수 (2 μl BHT 포함 ) 와재혼합하였다. 증류수로최종부피를 200 μl에맞춰주고 2 mm 표준액을 0, 2, 4, 6, 8, 10 μl씩넣은후증류수로 200 μl 부피를맞춘다음, 600 μl TBA 시약을넣고 60분간 95 C에서반응하였다. 얼음에서 10분간방치하여온도를떨어뜨린뒤에샘플흡광도를 532 nm에서측정하였다. 중성지방측정혈중중성지방 (triglyceride, TG) 의측정은효소법 ( 아산셋트중성지방측정용시액, Asan Pharm. Co.) 의방법에따라혈청 20 μl를효소용액 3 ml와잘혼합하여 37 C에서 10분간방치한후 60분이내에 550 nm에서증류수를대조로흡광도를측정하였다. 총콜레스테롤측정혈청중에존재하는총콜레스테롤 (total cholesterol, T- CHO) 의양은면역화학검사시약 ( 아산셋트총콜레스테롤측정용시액, Asan Pharm. Co.) 을이용한효소방법에따라효소시액 300 μl와표준시액, 혈청을각각 2 μl 넣고잘혼합한후 37 C에서 5분간방치한다음시약블랭크를대조로파장 500 nm에서흡광도를측정하였다. RNA 분리뇌조직 (hypothalamus) 으로부터 RNA를추출하기위하여조직을추출시약 (Trizol) 300 μl에넣고 homogenizer 로균질화한후상온에 5분동안방치하였다. 이후 chloroform을 200 μl 넣어 30초간 vortex 하였고, 12,000 rpm에서 5분간원심분리를한후상층액을새로운튜브에옮긴다음동일양의 phenol : chloroform : isoamyl alcohol(25: 24:1) 용액넣어 30초간 vortex 후에 5분간 12,000 rpm에서 5분간원심분리를시행하였다. 상층액을모아동량의 isopropanol을넣어 vortex 후상온에서 5분간방치한다음 12,000 rpm으로 20분간원심분리하여 RNA 침전물을획득하였다. 획득한침전물은 70% 에탄올 1 ml를넣어 washing 하여 12,000 rpm으로 20분간원심분리를한후에탄올을제거한다. Hood 안에서 pellet을말려준후 TE buffer 20 μl를넣어준다음 60 C에서 5분간끓여준후 Qubit working solution(q32852, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 을이용하여 RNA 정량을시행하였다. 실시간역전사중합효소연쇄반응 RNA to cdna EcoDryTM Premix(Oligo dt; Clontech, Mountain View, CA, USA) 를이용하여 cdna를합성하였다. cdna를합성한후비만에관련된인자인 neuropeptide Y(NPY), cocaine-and amphetamine-regulated transcript(cart), tumor necrosis factor(tnf-α) 의 mrna 발현정도를확인하였다. 실시간역전사중합효소연쇄반응 (real-time PCR quantification) 은 Rotor-Gene SYBR- Green PCR Kit(Qiagen, Hilden, Germany) 을이용하여증폭하였다. 실험에사용된 primer의염기서열과 PCR 조건은 Table 1과같으며유전자의정량분석은 Rotor-Gene Q series Software(Qiagen) 를이용하였다. 간의과산화지방질분석간조직에서과산화지방질양을분석하기위하여과산화지방질비색분석법 (BioVision Lipid Peroxidation Colorimetric Assay Kit, BioVision Inc.) 을실시하였다. 얼음위에서간조직샘플 10 mg을분쇄하여 MDA lysis buffer 300 μl(3 μl 100X BHT 포함 ) 를넣고 13,000 g에서 10분 Table 1. PCR primers and condition for real-time PCR Gene TNF-α NPY Cart Actin Forward and reverse primer sequence F R F R F R F R Nucleotide sequences ATGAGCACAGAAAGCATGATCCGC CCAAAGTAGACCTGCCCGGACTC TACTCCGCTCTGCGACACTACA AATCAGTGTCTCAGGGCTGGAT CTGCAATTCTTTCCTCTTGAAGTG GGGAATATGGGAACCGAAGGT CAAGAGAGGCCACGGCTGC TCCTTCTGCATCCTGTCGGC Length of PCR products (bp) Annealing ( C) 644 58 78 58 68 58 275 60
홍삼에의한고지혈증개선 913 간원심분리하였고, 샘플상층액 200 μl를획득하였다. 2 mm 표준액을 0, 2, 4, 6, 8, 10 μl씩넣은후증류수로 200 μl 부피를맞춘다음샘플과표준액에 600 μl TBA 시약을넣고 60분간 95 C에서 incubate 하였다. 얼음에서 10분간보관하여온도를떨어뜨린뒤에샘플흡광도를 532 nm에서측정하였다. 간의글루타티온과산화효소분석간조직에서글루타티온과산화효소 (glutathione peroxidase) 양을분석하기위하여글루타티온과산화효소비색분석법 (BioVision Glutathione Peroxidase Activity Colorimetric Assay Kit, BioVision Inc.) 을실시하였다. 0.1 g의간조직을균질화시킨후조직샘플을 0.2 ml의차가운 assay buffer에넣고 10,000 g에서 15분간 4 C에서원심분리하고상층액을얼음에보관하였다. 2~50 μl의샘플을 96-well plate에넣고, assay buffer로부피를 50 μl로맞추었다. 40 mm NADPH 용액 25 μl를 975 μl 증류수에희석하여 1 mm NADPH 용액을만들어 0, 20, 40, 60, 80, 100 nmol/well 표준용액을만들었다. 마지막으로 assay buffer로샘플및표준액총부피를각 100 μl로맞춘후 340 nm에서흡광도를측정하였다. 간, 지방조직의단백질분석조직샘플을액화질소에서분쇄후 microcentrifuge tube 에옮긴뒤에 50 mm Tris-base(pH 7.5), 10 mm Na-pyrophosphate, 1% NP-40, protease inhibitor가포함된 lysis buffer를넣었다. 정량후 30 μg 조직샘플을 SDSgel을사용하여전기영동시키고 nitrocellulose membrane 으로 transfer 시킨후, 1차항체 anti-phosphor-ampk, anti-ampk, anti-β-actin, anti-ccaat/enhancer binding protein(c/ebp)α(cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), SREBP1(Abcam, Cambridge, UK), peroxisome proliferator-activated receptor gamma(pparγ; Millipore, Billerica, MA, USA) 를 16시간동안반응시켰다. 1 TBST buffer에서 washing을 3번한뒤 anti-rabbit 및 anti-mouse 2차항체를 2시간붙인후 1 TBST buffer 에서 4번 washing 하였다. 항체발현도는 Imager ChemiDoc XRS+(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 를사용하여획득하였으며, Image Lab TM software version 2.0.1(Bio-Rad) 을통하여분석하였다. 하였다. 결과및고찰홍삼추출물의 3T3-L1 지방세포독성측정홍삼추출물의세포독성을측정하기위해 3T3-L1 세포를 96-well plate에 2 10 4 cells/well로배양한후홍삼추출물을 10, 20, 50, 100, 200, 250, 500 μg/ml의농도로처리하였다. 24시간후에 MTT 용액을이용하여세포독성을측정한결과홍삼추출물에의한세포독성은나타나지않았다 (Fig. 1). 홍삼추출물의지방분화억제효능평가지방세포분화에미치는영향을관찰하기위해 20, 50, 100 μg/ml의농도로지방세포분화시에처리한후 Oil Red O 염색법을통하여세포내지방함량을분석한결과대조군대비홍삼을처리한모든군에서유의하게지방함량이저해되었는데저농도 (20 μg/ml, 84.25±7.1%) 및고농도 (100 μg/ml, 85.01±6.0%) 처리군에비해홍삼중농도 (50 μg/ml, 58.25±7.5%) 처리군이양성대조군인 pravastatin(30.5±8.5%) 과유사하게감소하였다 (Fig. 2). 이는지방세포에서 50 μg/ml까지는농도의존적으로홍삼이지방세포분화를억제하나그이상의농도에서는오히려그효과가감소하는것을보여주고있다. 식이섭취량, 식이효율및체중 ICR 5주령마우스에고지방식이와첨가수준을달리한홍삼식이를 13주간급여한각군의체중증가량, 식이섭취량및식이효율은 Table 2와같다. 체중증가량은고지방대조군에비해홍삼중농도섭취군, 고농도섭취군그리고양성대조군은약간증가하는경향을보였고, 홍삼저농도섭취군만이감소하였으나유의성은없었다. 식이섭취량은모든군이유사한경향을보였다. 식이효율은고지방대조군에비 통계분석모든분석자료는결과는 SPSS 23(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 를이용하였으며, 통계적유의성검정은 P<0.05 수준일때를기준으로하고평균 ± 표준오차 (mean±se) 로나타내었다. 일원배치분산분석 (one-way ANOVA) 을한후, 각시료간의통계적유의성은 Tukey s multiple comparison test 또는 Dunnett s test를이용하여사후검증을 Fig. 1. Cell viability of red ginseng (RG) extract on 3T3-L1 cells. Cells were treated with various concentrations of RG (10, 20, 50, 100, 200, 250 or 500 μg/ml) for 24 h. Cell viability was determined by the MTT assay. Values are mean±se (n=6).
914 정하진 오승택 류천봉 최유라 이성미 전송희 A B Fig. 2. Oil Red O staining in 3T3-L1 adipocytes. Cells were treated with different concentrations RG (20 μg/ml, 50 μg/ml, and 100 μg/ml) or pravastatin (10 μg/ml) of for 27 days. (A) Oil Red O stained cells were captured. (B) The optical density of stained lipid was measured. Values are mean±se (n=6). * P<0.05 vs Control, ** P<0.01 vs Control, *** P<0.001 vs Control. Table 2. Effects of red ginseng (RG) on body weight, food intake, and food efficiency ratio in ICR mice fed a HFD for 13 weeks Groups Sham RG-L RG-M RG-H Pravastatin Initial body weight (g) 30.88±0.81 30.44±0.37 30.74±0.59 30.48±0.39 30.30±0.75 Final body weight (g) 54.02±2.86 52.34±2.80 56.10±3.11 56.22±1.49 54.30±2.66 Body weight gain (g) 23.14±2.47 21.90±2.62 25.36±2.56 25.74±3.44 24.00±0.53 Body weight gain (g/d) 0.21±0.02 0.24±0.03 0.33±0.02 0.25±0.03 0.29±0.01 Food intake (g/d) 6.29±0.10 6.96±0.22 6.20±0.12 7.20±0.29 6.43±0.18 Food efficiency ratio 4.06±0.47 3.44±0.35 4.50±0.46 3.98±0.38 4.10±0.05 Sham: high fat diet group, RG-L: red ginseng (880 mg/kg/d) contained HFD group, RG-M: red ginseng (1,760 mg/kg/d) contained HFD group, RG-H: red ginseng (3,520 mg/kg/d) contained HFD group, Pravastatin: Pravastatin (40 mg/kg/d) contained HFD group. Values are mean±se (n=6). 해큰차이를보이지않았고, 홍삼저농도섭취군은유의적인차이는없었으나고지방대조군에비해약 15% 감소하였다. 혈액성분분석고지방식이와첨가수준을다르게한홍삼식이를급여한각군의중성지방, 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 심혈관위험지수 (cardiac risk factor, CRF) 및동맥경화지수 (atherogenic index, AI) 는 Table 3과같다. 혈청중중성지방함량은고지방대조군에비해모든실험군이증가하는경향을보였으나유의적인차이는없었다. 혈청중총콜레스 테롤의양은고지방대조군에비해다른모든실험군에서감소하는경향을보였고, 특히홍삼저농도섭취군에서많은감소를나타내어유의성있는차이를보였다 (P<0.01). 또한, 혈청중 HDL-콜레스테롤은고지방대조군에비해홍삼저농도섭취군, 중농도섭취군및양성대조군에서유의적으로증가하는경향을보였다. 이에따른심혈관위험지수와동맥경화지수역시고지방대조군에비해다른모든군에서유의적으로감소하는경향을보였으며, 특히홍삼저농도섭취군이가장크게감소하는결과를보였다 (P<0.001). 이는홍삼이고지방식이로증가된총콜레스테롤을낮춰주고, Table 3. Effects of red ginseng (RG) on body weight, food intake, and food efficiency ratio in ICR mice fed a HFD for 13 weeks Groups Sham RG-L RG-M RG-H Pravastatin Triglyceride (mg/dl) 110.20±9.66 154.40±12.01 134.94±10.52 136.90±13.12 132.83±12.26 Groups are the same as Table 2. Values are mean±se (n=6). ** P<0.01 vs Sham, *** P<0.001 vs Sham. Total cholesterol (mg/dl) 88.00±2.83 64.48±3.25 ** 77.58±2.58 71.70±3.29 77.46±6.47 HDL-cholesterol (mg/dl) 17.38±1.86 37.66±3.64 ** 45.66±5.50 ** 30.44±3.89 40.34±3.17 ** CRF (cardiac risk factor) 5.23±0.43 1.75±0.10 *** 1.77±0.15 *** 2.45±0.19 *** 1.93±0.10 *** AI (atherogenic index) 4.23±0.43 0.75±0.10 *** 0.77±0.15 *** 1.45±0.42 *** 0.93±0.10 ***
홍삼에의한고지혈증개선 915 A B Fig. 3. Oral glucose tolerance test (OGTT) in ICR mice fed a HFD with RG for 13 weeks. (A) Blood samples were taken at 0, 30, 60, 90, and 120 min. All values are expressed as mean±se (n=10); (B) Area under the curve of glucose. 특히 HDL-콜레스테롤을증가시킴으로써심혈관위험지수및동맥경화지수를낮춰주어혈중지질개선효과와심혈관계질환의개선에도움을주는것으로여겨진다. 경구당부하검사, 혈당반응면적전혈의공복혈당수준은고지방대조군에비해홍삼고농도섭취군과양성대조군에서높게나왔으나유의적이지않았다. 포도당투여후혈당의변화는고지방대조군과양성대조군에서는포도당투여 30분후에가장높은혈당수준을보인후감소하였으나, 홍삼을섭취한군은포도당투여 60 분후에가장높은혈당수준을보인후감소하였고, 시간대별유의적인차이는보이지않았다 (Fig. 3A). 또한, 혈당반응면적역시고지방대조군에비해유의한차이는보이지않았지만, 홍삼을섭취한군이 14~18% 정도낮은경향을보였다 (Fig. 3B). 뇌시상하부에서 NPY 발현변화뇌의시상하부를실시간역전사중합효소연쇄반응을통하여식이조절과에너지섭취관련인자인 NPY, 식욕에관련되었다고알려진 Cart와면역반응에관련된인자인 TNFα를확인하였다 (15,16). 그결과고지방대조군에비해홍삼 중농도, 고농도섭취군및양성대조군에서 NPY의 mrna 발현량이증가하는것을확인하였다 (Fig. 4). 이결과는각군의체중증가량및식이효율과유사한경향을보이며, 홍삼추출물이 NPY를통하여식이조절에연관되어있음을시사한다. 간조직단백질분석 AMPK는대사성스트레스나운동으로세포내의에너지가감소하는경우에너지를소비하는과정인지방산합성과콜레스테롤합성을억제하고에너지를생산하는지방산산화를촉진한다 (17). 또한, AMPK는지방합성및콜레스테롤합성에필요한효소인 acetyl-coa carboxylase(acc) 를인산화및불활성화시킴으로써 malonyl-coa 양을감소시키고 carnitine palmitoyltransferase-1α를활성화하는것으로보고되었으며, ACC의억제에의한 acetyl-coa 및 malonyl-coa 생산의감소가지방산화를촉진하고지방및콜레스테롤합성을저하시키는것으로알려져있다 (18,19). 간조직에서지방대사관련단백질인 AMPK 발현을측정한결과, 고지방대조군에비해홍삼저농도섭취군에서 AMPK 발현이현저하게증가하는것을확인하였다 (Fig. 5, P<0.01). 이처럼홍삼저농도섭취군에서의 AMPK 발현증가는지방산화증가와지방및콜레스테롤합성감소현상을시사한다. ** ** Pravastatin TNF-α NPY Cart Fig. 4. Effect of RG on mrna levels of TNF-α, NPY, Cart gene in RG dieted hypothalamus. Real-time PCR was analyzed in the cdna. Values are expressed as mean±se (n=4). ** P<0.01 vs Sham. 간조직에서의과산화지방질분석 MDA는막지질단백질이나불포화지방산이자유라디칼 (free radicals) 로인하여산화적스트레스를받게될때발생되는산화물질인데, 특히고지방식이섭취동물모델에서많이발견된다고하는발표가있다 (20). 간조직에서자동산화및활성산소등에의해과산화반응을일으킨과산화지질을측정하였는데, 고지방대조군, 홍삼섭취군및양성대조군에서모두과산화지질의양은변화가없음을확인하였으며 (Fig. 6), 이는홍삼및양성대조군모두과산화지질조절기능과는관련이없음을알려준다. 간의글루타티온과산화효소분석글루타티온과산화효소는산화스트레스로부터유기체를
916 정하진 오승택 류천봉 최유라 이성미 전송희 A Sham RG-L RG-M RG-H Pravastatin pampk tampk β-actin B ** C Fig. 5. Expression and phosphorylation levels of AMPK. (A) Liver tissue lysates were electrophoresed and immunoblotted with each antibody. (B) Total AMPK levels were normalized to β-actin. (C) Phospho-AMPK levels were normalized to total AMPK. All values are expressed as mean±se (n=6). ** P<0.01 vs Sham. Fig. 6. Lipid peroxidation (MDA) analysis. The end-products of lipid peroxidation (malondialdehyde) were assessed using 96-well ELISA microplate. The intensity of color change was quantified using spectrophotometer. All values are expressed as mean±se (n=6). Fig. 7. Glutathione peroxidase (GPx) activity was analyzed in the liver tissue. Glutathione dependent peroxidases were assessed using 96-well ELISA microplate. The intensity of color change was quantified using spectrophotometer. All values are expressed as mean±se (n=6). Significant difference was determined using t-test. ** P<0.01 vs Sham. 보호하는기능을하며, 글루타티온과산화효소의감소는자유라디칼로인한질병을발생시킬수있다. 간조직에서글루타티온과산화효소활성도를분석하기위하여글루타티온과산화효소비색분석법을실시하였는데, 그결과고지방대조군에비해홍삼중농도, 고농도섭취군및양성대조군에서는유의하게변하지않았으나, 홍삼저농도섭취군에서현저히증가하였음을확인하였다 (Fig. 7). 따라서홍삼저농도섭취군에서글루타티온과산화효소의증가는홍삼이산화스트레스로부터보호하는긍정적인기능을가지고있음을시사하고있다. 지방조직단백질분석지방조직의지방세포분화를촉진하는스테로이드계 superfamily 전자인자로 PPARγ(21) 의발현을면역불롯으로확인한결과고지방대조군에비해홍삼섭취군및양성대조군에서모두유의하게감소하였다 (P<0.001). SREBP-1은 adipocyte determination과 differentiation-dependent factor로알려져있다. 콜레스테롤대사와 adipocyte 유전자의전사조절에중요한역할을하며, 높은콜레스테롤상태일때는 membrane에결합되어있고비활성화상태이지만, 콜레스테롤레벨이낮을때는단백질가수분해로인해절단
홍삼에의한고지혈증개선 917 A Sham RG-L RG-M RG-H Pravastatin B Pravastatin PPARγ SREBP-1 C/EBPα β-actin PPARγ SREBP-1 C/EBPα D C Sham RG-L RG-M RG-H Pravastatin pampk tampk Fig. 8. Anti-adipogenic effect of GR in the HFD-administrated adipose tissue. (A) Adipose tissue lysates were immunoblotted with the indicated antibodies. (B) The intensity of the each band was normalized to β-actin and presented in bar graphs. (C) Adipose tissue lysates were immunoblotted with the phosphorylated or total AMPK antibody. (D) The intensity of the phosphorylated band was normalized to total band and presented in bar graphs. Values are mean±se (n=6). ** P<0.01 vs Sham, *** P<0.001 vs Sham. 되고활성전사요인으로유리된다 (22). 홍삼을투여한군모두에서 SREBP-1의발현이저해되었는데그중에서홍삼저농도섭취군에서가장발현이억제되었다 (Fig. 8). 그리고에너지대사를포함한대부분의 adipocyte의전사에중요한역할을하는인자인 C/EBP는지방세포분화전에는 C/EBP α, β, δ 모두낮게발현하다가분화중에 C/EBP β, δ가증가하고, 그후 C/EBPα의레벨이증가한뒤성숙한지방세포가되면모두높은수준으로유지된다 (23). Fig. 8에서보는바와같이홍삼을투여한모든실험군에서 C/EBPα의레벨이감소하였다 (P<0.001). 이러한결과는홍삼이지방세포분화에관여하는전사인자의발현을저해하여지방세포분화및콜레스테롤생성을억제하는것으로생각된다. 또한, 에너지대사에관여하는 AMPK의인산화가저농도의홍삼을처리한군에서현저하게증가하였다 (Fig. 8C, 8D). 이러한결과는홍삼투여로인해지방세포에서도 AMPK의활성을통해지방세포분화가억제됨을시사하며, 진세노이드 Rg3 를 3T3-L1 세포에처리하였을때지방세포분화가억제되고, 이때 PPARγ의억제도수반된다는보고가있어이를뒷받침한다 (24). 요약당및지질대사조절의이상으로인한대사성질환중의하나인고지혈증은현대사회에서급격하게증가하고있다. 이러한문제를해결하기위하여부작용이적은천연물을사 용하는사례들이급증하고있는데, 특히이연구에서는초미세분말을첨가한홍삼을이용하여지방세포및쥐혈액, 간, 그리고지방조직에서지질, 콜레스테롤, 당, 과산화수치를확인함으로써홍삼의효능을관찰하였다. 세포실험결과, 특정한홍삼농도 (50 μg/ml) 에서지질형성을미세하게억제하고있음을알수있으며, 동물실험에서도마찬가지로저농도의홍삼을처리하였을때혈중총콜레스테롤수치가가장감소하였고 HDL-콜레스테롤수치또한증가하는것으로밝혀졌으며, 이는심혈관위험지수및동맥경화지수를낮춰준다. 그뿐만아니라저농도홍삼식이법시행군에서지질대사관련단백질인 AMPK의발현량이증가하였는데, 이는특정농도의홍삼이 AMPK 활성화를높임으로써지방및콜레스테롤합성억제를돕는것으로판단된다. 따라서본연구는홍삼이대사성질환인고지혈증치료및예방에도움을주는천연물후보임을시사하는바이다. 감사의글 본연구는참다한홍삼의연구비지원으로이루어졌으며이에감사드립니다. REFERENCES 1. Lim S, Shin H, Song JH, Kwak SH, Kang SM, Yoon JW, Choi SH, Cho SI, Park KS, Lee HK, Jang HC, Koh KK. 2011. Increasing prevalence of metabolic syndrome in Ko-
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