대한치주과학회지 ;:- 사람치은섬유아세포에서의 Tannerella forsythia 전세균, 막단백질, 당지질에의한염증성사이토카인발현 김정은, 이성훈, 최봉규, 구기태, 김태일, 이용무, 구영, 정종평, 류인철. 서울대학교치의학대학원치주과학교실및치학연구소. 서울대학교치의학대학원구강악안면감염-면역학전공및치학연구소 Pro-inflammatory cytokine expression in human gingival fibroblasts by Tannerella forsythia whole bacteria, membrane proteins, and lipopolysaccharide Jung-Eun Kim, Sung-Hoon Lee, Bong-Kyu Choi, Ki-Tae Koo, Tae-Il Kim, Yong-Moo Lee, Young Ku, Chong-Pyoung Chung, In-Chul Rhyu. Department of Periodontology, School of Dentistry and Dental Research Institute, Seoul National University. Oral Infection and Immunity, School of Dentistry, Seoul National University ABSTRACT Purpose: The purpose of this study was to investigate induction of cytokine expression in human gingival fibroblasts (HGFs) by whole cell and the components of T. forsythia. Material and Methods: After HGFs were treated with lipopolysaccharide (LPS), membrane protein isolated from T. forsythia or culture media of T. forsythia, the induction of interleukin (IL)-, IL- and IL- was examined with real-time PCR and ELISA. Their induction ability of cytokines was compared with whole bacteria. Result: The expression of IL- and IL- was significantly induced in HGFs by whole bacteria and membrane protein. The expression of IL-βwas induced by membrane protein of T. forsythia, not by whole bacteria. LPS and condition media of T. forsythia slightly activated HGFs. Conclusion: The membrane protein of T. forsythia could be one of virulence factors. (J Korean Acad Periodontol ;:-) KEY WORDS: Tannerella forsythia; virulence factors; human gingival fibroblasts 서론 치주질환은치주조직의파괴와골흡수에의한치아손실을야기하는대표적구강질환이다. 치주질환에관련된요인으로는유전적요인, 식이요인, 면역학적요인, 미생물에의한요인및생활습관등이있으며다양한요인에의해서진행된다고알려져있다,). 이러한다양한요인중에치주질환을야기하는미생물요 Correspondence: In-Chul Rhyu Department of Periodontology, School of Dentistry and Dental Research Institute, Seoul National University, Yeongon-dong, Chongno-ku, Seoul, -7, Korea. E-mail: icrhyu@snu.ac.kr, Tel: --7-, Fax: --7- Received: Sep, ; Accepted: Sep, 인에대한연구가활발히이루어지고있는데구강내에존재하는수백종의세균중 Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Treponema denticola 및 Tannerella forsythia 가많이연구되고있는치주병원균이다,). 또한치주질환환자와건강한성인을대상으로역학조사결과 P. gingivalis, T. denticola 및 T. forsythia 가치주질환을갖고있는환자에서많이존재하는것으로나타나이세균들을치주질환중요세균으로인식하고 ʻʻred complexʼʼ로명명하였다 ). Red complex 세균중 P. gingivalis 와 T. denticola 에대한연구는활발히이루어져유전체정보가밝혀졌지만 T. forsythia 에대한연구는아직많이이루어지지않았다,7).
김정은, 이성훈, 최봉규, 구기태 대한치주과학회지 년 권 호 T. forsythia 는그람음성의길쭉한형태의혐기성세균으로방추 (fusiform) 모양이특징이다 ). 이세균은치주질환환자의 P. gingivalis 집락에서같이발견됨으로써그중요성이부각되었는데이후치은연하바이오필름형성시 F. nucleatum 과함께숙주조직과미생물간의집락을강화하여치주질환의진행에있어서중요한역할을하는것이보고되었다 -). 또한 T. forsythia 의 leucine-rich repeat protein 인 BspA 는 T. denticola 의 LrrA 와부착된다고보고되었다 ). 이런연구결과로인해 T. forsythia 는바이오필름형성에중요한매개체역할을하는세균으로간주되고있다 ). 또한 BspA 는단핵세포주에서 CD 와 Toll-like receptor 를경유하여염증성사이토카인의발현을유도하는것으로알려졌는데 ) 최근에는사람치은상피세포에서 BspA 에의해 IL- 의발현이유도되는것이보고되기도하였다 ). 이세균은다른독력인자 (virulence factors) 로치주조직파괴와관련되어 N-benzoyl-DL arginine-naphthylamide(bana) test 에양성을보이는 trypsin-like protease 인 prth 를갖고있는것으로보고되었으며 ), 치은섬유아세포와단핵세포주인 THP- 세포에이세균의지질단백질 (BfLP) 을처리하였을경우 IL- 과 TNF-α 의발현을유도하는것이밝혀져 T. forsythia 가치주질환의염증성조직변화에기여할것이라고보고되었다 ). Bodet C 등 ) 은 HeLa 세포와단핵세포주인 U97 세포를공동배양시 T. forsythia 에의한염증성사이토카인, Prostagladin E 및 Matrix metalloproteinase 9의발현이유도되는것을밝혔다 ). 하지만다른 red complex 세균인 P. gingivalis 와 T. denticola 와비교하였을때까다로운배양조건등을이유로연구가더디게진행되고있으며치주질환과의관련성에대한연구도부족한실정이다. 본연구에서는치은섬유아세포에서치주질환과관련성이높은 T. forsythia 의당지질 (Lipopolysaccharide, LPS), 막단백질및세균분비물질의 IL-, IL- 및 IL- 발현유도능을평가하여염증유도사이토카인발현과관련된독력인자를확인하고자하였다. 재료및방법. 세균배양 T. forsythia ATCC 7 은 % 열처리한우태아혈청 과.% N-acetylmuramic acid를포함한 NOS 배지를이용하여혐기성환경 (% CO, % H, % N ) 으로 7 C 에서배양하였다.. 외막당지질분리배양된세균의침전물을얻고 LPS extraction kit (intron, Kyunggi Korea) 를이용하여외막당지질을분리하였다. 세균 ml 배양액에서 ml 를. ml 튜브로옮겨서세균수를측정하고나머지를, g, C에서 분간원심분리하여세균침전물을얻었다. 이침전물에 ml 의 lysis buffer를넣고침전물이부유될때까지 vortex 하고 ml 의 chloroform을넣고다시 초간 vortex 하였다., g 에서 분간원심분리하고상층액을깨끗한튜브에옮긴후상층액에다시 ml 의 lysis buffer 를넣고 vortex 하고 μl 의 chloroform 을넣고 초간 vortex,, g 에서 분간원심분리하였다. 상층액을깨끗한튜브로다시옮기고, 두배의 purification buffer를넣고 - C에 분간방치한후, g 에서 분간원심분리하여상층액을제거하고 7% 에틸알코올을 ml 넣고다시상층액제거후당지질을공기중에건조하였다. 완전히건조된당지질을내독소오염이없는증류수로녹이고동결건조시켜분리된당지질은 SDS-PAGE 수행후에질산은염색을이용하여확인하였고단백질과핵산오염은 coomasie blue 염색과 agarose gel 전기영동을이용하여확인하였다.. 막단백질분리세균의막단백질분리는세포막을먼저파괴하여세균내에있는물질을해리되게하고다시막에있는단백질을분리하는원리로 ProteoExtrac TM partial bacterial proteome Extraction kit(calbiochem, CA, USA) 를이용하였다. 세균침전물을 Wash buffer 로세척하고 Extraction Reagent 을넣고완전히부유시키고유리구슬을넣고 분간 vortex 한후 Benzonase 를넣고흔들어준후, g, C에서 분간원심분리, 상층액을제거하고 Extraction reagent 와 Benzonase 를넣고실온에서 분간교반시켰다. 이튜브를다시, g, C에서 분간원심분리후상층액 ( 막단백질추출액) 을깨끗한튜브로옮기고침전물은 Extraction reagent 을넣고실온에서 분간교반시킨후마지막으로
J Korean Acad Periodontol ;() 사람치은섬유아세포에서의 Tannerella forsythia 전세균, 막단백질, 당지질에의한염증성사이토카인발현, g, C에서 분간원심분리후상층액을막단백질추출액 이담긴튜브에넣고단백질의양을 BCA assay (Pierce, IL, USA) 를이용하여정량하였다.. 세균수측정세균부유액을, g 에서 분간원심분리하고다시생리식염수로세척한후다시 ml 의생리식염수로부유시킨후, 및 배희석하여 safranin O와동량혼합후실온에서 분간방치하였다. Petroff-Hauser counter chamber(hausser Scientific Co., PA, USA) 를이용하여세균수를측정하였다.. 세포배양및처리치은섬유아세포는열처리한 % 우태아혈청이포함된 Dulbeccoʼs modified Eagleʼs medium(dmem; Gibco, MD, USA) 배지에서 % CO 혐기성조건에서배양하였다. 세포를단층으로배양하여 mm-diameter dish 에옮긴후세포양의, 및 배에해당하는세균과세균물질을 시간처리하였다. 또한치은섬유아세포에 μl 와 μl 의세균배양액을 시간처리하였다. 세포배양액은 - C에보관하였고세포는 RNA 를추출하는데사용하였다. (Invitrogen. CA. USA) 을이용하여 RNA 를추출하고, ND- (Nanodrop; DE, USA) 을이용하여 RNA 농도를측정후, μg total RNA 를 MaximeTM RT-premix kit(intron Biotechnology, Kyunggi, Korea) 를이용하여 cdna 를합성하였다. cdna( μl) 를 Premix Ex Taq, ROX reference Dye(Takara Bio, Otsu, Japan) 및. μm 의특정 primer 와혼합후증폭하였다 (Primer sequence 는 Table 과같다 ). Real-time PCR 의조건은 ABI PRISM 7 Sequence Detection System(Applied Biosystems, Darmstadt, Germany) 을이용하여 9 C에서 초, C에서 초및 7 C에서 초 cycle을수행하였다. 증폭산물의특이적반응은녹는점을확인하였으며, housekeeping gene 으로는 glyceraldehydes--phosphate dehydrogenase(gapdh) 를이용하였으며이유전자를기준으로대조군과대비하여특정유전자의발현정도를산출하였다. 7. 효소결합면역흡수분석세균및세균구성물질을처리한세포에서얻은배양액을얼음에서녹이고 vortex 후 C,, g 에서원심분리하고상층액을이용하여 IL- 및 IL- ELISA kit(bd Bioscience, CA, USA) 를이용하여제조사용법으로사이토카인을측정하였다.. 실시간역전사중합효소연쇄반응. 통계분석 세균및세균구성물질과반응시킨세포를 TRIzol 모든실험은적어도 번이상을독립적으로반복하였으 Table. Primer sequences for real-time PCR Gene Name IL-β IL- IL- GAPDH Primer sequences Forward -AGC TGT ACC CAG AGA GTC C- Reverse -ACC AAA TGT GGC CGT GGT TT- Forward -AAC CTG TCC ACT GGG CAC A- Reverse -TCT GGC TCT GAA ACA AAG GAT- Forward -GTG AAG GTG CAG TTT TGC CA- Reverse -TCT CCA CAA CCC TCT GCA C- Forward -GTG GTG GAC CTG ACC TGC- Reverse -TGA GCT TGA CAA AGT GGT C-
김정은, 이성훈, 최봉규, 구기태 대한치주과학회지 년 권 호 며, 통계학적유의성은 SPSS(Ver., SPSS, USA) 를이용하여 ANOVA 와 T-test 로검사하였다. 통계학적유의성과 p value 는. 미만일때로하였다. 결과. 세균의영향 T. forsythia 를치은섬유아세포에세포당여러배율의세균수 (multiplicity of infection; ) 로처리하였을경우 IL-β, IL- 및 IL- 의발현이유도되었다 (Fig. ). 세균을처리하였을경우 에서는염증성사이토카인의발현이약하게유도되었으며 (p>.) 부터유의성있게발현을많이유도시켰다 (p<.). 특이하게 IL-β 의경우는모두대조군보다낮게나타났다. mrna 의경우 에서가장높게나타났으며 에서약간감소하는것으로나타났다. 효소결합면역흡수분석의경우 IL- 에서는 RNA 에비슷한양상을보였지만 IL- 의경우는 과 이비슷하게생산되었다.. 당지질의영향당지질은세균이갖고있는고유산물 (pathogen associated molecular pattern; PAMP) 로가장높은독력을나타내는것으로보고되고있으며, T. forsythia 의당지질이치은섬유아세포에미치는영향을관찰한결과, 전세균을처리한경우보다낮은염증성사이토카인발현을유도하였다 (Fig. ). 통계학적유의성도 에서나타났으며, 전체적으로당지질에의한치은섬유아세포의면역반응은낮게나타났다. a b c control control control d e control control Figure. The effect of T. forsythia whole bacteria on expression of cytokine HGFs were treated with T. forsythia whole cells at various for h. RNA was isolated from the HGFs, and the induction of IL-β, IL-, and IL- expression was analyzed with real-time PCR (a-c). The production of cytokines in conditioned medium was measured by ELISA (d-e). ; P<.
J Korean Acad Periodontol ;() 사람치은섬유아세포에서의 Tannerella forsythia 전세균, 막단백질, 당지질에의한염증성사이토카인발현 a b c 9 9 9 7 7 7 control control control d control e control Figure. The effect of T. forsythia LPS on expression of cytokines HGFs were treated with LPS extracted from T. forsythia equivalent to, and for h. RNA was isolated from the HGFs, and the induction of IL-β, IL-, and IL- expression was analyzed with real-time PCR (a-c). The production of cytokines in conditioned medium was measured by ELISA (d-e). ; P<.. 세균막단백질의영향. 세균배양액의영향 세균과숙주와의반응에있어서외막에존재하는당지질뿐만아니라외막에존재하는단백질에대한연구도많이이루어지고있다. T. forsythia 의막단백질에대한치은섬유아세포의면역반응을염증성사이토카인의발현유도로관찰한결과전세균을처리하였을경우와비슷한경향을나타내었다 (Fig. ). 또한막단백질의경우 IL-β 를제외하고 에서부터 IL- 과 IL- 의발현을유도하였으며, 처리한양과비례하여 mrna 또는단백질수준에서모두관찰되었다 (p <.). T. forsythia 의경우 BANA 테스트에서양성을보여 trypsin-like protease 를분비하는것으로보고되었다 ). 따라서본연구에서세균배양배지를치은섬유아세포에직접처리하여면역반응을관찰하였는데 μl 및 μl 처리하였을경우, RT-PCR 에서는대조군에비하여유의성있는차이를보이지않았지만효소결합면역흡수분석결과에서는 μl 로처리하였을때 IL- 과 IL- 의발현을유도하는것이관찰되었다 (Fig. ). 7
김정은, 이성훈, 최봉규, 구기태 대한치주과학회지 년 권 호 a b 9 c 7 control control d control Figure. The effect of T. forsythia membrane proteins on expression of cytokines HGFs were treated with membrane fraction extracted from T. forsythia equivalented to, and for h. RNA was isolated from HGFs, and the induction of IL-β, IL-, and IL- expression was analyzed with real-time PCR (a-c). The production of cytokines in conditioned medium was measured by ELISA (d-e). ; P<. a b c e 7 control control......... control μl μl d 9 7 control μl μl control μl μl e control μl μl Figure. The effect of T. forsythia culture medium on expression of cytokines HGFs were treated with culture medium of T. forsythia at concentration of and μl for h. RNA was isolated from HGFs, and the induction of IL-β, IL-, and IL- expression was analyzed with real-time PCR (a-c). The production of cytokines in conditioned medium was measured by ELISA (d-e). ; P<. control μl μl
J Korean Acad Periodontol ;() 사람치은섬유아세포에서의 Tannerella forsythia 전세균, 막단백질, 당지질에의한염증성사이토카인발현 고찰 치주질환은치주조직의파괴와골흡수에의한치아손실을야기하는주된구강질환으로복합세균감염에의하여발생한다. 이러한복합세균감염의원인을밝히기위해많은연구가시행되었으며, 최근에는구강내바이오필름형성에관여하는세균종간의상호작용과부착에대한연구가중점적으로이루어지고있다 7). 구강바이오필름이형성될때, 법랑질에부착이가능하며산소가있어도성장이가능한 streptococci 종이먼저치은연상에부착하고, 이렇게부착된 streptococci 종에다른세균들이순차적으로붙어바이오필름이점차치은연하부위로확대되어 F. nucleatum 과 T. forsythia 를매개로 P. gingivalis, T. denticola 등이부착하게된다 -). Tanner 등 ) 은 97 년에남성치주환자에서 Fusobacteria 같은방추형태의세균을동정하였는데이후치주질환과관련성이높은 T. forsythia 로밝혀졌다 9). 뒤이은역학조사에서이세균이치주질환환자에게서 P. gingivalis 와함께종종동정되었으며, 고령의환자에서두종의집락이증가하는것이관찰되었다 9,,). 또한 Socransky 등은이두세균뿐만아니라 T. denticola 가역시치주질환과관련이높은세균그룹으로정하고이를 ʻʻ Red complexʼʼ로명명하였다 ). 이세균중배양이상대적으로용이한 P. gingivalis 에대해서많은연구가이루어지고있으며, 이세균의독력인자를나타내는여러물질에대한연구도많이이루어지고있다 9-). T. forsythia 에대한연구는아직초기단계이며세균의당단백질 (lipoprotein) 에대한몇몇연구만보고되고있는실정이며, 이당단백질에의해서섬유아세포와단핵세포주에서 IL- 과 TNF-α 의발현이유도되는것이관찰되었다 ). 당단백질은숙주에서 toll-like receptor- 를통해서인지되며 nuclear factor kappab 를통해서염증성사이토카인을발현시키는것으로보고되었다 ). 하지만아직까지 T. forsythia 를숙주세포에처리하여면역반응을관찰한연구는없었으며, 또한 T. forsythia 와외막의구성성분에대한면역반응을비교한연구도없었다. 본연구에서는 T. forsythia 에대한치은섬유아세포의염증관련요소를관찰한후, 이세균의외막성분중당지질 (LPS) 과단백질을추출하고세균을배양했던배지를치은섬유아세포에처리하여전세균 (whole bacteria) 과비슷한경향을나타내는구성성 분을찾음으로써 T. forsythia 의독력인자를밝히고자하였다. 본연구에서치은섬유아세포대비세균수 () 를, 및 배로처리하였는데, 세균막구성성분을추출하는경우에도세균수를측정하고추출물의양을세균수에해당하는양으로환산하여처리하였다. 세균수의산출과정에서오차가발생할가능성은존재하나그값이크지않을것이다. 또한현재까지대부분의연구에서는세균으로부터의추출물을질량단위로처리하여숙주세포의반응을관찰하였지만본연구에서는추출물의질량을구강에실재로존재가능한세균수에해당하는단위로환산하여숙주세포의반응을관찰하여독력인자를조사하였다는것이차별화된점이다. 세균을치은섬유아세포에직접처리한경우 에서는염증성사이토카인의발현이나타나지않았으며, 부터염증성사이토카인의발현이유도된것을관찰하였다. 특이한점은 IL- 과 IL- 의발현은유도되었지만 IL-β 의발현은유도되지않았다는것이다. 그이유에대해서는향후심화된연구가필요할것이다. 이러한반응은세균의당지질에의해서는유도되지않았으며, 기존에당지질의수용체로알려진 toll-like receptor(tlr), 에대해서도 CHO/CD/TLR 및 CHO/CD/TLR를이용하여확인한결과생물학적활성이나타나지않았다 ( 결과값밝히지않음 ). 세균막단백질의경우전세균의경우와유사하게그양이증가할수록 IL- 과 IL- 의발현유도또한증가하는것이관찰되었고 IL- β의경우는전세균에서는발현유도가되지않았지만세균막단백질에서는발현이유도되는것이관찰되었다. 이는세균막에서표출되어있는 epitope 부분이치은섬유아세포에영향을미치는것이아니라세균막에싸여져있는부분에의해서반응이유도되거나막단백질추출과정에서단백질의삼차구조가변하여반응의차이가나타난것으로생각된다. 마지막으로세균배양액을치은섬유아세포에처리하여세포활성반응을보았는데세균배양액의경우는 μl 에서는반응을나타내지않았으며 μl 에서 mrna 수준에서는유의적인차이를나타내지않았지만단백질수준에서는대조군에비하여통계적으로유의한차이를나타내었다. 그러나전세균을처리한경우와양적인차이를비교하였을때더적은양으로유도되는것을알수있었다. 여러가지세균추출물과세균배양액의독력을비교한실험에서 T. forsythia 의독력인자는세균막에존재하는단백질인것으로보인다. 또한 T. forsythia 는치주질환을유 9
김정은, 이성훈, 최봉규, 구기태 대한치주과학회지 년 권 호 발하는구강내바이오필름형성과정중타세균과의부착에의해질병의진행에관여하므로독력인자에대한보다많은연구가필요할것이다. 참고문헌. Pihlstrom BL, Michalowicz BS, Johnson NW. Periodontal diseases. Lancet ;:9-.. Loomer PM. Microbiological diagnostic testing in the treatment of periodontal diseases. Periodontol ;:9-.. Timmerman MF, van der Weijden GA. Risk factors for periodontitis. Int J Dent Hyg ;:-7.. Socransky SS, Haffajee AD. Periodontal microbial ecology. Periodontol ;:-7.. Socransky SS, Haffajee AD, Cugini MA, Smith C, Kent RL, Jr. Microbial complexes in subgingival plaque. J Clin Periodontol 99;:-.. Nelson KE, Fleischmann RD, DeBoy RT, et al. Complete genome sequence of the oral pathogenic Bacterium Porphyromonas gingivalis strain W. J Bacteriol ;: 9-. 7. Seshadri R, Myers GS, Tettelin H, et al. Comparison of the genome of the oral pathogen Treponema denticola with other spirochete genomes. Proc Natl Acad Sci U S A ;:-.. Tanner AC, Haffer C, Bratthall GT, Visconti RA, Socransky SS. A study of the bacteria associated with advancing periodontitis in man. J Clin Periodontol 979;: 7-7. 9. Yang HW, Huang YF, Chou MY. Occurrence of Porphyromonas gingivalis and Tannerella forsythensis in periodontally diseased and healthy subjects. J Periodontol ;7:77-.. Kapatral V, Anderson I, Ivanova N, et al. Genome sequence and analysis of the oral bacterium Fusobacterium nucleatum strain ATCC. J Bacteriol ;: -.. Ikegami A, Honma K, Sharma A, Kuramitsu HK. Multiple functions of the leucine-rich repeat protein LrrA of Treponema denticola. Infect Immun ;7:9-7.. Hajishengallis G, Martin M, Sojar HT, et al. Dependence of bacterial protein adhesins on toll-like receptors for proinflammatory cytokine induction. Clin Diagn Lab Immunol ;9:-.. Onishi S, Honma K, Liang S, et al. Toll-like receptor -mediated interleukin- expression in gingival epithelial cells by the Tannerella forsythia leucine-rich repeat protein BspA. Infect Immun ;7:9-.. Takaishi Y, Morii H, Miki T. The benzoyl-dl arginine-naphthylamide (BANA) test and polymerase chain reaction measurement of pathogenic bacteria can assess the severity of periodontal disease. Int J Tissue React ;: 9-.. Hasebe A, Yoshimura A, Into T, et al. Biological activities of Bacteroides forsythus lipoproteins and their possible pathological roles in periodontal disease. Infect Immun ;7:-.. Bodet C, Chandad F, Grenier D. Inflammatory responses of a macrophage/epithelial cell co-culture model to mono and mixed infections with Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia. Microbes Infect ;: 7-. 7. Socransky SS, Haffajee AD. Dental biofilms: difficult therapeutic targets. Periodontol ;:-.. Welin J, Wilkins JC, Beighton D, Svensater G. Protein expression by Streptococcus mutans during initial stage of biofilm formation. Appl Environ Microbiol ;7:7-7. 9. Nishihara T, Koseki T. Microbial etiology of periodontitis. Periodontol ;:-.. Sharma A, Inagaki S, Sigurdson W, Kuramitsu HK. Synergy between Tannerella forsythia and Fusobacterium nucleatum in biofilm formation. Oral Microbiol Immunol ;:9-.. Tanner AC, Socransky SS, Goodson JM. Microbiota of periodontal pockets losing crestal alveolar bone. J Periodontal Res 9;9:79-9.. Tanner A, Maiden MF, Macuch PJ, Murray LL, Kent RL, Jr. Microbiota of health, gingivitis, and initial periodontitis. J Clin Periodontol 99;:-9.. Into T, Nodasaka Y, Hasebe A, et al. Mycoplasmal lipoproteins induce toll-like receptor - and caspases-mediated cell death in lymphocytes and monocytes. Microbiol Immunol ;:-7.