대한진단검사의학회지제 26 권제 1 호 2006 Korean J Lab Med 2006;26:9-13 원저 임상미생물학 뇌척수액에서실시간 - 이중 - 역전사중합효소연쇄반응을이용한장바이러스의검출 허세란 1 진선경 1 장호은 1 박경운 1,2 송정한 1,2 김의종 2 분당서울대학교병원진단검사의학과 1, 서울대학교의과대학검사의학교실 2 Detection of Enterovirus in Cerebrospinal Fluid by Real-Time Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Se Ran Heo 1, Sun Kyung Jin 1, Ho Eun Chang 1, Kyoung Un Park, M.D. 1,2, Junghan Song, M.D. 1,2, and Eui Chong Kim, M.D. 2 Department of Laboratory Medicine 1, Seoul National University Bundang Hospital; Department of Laboratory Medicine 2, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea Background : Enterovirus is a common cause of aseptic meningitis, respiratory disease and nonspecific febrile illness. The conventional methods for laboratory diagnosis of enterovirus infections have been virus culture and serotyping by an immunofluorecent test. We studied a new and more rapid approach for enterovirus detection in cerebrospinal fluid (CSF) by real-time nested PCR. Methods : This study was performed on 50 CSF specimens from patients suspected of aseptic meningitis. Enterovirus was detected in CSF by PCRs for 3 different targets and real-time nested PCR. Enterovirus culture was also performed in 44 CSF specimens. Results : The positive rate of PCRs for each of the 3 different targets was 26.0%, 40.0%, or 46.0%, and that of real-time nested PCR was 86.0%. Only 6.8% were positive in culture. Thus, the positive rate of real-time nested PCR was much higher than other methods. Conclusions : Our study revealed that the real-time nested PCR should be useful for diagnosis of enterovirus infections because of a high sensitivity and rapid detection. (Korean J Lab Med 2006;26: 9-13) Key Words : Enterovirus, Real-time polymerase chain reaction, Nested PCR, Reverse Transcription PCR, Aseptic meningitis 서 론 장바이러스 (enterovirus) 는 Picoronaviridae 에속하는 24-30 nm 크기의바이러스로서외피가없는정이십면체의형태를가지며, 단 일가닥양성센스리보핵산 (single-stranded positive sense RNA) 으로구성된다. Poliovirus, coxsackievirus A군과 B군, echovirus 접수 : 2005년 9월 20일접수번호 : KJLM1884 수정본접수 : 2006년 1월 9일게재승인일 : 2006년 1월 16일교신저자 : 박경운우 463-707 경기도성남시분당구구미동 300 분당서울대학교병원진단검사의학과전화 : 031-787-7692, Fax: 031-787-4015 E-mail: m91w95@dreamwiz.com 및기타장바이러스 68형에서 71형까지약 70여종이알려져있다 [1]. 비특이적인열, 무균수막염, 호흡기질환, 피부병변, 위장관질환등의다양한임상양상을보이며, 드물게는치명적인심근염및뇌염을유발할수있다 [2-5]. 감염의진단은혈청학적방법인항체검사또는배양을통한바이러스의검출에의존하여왔다. 항체검사의경우바이러스의직접적인검출이아니며, 배양법의경우결과를얻기까지일주일정도가소요되고일부의장바이러스에대해서는숙주세포가감수성을나타내지않는다는단점이있다 [6]. 이에반하여장바이러스유전자중 5 NCR (5 noncoding region) 을대상으로한중합효소연쇄반응 (PCR: polymerase chain reaction) 은장바이러스에대하여높은특이도를보이며, 개체수가적은경우에도바이러스를비교적빠른시간내에검출하므로 9
10 허세란 진선경 장호은외 3 인 환자의조기진단에도움이된다 [7-9]. 실시간-중합효소연쇄반응 (real-time PCR) 은유전자의증폭산물에결합된형광물질로부터방출되는형광량을실시간으로측정한다. Hybridization probe는형광이표지된한쌍의소식자 (probe) 를대상유전자에특이적으로결합시킨후, FRET (fluorescence resonance energy transfer) 반응에의해방출되는형광을측정하는방식이다. 또한 hydrolysis probe는소식자의양끝에한쌍의형광을표지하여대상유전자에특이적으로결합시킨후, 가수분해에의해발광되는형광을측정하는방식이다. 본연구에서는장바이러스검출을위해고안된다음의여러방법들을비교, 분석하였다 : 세종류의각기다른표적을대상으로시행한역전사중합효소연쇄반응 (RT-PCR: reverse transcription PCR), 바이러스배양, 실시간-이중 -역전사중합효소연쇄반응 (real-time nested RT-PCR). 이를통해장바이러스를검출함에있어서실시간-이중 -역전사중합효소연쇄반응의유용성을검증하고자하였다. 대상및방법 1. 대상및리보핵산추출무균수막염이의심되는 50명의환자들을대상으로요추를천자하여멸균된용기에뇌척수액을채취한후, 2-3개로분주하여 -70 냉동고에보관하였다가리보핵산추출에이용하였다. 리보핵산추출에는 QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) 를사용하였다. 1.5 ml 튜브에 AVL 완충액 560 L, 뇌척수액 140 L를넣고실온에 10분동안방치하였다. 100% 에탄올 560 L를넣고혼합한후 QIA spin column에넣고 8,000 rpm에서 1분동안원심분리하였다. 500 L 의 AVW1 및 AVW2 완충액으로세척한후 AVE 완충액 60 L로리보핵산을추출하였다. MA, USA) 를이용하였다. 매반응마다바이러스배양법에서양성반응을나타낸검체로부터추출한장바이러스리보핵산을양성대조로사용하였다. 세종류의각기다른표적을대상으로중합효소연쇄반응을시행하였다. 사용된시발체및반응조건등은 Table 1에정리하였다 [10, 11]. 반응액 (25 L) 은다음과같으며, 각반응에사용된시발체의종류만다를뿐나머지구성은모두동일하였다 : 10 buffer 2.5 L, dntp 0.5 L ( 각 0.05 mm), 시발체각 1 L (10 pmol), 0.625 단위의 Taq 중합효소 (TaKaRa, Shiga, Japan), 역전사된디옥시리보핵산 1.5 L. 증폭된산물은 ethidium bromide (0.5 g/ml) 가포함된 3% 아가로오즈겔 (agarose gel) 에서 100 V, 20분동안전기영동하여확인하였다 (Fig. 1). 3. 장바이러스검출을위한실시간 - 이중 - 역전사중합효소연쇄반응 역전사반응을따로시행하지않고, 주형으로리보핵산을반응액에직접첨가하여한번의과정만으로역전사중합효소연쇄반응을시행하였다. 매반응마다배양법에서양성반응을나타낸검체로부터추출한장바이러스리보핵산을양성대조로추가하였다. 일차실시간-역전사중합효소연쇄반응에는시발체 EV3-F (5 -CCC CTG AAT GCG GCT AAT CC-3 ), 시발체 EV3-R (5 - CAA TTG TCA CCA TAA GCA GCC A-3 ) 및소식자 EV3-P (6-FAM-5 -CAC GGA CAC CCA AAG TAG TCG GTT CC-3 -TAMRA) 를사용하였다 (Bioneer, Daejeon, Korea) [11]. 반응액의조성 (20 L) 은다음과같았다 : 2.7 LightCycler A 2. 장바이러스검출을위해세종류의각기다른표적을대상으로시행한역전사중합효소연쇄반응 중합효소연쇄반응을시행하기전에장바이러스리보핵산으로부터상보적인디옥시리보핵산을합성하는역전사반응을시행하였으며그반응액 (20 L) 은다음과같았다 : 10 RT buffer 2 L, dntp 8 L ( 각 1 mm), 임의의시발체 (random primer) 1 L (50 pmol), 10 단위의리보핵산분해효소억제제 (ribonuclease inhibitor), 7 단위의 AMV 역전사효소 (avian myeloblastosis virus reverse transcriptase), 추출된리보핵산 2 L. 25 에서 10분, 41 에서 60분간역전사반응을시행한후에 4 에서 10분간디옥시리보핵산의안정화반응을시행하였다. 역전사반응은 PTC-200 thermal cycler (MJ Research Inc., Waltham, Fig. 1. Detection of enterovirus by RT-PCR methods for 3 different targets using CSF specimens. (A) The amplified products of first method using EV1-F and EV1-R primers are 114 bp. (B) The amplified products of second method using EV2-F and EV2-R primers are 154 bp. (C) The amplified products of third method using EV3- F and EV3-R primers are 149 bp. Lane 1, negative control; lane 2, positive control; lane M, 100 bp DNA size marker; lane 3-12, specimens. B C
실시간 - 중합효소연쇄반응을이용한장바이러스의검출 11 RNA Master HybProbe (Roche, Penzberg, Germany) 7.5 L, 5.5 mm Mn 2+, 0.4 M 각시발체, 0.2 M 소식자, 추출된리보핵산 4 L. 61 에서 20분간의역전사반응후 95 에서 2분간초기변성을시행하였다. 증폭반응 ( 총 60회 ) 을위해 95 에서 5초동안변성을시행하였고, 70 에서 62 까지한회당0.2 만큼내려가도록설정하여 (step size: 0.2 /cycle) 10초동안결합반응을시행한다음, 72 에서 10초동안연장반응을거쳐 40 에서 30초동안증폭산물을안정화시켰다. 증폭반응은 LightCycler 2.0 (Roche, Penzberg, Germany) 을이용하여시행하였으며, 증폭신호의검출을위해서측정파장 530 nm, 분석파장 530/ 705 nm로설정하여결합반응에서의형광신호를단발적으로측정하였다 (single fluorescence measurement). 이차실시간-중합효소연쇄반응에는일차실시간-역전사중합효소연쇄반응증폭산물을증류수로 50배희석해서주형핵산으로첨가하였으며소식자는일차반응과동일하게사용하였다. 시발체로는 Cox-F (5 -GTA ACG GGC AAC TCT GCA GC-3 ), Pol-F (5 -CGT AAC GCG CAA GTC TGT GG-3 ) 및 Ent-R (5 -ATT GTC ACC ATA AGC AGC CA-3 ) 을사용하였다 (Bioneer, Daejeon, Korea)[11]. 반응액의조성 (20 L) 은다음과같았다 : 10 LightCycler FastStart DNA Master HybProbe (Roche, Penzberg, Germany) 2 L, 4 mm MgCl 2, 0.2 M Cox-F 시발체, 0.2 M Pol-F 시발체, 0.4 M Ent-R 시발체, 0.2 M 소식자, 주형핵산 2 L. 95 에서 10분동안초기변성을시행하였고, 30회의증폭반응 (95 5초, 65 10초, 72 10초 ) 을시행한후, 40 에서 30초동안증폭산물을안정화시켰다. 형광측정파장과분석파장은일차반응과동일하게적용하였다. 4. 장바이러스배양 총 44명의환자로부터채취한뇌척수액에대해바이러스배양이시행되었다. 숙주세포로는 RD 세포 (human embryonal rhabdomyosarcoma cell) 와 MRC-5 세포 (human embryonal lung fibroblast cell) 를사용하였으며, 접종한다음날부터 7일동안세포의변형유무를관찰하였다. 결 1. 장바이러스검출을위해세종류의각기다른표적을대상으로시행한역전사중합효소연쇄반응 시발체 EV1을이용한역전사중합효소연쇄반응에서는 26.0% (13/50) 에서장바이러스가검출되었다. 시발체 EV2을이용한반응에서는 40.0% (20/50), 시발체 EV3를이용한반응에서는 46.0% (23/50) 에서장바이러스가검출되었다 (Table 2). 과 2. 장바이러스검출을위한실시간 - 이중 - 역전사중합효소연쇄반응 실시간-이중-역전사중합효소연쇄반응을실시한결과 86.0% (43/50) 에서장바이러스가검출되었다 (Table 2). 실시간 -중합효소연쇄반응에서음성소견을보였던 7예 (14%) 는세종류의각기다른표적을대상으로시행한중합효소연쇄반응에서도모두음성이었으며, 세종류의각기다른표적을대상으로시행한중합효소연쇄반응에서모두양성인 13예 (26%) 는실시간 -중합효소연쇄반응에서도모두양성소견을보였다. Table 1. Oligonucleotide primers used to detect enterovirus and reaction conditions Methods *Reverse transcription PCR. PCR* 1 Primers EV1-F: 5 -ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT TCC-3 EV1-R: 5 -TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C-3 Conditions 95 C 45 sec-58 C 45 sec-72 C 45 sec (35 cycles) Product size 114 bp 2 Primers EV2-F: 5 -CCT CCG GCC CCT GAA TGC GGC TAA T-3 EV2-R: 5 -ATT GTC ACC ATA AGC AGC CA-3 Conditions 90 C 45 sec-46 C 45 sec-72 C 45 sec (37 cycles) Product size 154 bp 3 Primers EV3-F: 5 -CCC CTG AAT GCG GCT AAT CC-3 EV3-R: 5 -CAA TTG TCA CCA TAA GCA GCC A-3 Conditions 95 C45 sec-64.5 C45 sec-72 C45 sec (35 cycles) Product size 149 bp 3. 장바이러스배양 총 44명의환자로부터채취한뇌척수액을 RD 세포및 MRC-5 세포에배양한결과, 3예에서양성소견 (6.8%) 을보였다. Table 2. Comparison between the results of real-time PCR and PCRs for 3 different targets Real-time PCR PCR 1* (74.0%) (26.0%) PCR 2 (60.0%) (40.0%) PCR 3 (54.0%) (46.0%) Negative 7 0 7 0 7 0 (14.0%) Positive 30 13 23 20 20 23 (86.0%) *First RT-PCR method using EV1-F and EV1-R primers; Second RT-PCR method using EV2-F and EV2-R primers; Third RT-PCR method using EV3-F and EV3-R primers; Real-time nested RT-PCR.
12 허세란 진선경 장호은외 3 인 고찰최근국내에서장바이러스에의한무균수막염의유행을경험한바있다 [12-16]. 1997년에유행한무균수막염은그전에유행했던것과는다른양상을띄어, 소아환자와함께많은성인환자가발생하였으며 echovirus type 30, 6, 4와 coxsackievirus type B5, A24 등한종류가아닌여러종류의장바이러스혈청형이동시에분리되었다 [16]. 원인균이밝혀지지않은무균수막염의 80-92% 가장바이러스에의해발병하며 [17], 수막염외에도호흡기질환, 위장관질환, 심근염, 뇌염등다양한임상양상이나타날수있으므로조기에장바이러스를검출하는것이중요하다. 장바이러스를검출할수있는방법중실시간-중합효소연쇄반응은기존의중합효소연쇄반응이나바이러스배양에비해빠른시간내에장바이러스를검출할수있다는장점이있다. 또한적은개체수의장바이러스도검출할수있는높은민감도를갖는다 [18, 19]. 기존의중합효소연쇄반응은핵산추출에서전기영동하기까지약 4시간이소요되고, 바이러스배양은결과를얻기까지일주일이소요되는반면, 실시간-이중-중합효소연쇄반응은검사결과를얻기까지약 2시간이소요되었다. 본연구에서는장바이러스검출에있어서실시간-중합효소연쇄반응의유용성을평가하기위하여, 세종류의각기다른표적을대상으로시행한중합효소연쇄반응및바이러스배양의결과와비교하였다. 실시간-중합효소연쇄반응에서음성인모든증례는세종류의각기다른표적을대상으로시행한중합효소연쇄반응에서도모두음성이었으며, 세종류의각기다른표적을대상으로시행한중합효소연쇄반응에서모두양성소견을보였던증례들은실시간-중합효소연쇄반응에서도양성소견을보였다. 배양법에서양성소견을보였던세증례는실시간-중합효소연쇄반응에서도모두양성이었다. 한편세종류의각기다른표적을대상으로시행한중합효소연쇄반응의장바이러스검출률은각각 26.0%, 40.0%, 46.0% 로 50.0% 이하였던반면에실시간-중합효소연쇄반응은 86.0 % 의검출률을보여 (Table 2), 실시간 -중합효소연쇄반응의높은민감도를확인할수있었다. 실시간-중합효소연쇄반응결과의판독에있어서 crossing point (Cp) 값이산출되고동시에완만한증폭곡선을보이는경우에양성으로하였으며, Cp 값이산출되지않거나산출되더라도완만한증폭곡선을형성하지않은경우에는음성으로판독하였다. 즉결과를판독할때는해당검체의 Cp 값과증폭곡선을동시에살펴보아야하는주의가필요하다. 실제로검사실에서실시간-이중- 중합효소연쇄반응을시행할때는, 검사과정중발생할수있는증폭산물의오염을방지하기위하여일차반응결과 Cp 값이산출되고완만한증폭곡선을형성하여양성으로판독이가능한경우에는이차반응을시행하지않는것도고려해볼수있을것이다. 세종류의각기다른표적을대상으로시행한중합효소연쇄반응은아가로오즈겔에전기영동하여결과를판독하므로, 약양성의경우양성또는음성에대한객관적인판독이어려운점이있으며, 이런문제점은특히증폭산물의크기가작은경우에심각하다. 반면에실시간-중합효소연쇄반응은증폭곡선과 Cp 값을객관적인지표로삼아판독하므로결과판독에있어서주관적인판단을배제할수있다. 최근들어국내에서도실시간-중합효소연쇄반응법의유용성이보고되고있다 [20, 21]. 저자들은장바이러스검출에실시간-중합효소연쇄반응을이용함으로써기존의방법들에비해검출률을높일수있으며빠른시간내에검출할수있고객관적인판독이가능함을확인하였다. 실시간-중합효소연쇄반응을통한장바이러스의검출은무균수막염과세균성수막염과의신속하고정확한감별진단에유용하게쓰일수있을것으로생각된다. 요약배경 : 장바이러스 (enterovirus) 는무균수막염, 호흡기질환, 피부병변, 심근염, 뇌염등의다양한증상을유발할수있다. 감염의진단은항체검사와숙주세포를이용한배양법및중합효소연쇄반응에의존해왔으나낮은민감도가문제가되어왔다. 이러한단점을보완하기위해저자들은실시간-중합효소연쇄반응의장점을이용한장바이러스검출법의유용성을평가하였다. 방법 : 무균수막염이의심되어뇌척수액검체를채취한 50명을대상으로세종류의각기다른표적을대상으로시행한역전사중합효소연쇄반응과실시간-이중-역전사중합효소연쇄반응을시행하였다. 이중 44명의환자에대해바이러스배양검사를시행하였다. 결과 : 세종류의각기다른표적을대상으로시행한중합효소연쇄반응의결과각각 26.0%, 40.0%, 46.0% 의장바이러스검출률을보였으며바이러스배양법의양성률은 6.8% 였다. 실시간 - 중합효소연쇄반응의장바이러스검출률은 86.0% 였다. 결론 : 장바이러스검출에있어서실시간-중합효소연쇄반응법은기존의방법들에비해검출률을높일수있으며빠른시간내에검출할수있어, 무균수막염과세균성수막염의신속하고정확한감별진단에유용하게쓰일수있을것으로생각된다. 참고문헌 1. Rotbart HA, Sawyer MH, Fast S, Lewinski C, Murphy N, Keyser EF, et al. Diagnosis of enteroviral meningitis by using PCR with a colorimetric microwell detection assay. J Clin Microbiol 1994;32: 2590-92. 2. Cherry JD, ed. Pediatric infectious disease. 3rd ed. Philadelphia: WB Saunders, 1992:1705-53. 3. White DO and Fenner FJ. Picoronaviridae. In: Fenner FJ, ed. Medical virology. 4th ed. San Diego: Academic Press, 1994:381-406. 4. Berlin LE, Rorabaugh ML, Heldrich F, Roberts K, Doran T, Modlin
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