J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 43(8), 1289~1295(2014) http://dx.doi.org/10.3746/jkfn.2014.43.8.1289 발효소시지제조에적합한스타터선발 유선아 서승호 박성은 손홍석동신대학교식품영양학과 Screening of Lactic cid acteria as a Starter Culture in Fermented Sausage Seon- Yoo, Seung-Ho Seo, Seong-Eun Park, and Hong-Seok Son Department of Food and Nutrition, Dongshin University STRCT The aim of this study was to select the most suitable starter cultures for production of fermented sausages. total of 27 strains isolated from Korean fermented foods and natural substances were characterized with respect to their physicochemical properties in a fluid (submerged) model system modified according to the special conditions of fermented sausages. Three of these strains were pre-selected for testing as potential cultures based on their ability to grow fast and initiate rapid acidification. The selected strains were identified by PI and partial sequence analysis of 16S rrn. The results exhibited sequence similarity to known sequences of Staphylococcus warneri, Staphylococcus epidermidis and Lactobacillus plantarum. mong them, relatively good growth properties and nitrite reduction activities were detected for S. epidermidis and L. plantarum and low ph values and high total acidities were observed in the model system fermented with these isolates compared with reference strains. Key words: fermented sausage, starter, isolation, screening, lactic acid bacteria 서 발효소시지는세절된육, 등지방, 식염, 발색제, 당류및향신료등을혼합하여 casing에충진시킨후발효및건조에의하여장기간의보존성을부여한육제품이다 (1). 발효소시지의주재료는고기와지방이며, 이외에미생물을위한탄소원으로사용될당분, 염지제, 향신료그리고스타터등을첨가하여만든다 (2). 발효소시지는본래재료나자연상태에서존재하는미생물에의해자연발효되는방식으로제조되었지만소시지의생산이산업화됨에따라공정과정시간을줄이고소시지의품질을표준화할필요성이증대되어현재에는주로스타터를이용한발효소시지를생산하고있다 (3). 스타터로일부곰팡이 (Penicillium nalgiovense, Pen. chrysogenum) 이나효모 (Debaryomyces hansenii) 가사용되고있기도하지만, 주로 Lactobacillus plantarum, Lac. pentosus, Lac. sakei, Lac. curvatus, Pediococcus pentosaceus, Ped. acidilactici 등의 lactic acid bacteria와 Staphylococcus carnosus, Sta. xylosus, Micrococcus varians 등의 catalase-positive cocci가발효소시지제조를위한스타터로사용되고있다 (4). 발효소시지스타터는소시지의환경 ( 염농도, 온도 ) 에잘적응하고, 다른미생물들 Received 8 pril 2014; ccepted 30 June 2014 Corresponding author: Hong-Seok Son, Department of Food and Nutrition, Dongshin University, Naju, Jeonnam 520-714, Korea E-mail: hsson@dsu.ac.kr, Phone: +82-61-330-3225 론 과경쟁하여빠른성장능력과 ph 저하능력을가져각종유해미생물들의성장을억제하여안전성을증진시킬수있어야한다 (5). 또한발효소시지의보존성을위해첨가하는아질산염에대해저항력이있고아질산염을소거시키는능력이있는것이좋으며 (6), 짧은숙성기간중독특한맛과풍미, 물성및색상을형성하여관능적인특성에긍정적으로기여하여야한다 (3). 국외에서는발효소시지제조를위하여 bacterioncin 생성 (7), 안전성증진 (8), probiotics로서의기능 (8,9) 등발효스타터의기능성에초점을두고있는연구들이활발하게이루어지고있는반면국내에서는발효소시지스타터에관한연구는미흡한실정이다. Lee 등 (5) 은김치에서발효소시지제조에적합한미생물을분리, 동정하여스타터로서의사용가능성을제시한바있지만대부분발효소시지제조에적합한균주를발굴하기보다는기존균주에관한비교연구 (10) 들이주를이루고있다. 김치, 젓갈, 식혜및장류등의한국전통발효식품들은주로젖산발효를기본으로하고있기때문에 (3) 발효소시지제조를위한스타터를발굴할수있는좋은재료이다. 현재전통발효식품에서분리된균주로는 Lactobacillus 속 (Lac. bulgaricus, Lac. acidophilus, Lac. plantarum, Lac. brevis, Lac. sakei, Lac. casei, Lac. coryniformis), Leuconostoc 속 (Leu. mesenteroides, Leu. lactis, Leu. paramesenteroides), Pediococcus 속 (Ped. pentosaceus, Ped. halophilus) 등이보고되고있다 (11-13). 발효식품에서분
1290 유선아 서승호 박성은 손홍석 리된이들젖산균들의생육환경은발효소시지의환경과다르지만일반적으로높은염농도의환경에서생육이가능하기때문에발효소시지제조를위한스타터로의적용가능성이있다. 본연구에서는전통발효식품과천연물에존재하는젖산균 27종을분리하고발효소시지와유사한환경 (model-system) 에서배양하며생육능력, ph 저하능력, 산생성능력및아질산염소거능력등을분석하여발효소시지제조에적합한균주를선발하고동정하여향후발효소시지제조에실제적용하기위한스타터를개발하고자한다. 재료및방법스타터균주발효소시지제조를위한스타터를발굴하기위해김치류 10종류, 젓갈류및장아찌류 3종류, 기타천연물 4종류 (fermented blueberry juice, black garlic vinegar, mozzarella cheese, neonate faces) 를수집하여멸균한생리식염수 (0.9%) 에희석, 현탁하여그상등액을 Lactobacilli MRS agar(difco, Detroit, Sparks, MD, US) plate에도말한후 37 C에서 48시간배양하였다. 배양후집락을관찰하면서 single colony를 2회계대배양하여총 27종을분리하였고 4 C에서보관하며사용하였다. 상대적인비교를위한대조구로는실제로상용되고있는발효소시지 starter culture인 LS-25(LS-25, ITEC, Ontario, Canada), RPS (Roh Pokel Star, VN HEES, Walluf, Germany) 와실제발효소시지제조에주로이용되는젖산균 5종류를 KCTC (Daejeon, Korea) 로부터분양받아사용하였다 (Lac. plantarum KCTC 3104, Lac. curvatus KCTC 3767, Lac. sakei KCTC 3598, Ped. acidilactici KCTC 1624, Ped. pentosaceus KCTC 3116). Model-system의제조 Lee 등 (5) 의연구를참고하여발효소시지제조와유사한 model-system을제조하였다. Model-system은 beef extract(12.0 g/l), glucose(10.0 g/l), NaCl(20.0 g/l), dipotassium hydrophosphate(2.0 g/l), MgSO 4 7H 2O(0.15 g/l), nitrite(0.15 g/l) 로구성하였으며, 초기 ph는 0.5 N HCl을이용하여 5.8로조정하였다. 각젖산균은 Lactobacilli MRS broth를이용하여 37 C에서 48시간전배양후 model-system에접종하였으며, 접종시초기균수는 10 6 ~ 10 7 CFU/mL였고 20 C에서 168시간동안배양하며시간대별로샘플 (50 ml) 을채취하여분석하였다. 젖산균생육곡선, ph 및총산도 Model-system에서젖산균을배양한후배양 0, 4, 8, 12, 24시간에샘플을채취하였고이후 168시간까지는매 24시간마다샘플을채취하였다. 흡광도값이 0 1.2 사이가되도 록증류수로희석한뒤 spectrophotometer(uv-1601, Shimadzu, Kyoto, Japan) 를이용하여 550 nm에서흡광도를측정하여미생물생육곡선을작성하였다. ph는 ph meter(ph-250l, ISTEK, Seoul, Korea) 를이용하여측정하였고, 총산도는시료 1 ml를증류수 4 ml에가하여희석한후 0.1 N NaOH를이용하여적정하였으며, 이때소요된 NaOH 소비량을 lactic acid(%) 로환산하여계산하였다. 잔존아질산염아질산염의정량은 Kato 등 (14) 의방법을변형하여다음과같이실시하였다. 시료 1 ml를취하여 2% acetic acid 용액 5 ml, Griess 시약 (30% acetic acid로각각조제한 1% sulfanilic acid와 1% naphthylamine을 1:1비로혼합 ) 0.4 ml를가하여잘혼합한다음실온에서 15분간방치시킨후 spectrophotometer를사용하여 520 nm에서흡광도를측정한후미리작성한검량선으로부터아질산염농도를산출하였다. 아질산염소거율은배양전의아질산염농도에대한배양후의농도를백분율로산출하였다. 선발젖산균의동정 Model-system에서생육속도와 ph 저하능력, 산생성능력, 아질산염소거능력이우수한균주 3종을선발하였고, PI 50CHL kit(pi biomerieux, Marcy-l'Etoil, France) 와 16S rrn sequencing은 KCCM(Seoul, Korea) 에의뢰하여분석하였다. 결과및고찰 ph 및총산도변화발효식품등으로부터분리한 27종의균주를 modelsystem에서배양하며흡광도, ph 및총산도를측정한결과를 Table 1에나타내었다. 발효소시지제조를위한스타터를선발하기위해서는빠른생육속도와 ph 저하능력을갖는것이무엇보다중요하다 (3). Model-system에서의결과를바탕으로생육속도가빠르고 ph 저하효과가우수하며, 총산도가높은균주 3종을선발하고 KI 7-3, DO 10-1, MLK 14-2로명명하였다. 분리한 3종의균주가발효소시지제조를위한스타터로서적합한지알아보기위해상업용균주 2종과발효소시지제조에주로사용하는균주 5종과비교하여 model-system에서의발효패턴을분석하였다. Model-system에서의 ph 변화를살펴보면 Lac. plantarum과 Lac. sakei를배양한실험구에서배양초기부터서서히 ph가저하되기시작하여배양 24시간이후에는 ph 가급격하게낮아졌으며, Ped. pentosaceus, Lac. curvatus와 Ped. acidilactici를접종한실험구는배양 72시간이후급격한 ph 저하를보였다 (Fig. 1). 배양 168시간후최종 ph는 3.64 4.32 사이였으며 Ped. acidilactici를접종한실험구가 3.64로가장낮은값을보였다. 한편상업용
발효소시지스타터선발 1291 Table 1. Changes of absorbance (OD), ph, and total acidity (T) during fermentation in sausage model-system 1) Isolate aechu kimchi Chonggak kimchi Kakdoogi 1 Kakdoogi 2 Mustard leaf kimchi Kimchi Green onion kimchi Perilla leaf kimchi Dongchimi Pickles Mustard leaf kimchi Salted-fermented shrimp Salt squid jeot-gal Doenjang Fermented blueberry juice lack garlic vinegar Mozzarella cheese Neonate feces Stain number 2-1 3-1 3-2 3-3 4-1 4-2 5-1 5-2 6-1 6-2 7-2 7-3 8-2 9-1 10-1 10-2 12-1 14-2 15-1 17-1 24-2 27-1 29-1 29-2 30-1 40-2 40-3 48 hr 96 hr 168 hr OD ph T (g/l) OD ph T (g/l) OD ph T (g/l) 0.115 0.090 0.140 0.160 0.160 0.190 0.165 0.160 0.110 0.110 0.075 0.410 0.070 0.035 0.340 0.455 0.130 0.585 0.165 0.305 0.120 0.145 0.130 0.140 0.140 0.055 5.11 5.11 5.31 5.42 5.44 4.73 5.01 5.09 5.62 5.63 5.75 4.44 5.79 5.97 4.35 4.36 5.22 4.40 5.03 4.95 4.48 5.23 5.01 5.25 5.01 5.22 5.81 1.611 1.647 1.449 1.368 1.386 1.890 1.683 1.539 1.359 1.249 1.233 2.097 1.278 1.125 2.250 2.304 1.476 2.248 1.728 1.674 2.061 1.431 1.566 1.557 1.692 1.503 1.197 1) Model-system: beef extract 1.2%, glucose 1.0%, NaCl 2.0%, dipotassium hydrophosphate 0.2%, MgSO 4 7H 2O 0.015%, nitrite 0.015%, ph 5.8. 0.210 0.290 0.105 0.255 0.255 0.215 0.175 0.500 0.240 1.050 1.015 0.145 1.020 0.210 0.425 0.425 0.130 0.350 0.195 0.175 0.165 4.78 4.73 4.83 5.05 5.03 4.78 4.70 4.78 4.82 4.85 5.45 4.20 4.92 4.98 3.73 3.83 4.84 3.85 4.71 4.32 4.50 4.79 4.31 4.62 4.70 4.58 5.04 1.881 1.728 1.764 1.575 1.692 1.845 1.899 1.809 1.719 1.764 1.440 2.466 1.724 1.638 3.699 3.366 1.746 3.150 1.800 2.178 2.007 1.701 2.250 1.890 1.924 1.989 1.620 0.295 0.300 0.555 0.305 0.345 0.330 0.330 0.360 0.240 0.485 0.460 0.335 1.100 0.765 0.805 0.885 0.475 0.355 0.380 0.855 0.415 0.305 0.240 0.375 4.50 4.46 4.54 4.24 4.58 4.56 4.40 4.50 4.45 4.52 4.82 4.19 4.22 4.33 3.64 3.78 3.90 3.82 4.52 4.20 4.32 4.22 3.86 4.13 4.37 4.39 4.22 1.683 1.818 1.890 2.664 2.205 2.088 2.403 2.295 2.196 2.151 1.827 2.565 2.376 2.250 4.095 3.420 3.096 3.303 2.106 2.367 2.178 2.511 2.988 2.313 2.367 2.151 2.457 균주인 LS-25와 RPS를접종한실험구는다른균주들과다르게배양 0시간부터지속적으로 ph가저하되었으며, 분리한 3균주를접종한실험구들은발효 24시간이후 ph가급격하게저하되는것이관찰되었다 (Fig. 1). Model-system 에서의 ph는상업용균주인 LS-25와 RPS를배양한실험구가가장빠른속도로낮아졌지만, 최종 ph는분리균주인 DO 10-1과 MLK 14-2를배양한실험구가 4.0 이하로더낮았다. 총산도값은 ph 결과와대조적인결과를나타내었다 (Fig. 2). 분양받은 5종의균주모두발효 24시간까지는총산도의증가가미미했으나, 그이후급격하게총산도가증가하는경향을나타내었다. ph 측정결과에서나타난것처럼상업용두균주는배양 0시간부터총산도가지속적으로증가되었으며, 분리한 3균주는배양 24시간이후총산도가급격히증가하는것이관찰되었다. 특히 DO 10-1과 MLK 14-2는배양 72시간이후에는상업용균주들보다더높은총산도 Fig. 1. Changes of ph during fermentation of model-system at 20 C.
1292 유선아 서승호 박성은 손홍석 Fig. 2. Changes of total acidity during fermentation of model-system at 20 C. 값을보였다. Kunz와 Lee(3) 는발효소시지제조에있어서발효후 2 3일째까지 ph를 5.1 정도로낮추는것이바람직하다고제시한바있는데, 본실험의발효소시지 modelsystem에서상업용두균주는발효 8시간이후, 분양받은 5종의균주는 72시간이후, 분리한균주는 48시간이후 ph 가 5.0 이하로저하되는결과를나타내었다. 발효소시지의낮은 ph는소시지의발색을돕고풍미를증진시키며 (15), 조직발달및건조를촉진하는효과를가져와숙성에걸리는시간을줄여줌과동시에 E. coli, Salmonella, Staphylococcus와같은부패미생물의성장을억제시키고제품의저장안정성을증가 (16) 시키는역할을한다. Model-system 의환경은실제발효소시지를제조하는환경과는다르지만 ph 결과만을본다면분리한 3종의균주는발효소시지스타터로서적합할것으로사료된다. 생육곡선 Model-system에서젖산균의생육곡선을흡광도를이용하여측정하였으며그결과를 Fig. 3에나타내었다. 대부분의균이배양 168시간에최대흡광도에도달하였으나, 도달하는시간및도달후유지되는양상은균주에따라달랐다. Lac. plantarum 균주를배양한실험구는배양 48시간째, Ped. acidilactici를배양한실험구는배양 72시간째흡광도 가급증하였으며, 최종흡광도는 Ped. acidilactici를배양한실험구가 0.96, Lac. plantarum을배양한실험구가 0.72의값을보여다른세균주에비해높았다. 한편 LS-25와 RPS 를접종한실험구들은 ph와총산도의결과처럼배양초기부터지속적으로흡광도가증가하였지만최종흡광도값은 0.6 이하의값을보였다. DO 10-1과 MLK 14-2는배양 24시간이후부터흡광도가증가하기시작하여 168시간째는 DO 10-1을배양한실험구가 1.1, MLK 14-2를배양한실험구가 0.89로상업용균주보다높은값을나타내었다. 일반적으로생육속도가빠른균주는급속한 ph 저하와산도증가를나타낸다. Model-system에서배양기간동안측정한흡광도, ph, 총산도의결과를바탕으로상관관계를 Fig. 4에나타내었다. 흡광도가증가할수록 ph는저하되는반비례적상관관계를보이지만총산도는증가하는비례적상관관계를나타내며총산도가증가할수록 ph는감소하는반비례적상관관계를보여준다. Kunz와 Lee(3) 는 20 24 C에서발효할경우발효 2 3일후젖산균의수가 10 8 CFU/ g에이르게되고산의생성또한왕성해지면서빠른 ph 저하가일어난다고하였는데이는본실험결과와일치한다. 발효소시지스타터가증식함에따라젖산등의유기산이생성되므로 ph 저하와밀접한관련이있다. 특히흡광도와 ph 사이의상관관계 (r 2 : 0.6378) 보다는흡광도와총산도의관 Fig. 3. Changes of absorbance during fermentation of model-system at 20 C.
발효소시지스타터선발 1293 C Fig. 5. Changes of nitrite scavenging activity during fermentation of model-system at 20 C. Fig. 4. Relations on the ph, total acidity, and absorbance of model-system according to fermentation period. 련성 (r 2 : 0.8154) 이높았으며총산도와 ph 결과가가장높은상관관계 (r 2 : 0.8793) 를나타내었다. 잔존아질산염측정 Model-system에서잔존아질산염측정결과를 Fig. 5에나타내었다. 배양 168시간까지아질산염함량이지속적으로낮아지는모습을보였으며, 최종적으로 Lac. curvatus를배양한실험구가잔존아질산염함량이 15.23% 로가장낮은함량을보였다. Lac. sakei를배양한실험구는 23.01%, Ped. acidilactici를배양한실험구는 23.42% 의함량을나타내었고, Ped. pentosaceus, Lac. plantarum, LS-25, RPS, KI 7-3은최종 168시간째아질산염함량이 28.9 40.8% 로배양중소거능력이상대적으로낮았다. 한편상 업용균주에비해분리한균주를첨가한실험구들이아질산염을소거하는속도가빨랐으며, 최종아질산염함량은 MLK 14-2가 27.4%, DO 10-1이 30.7% 로상업용균주에비해아질산염소거능력이우수하였다. 아질산염은발효소시지제조과정에서미생물의오염을방지하고발색을위해첨가하지만, 아질산염을일정농도이상으로섭취할경우혈중에서아질산염이 hemoglobin의산화를일으켜중독증상을발생시키고 2급, 3급 amine과결합하여발암물질인 nitrosoamine을생성하므로아질산염소거능평가는발효소시지스타터를선발함에있어중요한요소로작용할수있다 (17). 아질산염소거능은 ph 의존성이매우커 ph가낮을수록그소거능이증가하고중성에가까울수록낮아진다고하였는데 (18), 본연구에서도 model-system에접종한젖산균이증식함으로써산을생성하고 ph를낮추어발효소시지의아질산염소거능이증가된것으로사료되었다. Jin 등 (19) 은아질산염잔존량이미생물의균총에영향을받는다고보고하였으며, 아질산염의소거능은목적에따라스타터선발의기준이될수있다. 분리스타터의동정분리한 3종의균주를동정하기위하여 PI 50CHL kit를사용하여 49개탄소원에대한이용성을분석한결과 KI 7-3 은 Sta. xylosus, DO 10-1은 Sta. epidermidis, MLK 14-2 는 Lac. plantarum과유사한것으로판정되었다. 균의상태
1294 유선아 서승호 박성은 손홍석 Fig. 6. Phylogenetic analysis of the isolate based on 16S rrn gene sequences of other L. The tree was constructed by using the neighbor-joining method based on partial 16S rrn sequences. The scale bar indicates the 0.005% nucleotide difference. 에따라탄소원을기질로발효가일어나는조건이조금씩다를수있으므로보다정확한결과를확인하기위해 16S rrn sequence를분석하고이를 Gene ank에등록된여러젖산균들과상동성을비교하였다. 분리균주의 16S rrn sequencing 결과 KI 7-3은 Sta. warneri, DO 10-1 은 Sta. epidermidis, MLK 14-2는 Lac. plantarum과 99% 의상동성을보였다 (Fig. 6). KI 7-3의경우 PI 50 CHL kit 결과로는 Sta. xylosus로동정되었지만, 16S rrn sequence를이용한분자생물학적동정결과는 Sta. warneri 로동정되어일치하지않은결과를보였다. 분리한균주는 16S rrn sequence 결과를바탕으로최종적으로 Sta. warneri KI 7-3, Sta. epidermidis DO 10-1, Lac. plantarum MLK 14-2로명명하였다. Sta. warneri와 Sta. epidermidis 균주는스타터접종없이자연발효하는발효소시지에서빈번하게분리되는균주이다 (20). 하지만 Sta. warneri는소와인간의자연유산 (21), 요로감염 (21), 수막염 (22) 등의질병과관련되어있으며, Sta. epidermidis는피부세균총의일부로실험실내빈번한오염물질 (23) 로기회감염균 (24) 의가능성이있기때문에발효소시지의 starter culture로사용하기에는부적합할것으로사료된다. 반면 Lactobacillus 균주는산도를증가시키고 ph를감소시켜발효식품의풍미를향상시키며, 유해세균을비롯한다른장내균들의증식을억제하는것으로알려져있다 (25). 특히 Lac. plantarum은 CE 저해활성, 콜레스테롤저하효과가우수하며 (10), probiotics로서의효과 (26,27) 등발효소시지제조에있어서기능성을향상시키는 starter culture로활발한연구가이루어지고있다. 하지만분리한균주를산업적으로이용하기위해서는용혈현상, 암모니아나인돌생성여부, 젤라틴용해여부와 phenylalanine deaminase, β-glucuronidase, β-glucosidase, 7α-dehydroxylase, nitroreductase 등의효소활성에대한추가연구를통해안전성을검사하여야한다 (28). 요약본연구에서는전통발효식품 13종과천연물 4종에서 27균주를분리한후생육속도가빠르고 ph 저하능력이우수한 3종의균주를 1차선발하였으며, 분자생물학적방법을이용하여동정한결과 Staphylococcus warneri, Sta. epidermidis, Lactobacillus plantarum과 99% 상동성을보였다. 선발된 3균주의발효소시지스타터로서이용가능성을알아보기위해발효소시지의환경과유사한 model-system에서배양하며 ph 저하능력, 총산생성능력, 생육능력, 아질산염소거능력을발효소시지의스타터로많이사용되고있는 5균주및상업용 2균주와비교하였다. Modelsystem에서 ph 저하능과총산생성능, 생육능은관련성이있었으며, 상업용균주보다분리한 Sta. epidermidis DO 10-1, Lac. plantarum MLK 14-2가우수한결과를나타내었다. 아질산염소거능의경우에도분리한 3균주가상업용균주보다상대적으로빠른속도를보였다. 분리한 3균주는발효소지지스타터로서의발효소거능력은우수할것으로보이지만 Staphylococcus는잠재적인위험성이제기되는균주이므로 Lac. plantarum이발효소지지제조에가장적합할것으로사료된다. 감사의글본연구는제주광역경제권선도산업의연구비지원하에수행되었으며이에감사드립니다.
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