pissn eissn J. Milk Sci. Biotechnol. 2019;37(2): ARTICLE 전통김치로부터 Probiotic 유산균의

pissn 2384-0269 eissn 2508-3635 J. Milk Sci. Biotechnol. 2019;37(2):115-128 https://doi.org/10.22424/jmsb.2019.37.2.115 ARTICLE 전통김치로부터 Probiotic 유산균의분리및우유발효특성 임영순 * 김지연 강현철 서울에프엔비식품연구소 Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria with Probiotic Activities from Kimchi and Their Fermentation Properties in Milk Young-Soon Lim *, JiYoun Kim, and HyeonCheol Kang R&D Center, Seoul F&B Co. Ltd., Hoengseong, Korea Received: May 8, 2019 Revised: June 19, 2019 Accepted: June 20, 2019 *Corresponding author : Young-Soon Lim R&D center, Seoul F&B Co. Ltd., Hoengseong, Korea Tel : +82-33-340-4641 Fax : +82-33-345-9554 E-mail : lysya@hanmail.net Copyright 2019 Korean Society of Milk Science and Biotechnology. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http:// creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. ORCID Young-Soon Lim https://orcid.org/0000-0002-5432-0312 JiYoun Kim https://orcid.org/0000-0002-4312-6469 HyeonCheol Kang https://orcid.org/0000-0002-2804-246x Abstract Lactic acid bacteria obtained from traditional Kimchi were selected on the basis of their caseinolytic activity and lactose usability and examined for availability as a starter in probiotic activity. Thirty-two strains were selected as lactic acid producing bacteria in BCP agar, and two strains (KC23 and KF26) with more than 90% resistance for both acid and bile salts were selected. The two strains were identified as L. plantarum (KC23) and L. paracasei (KF26) by API 50 CHL system and 16S rrna sequence analysis. L. plantarum (KC23) was finally selected based on its biochemical characteristics for lactose and raffinose usability. Free tyrosine content increased rapidly in 10% skimmed milk medium, from 24.1 μg/ml after 8 h to 43.9 μg/ml after 16 h. Additionally, the caseinolytic clear zone of 12 mm of L. plantarum (KC23) was greater than the 9 mm zone of commercial L. acidophilus CSLA. The bacterium exhibited mesophilic growth and yielded 8.9 10 8 CFU/mL when incubated at 37 C for 12 h at ph 4.25. Moreover, L. plantarum KC23 exhibited antibacterial activity as it formed a clear zone of 8 13 mm for the 5 pathogens. Adherent activity was 2.23 fold higher than that of LGG. The acidity of 10% skimmed milk fermented for 12 h was 0.74%. Keywords lactic acid bacteria, Kimchi, Lactobacillus plantarum, probiotic, proteolytic 서론 유산균은탄수화물을이용하여젖산을생성하는미생물로서오랫동안산업에이용되어왔으며, 발효공정을통해탄수화물과단백질및지방성분등을분해하여풍미를증진시키고, 영양학적가치를 높여준다 (Leroy and De Vuyst, 2004). Elie Mechinikoff 가불가리아사람들이장수를누리는 이유가 Lactobacillus 로발효된발효유의섭취때문이라는것을밝혀내어노벨상을받은이래로 유산균과프로바이오틱스의기능성은지속적으로연구되어오고있다 (Mercenier et al., 2003). 프로바이오틱스 (Probiotics) 유산균은체내에들어가서정장효과를포함하는유익한기능성을 가지는살아있는균을말하는것으로, 장내에서젖산을생성하여장내환경을산성으로만들어산성에 견디지못하는유해균을억제시키고, 산성에서생육이잘되는유익균의증식여건을조성하여정상 장내세균총의균형을유지하고, 배변활동원활에도움을줄수있다 (Ouwehand et al., 2002). 유산균을비롯한세균들이프로바이오틱스로인정받기위해서는위산과담즙산에살아남아 소장까지도달하여장에서증식하고정착하여야하며, 장관내에서유효한효과를나타내어야한다. 또한, 발효공정을통해서는추가적으로유당불내증을개선하고, 면역기능개선등다양한효능을 J Milk Sci Biotechnol Vol. 37, No. 2 115

Lim et al. 기대할수있어소비자들의관심이높으며, 이에대한다양한연구가진행되고있다. 이와같이다양화되고있는제품유형과소비자성향을충족시켜주기위해서는우수한프로바이오틱스의지속적인개발이필요하다. 국내에서사용되고있는유산균종균의경우, 대부분수입에의존하고있는실정으로덴마크, 미국, 프랑스및독일등낙농선진국으로부터수입하고있는실정이다. 이는서구유럽의유산균주개량기술이크게앞서고있기때문으로볼수있으며, 또한국내적으로산업적이용가능한유산균의개발이부족한것도유산균의경쟁력저하요인으로볼수있다. 김치는우리나라의대표적인전통발효식품 (Choi and Hwang, 2000) 이면서세계 5대건강발효식품중하나로평가되고있다. 최근에는김치의효능에관한연구가활발해지면서김치발효과정에관여하는유산균에대한관심이높아지고있다. 김치발효젖산균으로는 Lactobacillus sp., Pediococcus sp., Leuconostoc sp., Weissella sp. 등의주요발효균이있으며, 이들이김치발효에있어중요한역할을하는것으로알려져있다 (Han et al., 1990; Han, 1991; Park and Cheigh, 2000; Choi et al., 2002; Lee et al., 2002). 한편, 2018 식품연감에따르면생활수준의향상과의료기술의발달은고령화사회를급속하게구성시키고있으며, 우리나라의경우에도 2026년에 65세이상의노인인구의비율은전체인구의 20.8% 로 5명중 1명이노인이되는초고령사회에도달할것으로예측되고있다. 고령인구는노화가진행됨에따라인체를구성하는조직및기관의생리적기능은성숙기에비해비가역적으로저하되며, 이러한신체변화에따라만성퇴행성질환의위험률이증가하며, 저작장애, 연하장애, 소화흡수율저하, 미각감소등의현상이나타나게된다. 이중저작능력저하는섭취할수있는음식에제한이생기고, 식사의양과질이떨어질수도있는데, 발효유소재는섭취용이성과함께영양을효과적으로제공해줄수있을것이며특히, 단백질분해특성이우수한유산균을이용한발효는단백질과같은고분자물질의저분자화로소화용이성을제공할수있을것이다 (Food Yearbook, 2018). 본연구에서는강원지역에서제조된전통김치로부터 lactose 와 raffinose 를포함하여분해능을가지며또한, 내산성및내담즙성과우유단백질분해능이우수한유산균을분리선발하고, 분리균의형태및생화학적특성과항균성및장내부착능등프로바이오틱활성을조사하였으며, 새로운유산균주로서우유발효용스타터로서의이용가능성을검토하였다. 재료및방법 1. 재료및시약강원도일원에서 25종의재래김치를수거하고, 각시료별로 1 g씩을취한후멸균수에 5배희석하여유산균분리를위한시료로사용하였으며, 탈지분유는서울우유 (Seoul Dairy Cooperative, Korea) 제품을사용하였다. 유산균의분리및저장에는 BCP 배지 (Eiken chemical Co., Ltd., Japan) 와 MRS 배지 (Difco, USA) 및 NA 배지 (Difco, USA) 를사용하였고, 항균활성실험에는 BHI 배지 (Bacto, USA) 를사용하였다. 내산성과내담즙성실험에는 1 N HCl(Daejung chemicals & metals Co., Ltd., Korea) 과 bile salts(oxoid, England) 를사용하였으며, 당발효실험에는 API 50CHL Kit(biomerieux, France) 을사용하였고, 적정산도측정에는 0.1 N NaOH(OCI, Korea) 을사용하였으며, 단백분해능실험을위한 L-tyrosine 과 1 N Folin 시약은 Sigma Aldrich(USA) 로부터구입하여사용하였다. 2. 유산균의분리및선발 희석한김치시료를 MRS 고체배지에백금이로획선접종하여 37 에서 24 시간동안배양하고, 유백색의콜로니를크게형성하는균락을 1 차적으로 50 콜로니를선별하였다. 선별한콜로니를다시 116 J Milk Sci Biotechnol Vol. 37, No. 2

전통김치로부터 Probiotic 유산균의분리및우유발효특성 BCP 고체배지에획선접종하여젖산생성으로노란색을형성하는균락을유산균으로판단하고, 이들 중산생성이우수한 32 콜로니를순수분리하였으며, 이들을대상으로프로바이오틱활성실험을 진행하여우수균을선발하였다. 3. 내산성및내담즙성내산성확인을위해분리균주를 MRS broth 에접종하여 37 에서 24시간배양한배양액을 1N-HCl 로보정하여만든 ph 3.0 MRS broth 에각각 2% 씩접종하여 37 에서 3시간배양방법으로테스트하였다. 배양된샘플을멸균수에십진희석하고, 1 ml를채취하여 MRS agar에접종한다음, 37 에서 24시간배양하여생성된콜로니를계수하고, 초기균수와배양후의균수를비교하여산성 ph에대한내성을확인하였다. 내담즙성확인은분리유산균배양액을 0.3% bile salts를첨가한 MRS broth 에각각 2% 씩접종하여 37 에서 6시간배양방법으로테스트하였다. 4. 분리균주의형태, 생화학적및당분해특성분리유산균의특성조사는그람염색후광학현미경 (BX60, Olympus, Japan) 을통한형태학적관찰, 산소유무와 35 및 45 에서의생장, catalase 활성여부및 API 50 CHL kit에의한 49종의탄수화물이용성을확인하였다. API 50CHL medium 에현탁하여 strip에분주한후 37 에서 48시간동안배양하였고, 실험에의한 strip의판독은각 tube의색변화로 negative( ), positive (+) 등으로판정하였으며, API 50 CHL database 를이용하여동정하였다. 5. 분리균주의 16S rrna 유전자염기서열분석분리균주의정확한동정을위하여 16S rrna gene 분석을통한유전학적동정을실시하였다. 분리균주의콜로니샘플은 MRS 액체배지에서 24시간배양하여 genomic DNA를추출후 16S rrna 증폭을위해유산균용프라이머인 forward primer 27F(5'-aga gtt tga tcc ctc ag-3') 와 reverse primer 1492R(5'-ggt tac ctt gtt acg act t-3') 을사용하였고, 처음사이클은 95 에서 15분, 30 사이클은 95 에서 20초, 50 에서 40초, 72 에서 1분 30초, 마지막사이클은 72 에서 5분, 4 에서 10분의조건으로 polymerase chain reaction(pcr) 을수행하였다. 염기서열분석은 ABI 3730XL capillary DNA Sequencer(Applied Biosystems) 를사용하였고, NCBI blast (www.ncbi.nih.gov/blast) 의 database 를이용하여유전학적동정을실시하였으며, 염기서열분석에기초하여 Phylogenetic tree를나타내었다. 6. 우유단백질분해능측정분리균주의우유단백질분해력측정은 paper disc assay method 와 tyrosine 함량측정방법으로실험하였다. 2% SMP를혼합한 NA 평판배지를만든후 paper disc를올려놓은다음, 상기분리유산균액체배양액을 10 μl씩적하하고, 37 에서 48시간동안배양시켜 clear zone의생성여부를확인하였다. 투명환의생성을우유단백질분해능이있는것으로판단하였으며, 비교를위하여상업균주인 L. acidophilus CSLA를실험에사용하였다. Tyrosine 함량측정은 10% 환원탈지유를배지로사용하였으며, 유리되는 tyrosine 함량으로나타내었다. 살균된환원탈지유배지에계대배양된분리균주 1% 를접종한후 37 에서 24시간동안배양하면서 4시간단위로시료를취하여분석하였다. 시료를 Whatman(No. 2) 여과지로여과한후여과액 5 ml에 0.44 M trichloroacetic acid(tca) 동량을가해침전시켜상등액을사용하였다. 30분간방치후 Whatman(No. 42) 여과지로여과하여여과액 1 ml와 0.44 M의 Na 2 CO 3 2.5 ml를혼합한후 1 N Folin 시약 200 μl를가하여 5분동안잘흔들어청색을발색시켰다. 발색시킨 J Milk Sci Biotechnol Vol. 37, No. 2 117

Lim et al. 시료를 Spectrophotometer(X-ma 1200, Human Co., Ltd., Korea) 로 660 nm 에서의흡광도를 측정하였으며, 측정값을준비해둔 tyrosine standard 의값으로환산하여유리된 tyrosine 량을 μg/ml 로표시하였다 (Hull, 1947). 7. 분리균주의생육특성분리균주를 MRS broth에서 37 로정치배양하면서 3시간간격으로시료를채취하고, Spectrophotometer 로 660 nm에서흡광도를측정하여생육곡선을작성하였으며, 생육에따른 ph는 ph meter(orion 3 star plus, USA) 로, 산도는 AACC method 02-31(2000) 에따라적정산도를측정하였다. 8. 항균활성측정분리균주의항균활성테스트는 Paper disc agar diffusion method(song et al., 2009) 을응용하여대표적인병원성지시균으로 Salmonella typhimurium ATCC14028, Listeria monocytogenes ATCC15313, Staphylococcus aureus ATCC25923, Bacillus cereus ATCC27348, Escherichia coli KCCM32396 등의 5종을각각 tryptic soy broth에접종한뒤, 37 에서 24시간배양하여피검균주로사용하였다. 분리유산균배양액은 MRS broth 에분리균주를접종하여 3 7 에서 12시간동안전배양한다음샘플로사용하였으며, 비교유산균으로상업균주인 L. acidophilus CSLA를동일한방법으로전배양하여사용해비교하였다. MRS agar와 BHI(brain heart infusion) agar를 1:1로혼합하여평판배지를만들고충분히굳힌다음, 각병원성미생물배양액을고체배지표면에 100 μl씩뿌린후멸균면봉으로도말하였다. 표면을충분히건조시킨후멸균한 paper disk를올려각유산균배양액샘플 50 μl씩을접종하고, 37 에서 24시간동안배양한후 clear zone 의형성여부를확인하였다. 저해환의크기는 12 mm를초과는 ++ 로, 10 12 mm의크기는 + 로, 10 mm 미만은 w로표시하였다. 9. 장내세포부착능분리균의장내부착능실험에는 Caco-2 cell line을사용하였고, L. rhamnosus GG(LGG; Valio Ltd, Finland) 균주를대조군으로하여상대적부착능을확인하였다. 먼저 Caco-2 cell line 배양액을 37 5% CO 2 환경에서배양하여준비하였으며, 부착도측정을위해 39번째와 41번째분열기사이의 Caco-2 cell line이사용되었다. Caco-2 cell들은 5 10 2 ml 농도로 12개의세포배양 plate well에 loading 후 72시간동안배양하여 80% 가채워진단일세포층을형성하였다. 부착도측정전에 Caco-2cell 을항생제가없는 MEM 배지에서 2시간동안배양하고, 이배양액을 0.5 ml의시료유산균이담긴동량의 PBS 용액과혼합하여최종세균농도가 2 10 8 CFU/mL 가되도록하였다. 다음으로용액을각조직배양 plate well 에첨가하고 37, 5% CO 2 환경에서 2시간동안배양하였다. 그이후단일세포층을멸균한 PBS(pH 7.2) 용액으로 2번세척하고, 10% 포르말린용액으로고정시킨다음 crystal violet 으로염색하고현미경하에서관찰하였다. 장부착률 (%)=(Viable cell count/initial cell count) 100 10. 주사전자현미경 (scanning electron microscopy) 관찰분리균주의관찰은 SEM(TM3030 Plus, HITACHI, Japan) 을사용하였다. 분리균주를 MRS agar에 streaking 하여증식시킨후단일콜로니를백금이로취하여 slide glass에균일하게도포하였으며, 이를 SEM용샘플 holder 에고정시켰다. 샘플 holder 를 SEM에위치시킨후진공상태를형성하여외부공기를차단시킨다음 15,000 30,000 배율로형태를관찰하였으며, 저진공에서 15 kv 조건으 118 J Milk Sci Biotechnol Vol. 37, No. 2

전통김치로부터 Probiotic 유산균의분리및우유발효특성 로 imaging 하였다. 11. 분리균주의환원탈지유에서생장특성환원탈지유에서의생장특성은분리된특정균주를 MRS broth 에서 37 로 24시간동안배양한다음 10% 환원탈지유에 2% 씩접종하였다. 이것을 37 에서 12시간동안배양하여 ph 및적정산도변화정도를관찰하고, 발효유제조용 starter 로서의사용가능성을판단하였다. 결과및고찰 1. 유산균의분리김치시료 1 g씩을멸균수에희석한후 MRS 고체배지에백금이로획선접종하여 37 에서 24시간동안배양하고, 유백색의콜로니를크게형성하는균락을 1차적으로 50 콜로니를선별하였다. 선별한콜로니를다시 BCP agar 에획선접종하여젖산생성으로노란색을형성하는균락을유산균으로판단하였으며, 이들중상대적으로노란색환을빠르고크게형성하여산생성이우수한것으로판단되는 32 콜로니를순수분리하였다. 2. 내산성및내담즙성분리한 32개균주를대상으로우수균주를선발하기위한프로바이오틱활성측정으로내산성및내담즙성을실험하였다. 분리균주를 MRS broth 에접종하여 37 에서 24시간배양한배양액을준비하고, 내산성은 1N-HCl 로보정하여만든 ph 3.0 MRS broth 를사용하였으며, 내답즙성은 0.3% bile salts를첨가한 MRS broth 를사용하여각각 2% 씩접종하고, 37 에서 3시간및 6시간배양방법으로테스트하였다. 배양된샘플을멸균수에십진희석하고 1 ml 채취하여 MRS 평판배지에접종한다음, 37 에서 24시간배양하여생성된콜로니를계수하고, 초기균수와배양후의균수를비교하여산성및염기성 ph에대한내성을확인하였다. 유산균이 probiotics 가되기위해서는위장의 ph 3 이하의산성조건과소화효소가많은담즙의환경조건에서생존할수있어야한다 (Mcdonald et al., 1990; Ouwehand et al., 1999). 실험결과를바탕으로내성이우수한수준을생존율 60% 이상으로임의판단하였으며, Table 1에서보이는것과같이 60% 이상의생존율을보인시료는내산성실험에서는 16개균주, 내염기성실험에서는 22개균주가확인되었는데, 내산성과내염기성에서모두 60% 이상의생존율을보인균주는 13개시료를나타내었다. 특히내담즙성실험에서는 8개균주에서 100% 이상의생존율을보였는데, 이는 0.3% 의 bile salts 농도에서는생장이억제되지않고일정비율로증식이가능하였음을보여주는것으로김치유래유산균들이내산성뿐만아니라, 매우우수한내담즙성을나타내는것을확인할수있었다. 이는김치유래유산균은내담즙성보다는높은내산성을지닌다는기존보고들과차이를보였는데, 김치종류별로봤을때내담즙성을지닌유산균이깍두기에서다른김치종류에비해월등히많았다는 Ko 등 (2013) 의보고와같이김치종류의차이때문으로생각된다. 본연구에서는일반적으로 ph 2.5 3.5에서 90% 이상의내산성으로보이는것으로알려진 L. acidophilus 에비교되는내산성과내염기성모두에서 90% 이상의매우우수한내성을보인 KC23 과 KF26 2개균주를우수균주로선발하고, 동정및추가적인특성을실험하였다. 3. 분리균주의형태적, 생화학적및당분해특성분리균주 KC23 과 KF26 의형태적, 생화학적특성을분석한결과는 Table 2와같았다. 2개균주모두그람염색을통해그람양성 (+) 균임을확인하였고, 현미경관찰결과 rod 형태를보였으며, catalase 시험결과음성 ( ) 반응을나타냈고, 산소유무와관계없이잘증식하였다. 또한최적생장온도를확인 J Milk Sci Biotechnol Vol. 37, No. 2 119

Lim et al. Table 1. Survival of 32 strains in ph 3.0 condition for 3 hr and bile salts 0.3% condition for 6 hr Strains Survival(%) ph 3.0 condition for 3 hr Bile 0.3% condition for 6 hr KC1A 78.0 64.3 KC2 59.6 69.2 KC3 26.1 36.0 KC4 23.2 45.7 KC5 87.5 104.5 KC6 48.2 43.4 KC7 51.1 38.0 KC8 85.6 108.0 KC9B 81.2 87.6 KC10 62.1 37.0 KF11J 64.2 65.8 KC12 32.6 74.4 KC13C 74.5 108.0 KC14 51.2 85.4 KC15 52.0 82.2 KC16 21.3 71.4 KC17 35.0 185.2 KR18 60.1 226.9 KR19 44.2 58.2 KR20 77.6 85.1 KF21 63.1 183.2 KR22 70.0 65.0 KC23 90.9 156.3 KC24 66.4 64.3 KC25 45.6 74.2 KF26 92.3 91.2 KC27 68.7 45.8 KC28 49.6 85.3 KR29H 70.0 180.0 KF30 56.0 24.1 KF31 46.3 65.3 KF32 62.5 45.4 Table 2. Physiological characteristics of Lactobacillus plantarum KC23 and L. paracasei KF26 isolated from Kimchi Characteristics KC23 KF26 Cell type Rod Rod Gram stain + + Catalase test Aerobic growth + + Anaerobic growth + + Growth at 35 + + Growth at 45 하기위하여 BCP agar에 streaking 한후 45 및 35 에서 24시간동안배양한결과, 45 에서는거의생장이이루어지지못하고, 35 에서는잘생장하는전형적인중온균의특성을보였다. 또한, KC23 과 KF26 의당분해특성을확인하기위해 API 50 CHL kit를이용하여 37 에서 48시간동안배양한후각각의당이용패턴을조사한결과는 Table 3과같다. KC23 균주는 D-galactose, 120 J Milk Sci Biotechnol Vol. 37, No. 2

전통김치로부터 Probiotic 유산균의분리및우유발효특성 Table 3. Carbohydrate utilization of the Lactobacillus plantarum KC23 and L. paracasei KF26 using the API 50CHL system Carbohydrate Reaction Reaction Carbohydrate KC23 KF26 KC23 KF26 Control Esculin + + Glycerol Salicin + + Erythritol Cellobiose + + D-Arabinose Maltose + + L-Arabinose + Lactose + Ribose + + Melibiose + D-Xylose Sucrose + + L-Xylose + Trehalose + + Adonitol Inulin + Methyl-βD-xylopyranoside Melezitose + + D-Galactose + + Raffinose + D-Glucose + + Starch D-Fructose + + Glycogen D-Mannose + + Xylitol L-Sorbose + + Gentiobiose Rhamnose D-Turanose + + Dulcitol D-Lyxose Inositol D-Tagatose + Mannitol + + D-Fucose Sorbitol + + L-Fucose α-methyl-d-mannoside + D-Arabitol α-methyl-d-glucoside + L-Arabitol N-Acetyl-glucosamine + + Gluconate + Amygdalin + 2-Keto-gluconate Arbutin + 5-Keto-gluconate +, positive;, negative. Lactose 및 Raffinose 을포함하여양성반응을보여우유또는두유중의당이용가능성을확인할수있었으며, 이에비하여 KC26 균주는 D-galactose 에서는양성반응을보였으나, lactose 와 raffinose 에서는음성반응으로차이를보였다. 당분해패턴을 API 50 CHL database 를이용하여동정한결과, KC23 은 L. plantarum 과 KF26 은 L. paracasei 와각각 99.9% 유사한것으로판정되었다. 4. 분리균주의 16S rrna 염기서열분석분리균주 KC23 과 KF26의종수준까지정확한동정을위하여 16S rrna gene분석을통한유전학적동정을실시하였다. 염기서열의상동성이 97% 이상을보일때하나의종으로정의할수있는데, Table 4의결과와같이 KC23 은 Lactobacillus plantarum, KF26은 Lactobacillus paracasei 로 99% 이상의상동성을보이며동정되었다. 본연구에서는우유또는두유요구르트제조용스타터로서활용하기위하여당분해특성에서 lactose 와 raffinose 에양성반응을보인 Lactobacillus plantarum KC23 을최종균주로선발하고, 한국미생물보존센터에기탁 (KCCM12351P) 하였으며, phylogenetic tree를 Fig. 1에나타내었다. 5. 유단백질분해능측정 분리균주 L. plantarum KC23 의우유단백질분해력측정은 10% 환원탈지유를배지로사용하였으 J Milk Sci Biotechnol Vol. 37, No. 2 121

Lim et al. Table 4. Identification and identity percentage of isolated strains by API 50CHL kit and 16S rrna analysis Strains Identification API 50 CHL 16S rrna KC23 Lactobacillus plantarum 99.9% 99% KF26 Lactobacillus paracasei 99.9% 99% Fig. 1. Phylogenetic tree of Lactobacillus plantarum KC23. 며, 유리되는 tyrosine 함량및 clear zone 크기로나타내었다. MRS broth 에서계대배양한분리균주를 10% 환원탈지유에 2% 씩접종한후 37 에서 24시간동안배양하면서유리된 tyrosine 함량을측정한결과 Fig. 2와같이나타났다. 배양후 8시간이전까지는미미한수준의단백질분해력을보였으며, 배양 8시간후에는 24.1 μg/ml 에서 16시간후에는 43.9 μg/ml, 20시간후에는 52.2 μg/ml 로급격한증가를보였다. 이는 Lim 등 (2008) 이 Kefir 에서분리한 Str. thermophilus LFG-1 의 65 78 μg/ml 보다는다소낮은수준이지만, Mok 등 (2002) 이내몽골산치즈에서분리한 L. amylovorus IMC-1 의배양 12시간후 6 μg/ml 및배양 72시간후 69 μg/ml 보다는높은단백질분해활성을보였다. 또한, 2% SMP를혼합한 NA고체배지에서투명환생성여부를비교균주인 L. acidophilus CSLA와함께확인한결과, Fig. 3과같이 L. plantarum KC23 가비교균주의약 9 mm보다큰약 12 mm의투명환을형성시키며우수한우유단백질분해특성을나타내었다. Fig. 2. Proteolytic activity of Lactobacillus plantarum KC23 in 10% reconstituted skim milk at 37 for 24 hr. 122 J Milk Sci Biotechnol Vol. 37, No. 2

전통김치로부터 Probiotic 유산균의분리및우유발효특성 Fig. 3. Clear zone formation by L. plantarum KC23 (A) and L. acidophilus CSLA (B) on MRS agar plate with 2% skim milk powder fermentation for 48 hr. 6. 분리균주의생육특성분리균주 L. plantarum KC23 의생장특성을확인하기위해 MRS broth 에각균주를접종한후, 앞의최적생장온도실험에서확인된 37 에서 12시간동안배양하면서 2시간간격으로 Spectrophotometer 를이용하여 660 nm에서의흡광도를측정하고생육곡선을작성하였다. Fig. 4(A) 와같이균주의생육은배양 6시간에서 10시간사이에대수증식기를보이며잘생육하였고, 배양 12시간후의생균수는 8.9 10 8 CFU/mL 를보였으며, 10시간이후에는완만한증가세로정체기에접어 Fig. 4. Growth (A) and ph change (B) of L. plantarum KC23 (KC23) and L. acidophilus CSLA (CSLA) in MRS broth at 37 for 12 hr. J Milk Sci Biotechnol Vol. 37, No. 2 123

Lim et al. 들고있음을확인할수있었다. 대조균으로사용된 L. acidophilus CSLA 의생장형태는서로유사한경향을보여분리균주는상업균주와같이우수한생장능력이있음을알수있었다. 또한, ph의변화는 Fig. 4(B) 에서보이는것과같이분리균과대조균이생균수의증식곡선에비례하여 6시간에서 10시간사이에급격한저하를보였고, 배양 12시간후에는 ph 4.25 수준으로감소하였다. Lee 등 (2013) 은배추김치로부터분리한 L. curvatus Gk36의조사에서 25 30 에서최적생장온도를가지며, 배양 15시간후 ph 3.84 수준까지저하되었다고하였으며, Kim 등 (2013) 은묵은지에서분리한 L. sakei JK-17 의기능성조사에서 30 진탕배양으로 ph 4.1까지저하됨을보고하였고, Song 등 (2009) 은김치에서분리한 L. plantarum YK-9 이 ph 3.6까지감소됨을보고하였다. 이들에비하여분리균주 L. plantarum KC23 은 ph 4.25로다소높은수준을보였는데, 신맛을선호하지않는시니어프랜들리용발효유제조에적용하기에적합할것으로판단되었다. 7. 항균활성측정분리균주의항균활성테스트는 tryptic soy 고체배지에 paper disk method 를이용하였으며, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus 와 Escherichia coli 등 5종의병원성미생물에대하여형성된 clear zone의 size를비교하였다. 실험결과, Table 5와같이분리균주 L. plantarum KC23은시험한 5개모두의병원성균주에대해 8 13 mm의저해환을형성하여항균력을나타내었고, 포도상구균을제외한다른 4종의병원성균에대하여모두상업균주인 L. acidophilus CSLA보다우수한항균특성을보였다. 이는 Ahn 등 (2003) 의김치로부터분리한유산균중 35% 50% 에서 Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella typhimurium 에대한항균력을보였다는보고와 Ko 등 (2013) 의 Bacillus sp. Listeria monocytogenes, S. typhimurium 에대해항균력을지닌유산균이갓김치보다배추김치등에서 2배이상존재한다는보고등김치유래유산균의우수한항균특성보고들과유사한결과이다. 일반적으로유산균은젖산을생성하여산도를낮춤으로써병원성세균의생육을억제하며, bacteriocin 등의항균물질을생성하여항균작용을나타내는것으로알려져있다 (Kaur et al., 2002; Song et al., 2009). 따라서항균활성이우수한분리균주는생균제또는발효유용으로이용시유해균의증식을억제하여장내균총을개선시키는효과를기대할수있을것으로판단된다. 8. 분리균의장내부착능실험장세포부착능은프로바이오틱스로서숙주의장내환경에대한적합성을판단하는대표적인방법이며 (O Halloran et al., 1997), 이를확인하기위한실험을진행하였다. 인체의소장상피세포와유사한형태로증식되는 Caco-2 cell line을사용하였고, 일반적으로사용되는상업균주로서 L. rhamnosus GG를대조군으로하여상대적부착능을확인하였다. 실험결과는 Fig. 5와같이 LGG의장세포부착능을 1.0% 로보았을때분리균주인 Lactobacillus plantarum KC23 은 2.23% 를보였으며, Table 5. Antimicrobial activity of Lactobacillus plantarum KC23 isolated from Kimchi and L. acidophilus CSLA 1) Pathogens Species L. acidophilus CSLA L. plantarum KC23 Salmonella typhimurium ATCC14028 w 1) (8 mm) ++(13 mm) Bacillus cereus ATCC27348 +(10 mm) ++(13 mm) Listeria monocytogenes ATCC15313 +(10 mm) +(10 mm) Staphylococcus aureus ATCC25923 +(10 mm) +(8 mm) Escherichia coli KCCM32396 w(8 mm) +(10 mm) Inhibitory clear zone size (w, <10 mm; +, 10 12 mm; ++, >12 mm). 124 J Milk Sci Biotechnol Vol. 37, No. 2

전통김치로부터 Probiotic 유산균의분리및우유발효특성 Fig. 5. Adhesion ability of Lactobacillus plantarum KC23 to Caco-2 cell. 이때의유산균수는 8.6 10 6 CFU/mL 로서비교적높은수준의우수한장세포부착능을확인할수 있었다. 장내에부착하여군락을형성해생존하여야사멸된유산균에비하여면역활성증진및항암 효과가크다고보고되고있다 (Ouwehand et al., 1999). 9. 분리균주의현미경관찰 Lactobacillus plantarum KC23 유산균을 crystal violet으로염색하여 1,000배율의광학현미경으로관찰한결과, 단간균형태임을확인할수있었고, 전자현미경으로관찰한결과, 세포의크기는약 2 3 μm를나타내었으며, 표면상태는점질물이없이매끄러운형태를보였다 (Fig. 6). 10. 분리균주의환원탈지유에서젖산생성분리균주인 L. plantarum KC23 와대조구로서상업균주인 L. acidophilus CSLA 를 MRS broth 에서 37 로 12시간동안배양하여스터터로사용하였으며, 10% 환원탈지유를 85 로 10분간살균하고, 1% 씩접종한후 37 에서 12시간동안배양하여 ph 및적정산도변화를관찰하고, 발효유제조용 starter 로서의사용가능성을판단하였다. 살균탈지유에서 12시간동안배양한결과, MRS broth 에서와는다르게상업균주인 L. acidophilus CSLA 의경우 ph 3.92 와적정산도 0.94% 를보인것에비하여 L. plantarum KC23 의경우는 ph 4.32 와적정산도 0.74% 로다소낮은산생성을보였다 (Table 6). (A) Fig. 6. Photograph of Lactobacillus plantarum KC23 grown on the MRS agar at 37 for 48 hr. (A) Optical microscope, (B) SEM (Scanning electron microscopy). (B) J Milk Sci Biotechnol Vol. 37, No. 2 125

Lim et al. Table 6. ph and acidity of fermented milk with Lactobacillus plantarum KC23 and L. acidophilus CSLA at 37 for 12 hr ph Acidity (%) L. plantarum KC23 L. acidophilus CSLA 4.32 3.92 0.74 0.94 L. plantarum KC23 의이러한특성은약한신맛을선호하는소비층을대상으로하는저산성발효유 제조에활용할수있을것으로사료된다. 요약 본연구는전통김치로부터유단백질분해능과 lactose 분해능을가지는유산균을선발하고, 프로바이오틱활성을측정하여발효유용스타터로서의이용가능성을조사하였다. BCP agar에서젖산생성력이우수한 32 colony 를선발한후내산성및내담즙성모두에서 90% 이상으로내성이우수한 2 colony(kc23, KF26) 를 2차로선발하였다. 이들을대상으로 API 50CHL 탄수화물이용성테스트및 16S rrna 염기서열을분석한결과, L. plantarum KC23 과 L. paracasei KF26 으로동정되었다. 이들중 lactose 와 raffinose 를포함하여당분해능을가진 L. plantarum KC23 을최종선발하고프로바이오틱활성을조사하였다. 우유단백질분해능을 10% 환원탈지유배양중의유리 tyrosine 함량으로측정한결과, 배양 8시간후에는 24.1 μg/ml 에서배양 16시간후에는 43.9 μg/ml 로급격하게증가되었으며, 또한 clear zone 형성크기를비교한결과 12 mm로상업균주인 L. acidophilus CSLA 의 9 mm보다우수한특성을보였다. 온도별생장특성을확인한결과는 45 에서보다 35 에서잘증식하는중온균의특성을나타내었고, 37 에서 12시간동안배양한결과배양 6 10시간사이에대수증식기를보였으며, 배양 12시간후생균수는 8.9 10 8 CFU/mL 와 ph 4.25 수준을나타내었다. 항균활성을측정한결과는 5개병원성균에대하여 8 13 mm의 clear zone 을형성하여우수한저해특성을보였으며, 그중 Salmonella typhimurium 과 Bacillus cereus 에대한항균활성이가장우수하였다. 장내부착능을측정한결과는비교균주인 LGG에비하여 2.23배의우수한결과를보였으며, 10% 환원탈지유를이용한 37 배양에서젖산생성능을확인한결과는대조군인 L. acidophilus CSLA 에비하여다소낮은경향을보였지만, 적정산도가 0.74% 수준으로서저산성발효유제조를위한스타터로활용가능할것으로판단되었다. 감사의글 본연구는중소벤처기업부에서시행한지역특화주력산업육성기술개발사업의지원에의해이루어진 것으로이에감사드립니다 (P0002722). References AACC. 2000. Approved methods of the AACC. 10th ed, American Association of Cereal Chemists, St. Paul, MN. Ahn, D. K., Han, T. W., Shin, H. Y., Jin, I. N. and Ghin, S. Y. 2003. Diversity andantibacterial activity of lactic acid bacteria isolated from Kimchi. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 31:191-196. Choi, H. J., Cheigh, C. I., Kim, S. B., Lee, J. C., Lee, D. W., Choi, S. W., Park, J. M. 126 J Milk Sci Biotechnol Vol. 37, No. 2

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