Journal of Bacteriology and Virology 2011. Vol. 41, No. 4 p.237 244 http://dx.doi.org/10.4167/jbv.2011.41.4.237 Review Article Exploitation of Culture Medium for Mycobacterium tuberculosis Hyejin Kim and Sungweon Ryoo * Korean Institute of Tuberculosis, Osong, Chungcheongbuk-do, Korea The culture media for Mycobacterium tuberculosis (MTB) were contrived from both egg-based and agar based ingredients. In 1903, Dorset introduced the first egg-based medium. It was followed by the invention of Löwenstein-Jensen and Ogawa media that contain whole eggs as nutrient and malachite green to inhibit the growth of contaminants. These media have been used worldwide for their usefulness and inexpensiveness. However they have a fundamental disadvantage that the cultivation time for mycobacterial growth takes more than 4 weeks. In 1947, Dubos introduced the first agar medium and followed by the invention of the 7H10 by Middlebrook and Cohn. A powder base of these media contains agar, combination of seven salts, L-glutamic acid, pyridoxine, biotin, and malachite green. This requires the addition of the oleic acid, albumin, dextrose, and catalase (OADC) growth supplement. BACTEC MGIT960 has recently been introduced for rapid cultivation of MTB, which is fully automated liquid culture system with modified 7H9 broth. Agar-based medium developed by Middlebrook has a number of advantages over egg-based medium. One of them is transparency, which enables earlier detection of growing colonies. The major disadvantages of agar media are the high cost of OADC and the need for a CO 2 incubator. In conclusion, there is a need for a new agar medium, which can be produced at a lower cost and earlier growth detection. In this review, we introduced the growth promoting factors which can be used as an alternative new growth supplement, camp and resuscitation-promoting factor (Rpf). These factors may abrogate a lag in adaption of the bacilli in culture media. Key Words: Mycobacterium tuberculosis, Löwenstein-Jensen, Ogawa, 7H10, Growth promoting factor 서론 세계적으로, 결핵은감염성질환중 AIDS에이어성인사망원인의두번째를차지하고있는심각한질환중하나이다. 2010년세계보건기구 (WHO) 의보고에따르면 2009년한해동안 200여개국가로부터신고된결핵환자중신환자가약 450만명이며이중전염성이높은도말양성신환자는약 200만명에달하고있다 (1). 이수치는 Received: November 25, 2011/ Revised: December 3, 2011 Accepted: December 5, 2011 * Corresponding author: Sungweon Ryoo. Korean Institute of Tuberculosis, Mansu-ri 482, Gangoe-myeon, Cheongwon-gun, Chungcheongbuk-do, 363-954, Korea. Phone: +82-43-249-4948, Fax: +82-43-249-4989 e-mail: scientist1@empal.com ** This research was supported by Basic Science Research Program through NRF funded by the Ministry of Education, Science and Technology (2011-0027094). 세계보건기구에신고된수치만을기준으로산정한것이므로실제신고되지않았거나, 결핵환자의파악이어려운저개발국가들의상황을고려한다면, 그수치는더높을것으로추정된다. 2009년, OECD에가입한 30개국가의결핵발생률및사망률 (10만명당 ) 자료를보면, 우리나라는 OECD 가입국중인구 10만명당발생률 90명, 사망률 8.3명으로가장높은수치를보이고있다 (1). 2009년 1월 1일부터 12월 31일까지 1년간전국의보건소와민간병 의원에서결핵정보감시체계에신고된결핵사례를보면, 결핵환자는총 47,302명 ( 인구 10만명당 97.0명 ) 으로전년대비 3,128명이증가하였고, 이중폐결핵환자는 38,950명 ( 인구 10만명당 79.9명 ) 으로전체신고환자의 82.3% 를차지하였으며, 폐외결핵환자는 8,352명 ( 인구 10만명당 17.1명 ) 으로전체신고환자의 17.7% 였다. 폐결핵환자중도말양성환자는 15,763명 ( 인구 10만명당 32.3명 ) 으로전체신고환자의 33.3% 였고, 환자유형별로 237
238 HJ Kim and SW Ryoo 신환 35,845명 (75.8%), 재발 5,624명 (11.9%), 기타 2,802명 (5.9%), 전입 1,775명 (3.8%), 중단후재등록 869명 (1.9%) 등이었다. 환자등록유형별추이를보면 2009년신고신환자는 10만명당 73.5명으로 2001년 72.1명보다증가하였으며, 재발, 초기치료실패, 중단후재등록, 전입은 2001년에비해감소하는추세를보이고있다 (2). 이와같은우리나라의결핵실태를조기에개선하기위해기존의 '2030 결핵퇴치계획 ' 을 10년앞당겨 2020년선진국수준으로결핵발병률을낮추기위한정부의 ' 결핵퇴치 2020 계획 ' 이발표되었으며이계획을성공적으로완수하기위해결핵예방접종, 적절한약제치료등은강화되었지만, 효과적인결핵관리를위한가장필수적인노력은결핵의정확한진단이라고할수있다. 미생물학실험실에서의결핵진단의핵심은임상분리검체에서결핵균을직접발견하는것이라고할수있는데, 가장저렴한비용으로광범위하게사용되고있는객담도말검사의경우민감도 (30~85%) 가검사자의숙련도에따라차이가있고, 결핵균배양검사의경우 6주이상의시간이소요되기때문에조기진단에어려움이많다. 특히모든결핵진단의기본이되는결핵균배양을신속하게진행하기위해서는현재사용하고있는결핵균용고체및액체배지의성능을획기적으로개선시킬수있는방안이마련되어야한다는요구가지속적으로제시되고있다. 본논문에서는현재사용하고있는결핵균전용배지들의개발역사와각배지의특성에대해알아보고, 향후결핵균전용배지의개발방향에대해살펴보고자한다. 본론 1. 결핵균전용배지의개발역사와특성 1) 배지개발초기단계 1882년 Robert Koch가세계최초로슬라이드글라스위에혈액을응고시켜결핵균순수배양에성공하였고, 그후 peptone, salts, glycerol 등을포함시킨 petri-dish를사용하여편의성과안전성을증가시킨 "plate technique" 이라고명명된배양방법을개발하였다 (3). 약 20년후인 1902 년미국농림부 (US Department of Agriculture) 소속의과학자인 Dorset에의해결핵균의성장에필요한 beef extract, organic phosphate, 달걀등을주성분으로하는 Dorset's egg medium 이개발되었다 (4). 1908년부터는소 ( 牛 ) 의피하에 Tuberculin을접종하여가축용소의결핵감염여부를판 정하는우결핵관리가시작되었는데, 당시개발되어있는배지들은우결핵진단시비특이적반응이나타나는큰문제점을안고있었다. 이러한문제점을해결하기위해, 1934년 Dorset은결핵균이증식하는데필요한질소원으로사용되는 beef extract 대신 asparagine을첨가하여비특이적반응을최소화한배지를개발하여사용하였다 (5). 그후에도 egg-based 배지는지속적으로개량되어현재널리사용되고있는 Löwenstein-Jensen (L-J) 배지, Ogawa 배지에까지이르게되었다. 현재우리나라에서는결핵균의배양과약제감수성검사에 Ogawa 배지와 L-J 배지를널리사용하고있다. 2) Egg-based 배지 L-J 배지와 Ogawa 배지의개발배경을살펴보면, Löwenstein, Sonnenschein, Hohn 등의미생물학자들은결핵균이외의다른미생물의성장을억제하기위해 Dorset's 배지에 Congo red와 malachite green 등을첨가하여사용하였다 (6~8). 1932년 Jensen은기존의 Löwenstein 배지성분에 citrate와 phosphate 함량을늘리고, Congo red를첨가하지않는대신 malachite green 성분함량을추가하는방식으로배지를개량하였는데 (9), 이러한과정을거쳐현재우리나라뿐만아니라전세계적으로널리사용되고있는 L-J 배지가탄생하게되었다. L-J 배지의주성분은 Table 1과같다 (10). 그후 1949년일본의 Ogawa 박사는 L-J 배지에서탄소원으로사용되는성분인 asparagine 대신에가격이저렴한 sodium glutamate 를첨가한 Ogawa 배지를개발하였다. Ogawa 배지의주성분은 whole egg와탄소원인 sodium glutamate, 그리고잡균의오염을제거하기위한 2% malachite green 등으로이루어져있고, KH 2 PO 4 를이용하여배지의 ph를 6.8로조정하였다. 현재결핵환자의객담검체에서결핵균을분리배양하는과정에서는 L-J 배지보다개량된 Ogawa 배지를주로사용하고있는데, 그이유는개량형 Ogawa 배지나 Acid-buffered Ogawa 배지의경우강염기로탈오염처리된객담검체를바로사용할수있기때문이다. 개량형 Ogawa 배지는탄소원인 sodium glutamate와 malachite green 함량을높였으며, 배지의최종 ph는 6.2로조정하였다. Acidbuffered Ogawa 배지는 magnesium citrate를추가적으로첨가하였는데배지내의 Mg 2+ 이온은결핵균이산에대한스트레스를극복하는데꼭필요한요소로작용하게된다 (11). L-J 배지와마찬가지로 Ogawa 배지도 80 이상의 inspissator에서 45분간가열하여배지를응고시키는
Media for Mycobacterium tuberculosis 239 Table 1. Composition of both Löwenstein-Jensen and Ogawa medium Löwenstein-Jensen medium Potassium dihydrogen phosphate anhydrous Asparagine Magnesium citrate Magnesium sulfate Glycerol Malachite green Homogenized whole eggs Ogawa medium Potassium dihydrogen phosphate anhydrous Sodium glutamate Malachite green Homogenized whole eggs 데, 가열온도가배지의품질을결정하는주요요인으로작용하게된다 (10). Ogawa 배지의주성분은 Table 1과같다. 3) Mycobacteria 종별배양용배지결핵균이외에 Mycobacterium 속에포함되는여러종이밝혀짐에따라각각의종의성장조건에맞는배지의개발이이어졌다. 한예로, 대부분의 mycobacteria는 L-J 배지에서탄소원으로 glycerol을사용하는데, M. tuberculosis complex (M. microti, M. africanum, M. bovis, M. tuberculosis) 중에서 M. tuberculosis를제외한나머지 3종은 glycerol을 pyruvate로전환시키는데필요한 pyruvate kinase가결여되어있어탄소원으로 pyruvate를첨가해줄경우더높은성장률을보인다. 실험목적으로사용되고있는 M. bovis 표준균주는 glycerol이있는배지에서 in vitro passage를통해적응하여일반적인 L-J 배지에서도배양되지만, 우결핵발병률이높은나라에서는검체를 L-J 배지에바로접종하면 M. bovis를배양할수없는경우가종종발생한다는보고가있다 (10). 이와같은단점을보완하고 M. bovis를정확하게배양하기위해 glycerol 대신 0.5% sodium pyruvate 를첨가하여 M. bovis 등이잘자랄수있는 Stonebrink 배지가개발되었다 (12). 그외에도 M. fortuitum, M. abscessus 등이염성분을좋아하는성질을이용하여 L-J 배지에 sodium chloride를첨가한배지가개발되었다 (13). NTM (Non tuberculous mycobacteria) 감염이늘어나고있는세계적인추세를감안할때결핵균을포함하는다양한 mycobacteria 종에특이적으로사용할수있는전용배지의개발이요구되고있다. 4) Agar-based 배지 Egg-based 배지개발이후, 1945년 Dubos와 Middlebrook 은결핵균의집락형태관찰을위해 agar-based 고체배지인 'Dubos Oleic Acid Albumin Agar' 를개발하였는데, 이배지는 1958년에 Middlebrook과 Cohn에의해개발된 7H10 한천배지의모체가되었다 (14). 'Dubos Oleic acid albumin agar' 의주성분은질소원으로사용되는 peptone과 asparagine으로구성되어있으며, 배지의 ph는 disodium phosphate와 monopotassium phosphate를이용하여조절한다. 그외에성장촉진인자로 Tween 80, oleic acid ester, bovine albumin 등을첨가하는데, Tween 80는계면활성제로작용하여결핵균을확산시켜성장을증가시키는동시에탄소원으로서의역할을하고 (15), bovine albumin 은 Tween 80에서생성되는독성물질인 free fatty acid 등을중화하는역할을한다 (16, 17). 우무배지는투명하여, 접종후 2주정도가지나면집락을관찰할수있어서기존의 egg-based 배지에비해획기적으로결핵균의배양기간을단축시킬수있다. 기존의배지는배양기간이 6주정도로길기때문에배지에는늙은세포와젊은세포, 심지어죽은세포까지섞여있을가능성이높았지만, 'Dubos Oleic acid albumin agar' 배지는접종후이배지에서자라는균의평균나이를가늠할수있다는장점이있다. 이후 'Dubos Oleic acid albumin agar' 는 BCG 백신균주의생존능력측정이나마우스감염모델실험등에널리사용되었다. 이배지가개발될당시결핵균의성장을 2 주만에관찰할수있다는사실은획기적인사건이었고, 이배지가개발된몇주후에 Time지에 'The greatest contribution to TB research since Robert Koch first isolated the germ itself in 1882' 라는제목으로기사가실리기도하였다 (18). 5) Middlebrook 7H10과 7H11 agar 7H10 우무배지는 Middlebrook과 Cohn에의해결핵균의성장을촉진시키고독성물질을중화시켜주는 oleic acid와 albumin을보강하여개량한배지다 (19). 이배지는결핵균이자라는데필요한일곱가지의 salts와 L-glutamic acid, pyridoxine, biotin, sodium citrate, malachite green이포함되어있고, sodium citrate를첨가하여 salts의흡수를용이하게하였다 (Table 2). 그이외에탄소원인 glycerol과결핵균성장촉진인자를첨가한다. 현재시판되고있는결핵균성장촉진인자는 sodium oleate, albumin (bovine,
240 HJ Kim and SW Ryoo Table 2. Composition of 7H11, 7H11 agar, and growth supplement 7H10 agar medium 7H11 agar medium Growth supplement (OADC) Ammonium sulfate Pancreatic Digest of casein Oleic acid L-glutamic acid L-Glutamic acid Bovine albumin Disodium phosphate Disodium phosphate Dextrose Sodium citrate Sodium citrate Catalase Monopotassium phosphate Monopotassium phosphate Ferric ammonium citrate Ferric ammonium citrate Magnesium sulfate Magnesium sulfate Pyridoxine hydrochloride Pyridoxine Biotin Biotin Malachite Green Malachite Green Glycerol Glycerol Agar Agar Calcium chloride Copper sulfate Zinc sulfate fraction V), dextrose, catalase (OADC) 등을주성분으로하고있다 (20). 주성분각각의역할을살펴보면, oleic acid 는결핵균의대사작용에이용되고, albumin은독성물질로부터결핵균을보호하는역할을하며 dextrose는에너지원으로사용되고 catalase는배지의독성 peroxide를분해하는역할을한다. 7H10 한천배지와비슷한시기에 7H9 액체배지가개발되었는데, 7H9 액체배지는 7H10 한천배지의성분중한천을제외하고대신에결핵균성장을증진시키기위해 polysorbate 80을추가하였다 (21). 이어서 1968년에는, 성장조건이까다로운결핵균을배양하기위해 casein을 pancreatic digestion한 7H11 배지가개발되었다 (22). 6) 자동배양시스템최근국내외적으로사용이급격히증가하고있는 BD (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD., USA) 사의결핵균자동배양시스템인 BACTEC MGIT960 (Mycobacterium Growth Indicator Tube) 의경우개량된 7H9 액체배지를기본으로사용하고있으며, L-J와 Ogawa 배지에비해배양기간을단축시킬수있다는장점이있다. MGIT960에사용된배지는 7H9 broth base에결핵균성장촉진제인 oleic acid, albumin, dextrose, catalase, polyoxyethylene stearate (POES) 등을첨가하였다. MGIT tube 속의배지에는 10% CO 2 가함유되어있으며, 항생물질복합체인 PANTA (Polymyxin B, Amphotericin B, Naladixic acid, Trimethoprim, Azolcillin) 를사용전에첨가하여결핵균이아닌잡균의성장을억제한다. 이시스템의검출원리는호기성세균인결핵균이자라면서산소를소비하게되고, fluorescent indicator와결합된산소가소모되어 quenching되면서발색반응이나타나며이발색반응이자동모니터링장치에전달된다 (23). 7) Agar-based 배지의단점 7H10과같은고체배지를이용하여결핵균을배양하면전통적인 L-J 배지나 Ogawa 배지에서보다결핵균의생육속도를증가시킬수있다는장점이있지만, 7H10 배지를사용할경우배양과정에서 CO 2 를공급해야한다는번거로움이있다 (24). 7H10 배지는 ph 값이 6.6으로서결핵균의최적성장 ph인 6.2보다높은편이다. 그리고결핵균은자라면서암모니아를생성하게되는데이로인하여배지성분의알칼리화가더욱심해지게된다 (20). 7H10 배지에접종된결핵균의성장을극대화하기위해서는최적의결핵균성장 ph인 6.2를유지시켜야하는데, 이를위해서 5~10% 의 CO 2 가지속적으로공급되어야한다. 결핵균배양시험의특성상대부분격리된다수의공간을필요로하는데, 현재의결핵균배양시설에 CO 2 를
Media for Mycobacterium tuberculosis 241 지속적으로공급할경우적지않은시험비용의증가가우려된다. 2. 결핵균성장촉진인자탐색결핵균의평균세대기간은 12~24시간으로, 대장균과같은일반세균의 15분에비해훨씬길다. 결핵균의성장촉진을위해배지에여러영양분을첨가하는방법에는한계가있을수밖에없다. 결핵균의 doubling time이긴이유는다양한데, 그중몇가지주요요인을살펴보면, 첫번째로결핵균의세포벽성분을들수있다. 결핵균의세포벽은대부분지방성분으로구성되어있어세포벽을통해서영양물질을받아들이는데많은제약을받는다 (25). 두번째는결핵균의전사과정중 RNA chain 합성속도인데, 결핵균의성장속도에영향을미치는것으로알려져있다. 결핵균은다른세균에비해 promoter 부분에 G + C 함량이높아결핵균의전사속도는대장균보다보통 10배정도느리다 (26, 27). 전사시작단계부터나타나는느린반응은결국전체적인전사과정에영향을주고결과적으로필요한단백질의합성도지연되어결핵균의성장속도에영향을주게된다 (28). 이와같이결핵균의세대기간을고려할때, 균성장을촉진시키기위해기존의배지에여러영양성분을첨가하여배양기간을획기적으로단축시키는데는한계가있을수밖에없다. 결핵균의성장을촉진시키기위해서는영양성분의첨가보다는접종초기에결핵균의배지에대한적응력이더중요하다. 결핵균이새로운배지환경에잘적응하고회복되어안정된상태로얼마나빨리들어가는가가중요하다. 따라서영양성분의공급뿐만아니라성장과정에서최대한유도기를단축시킬수있는성장촉진인자를발굴하는데중점을둘필요가있다. 한예로, 기존의성장촉진인자중에서 7H9 액체배지에첨가되는 catalase는배지의독성 peroxide 를분해하여결핵균유도기를단축시키는역할을하는것으로알려져있다. 따라서향후발굴가능한성장촉진인자중결핵균전사조절물질과재활성화인자에대해살펴보는것도중요하다. 1) 결핵균전사조절물질결핵균의성장촉진을위한후보물질을발굴하기위해서는스트레스극복, 전사속도조절등과관련된물질에관한탐색이필요하다. 결핵환자의객담에서결핵균을분리배양하기위해서는탈오염제거과정을거치는데이때결핵균은강한염기에노출된다. 이러한외부의강한스 트레스에노출된결핵균이배양초기에안정화되어성공적인적응기에접어들수있도록하는성장촉진인자의탐색이필요하다. 개인적인견해이지만, 결핵균이세포내에서생존하는데필요한유전자조절뿐만아니라, starvation, 산성조건등과같은극한환경에처해있을때, 생존에필요한유전자발현을유도하는전사조절인자의작용을유도하면결핵균의생존율을높일수있고생육에도많은도움을줄수있을것으로생각한다. 또한이러한전사조절인자는결핵균의전사초기단계에영향을줄수있는물질로서단백질의합성이촉진되고외부의영양물질을최대한흡수할수있게되어배지상에서결핵균의성장속도를촉진시킬것으로예상된다. 세포에서 cyclic adenosine 3', 5'-monophosphate (camp) 는 ph, 산소농도등환경적인변화를인식하여유전자발현을조절하는 second messenger로서작용한다. 결핵균에서 camp의역할을알아보기위해배지에 dibutyryl camp를첨가하고 glucose, albumin 등을제한하여배양했을때, 영양결핍상태를극복하기위해결핵균은다량의 camp를분비하여결핵균의전체적인유전자발현을조절하는것으로밝혀졌다 (29). 특히큰포식세포내에서결핵균은저산소, 산성조건 (ph <4.5), 영양물질부족등의극한환경에직면하게되고이를극복하기위해결핵균은 camp 경로를활성화하여유전자를조절함으로써큰포식세포내에서생존할수있음이보고되었다 (29~33). 이와같이 camp는결핵균이큰포식세포내에서생존하는데필요한유전자조절뿐만아니라, starvation, hypoxia 와같은극한환경에처했을때생존에필요한유전자들의발현을유도한다. 앞에서도언급했듯이객담에서분리된결핵균은탈오염제거과정을거치면서강한염기등여러스트레스상황에직면하게된다. 이러한스트레스에노출된결핵균을성공적으로배양하기위해서는스트레스에반응하는유전자들이즉각적으로발현되어야할것이다. 연구결과들을고려해보았을때 camp는결핵균이처한스트레스상황에맞게효과적으로유전자발현을조절할것으로생각된다. 따라서결핵균의성장촉진을위한후보물질로서 camp는배양초기스트레스상황에있는결핵균의전사조절인자로작용하여단백질의합성을촉진하고, 초기유도기를단축하여결핵균성장을촉진시킬것이라고예상된다. 2) 결핵균재활성화인자영양부족등의환경적인스트레스를받게되면, 결핵균
242 HJ Kim and SW Ryoo 은 nonreplication 상태인잠복기에들어가성장을멈추게된다. Wayne 등은산소와영양분이부족한환경에서결핵균이 nonreplication 상태로들어가는것을증명하였고, 이상황에서결핵균은단백질합성을중단하고즉시성장을멈추는것이관찰되었다 (34, 35). 결핵균이외의다른세균중에서, Actinomycetales (Micrococcus luteus, Rhodococcus rhodochrous, Mycobacterium tuberculosis) 에속하는 Micrococcus luteus는제자리성장기나영양분이부족상황일경우잠복기상태로들어가게된다. 잠복기상태의 M. luteus를배양했을때집락을형성하지않는데보통 M. luteus는대수증식기에서의생존율이 100% 라고가정했을때, 제자리성장기에서는 4~10% 의생존율을보인다. 그런데, 이런잠복기상태에서 M. luteus는대수증식기의상층액을첨가했을경우성장이재활성화가일어나집락을형성하고정상적인성장을계속하는것이관찰되었다 (36, 37). 이실험에서 M. luteus의 Rpf (resuscitationpromoting factor) 라는단백질이잠복기의균을활성화시키는성장촉진인자임이밝혀졌는데, Rpf는 M. luteus뿐만아니라 M. smegmatis, M. tuberculosis에서도 picomolar 농도로활성을보여잠복결핵을재활성시킬수있는것으로알려졌다 (38). 영양분의결핍과스트레스환경에서잠복기로들어가는전형적인세균인결핵균에서 M. luteus 의 Rpf은 5개월정도성장이정지한결핵균을재활성시켰으며, 고체뿐만아니라액체배지에서도결핵균의성장을촉진시킬수있다는보고가있다 (39, 40). Rpf는약 16~17 kda 단백질로 G + C 함량이높은그람양성균, streptomycetes, corynebacteria, mycobacteria 등에널리존재한다. Rpf는 muralytic 활성을가지고있어서세포벽의 NAG (tri-n-acetylglucosamine) 에결합하여분해한다 (41). Rpf는결핵균세포벽의펩티도글리칸층에결합해 NAG 를분해하여세포벽의 remodeling을유도하고외부의영양물질이용을용이하게할것으로추정된다. 결핵균의성장속도가느린이유중하나는지방질로둘러싸인세포벽이외부영양물질의 uptake에장애물로작용하기때문으로추정되는데, Rpf 단백질을첨가할경우원활한영양공급이이루어져성장을촉진시킬것으로예상된다. 실제로, Rpf 단백질에서 muralytic 활성을가진 domain이제거된돌연변이균주의경우, Rpf의성장촉진능력이사라진다는사실은 (42) Rpf가이같은활성을갖고있다는것을시사한다. 또한 Rpf 단백질을성장촉진인자로첨가할경우, 결핵균중에서도특별히늦게자라는균들의 성장을촉진시킬수있을것이다. 복약중인결핵환자에서분리된결핵균은항결핵약제에노출되어생존능력이떨어져있을가능성이높기때문에이경우에도 Rpf를첨가하면결핵균의성장속도를효과적으로촉진시킬수있을것이다. 결론적으로, Rpf의기능을고려해볼때잠복기로들어가기전의결핵균뿐만아니라, 일반배지에서잘자라지않는성장이까다로운결핵균을다시활성화할수있는 Rpf를배지에첨가할경우, 결핵균이스스로배지내영양분을충분히이용할수있어결핵균의성장속도를증가시킬것으로기대된다. 결론 1982년 Robert Koch 가처음으로결핵균을순수분리배양한이후결핵균배지는 egg-based 배지와 agar-based 배지로개발및개량되어왔다. Dorset 이배지를개발한이후지속적인개량이이루어져현재우리나라를비롯한전세계에서가장보편적으로사용되고있는결핵균전용 egg-based 배지인 L-J와 Ogawa 배지는비용면에서매우저렴하고안정적으로결핵균을배양할수있다는장점이있다. Agar-based 배지는 1945년 Dubos와 Middlebrook 에의해 7H9, 7H10, 7H11 배지등이개발되었다. 이배지는성장촉진인자로 oleic acid, bovine albumin, dextrose, catalase를첨가하는데, 최근에사용이증가하고있는자동화배양기인 MGIT960 시스템도개량된 7H9 액체배지를사용한다. MGIT960 시스템은기존의 egg-based 배지에비해결핵균의배양기간을획기적으로단축시킨배지이지만, 고가의장비비용과 100% 수입품으로구성되어있는소모품을사용해야하는단점이있다. 국가차원의결핵관리대책에서중요한부분을차지하는신속한배양을통한결핵진단을위해서는 1882년 Robert Koch에의해처음으로결핵균의분리배양이가능해진이후지금까지의결핵균배지개발역사로부터새로운아이디어를얻어보다실용적인결핵균전용배지의개발이시급하다. 또한현재사용되고있는결핵균전용배지의단점들을보완할수있는경제적이고신속한결핵균배양방법을개발하기위해서는결핵균성장촉진인자의탐색과관련된연구가필요하며, 결핵균의성장속도를촉진시키기위한배양조건개선및유도기를최대한단축시킬수있는인자의발굴을위한연구도계속되어야할것이다.
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