Journal of Bacteriology and Virology Vol. 46, No. 1 p Original Article Effect of Methylene Blue

Journal of Bacteriology and Virology 2016. Vol. 46, No. 1 p.27 35 http://dx.doi.org/10.4167/jbv.2016.46.1.27 Original Article Effect of Methylene Blue-mediated Photodynamic Therapy on Wild-type and Ciprofloxacin-resistant Mycobacterium smegmatis Insoo Shim 1, Myungwon Choi 1, Yegee Min 1, Kwang Hyuk Seok 2, Jiyeun Kate Kim 1, Jee-Yeong Jeong 2, Chul-Ho Oak 3* and Indal Park 1* 1 Department of Microbiology, Kosin University College of Medicine, Busan; 2 Department of Biochemistry, Kosin University College of Medicine, Busan; 3 Department of Internal Medicine, Kosin University College of Medicine, Busan, Korea Tuberculosis (TB) patients are normally treated with a combination of antibiotics. However, with improper or incomplete treatment of antibiotics, the disease may progress to multidrug-resistant TB (MDR-TB). The treatment of MDR-TB is very costly and inefficient. Therefore, there is a great demand of new therapeutic approaches for MDR-TB such as photodynamic therapy. In this study, we tried to optimize the conditions for photodynamic inactivation of TB using methylene blue as a photosensitizer. Different combinations of methylene blue concentrations and light doses were tested for their photodynamic effects to A549 cells or Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis). We also tested the effect of photodynamic therapy on ciprofloxacin-resistant M. smegmatis. Methylene blue treatment alone did not affect the survival rates of A549 cells or bacteria up to 5 μg/ml. When the A549 and M. smegmatis cells treated with methylene blue were irradiated with laser light (wavelength, 630 nm), photodynamic inactivation of cells was increased in methylene blue concentration- and light dose-dependent manners. Interestingly, the ciprofloxacin-resistant M. smegmatis exhibited higher level of susceptibility to methylene blue-mediated photodynamic inactivation. This study suggests that photodynamic therapy at 3.6 J/cm 2 in the presence of 5 μg/ml methylene blue may be an appropriate range for therapy due to the high bactericidal activity against high level of ciprofloxacin-resistant M. smegmatis and the low damaging effect to mammalian cells. This study demonstrates that photodynamic therapy could be a potential alternative for MDR-TB treatment. Key Words: Photodynamic therapy, Methylene blue, Mycobacterium smegmatis, Ciprofloxacin, Tuberculosis INTRODUCTION 광역동치료법 (Photodynamic therapy, PDT) 은빛과그빛에반응하는물질의상호작용으로국소부위에서화학작용을일으켜치료하는방법으로써빛에너지와빛감각 제, 산소가필요하다. 빛이목적물에흡수되면빛감각제가 radial과 singlet oxygen과같은세포독성물질의생성을유도하게되고, 이물질이 DNA나단백질에작용하여 apoptosis 나 necrosis 를일으키는것으로알려져있다 (1). 빛에너지로는레이저, intense pulsed light, light-emitting diodes (LEDs), blue light, red light, 가시광선등이있으며, Received: January 19, 2016/ Revised: February 6, 2016/ Accepted: February 11, 2016 * Corresponding author: Indal Park. Department of Microbiology, Kosin University College of Medicine, 262 Gamcheon-ro, Suh-gu, Busan 49267, Korea. Phone: +82-51-990-6423, Fax: +82-51-990-3081, e-mail: indalp103@gmail.com * Corresponding author: Chul-Ho Oak. Department of Internal Medicine, Kosin University College of Medicine, 262 Gamcheon-ro, Suh-gu, Busan, 49267 Korea. Phone: +82-51-990-6215, Fax: +82-51-990-3081, e-mail: oaks70@daum.net CC This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/license/by-nc/3.0/). 27

28 I Shim, et al. 빛감작제로는 haematoporphyrin 유도체를비롯하여다양한물질들이있는데, 의료용으로사용되는감각제들은 porphyrins, chlorophylls, dyes 로분류하고있으며여러종류들이제품화되어있다 (2, 3). 본실험에사용한 methylene blue (MB) 는 phenothiazinium salts로알려져있는푸른색계통의염료로써 620~670 nm에서빛을흡수하며다른빛감각제와마찬가지로 singlet oxygen 과자유산소기를발생하여 Staphylococcus aureus 등과같은그람양성균뿐만아니라, Pseudomonas aeruginosa 같은그람음성균, 포자, 다양한종류들의진균이나효모, 바이러스등의제거에사용되고있으며, 암세포, 최근에는광우병의원인물질인프리온도불활성화시켰다는보고도있다 (4~12). 결핵 (tuberculosis, TB) 은주로폐에감염을일으키지만전신의거의모든장기에서질병을일으킬수있고, 기침, 재채기, 콧물, 대화하는과정에서도공기를통해전파될수있는균이기때문에보통같은공간에서생활하는사람들에서집단적으로발생할가능성이높다. 2015년세계보건기구 (World Health Organization, WHO) 의보고 (Global Tuberculosis Control WHO Report, 2015) 에의하면우리나라는결핵 3대지표인결핵발생률, 유병률, 사망률에있어서 10만명당발생률은 2013년 97명에서 2014년 86명으로, 유병률은 143명에서 101명으로, 사망률은 5.2명에서 3.8명으로감소했다고발표하였는데, 여전히결핵발생률은경제협력개발기구 (Organization for Economic Co-operation and Development, OECD) 국가중가장높다. 결핵의치료는기본적으로 6개월의장기간, 다량의약을복용해야하기때문에규칙적이고, 지속적인복용이어려워그로인한내성균의출현도높은편이다. 결핵치료제인 isoniazid (isonicotinyl hydrazine, INH), rifampin (RMP) 에내성을가진균을다약제내성결핵균 (multidrug-resistant TB, MDR-TB) 이라하고, 이들내성균의치료에는 aminoglycoside, ethionamide, pyrazinamide, fluoroquinolone (FQ) 의 4가지약제가사용되는데이런 MDR-TB 중 FQ에내성이면서주사용약제인 capreomycin 또는 kanamycin, amikacin 중하나에대해내성인균을광범위약제내성결핵균 (extensively drug resistant TB, XDR-TB) 이라고한다. 2014 년한해동안전세계에서 MDR-TB 환자가 480,000명발생하였고, 190,000 명이사망하였으며, MDR-TB 환자중 9.7% 가 XDR-TB 환자인것으로보고되었다. 결핵의재치료실패시 12~ 88% 의환자가 MDR-TB 로된다는 WHO의보고가있으며, 국가별 MDR-TB 환자수의추정치가 1,700여명으로 OECD 회원국중에서가장많은우리나라로서는결핵의예방과치료에집중적인연구가필요한상황이다 (13~15). MDR-TB 의치료에사용되는 FQ는 ofloxacin, ciprofloxacin (CFX), levofloxacin 등이며, 최근에는 4세대 FQ인 moxifloxacin 이나 gatifloxacin 이많이사용되고있고, 이약제들은 M. tuberculosis DNA의 double-strand 를절단함으로써사멸시키는것으로알려져있다 (16, 17). FQ에대한내성은주로 DNA gyrase 와 Topoisomerase IV의유전자변이에의해발생하는데, DNA gyrase 는 gyra, gyrb 유전자에의해, Topoisomerase IV는 parc와 pare 유전자에의해만들어지는데, M. tuberculosis 는 DNA gyrase 의돌연변이가내성에주로관여하는것으로알려져있다 (18~20). 이와같이결핵은전세계뿐만아니라국내에서도심각한질병으로문제가되고있지만아직확실한치료제나치료방법이개발되어있지않다. 따라서본실험에서는결핵균과유사한성질을갖고있는 M. smegmatis 를이용하여결핵균을효과적으로사멸시킬수있는방법을찾기위해가격이저렴하면서성능이우수한 MB를광감작제로이용하고, 광원으로는 300 mw/cm 2 레이저를사용하여균사멸에효율이높은 MB 의농도와레이저주사시간의조합을찾고자하였다. 그리고 CFX에내성인 M. smegmatis 를만들어내성균에대한효과역시연구함으로써결핵치료의기초자료를마련하고자하였다. MATERIALS AND METHODS 시약및배지세포주로는사람폐암세포 (Human lung adenocarcinoma epithelial cell line) 인 A549 (ATCC, CCL-185, USA) 를사용하였으며, 세포배양에는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, HyClone, USA) 에 10% fetal bovine serum (FBS, HyClone), 1% penicillin-streptomycin 혼합액 (Hyclone) 을첨가한배지를사용하였다. Methylene blue (MB) Seoul Chemical Inc., Korea) 는 phosphate buffered saline (PBS) 에 1 mg/ml 되게녹여보관하며사용하였고, 항균제는 ciprofloxacin (CFX; Bayer Schering Phama AG, Germany), lomefloxacin (LMX; Sigma., USA), levofloxacin (LFX; Daiichi Sankyo Co., LTD, Japan), moxifloxacin (MFX; Bayer Vital GmbH, Germany), amikacin (AMK; Boryung Pharm, Korea), clarithromycin (CLA; Abbott France, France), colistin (COL;

Photodynamic Therapy on Mycobacterium smegmatis 29 Mississauga, Canada), rifampin (RMP; Sigma) 등을사용하였다. M. smegmatis 배양에는 Middlebrook 7H9 액체배지 (Difco, USA) 와 7H10 고형배지 (Difco) 를사용하였으며, 0.5% Tween 80 (Sigma) 과 10% ADC (albumin, dextrose, catalase) enrichment (BD and BBL, USA) 를첨가하여균을 37 배양기에서배양하였다. 배양된균은 OD 600 = 0.6일때 14,000 rpm 에서 10분간원심분리하여 Tween 80이 0.5% 첨가된 PBS 에잘현탁하였고, 균수를 1 10 6 CFU/ml 로조정하여실험에사용하였다. MTT assay에는 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (Sigma) 를 PBS에 2 mg/ml 되게녹여사용하였고, 레이저는 Ceralas PDT Diode Laser System (CeramOptec, Germany) 의제품으로 630 nm의파장을갖고있다. A549 세포주에대한 MB의사멸효과측정사람의세포에영향을주지않는 MB의농도를측정하기위하여폐암세포주인 A549 세포를 DMEM 배지에서키워 5 10 7 개의세포를 96 well에분주하여 24시간동안배양하였다. MB의농도를 0, 1, 5, 10, 30, 80 μg/ml 으로, 40분간반응시키고 PBS (ph 7.0) 로세척하여세포생존율을 MTT assay로측정하였다. MTT assay는 MB에노출시킨세포들을 24시간배양한후 2 mg/ml 농도의 MTT 용액을 100 μl 넣고 37 에서 4시간반응시켰다. MTT 용액을제거하고 Dimethyl sulfoxide (DMSO, Pierce, USA) 를넣고 formazan 결정이녹을때까지실온에서 10분간가볍게흔들어준후 ELISA reader 를사용하여 540 nm에서흡광도를측정하였다. A549 세포주에대한 MB와레이저의 PDT 효과측정 MB와레이저를함께처리했을때어떠한효과가나타나는지알아보기위해 5 10 7 개의세포를 24-well plate 에분주하여 24시간배양하였다. MB의농도는 0, 5, 30 μg/ml 였으며, 레이저는 300 mw/cm 2 로, 0, 12, 60, 180, 360초동안 (0, 3.6, 18, 54, 108 J/cm 2 ) 조사하였다. 새로운배지로갈아준후 24시간배양하고, 2 mg/ml 농도의 MTT 용액 250 μl를넣고 MTT assay를하였다. M. smegmatis 에대한 MB의사멸효과측정 M. smegmatis 균액을 MB의최종농도가 0, 1, 5, 10, 30, 50, 80, 150 μg/ml 되게하여 24-well plate 에 1 ml씩분주한후암실에서 40분간 shaking 하며반응시켰다. 각균을 10-5 까지 10배계단희석하여 7H10 배지에 100 μl씩도말하고암실에서 3일간배양한후집락수를세었다. M. smegmatis 에대한 MB와레이저의 PDT 효과측정 M. smegmatis 균액을 MB의최종농도가 0, 5, 30 μg/ml 되게하여 24-well plate에 1 ml씩분주한후, 암실에서 40분간 shaking 하며반응시킨후레이저를 300 mw/cm 2 로, 0, 12, 60, 360초동안 (0, 3.6, 18, 108 J/cm 2 ) 조사하였다. 각균을 10-5 까지 10배계단희석하여 100 μl씩 7H10 배지에도말하고암실에서 3일간배양한후집락수를세었다. M. smegmatis 의 CFX에대한내성균제작 M. smegmatis 를 7H10 액체배지에접종하여배양하고, 배양된균은 CFX의농도를 0.0125 μg/ml부터단계적으로높여가면서인위적으로내성균을유도하는 stepwise selection 방법을사용하였다 (21). 만들어진내성균들은 5 ml씩배양하여초저온냉동고에보관하였다. 항균제감수성검사내성균들에대한 CFX, LMF, LFX, MFX, AMK, CLA, COL, RMP 등의항균제들의최저발육저지농도 (minimal inhibitory concentration, MIC) 를측정하기위해액체계단희석법을사용하였으며, 각항균제들의최고농도는 128 μg/ ml, 최저농도는 0.06 μg/ml 되도록 2배계단희석법으로희석하였다. 암실에서 3일동안배양한후 OD 600 = 0.6 되면 1 ml 취해서 14,000 rpm에서 10분간원심한후 Tween 80이첨가된 PBS에서잘현탁하여 20 μl씩접종하였다. 72시간배양한후관찰하여균이자라지않은가장낮은농도를 MIC로하였다. DNA 분리와 Polymerase chain reaction(pcr, 중합효소연쇄반응 ) 내성균주를각 5 ml 배양하여 14,000 rpm에서 20분간원심분리한후균을 PBS로 2번세척하였다. 증류수 50 μl 를넣어잘섞은후 100 에서 5분간가열하고 14,000 rpm 에서 20분간원심하여그상층액을중합효소연쇄반응원액으로사용하였다. M. smegmatis 의 FQ 내성관련유전자인 gyra와 gyrb 유전자부위에대한돌연변이를관찰하기위해 primer

30 I Shim, et al. M-gyrAF 5'-CAGCGCAGCTACACGACTA-3', M-gyrAR 5'- AGTCGAAGTCGGTCAGCTTG-3', M-gyrBF 5'-GGCATG- TACATTGGCTCGAC-3', M-gyrBR 5'-ACCGGAACAACA- ACGTCAAC-3' 를사용하여 PCR을시행하였다 (Genbank accession numbers X94224 and L27512). 반응에는 Smart Taq Pre-mix (SolGent, Korea) 를사용하였으며, PCR Thermal cycler (TaKaRa, Japan) 로 94 에서 10분간전처리하고, 94 에서 1분, 55 에서 1분, 72 에서 1분간 35회반응시킨후 72 에서 10분간더반응시켰다. 반응결과물은 1.5% agarose gel에서전기영동하여 ethidium bromide 용액으로염색한후관찰하였다. PCR 결과산물은자동염기분석기인 ABI PRISM 3730X Analyzer (Applied Biosystems, USA) 로염기서열을분석하였다. CFX 내성 M. smegmatis 에대한 MB와레이저의 PDT 효과측정 CFX 고도내성 M. smegmatis 를배양하여 OD 600 = 0.6일때 14,000 rpm에서 10분간원심분리하여 Tween 80이 0.5% 첨가된 PBS에잘현탁하였다. 균수를 1 10 6 CFU/ml 로조정하여 MB의최종농도가 0, 5, 30 μg/ml 되게한후 24-well plate에 1 ml씩분주하였고, 암실에서 40분간 shaking 하며반응시킨후레이저를 300 mw/cm 2 로, 0, 12, 60, 360초동안 (0, 3.6, 18, 54 J/cm 2 ) 조사하였다. 각균을 10-5 까지 10배계단희석하여 100 μl씩 7H10 배지에도말하고암실에서 3일간배양한후집락수를세었다. RESULTS A549 세포주에대한 MB의사멸효과 MB의농도에따른세포의생존율은 0.5 μg/ml 에서는 98.7% 이었고, 1 μg/ml에서는 98.1%, MB 농도 5, 10, 30, 80 μg/ml 에서는각각 95.9, 78.1, 53.2, 39.1% 로나타나 MB 5 μg/ml 까지는세포의생존율에거의영향을미치지않았으며그이상의농도에서는세포의생존율이떨어지는것이관찰되었다 (data not shown). A549 세포주에대한 MB와레이저의 PDT 효과 MB의농도를 0, 5, 30 μg/ml 되게한후레이저를 0, 12, 60, 180, 360초동안 (0, 3.6, 18, 54, 108 J/cm 2 ) 조사하여생존율을확인하였다. MB가없는경우레이저만으로는세포의사멸에거의영향을주지않았으며, MB의농도가 Figure 1. Effects of photodynamic therapy with methylene blue on A549 human lung cell. Different concentrations of methylene blue (MB) were incubated with A549 cells and irradiated with different light doses. Means are shown as points. 5 μg/ml 일경우는 MB 를넣지않은군과 3.6 J/cm 2 까지는 비슷하게감소하다가그이상의에너지를가하면급속히 사멸되는경향을보였고, MB 의농도가 30 μg/ml 인경우 에는초기부터급격히사멸하기시작하였다 (Fig. 1). M. smegmatis 에대한 MB 의사멸효과 M. smegmatis 에대해 MB 의농도가 0, 1, 5, 10, 30, 50, 80, 150 μg/ml 되게처리한결과, 10 μg/ml 까지는생존율이 95.9, 94.0, 91.4% 로거의변화가없었으며, 30 μg/ml 에서는 79.0%, 50 μg/ml 에서 55.9%, 80 μg/ml 에서 9.2% 로 50 μg/ml 이후에급격하게감소되는것으로관찰되었다 (data not shown). M. smegmatis 에대한 MB 와레이저의 PDT 효과 MB 농도 0, 5, 30 μg/ml 에서레이저를 0, 3.6, 18, 54 J/ cm 2 (0, 12, 60, 180 초 ) 되게조사하였더니 MB 농도 5 μg/ ml 에서는생존율이각각 95.2, 82.1, 36.1% 로 18 J/cm 2 까지 는큰변화가없었으며, 그이상에서는생존율이떨어짐 을관찰할수있었다. MB 30 μg/ml 에서는 83.1, 27.1, 1.1% 로다소급격하게사멸이이루어져 54 J/cm 2 에서는균이 현저하게감소된것으로관찰되었다 (Fig. 2).

Photodynamic Therapy on Mycobacterium smegmatis 31 Figure 2. Effects of photodynamic therapy with methylene blue on Mycobacterium smegmatis. Different concentrations of methylene blue (MB) were incubated with Mycobacterium smegmatis and irradiated with different light doses. Data were presented as Mean ± SD of three independent experiments. Asterisks indicate statistically significant differences with respect to the corresponding controls (student t-test: *, p < 0.05; **, p < 0.01). Figure 3. Effects of photodynamic therapy with methylene blue on ciprofloxacin resistant Mycobacterium smegmatis. Different concentrations of methylene blue (MB) were incubated with Mycobacterium smegmatis and irradiated with different light doses. Data were presented as Mean ± SD of three independent experiments. Asterisks indicate statistically significant differences with respect to the corresponding controls (student t-test: **, p < 0.01). M. smegmatis 의 CFX에대한내성균제작과항균제감수성검사 CFX의최종농도가 256 μg/ml 인내성균이만들어졌으며, 염기서열분석결과 94번째위치의 aspartic acid (D) 가 glycine (G) 으로치환된것이관찰되었다. 이균의항균제감수성검사결과는 CFX, LMX에대한 MIC는 0~256 μg/ ml, LFX는 0.5~64 μg/ml, MFX는 0~8 μg/ml 로새로운세대의 FQ 일수록효과가좋은것으로나타났다. 그리고 AMK, CLA, COL, RMP에대한 MIC 농도는각 0.5, 0.5~1, 32, 8~16 μg/ml 으로서 quinolone resistance-determining regions (QRDR) 의유전자변이와는연관성이없는것으로관찰되었다 (Table 1). CFX 내성 M. smegmatis 에대한 methylene blue와레이저의 PDT 효과인위적으로만든 CFX 내성 M. smegmatis 에 MB 농도 0, 5, 30 μg/ml에서레이저를 0, 3.6, 18, 54 J/cm 2 (0, 12, 60, 180초 ) 되게조사하였더니 MB 5 μg/ml에서는생존율이각각 61.8, 31.0, 4.3%, 30 μg/ml에서는 58.8, 18.7, 2.2% 로 MB 농도와관계없이두조건모두에서비슷한생존율을 나타내었고, 54 J/cm 2 에서는생존율이급격하게떨어지는것이관찰되었다 (Fig. 3). DISCUSSION MB는핵산과같이음전하를띠는세포구조물에염색이잘되기때문에세포나세균의염색에많이사용되어왔지만최근에는 PDT의광감각제로이용되어일반세균뿐만아니라진균, 칸디다, 아메바, 바이러스등과같은다양한종류의병원체를사멸시키는데사용되고있다. 그리고암세포나프리온과같은단백질도불활성화시키는데관여하고있으며, 그외뇌, 피부, 위, 간암등의치료에도 PDT를도입하기위한연구가한창진행중이다 (4~ 12). 결핵의경우는좋은약제들이있어완치가될수있는질병이지만, 많은양의약을복용해야하고, 6개월이상의복약기간이필요하므로치료가실패하는경우가많으며, 그로인해내성균이생길수있다. 일단내성균이생기게되면약제의선택이어려워지며, 최근에는 FQ를사용하기도하지만그역시내성균이생기게되어치료의어려움이있고심지어는치료를포기해야하는상황이오

32 I Shim, et al. Strains AA change Table 1. Characteristics of CFX resistant Mycobacterium smegmatis. Minimal inhibitory concentration of: gyra gyrb CFX LMX LFX MFX AMK CLA COL RMP WT None None 0 0.5 0 0 0.5 0.5 32 8 Ms1 None None 0.5 1 0.5 0 0.5 1 32 8 Ms5 None None 2 4 0.5 0 0.5 1 32 16 M1 None None 4 4 0.5 0 0.5 1 32 16 M2 None None 32 16 2 1 0.5 1 32 16 M4 None None 32 32 4 2 0.5 1 32 16 M8 None None 128 128 32 4 0.5 1 32 16 M16 D94G None 256 256 32 4 0.5 1 32 16 M32 D94G None 256 256 32 4 0.5 1 32 16 M64 D94G None 256 256 64 8 0.5 1 32 16 M128 D94G None 256 256 64 8 0.5 1 32 16 Abbreviations: CFX, ciprofloxacin; LFX, levofloxacin; LMX, lomefloxacin; MFX, moxifloxacin; AMK, amikacin; CLA, clarithromycin; COL, colistin; RMP, rifampin; AA, amino acid 기도한다. 본실험에서는이러한약물치료의어려움을극복하기위하여내시경을통한국소적인광역동치료법을개발함으로써통상의항균제로는치료가어려운결핵의새로운치료방법을찾고자하였다. 먼저 MB 자체가사람의세포에어떠한영향을주는지알아보기위하여사람의폐세포주인 A549 세포를사용하여, MB 농도 0, 0.01, 0.05, 0.1, 1, 5, 10 μg/ml 로, 30분, 4시간, 18시간, 24시간반응시켜세포생존율을보았더니 5 μg/ml 까지는생존율에거의영향을미치지않았지만그보다높은농도에서는생존율이급격하게떨어졌다 (data not shown). 그리고세포에 MB를작용시키고난뒤레이저를조사하였더니 5 μg/ ml에서는조사시간에비례해서생존율이감소하였으며, 30 μg/ml 에서는레이저를조사한초기부터급격히생존율이떨어지는것이관찰되었다 (Fig. 1). Sturmey 등 (22) 은 adenocarcinoma cell line OE33을사용하여 15 mm MB( 약 5 mg/ml) 에빛을 5분동안조사한경우가조사하지않은경우보다 30% 이상높은 DNA 손상이있었다고하였으며, 0.015 mm (5 μg/ml) 인경우는대조군과거의비슷한수준이었고, 0.15 mm (50 μg/ml), 1.5 mm (500 μg/ml) 의경우에는각각비례해서 DNA 손상정도가높았다. 이는본실험에서 MB 5 μg/ml 까지는세포의생존율에큰영향을미치지않았고, 그이상의농도에서는생존율이급격히 떨어진다는결과와유사하였다. 그리고 Davies 등 (23) 은 CaCo-2 adenocarcinoma cells에 0.1% (1 mg/ml) indigo carmine 또는 0.1% (1 mg/ml) MB를적용하고, 백열등을조사하지않거나, 2분동안백열등을조사하여 DNA 손상정도를비교하였더니 0.1% MB를적용하고백열등을조사한경우에만다른그룹에비해 DNA의손상이현저하게증가된것이관찰되었다고하였다. 이실험은 1 mg/ ml의고농도의 MB를작용시켰지만다양한파장을가진단순백열등을사용한점과세포의생존율보다 DNA 손상을관찰한점이본실험의방법과는다르지만 MB와빛에너지가같이작용할때는세포의 DNA에심각한손상을가져오며그로인해세포의사멸가능성이있다는점에서는유사한결과라고할수있다. M. smegmatis 에대한 MB의효과는세포주와는달리 50 μg/ml 까지는균의감소가거의없었으며, 그이상의농도에서는급격히생존율이떨어지는것이관찰되었다. MB 와레이저를같이작용시켰을때는 MB 5 μg/ml 에서는대조균과비슷한사멸률을보였고, 30 μg/ml 일때 18 J(60 초 ) 까지는급격한사멸이이루어졌으며, 그뒤완만하게사멸이이루어지다 54 J 이상에서는생존율이거의최저점에이르렀다. Feese 등 (6) 은 M. smegmatis 를대상으로 MB 를비롯한다양한광감각제를시험하였는데광원은백열

Photodynamic Therapy on Mycobacterium smegmatis 33 등 (400~700 nm) 으로에너지는 3.6, 18, 54, 108 J/cm 2 였고, MB의농도는 100 nm, 150 nm, 750 nm, 7.5 μm, 75 μm이었다. 실험결과 MB 7.5 μm( 약 2.5 μg/ml) 의경우는 54 J에서급격한사멸곡선을나타냈으며, 75 μm( 약 25 μg/ml) 인경우는초기부터급격한사멸률을보이다가 54 J에이르러서는거의다사멸한것으로나타났다. 이러한결과는본실험과사용한 MB의농도는비슷하지만 (2.5, 25와 5, 30 μg/ml) 에너지의세기에있어서 Feese 등 (6) 은 60 mw/cm 2 로긴시간을사용한반면본실험에서는 300 mw/cm 2 로짧은시간조사하여순간적인에너지양의차이에의해사멸곡선의기울기의차이는있었으나두실험모두 54 J에서는거의최저점으로떨어져유의성이있는결과라고할수있다. 그리고 Shih 등 (24) 은 M. fortutitum 을이용하여실험하였는데빛이없는경우에는 MB의농도 (1~100 μg/ml) 와관계없이아무런영향이없었으며, MB 1 μg/ml 에 100 J/cm 2 도효과가없었고, 10 μg/ml, 100 J/cm 2 에서는 2 또는그이상의 log CFU의감소가있었으며, 100 μg/ml, 100 J/cm 2 에서는모두사멸한것으로관찰되었다고하였다. 따라서본실험과, Feese 등 (6), Shih 등 (24) 의결과를종합해보면 mycobacteria 의경우 MB 25 μg/ ml 이상의농도에서 100 J/cm 2 정도의에너지를주게되면균수가현저히감소하거나, 거의모든균이사멸되는것으로관찰되었다. 결핵의경우에는치료약이한정되어있기때문에내성이생기면다른대체항균제를선택하기가어렵다. 따라서본실험에서는이러한항균제내성결핵균 (MDR- 또는 XDR-TB) 을제거하기위한방법으로다른항균제를선택하는대신 PDT의효능을알아보기위해동일한방법을적용시켜보았다. 그래서비교적최근에개발되어결핵치료제로사용하고있는 FQs 약제중하나인 CFX에대한내성균을만들었고, 만들어진내성균의염기서열분석과다른항균제에대한감수성을조사하였더니 Table 1과같았다. CFX 256 μg/ml 이상의높은내성을나타내는균들은 GyrA 단백질 94번위치의 aspartic acid가 glycine으로의아미노산치환이있었고, GyrB 단백질에서는아미노산치환이관찰되지않았다. 이는 Sirgel 등 (25) 은 M. tuberculosis 에서, Yokoyama 등 (26) 은 Mycobacterium leprae 의내성균을분석한결과 GyrA 단백질 94번 ( 또는 95번 ) 위치의아미노산치환이아주높은빈도로일어나며, FQ 에대한높은내성에도관여하는것으로보고한것과같은결과라고생각한다. 그리고 MIC 2~128 μg/ml 까지의 균들에서는유전자변이가관찰되지않았는데이는본실험에서사용한 primer 들이일반적으로 M. tuberculosis 의 QRDR로알려져있는 gyra의 codon 74-113, gyrb 의 codon 500-538 를포함하는 gyra의 codon 37-142, gyrb의 codon 488-562 부분이었지만 Devasia 등 (16) 이보고한것처럼일반적으로알려져있는 QRDR 부위이외에서도돌연변이가발생하고내성을가질수있다하여앞으로본실험에서검색했던부위보다더넓은부위에서유전자변이를찾아봐야할것으로생각한다. 인위적으로만든 CFX 내성 M. smegmatis 중내성도가높은균을사용하여 PDT를적용하였더니 MB 5, 30 μg/ml에서모두 18 J까지는생존율이각각 31, 17% 로급격한사멸률을나타내었고, 그뒤완만한사멸률을나타내다가 54 J 이상에서는생존율이거의최저점에이르렀다. 비내성 M. smegmatis 와 CFX 고도내성 M. smegmatis 의생존율을비교해보면 MB 5 μg/ml, 3.6 J일때 95, 61%, 30 μg/ml 일때 83, 59% 였고, 18 J일때 MB 5 μg/ml 이면 82, 31%, 30 μg/ml 이면 27, 17% 로내성균이비내성균보다더민감하게반응하는것이관찰되었고, 이러한결과는 Sung 등 (27) 이 M. tuberculosis 에광감각제로 radachlorin 을사용해서레이저를조사했을때비활성화비율이비내성균은 10 3.7~4.3 CFU인반면 MDR-TB 인경우 10 3.1 CFU로관찰된것과같이유전자상의돌연변이가 PDT에더민감하게반응하는것을알수있었다. 따라서 MB 매개광역동치료법은비내성균보다는 MDR-TB 균들에대해서더사멸효과가있을것으로생각하며, 본교실에서제작한 moxifloxacin 내성 M. smegmatis 를이용하여동일한현상이나타나는지다시한번확인해볼예정이다. 그리고 Shih 등 (24) 은 MB 50 μg/ml 와 CFX 또는 MFX, AMK 등의항균제를함께섞어 100 J/cm 2 의에너지를줬을때에항균제단독으로사용했을때보다 2배이상의상승효과가나타난다고하였고, Daniela 등 (4) 은 potassium iodide (KI) 를 MB와함께사용하면상승효과가나타난다고하여, 세포에대해손상이적으면서비내성균과내성균모두에서좀더효과를높일수있는방법으로적용될수있는지연구해볼가치가있다고생각한다. REFERENCES 1) Dougherty TJ. Photodynamic therapy. Photochem Photobiol 1993;58:895-900.

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