대한한방내과학회지제 34 권 1 호 (2013 년 3 월 ) Korean J. Orient. Int. Med. 2013:34(1)1-13 調胃升淸湯추출액이비만유도쥐의지질대사, 항산화계및염증반응계에미치는영향 오성원, 김병우상지대학교부속한방병원내과학교실 Effects of Jowiseungcheung-tang Extract on the Lipid Metabolism, Anti-oxidation and Inflammatory Reflex High Fat Diet Obese Rats Sung-won Oh, Byoung-woo Kim Dept. of Internal Medicine, Oriental Medical college, Sang-Ji University ABSTRACT Objectives : The purpose of this study was to investigate the effects of Jowiseungcheung-tang (JWSCT) extract on the lipid metabolism, anti-oxidation and inflammatory reflex. Methods : Male Sprague-Dawley rats were fed a high fat diet for 8 weeks and were randomly divided into 4 groups (10 mice in each group): control group, 100 mg/kg JWSCT group, 200 mg/kg JWSCT group, 300 mg/kg JWSCT group. The control group was administered 100 mg/kg of water, but the other three groups were administered 100, 200, 300 mg/kg JWSCT extract for 4 weeks. After 4 weeks, we measured lipid level, thiobarbituric acid reactive substance (TBARS), glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and cytokines in plasma and liver. The gene expression level and the ratio of apo-b and apo-e were then investigated by way of reverse transcription -polymerase chain reaction (RT-PCR). Results : In the JWSCT group, compared with the control, free fatty acid, triglyceride, total cholesterol, LDL-cholesterol, TBARS, IL-1β, IL-6 and TNF-α decreased significantly in plasma and liver. However HDL-cholesterol, IL-10, GSH-Px, SOD and CAT increased. In the JWSCT group, compared with the control, the gene expression level and the ratio of apo-a and apo-e decreased significantly in the RT-PCR analysis. Conclusions : The extract of JWSCT has anti-obesity, anti-inflammatory and anti-oxidant effects. Key words : Jowiseungcheung-tang ( ), lipid metabolism, anti-oxidation, inflammatory, anti-obesity Ⅰ. 緖論 비만은지질대사장애로인하여지방조직이체내에과잉으로축적된상태를말한다. 최근의연구 교신저자 : 오성원강원도원주시우산동상지대학교부속한방병원내과학교실 TEL: 010-3914-3487 E-mail: fouth1@hanmail.net 이논문은 2011 년도상지대학교대학원한의학박사학위논문임. 에서지방조직이내분비계에관여할뿐만아니라 cytokines 분비에영향을주어각종염증반응을일으킨다는것이밝혀졌다 1-2. 또한지방조직은간장의지방산합성, 분해및출납에영향을주는데, 지방조직이과잉으로축적된경우에는간장의지방산출납기능에이상을일으켜간장질환을야기하고, 혈중지질농도의비정상적인증가및지질과산화물의과잉생산으로순환계질환및암을유발한 1
調胃升淸湯추출액이비만유도쥐의지질대사, 항산화계및염증반응계에미치는영향 다 3. 이처럼비만은각종질환의원인이되므로예방및치료차원에서비만을개선해야할필요성이한층더높아졌다. 한의학에서는비만을 肥, 肥人, 肥貴人, 肥白人, 肥胖 이라고표현하고있는데, 素問 通評虛實論篇 에 肥貴人則膏粱之疾也 라하여기름진음식의과다섭취를비만의원인으로제시하였다 4. 朱震亨은 丹溪心法 에서 肥白人必多痰 이라하여肥人은脾虛하여痰飮이많으므로비만에서濕痰제거가중요하다고강조하였다 5. 또한 東醫寶鑑 肉 肉主肥瘦 에서 血實氣虛則肥, 東醫寶鑑 用藥 肥瘦用藥 에서 肥人, 氣虛多痰, 宜豁痰補氣 라하여비만의병기와치료법을제시하였다 6. 이에근거하여현재다양한처방들이비만치료에사용되고있는데, 서등 7 은太陰調胃湯의체중감소효과에대한임상연구결과를보고했으며, 박등 8 은導痰湯의비만치료효과를피력했고, 박등 9 은임상에서많이사용되는體減薏苡仁湯의고지혈증관련인자개선효과를입증하였다. 최근麻黃 10, 薏苡仁 11, 蒼朮 12 등의단미가비만에미치는영향에대한연구도활발히이루어지고있다. 調胃升淸湯은 東醫壽世保元 에수록된처방인데脈緩胸悶, 下肢沈重, 易疲勞, 多眠, 短氣, 食滯, 食後肥滿腿脚無力한태음인의胃脘受寒表寒病證을치료하는처방으로비만치료에효과가입증된太陰調胃湯 13-15 에蘿葍子의양을줄이고, 遠志, 天門冬, 酸棗仁, 龍眼肉등의養心安神, 潤肺藥을가미한것이다. 따라서調胃升淸湯은太陰調胃湯과더불어비만치료에유용한처방임에도불구하고현재調胃升淸湯에관한발표된논문이소수에그치고있어보다자세한기전연구가필요한실정이다. 따라서본연구에서는비만의예방및효과적인치료법을개발하기위한기초연구로고지방식이로비만을유도한흰쥐에게調胃升淸湯추출물을투여한후지질강하효과, 항산화및생체면역체계와관련되는각종생물학적수치를검토하여유의한결과를얻어보고하는바이다. Ⅱ. 材料및方法 1. 실험동물, 실험군및비만유도평균체중이 187.31±4.85 g의 6주령 Sprague-Dawley 계 rat 수컷 50마리를고지방식이 (Table 1) 를 8주간급여한후, 체중이 400 g 이상인 40마리를선발하여, 평균체중이유사하게대조군 ( 생리식염수 100 mg/kg), 처리 1군 ( 調胃升淸湯추출액 100 mg/kg, 이하 100 mg/kg JWSCT), 처리 2군 ( 調胃升淸湯추출액 200 mg/kg, 이하 200 mg/kg JWSCT) 및처리 3군 ( 調胃升淸湯추출액 300 mg/kg, 이하 300 mg/kg JWSCT) 으로나누어각처리군당 10마리씩임의배치하였다. 2. 식이급여식이급여는시험기간 4주동안전처리군동일하게기본식이 (Table 1) 를급여하였으며, 급여량은각처리군간에섭취량의차이가 5% 이내가되도록균등급여하였다. 물은자유급여하였다. Table 1. Composition of Experimental Diets. Ingredients (%) Basal diet High fat diet Casein 20.0 20.0 α- Corn starch 35.5 30.0 Sucrose 11.0 10.0 Lard 4.0 25.0 Corn oil 1.0 5.0 Mineral mix* 3.5 3.5 Vitamin mix 1.0 1.0 Cellulose powder 23.7 5.2 DL-methione 0.3 0.3 *Mineral mix. (g/ kg diet) : CaCO 3, 29.29; CaHPO 4 2H 2O, 0.43; KH 2PO 4, 34.30; NaCl, 25.06; MgSO 4 7H 2O, 9.98; Feric citrate hexahydrate, 0.623; CuSO 4 5H 2O, 0.516; MnSO 4 H 2O, 0.121; ZnCl 2, 0.02; KI, 0.005; (NH 4) 6 MO 7O 24 4H 2O, 0.0025. Vitamin mix. (mg/kg diet) : Thiamine-HCl, 12; Riboflavin, 40; Pyridoxin-HCl, 8; Vitamin-B12, 0.005; Ascorbic acid, 300; D-biotin, 0.2; Menadione, 52; Folic acid, 2; D-calcium pantothenate, 50; P-aminobenzoic acid, 50; Nicotinic acid, 60; Cholin choloride, 2000 (IU/ kg diet); Rethinyl acetate, 5000 (IU/ kg diet); Cholecalciferol, 250 (IU/kg diet). 2
오성원 김병우 3. 調胃升淸湯추출액및투여상지대학교부속한방병원약제과에서엄선한약재로구성된調胃升淸湯 500 g( 건조중량 ) 을수조상에서냉각수환류하에 5시간씩 3회추출하고여과, 감압농축하여에탄올추출물 102.95 g을만들었다. 투여는처리군별정량을매일오후 5시경에 needle zonde 를이용하여경구투여하였으며, 1첩분량은다음과같다 (Table 2). Table 2. Prescription of Jowiseungcheung-tang. Herbal name Crude drugs name Dose (g) 薏苡仁 Coicis Semen 12.0 乾栗 Castaneae Semen 12.0 蘿葍子 Raphani Semen 6.0 麻黃 Ephedrae Herba 4.0 桔梗 Platycodi Radix 4.0 麥門冬 Liriopis Tuber 4.0 五味子 Schizandrae Fructus 4.0 石菖蒲 Acori Graminei Rhizoma 4.0 遠志 Polygalae Radix 4.0 天門冬 Asparagi Radix 4.0 酸棗仁炒 Zizyphi spinosae Semen 4.0 龍眼肉 Longanae Arillus 4.0 Total amount 66.0 4. 채혈및간장적출채혈은실험종료일에 12시간절식을시킨후, 심장천자법에의해약 7 ml를하였으며, 채취한혈액을분석항목별로나누어각각의시료로사용하였다. 간장은채혈을마친후, 적출하여각각의분석항목별처리방법에따라처리한후, -80 에냉동보관하였다. 5. 생화학적분석 1) 혈장및간장내지질혈장내 total cholesterol, triglyceride(tg), low density lipoprotein cholesterol(ldl-cholesterol) 및 high density lipoprotein cholesterol(hdl-cholesterol) 농도는혈액자동분석기 (Boehringer Manheim, Germany) 에의해분석하였다. 혈장 free fatty acid(ffa) 함량은 V-NEFA kit( 日水제약, Japan) 를이용한효소법에의해측정하였다. 간장내 total cholesterol 및 TG량은정량용 kit(wako Co., Japan) 를이용하여분석하였다. 2) 혈장내 thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) 혈장내 TBARS량은혈장을분리하여, 37 에서 120분간배양후 Buge와 Aust의방법에의해정량하였다. 3) 간장내 thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) 간장내 TBARS량은 1~2 g 정도의간장절편을 0.9% 생리식염수로세척하여혈액을제거하고, 1.15% KCl 수용액과혼합한후, homogenizer로충분히마쇄하여 10% homogenate 를만들었다. 이중 0.1 ml의 homo -genate를취하여 screw cap tube에넣고 8.0% sodium dodecyl sulfate 0.2 ml와 20% acetic acid solution(ph 3.5) 1.5 ml 그리고 0.8% thiobarbituric acid(tba) solution 1.5 ml를첨가하였다. 총 4 ml가되도록증류수를넣은다음진탕하여 95 water bath에넣고 1시간동안가열하였다. 가열한시험관을흐르는수돗물에서냉각시킨후, 증류수 1 ml 와 n-butanol : pyridine (15:1, v/v) 혼합용액 5 ml를가하고 voltex 하였다. 1,500 g 에서 10분간원심분리한후상층액 (n-butanol : pyridine 층 ) 을채취하여 532 nm에서흡광도를측정하였다. 표준물질로는 TMP(1,1,3,3- tetramethoxypropane) 를사용하였고, lipid peroxide 수준은 nm MDA (malondialdehyde) 로표시하였다. 4) 간장내 glutathione peroxidase(gsh-px) 간장내 GSH-Px 활성은 Levander 의방법에준해분석하였다. 일정량의간장절편을생리식염수로세척하여혈액을제거시킨후, 0.15M KCl 수용액과함께 homogenizer 로 20% homogenate 가되도록마쇄하여 9,000 g 에서 15분간원심분리하였다. 이상층액을다시 15,000 g에서 1시간동안원심분리 3
調胃升淸湯추출액이비만유도쥐의지질대사, 항산화계및염증반응계에미치는영향 한후, 상층액을단백질의함량이 100~200 μg이되도록취하여분석에사용하였다. 원심분리시의온도는 4 를유지하였으며, 조제한시료를 stock solution(k buffer, 40 mm glutathione, KH buffer, ml당 1unit의 glutathione reductase) 에넣어 37 에서 10분간항온시킨후, 20 mm NADPH 를첨가하여다시 2분동안방치시켰다. 그리고 15 mm t-butyl hydroperoxide를가하여그반응을 340 nm 에서 1분간흡광도가감소하는속도를측정하였다. GSH-Px 활성도의 unit는 mg protein 당 1분동안 NADPH 가 NADH 로산화되는 nm수로나타내었다. 5) 간장내 superoxide dismutase(sod) 간장내 SOD 측정은 xanthine oxidase에의해 superoxide 를생성하고, 이 superoxide 가 ferricytochrome C(Fe 3+ ) 를 ferrouscytochrome C(Fe 2+ ) 로환원시키는데이때 SOD가존재하면 SOD가 superoxide 에대해경쟁하여 cytochrome C의환원속도가감소되는원리를이용한 Flohe 의방법으로측정했다. 본실험에서는 ferricytochrome C의환원이방해되는정도를 550nm에서 30초간격으로 3분간비색정량한후 ferricytochrome C의환원을 50% 방해하는 SOD의양을 1unit로하여분당활성정도를나타내었다. 6) 간장내 catalase(cat) 간장내 CAT 활성을측정하기위하여간장 0.2 g을 20배의 25 mm KH 2PO 4-NaOH buffer(ph 7.0) 에넣어균질화시키고이 homogenate 를같은 buffer 로 60배희석한후 ice bath 상태에서 ultrasonicator 로 15초씩 2회반복해서분쇄하여, 이시료를 spectrophotometer(550 nm) 에서흡광도를측정한후 formaldehyde 를표준용액으로하여얻은표준곡선으로부터활성을계산하였다. 7) 혈장및간장내 cytokines 혈장내 cytokines 정량용시료는채혈직후, 혈장을분리하여 -80 에냉동보관하였다. 간장내 cytokines 정량용시료는 1 g의간장을채취하여 5 ml의 cold phosphate buffered saline(pbs, ph 7.4, containing a protease inhibitors cocktail) 과함께혼합하여얼음위에서분쇄하였다. 분쇄혼합물을 4, 15,000 rpm, 15분간원심분리한후, 상층부를 0.45 μm 필터로여과하고, 다시원심분리해서상층부를 -80 에냉동보관했다. cytokines(il-1β, TNF-α, IL-6 및 IL-10) 정량은시판 kit(biosource International, USA) 를이용했다. TNF-α 의최저측정농도는 0.7 pg/ml이며, 다른 cytokines 들은 3~8 pg/ml이다. 간장내 cytokines 량은 5 ml의 PBS에생간장 1 g을혼합한조정액으로측정하였으며, pg/mg 단위로나타내었다. 8) 혈장내 aspartate aminotransferase(ast), alanine aminotransferase(alt) 혈장내 AST, ALT 는혈액자동분석기 (Boehringer Manheim, Germany) 로측정하였다. 9) RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction) 분석 TRI reagent(sigma alderich Co., USA) 를이용하여분화된간장세포의 total RNA를추출하였다. cdna합성은 M-MLV Reverse transcriptase kit (Promega, USA) 를사용하여 5 mg/ml total RNA 로하였다. 합성된 cdna는각각의 mouse TNF-α, apo-b, apo-e, leptin 및 β-actin genes의 primer (Table 3) 를이용하여 PCR을수행하였다. PCR의 reaction mixture는 3 μl 10 Ex-Taq buffer, 2.5 μl dntp mixture(2.5 mm each), 0.5 μl Ex-Taq polymerase(5 units/μl, TaKaRa), 2 μl forward 및 reverse primers( 각각 100 pm/μl), 1 μl cdna template 및 21 μl의증류수를혼합한 30 μl이며, PCR 반응은 94 에서 5분, 94 에서 30초간 denaturation 35 cycles, 57~60 에서 30초간 annealing, 72 에서 45초간 extension, 마지막으로 72 에서 10분간 extension 을실시했다. PCR products는 1.5% agarose gel(0.1 mg/ml ethidium bromide) 을이용하여전기영동을하였으며, size marker로 Gene Ruler DNA ladder mix.(fermentas, #SM0333) 를사용하였다. 4
오성원 김병우 Table 3. The Primers Used in RT-PCR and the Estimated Size of the Amplified Fragments. RNA Primer sequences (5 to 3 ) 5 -AGA AAG AGA ACA AAG Apolipoprotein B: CAG AGA TTG TGG-3 170bp 5 -CAT GCT CCA TTC TCA CAT GTT TA-3 Apolipoprotein E: 300bp β-actin: 348bp 5 -GTG GGC AAA CCT AAT GGA GA-3 5 -GCT GAA GCT GTG TGG AAT CA-3 5 -TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA-3 5 -TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3 6. 통계처리실험결과는 SPSS 통계프로그램 (version:12.0k ; SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) 을이용하여 one-way ANOVA 검정을수행하였으며, 각처리군간의유의성검정은 Duncan's multiple range test 에의해 p<0.05 수준에서실시했다. Ⅲ. 結果 1. 혈장내 free fatty acid(ffa) 및 triglyceride (TG) 농도 FFA 및 TG농도는調胃升淸湯추출액투여군이 대조군보다낮은경향을보였으며, 調胃升淸湯추출액투여량이증가함에따라하락하는경향을보였다. 그러나 FFA농도는調胃升淸湯 300 mg/kg 투여군만이대조군과유의한차이를나타내었으며, TG농도는調胃升淸湯추출액 200 및 300 mg/kg 투여군에서대조군과유의한차이를나타내었다 (Table 4). Table 4. Effects of Jowiseungcheung-tang Extract on Plasma FFA and Triglyceride Concentration in Rat Fed High Fat Diet. Treatment FFA (ueql) Triglyceride (mg/dl) Control (Saline 100 mg/kg) 981.47±36.19b 341.27±33.21 b 100 mg/kg JWSCT* 952.15±37.28 b 307.58±28.45 b 200 mg/kg JWSCT* 937.69±32.58 ab 249.15±31.74 a 300 mg/kg JWSCT* 855.94±41.53 a 251.38±27.85 a a,b : Means in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05). 2. 혈장내 cholesterol 농도 Total cholesterol 및 LDL-cholesterol 농도는調胃升淸湯추출액투여군이대조군보다낮은경향을보였으며, 調胃升淸湯추출액투여량이증가함에따라하락했다. HDL-cholesterol 농도는調胃升淸湯추출액투여군이대조군보다높은경향을나타내었다 (Table 5). Table 5. Effects of Jowiseungcheung-tang Extract on Plasma Total Cholesterol, HDL-cholesterol and LDL-cholesterol Concentration in Rat Fed High Fat Diet. Treatment Total Cholesterol (mg/dl) HDL-cholesterol (mg/dl) LDL-cholesterol (mg/dl) Control (Saline 100 mg/kg) 292.57±21.55 b 19.53±3.12 a 33.79±3.13 b 100 mg/kg JWSCT* 253.92±27.98 ab 21.77±3.83 a 32.05±4.27 b 200 mg/kg JWSCT* 206.38±31.21 a 32.53±3.69 b 27.11±3.91 ab 300 mg/kg JWSCT* 188.57±27.19 a 29.57±2.61 b 24.18±3.83 a a,b : Means in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05). 5
調胃升淸湯추출액이비만유도쥐의지질대사, 항산화계및염증반응계에미치는영향 3. 간장내 total cholesterol 및 TG 농도간장내 total cholesterol 및 TG 농도는調胃升淸湯추출액투여군들이대조군보다낮은경향이었으며, 調胃升淸湯추출액투여량이증가함에따라하락했다 (Table 6). Table 6. Effects of Jowiseungcheung-tang Extract on Liver Total Cholesterol and Triglyceride Concentration in Rat Fed High Fat Diet. Treatment Total Cholesterol (mg/g) Triglyceride (mg/g) Control (Saline 100 mg/kg) 19.11±1.38 c 23.72±2.38 c 100 mg/kg JWSCT* 18.37±1.75 bc 18.51±1.95 b 200 mg/kg JWSCT* 15.13±1.52 ab 14.87±1.81 a 300 mg/kg JWSCT* 13.66±1.59 a 14.29±1.75 a a,b,c : Means in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05). 4. 혈장및간장내 TBARS 농도혈장 TBARS 농도는調胃升淸湯추출액투여군모두가대조군보다유의하게낮은값을나타내었다. 간장내 TBARS 농도는調胃升淸湯추출액투 여군모두가대조군보다낮은경향을보였으나, 調胃升淸湯추출액 300 mg/kg 투여군만이대조군과유의한차이를나타내었다 (Table 7). Table 7. Effects of Jowiseungcheung-tang Extract on Plasma and Liver TBARS Concentration in Rat Fed High Fat Diet. Treatment Plasma TBARS (nm MDA/ml) Liver TBARS (nm MDA/g) Control (Saline 100 mg/kg) 22.67±2.35 b 15.58±3.17 b 100 mg/kg JWSCT* 15.79±2.11 a 12.39±2.51 ab 200 mg/kg JWSCT* 14.38±2.29 a 12.74±2.11 ab 300 mg/kg JWSCT* 15.31±2.56 a 9.82±1.99 a a,b : Means in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05). 5. 간장내 GSH-Px, SOD 및 CAT 활성치 GSH-Px, SOD 및 CAT의활성치모두가調胃升淸湯추출액투여군들이대조군보다높은경향을나타내었다. 調胃升淸湯투여량이증가함에따라 3개효소활성치모두가증가했다 (Table 8). Table 8. Effects of Jowiseungcheung-tang Extract on Antioxidase Activity in Rat Fed High Fat Diet. Treatment GSH-Px SOD CAT (nmoles/min/mg protein) (unit/mg protein) (μmoles(h 2O 2)/min/mg protein) Control (Saline 100 mg/kg) 134.22±5.84 a 13.72±2.89 a 41.52±4.83 a 100 mg/kg JWSCT* 141.73±5.29 a 15.93±2.55 ab 59.44±5.13 b 200 mg/kg JWSCT* 169.37±7.31 b 17.16±2.97 ab 77.36±3.97 c 300 mg/kg JWSCT* 175.88±5.97 b 20.18±3.11 b 78.58±4.02 c a,b,c : Means in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05). 6. 혈장내 cytokines 농도혈장내 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 농도는調胃升淸湯추출액투여군모두가대조군보다낮은경향을보였으며, 調胃升淸湯추출액투여량이증가함에따라감소하는경향을나타내었다. IL-10 농도 는調胃升淸湯추출액투여군모두가대조군보다높은경향을보였으나, 調胃升淸湯추출액 100 mg/kg 투여군은대조군과유의한차이를나타내지는않았다 (Table 9). 6
오성원 김병우 7. 간장내 cytokines 농도 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 농도는調胃升淸湯투여군모두가대조군보다낮은경향을보였다. 그러나 IL-1β 및 TNF-α 농도는전처리군간에통계적 유의성을나타내지는않았다. IL-10 농도는調胃升淸湯처리군모두가대조군보다높은경향을나타내었으나, 調胃升淸湯 100 mg/kg 처리군은대조군과유의한차이를나타내지는않았다 (Table 10). Table 9. Effects of Jowiseungcheung-tang Extract on Plasma Cytokines Concentration in Rat Fed High Fat Diet. Treatment IL-1β (pg/ml) IL-6 (pg/ml) TNF-α (pg/ml) IL-10 (pg/ml) Control (Saline 100 mg/kg) 37.51±4.38 c 49.84±4.39 b 39.27±3.88 b 14.27±2.07 a 100 mg/kg JWSCT* 33.76±4.51 bc 47.36±4.94 b 34.59±3.74 b 16.84±2.38 ab 200 mg/kg JWSCT* 26.11±3.37 ab 36.53±4.25 a 32.19±3.11 ab 20.15±3.95 b 300 mg/kg JWSCT* 25.95±3.72 a 34.21±5.03 a 27.65±2.93 a 21.87±4.14 b a,b,c : Means in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05). Table 10. Effects of Jowiseungcheung-tang Extract on Liver Cytokines Concentration in Rat Fed High Fat Diet. Treatment IL-1β (pg/mg) IL-6 (pg/mg) TNF-α (pg/mg) IL-10 (pg/mg) Control (Saline 100 mg/kg) 17.59±2.31 NS 5.15±0.88 b 1.83±0.71 NS 1.21±0.27 a 100 mg/kg JWSCT* 15.88±2.74 NS 4.39±0.85 b 1.55±0.69 NS 1.35±0.21 a 200 mg/kg JWSCT* 16.08±2.25 NS 2.21±0.71 a 1.17±0.74 NS 1.86±0.27 b 300 mg/kg JWSCT* 15.17±2.43 NS 2.13±0.69 a 1.21±0.66 NS 1.95±0.22 b a,b : Means in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05). NS : Not significantly different (p>0.05). 8. 혈장내 AST 및 ALT 활성치혈장내 AST 및 ALT의활성치는전처리군간에유의한차이를나타내지않았다 (Table 11). 9. RT-PCR 분석에의한 apo-b 및 apo-e gene expression Apo-B 및 apo-e의 gene expression 모두가調胃升淸湯추출물투여군둘이대조군보다확연하게낮은 expression 을나타내었으며, 調胃升淸湯추출물투여량이증가함에따라 gene expression 의수준은하락했다 (Fig. 1). Table 11. Effects of Jowiseungcheung-tang Extract on Aspartate Aminotransferase (AST) and Alanine Aminotransferase (ALT) Activity in Rat Fed High Fat Diet Treatment AST ALT (Karmen unit) (Karmen unit) Control (Saline 100 mg/kg) 42.31±5.12 NS 28.93±3.11 NS 100 mg/kg JWSCT* 43.29±4.95 NS 29.45±3.72 NS 200 mg/kg JWSCT* 38.17±3.58 NS 27.88±2.54 NS 300 mg/kg JWSCT* 39.73±4.31 NS 28.96±2.96 NS NS : Not significantly different (p>0.05). 7
調胃升淸湯추출액이비만유도쥐의지질대사, 항산화계및염증반응계에미치는영향 Fig. 1. RT-PCR analysis for apo-b and apo-e gene expression. Nor : Normal, Con : Control(Saline 100 mg/kg) 100 : 100 mg/kg concentration of Jowiseungcheung 200 : 200 mg/kg concentration of Jowiseungcheung 300 : 300 mg/kg concentration of Jowiseungcheung 10. β-actin expression에대한 apo-b 및 apo-e gene expression의비율 β-actin expression에대한 apo-b 및 apo-e의 gene expression 비율은調胃升淸湯추출물 200 mg/kg 및 300 mg/kg 투여군이대조군보다유의하게낮은값을나타내었으며, 調胃升淸湯추출물의투여량이증가함에따라감소했다 (Fig. 2, 3). Normal Control 100 200 300 Fig. 2. The ratio of apo-b/β actin in RT-PCR gene expression. a,b,c,d : Means with different superscripts are significantly different (p<0.05). 100 : 100 mg/kg concentration of Jowiseungcheung 200 : 200 mg/kg concentration of Jowiseungcheung 300 : 300 mg/kg concentration of Jowiseungcheung Normal Control 100 200 300 Fig. 3. The ratio of apo-e/β actin in RT-PCR gene expression. a,b,c,d : Means with different superscripts are significantly different (p<0.05). 100 : 100 mg/kg concentration of Jowiseungcheung 200 : 200 mg/kg concentration of Jowiseungcheung 300 : 300 mg/kg concentration of Jowiseungcheung Ⅳ. 考察 최근들어비만환자와노인층인구의증가로인해당뇨병, 고혈압및순환계질환등의성인병과이와관련된여러질환들의발병률이증가하고있다 16. 이러한질환들은대부분이만성질환들로환자본인의고통뿐만아니라사회적문제를야기하기도한다. 따라서비만의예방과조기치료에대한중요성을인식시켜준다. 한의학적으로비만의원인은 內經 에서는과다한음식섭취를들고있으며, 이외에氣虛, 水濕, 痰濁, 瘀血, 사상체질적차이등을그원인으로보고각원인별치료가이루어지고있다. 이중사상체질적으로살펴보면태음인은타체질에비해체격이크고기육이풍부한편으로임상에서볼수있는비만환자중가장많은비율을차지하고있다. 또한태음인은타체질에비해혈액중의 total protein, total cholesterol, triglyceride, phospholipid, LDL-cholesterol 등이유의하게높은것으로보고되고있다 17. 이러한태음인비만을치료하는데太陰調胃湯을 8
오성원 김병우 자주응용하는데, 調胃升淸湯은太陰調胃湯에遠志, 天門冬, 酸棗仁, 龍眼肉등의養心安神, 潤肺藥을가미한처방이다. 즉調胃升淸湯은太陰調胃湯의비만치료효능에스트레스를감소시키는효능과潤肺효능을추가한처방이라고할수있다. 이에관련하여류등 18 은調胃升淸湯의스트레스감소효과를입증하였으며, 한등 19 은調胃升淸湯이위점막의손상을감소시키는효과를보고하였다. 또류등 20 은調胃升淸湯이진통, 진정, 혈압강화효과가있다고보고하여식욕감퇴로발생할수있는복통이나혈압저하등의부작용을줄일수있을것으로예측된다. 이런이유로調胃升淸湯은비만을치료하면서발생하는스트레스, 위점막손상, 복통, 혈압저하등의부작용을함께치료할수있어太陰調胃湯과더불어비만치료에자주응용될수있다고사료된다. 하지만비만에관련되어調胃升淸湯과관련된논문은太陰調胃湯과관련된논문에비해소수에그치고있다. 따라서본연구는비만을유도한쥐에게調胃升淸湯추출액을투여한후, 체내지질대사, 항산화계및면역계에미치는영향을알아보기위하여관련생물학적수치들을처리군간에비교, 검토했다. 그결과는아래와같다. 혈액 FFA 농도, TG 농도, total cholesterol 및 LDL-cholesterol 농도는調胃升淸湯추출물의투여량이증가함에따라감소했다. HDL-cholesterol 농도는調胃升淸湯추출액투여군이대조군보다높은경향을나타냈다 (Table 4, 5). 비만으로인해지방조직이증가하면혈중 FFA, TG, total cholesterol 및 LDL-cholesterol 농도가증가하며, 관상동맥질환과심근경색등의위험을한층더높여준다 21. HDL-cholesterol 은간및소장에서합성되며, 세포내에있는 cholesterol 을회수하여간으로운반한다 22. 따라서 HDL-cholesterol 은관상동맥질환의방어인자로서중요하며, 비만, 고지혈증및당뇨병등의상태에서저하현상이나타나며, 혈장에서 HDL-cholesterol 의감소는말초조 직의콜레스테롤운반능력을감소시켜죽상경화병변을일으키게된다 21. 결과적으로혈액내 FFA, total cholesterol, LDL-cholesterol 및 TG 농도의증가와 HDLcholesterol 농도의하락은당뇨병및순환계질환등의성인병의발병과높은상관관계를가진다 23. 본연구에서調胃升淸湯추출물투여군들에서혈액내 FFA, total cholesterol, LDL-cholesterol 및 TG 농도가하락하고, HDL-cholesterol 농도가대조군보다높은경향을보여調胃升淸湯추출물내의기능성물질들은지질강하효과를가지고있으며, 성인병예방과치료에긍정적으로작용할수있음을시사해준다. 간장내 total cholesterol 및 TG 농도는調胃升淸湯추출액투여군들이대조군보다낮은경향이었으며, 調胃升淸湯추출액투여량이증가함에따라하락했다 (Table 6). 간장은지질의합성과분해가이루어지는곳으로, 식이의종류나간장내의효소활성에영향을줄수있는요인들에의해다소차이를나타낼수있다. 본실험에서식이의종류와섭취량이처리군간에거의동일하였기에調胃升淸湯추출물의기능성물질들이간장내지질의합성이나분해에어떤영향을주었을가능성을시사해준다. TBARS는생체내의지질과산화물의생성정도를나타내는지표로서많이이용되고있다. 지질과산화물은세포에산화적손상을유발하고각종기능장애를일으켜노화와질병의원인이되고있다 24. 본연구에서혈장 TBARS 및간장내 TBARS 농도는調胃升淸湯추출액투여군모두가대조군보다유의하게낮은값을나타내었다 (Table 7). 이와같은결과는調胃升淸湯이체내항산화계에긍정적인영향을줄수있음을입증한다. 체내항산화물질에대한세포내방어기전은항산화효소인 SOD, GSH-Px, CAT 등에의해이루어지며, SOD는 superoxide anion(o - 2 ) 을수소원자 (H + ) 와반응시켜과산화수소 (H 2O 2) 와산소분자 9
調胃升淸湯추출액이비만유도쥐의지질대사, 항산화계및염증반응계에미치는영향 (O 2) 로만드는작용을통해항산화작용을하고 25, GSH-Px는세포와혈중에존재하며과산화수소 (H 2O 2) 와그밖의유리과산화물을제거하는작용을하고, GSH-Px의결핍은지질과산화반응을촉진시킨다 26. CAT는 SOD에의해전환된 H 2O 2 가더강력한유리기를형성할수없도록하는데필요한효소이다. 본연구에서항산화계효소인 GSH-Px, SOD 및 CAT의활성치모두가調胃升淸湯추출액투여군들이대조군보다높은경향을나타내었으며, 調胃升淸湯투여량이증가함에따라 3개효소활성치모두가증가했다 (Table 8). 이러한결과는혈액내과산화물의실험결과와잘부합되며, 調胃升淸湯의기능성물질이항산화계효소의합성혹은활성에직접적인영향을줄가능성을시사한다. Cytokines 는염증에대한자기방어와세포의성장, 분화, 세포의사멸, 혈관형성, 항상성의회복과발달에대한기능을나타낸다 27. 또한지방세포가분비하는 cytokines, 즉 leptin, TNF-α 및 IL-6 등은인슐린저항성과밀접한관련이있으며 28,29, 당뇨병의주요원인이된다는것이밝혀졌다 30,31. 생체내염증반응에서는이들 cytokines들은전염증성 cytokines 들로알려져있다 32. IL-1β는단핵구, 대식세포, B-cell, dendritic cell, endothelial cell, 호중구와간세포에서분비되며, TNF-α, IL-6와함께체내염증반응에서상호연관되어있다. IL-6는단핵구, 섬유아세포, 림프구및교세포에서생성되며, 최근지방조직에서도생성됨이밝혀졌다 33. IL-6는면역기능및대사기능의중요한조절자로 TNF-α 의영향을억제하고, 간및지방조직에작용하여 glucose 및지질대사를조절한다 34. TNF-α는조직의인슐린 receptor 에영향을주어인슐린저항성을일으키며, 간세포의사멸과조직의 pathogenic 상태를유도한다. 따라서 TNF-α 의체내생산을제어하기위한연구가진행되고있다 35. IL-10은 T-cell, B-cell 및단핵구등에의해생 산되며 T 및 B-cell 등에대한다양한활성을나타내는데, 특히 IL-1, IL-6, TNF-α 생산을억제하는항염증성 cytokines 로알려져있다 21. 본연구에서혈장 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 농도는調胃升淸湯추출액투여군모두가대조군보다낮은경향을보였으며, 調胃升淸湯추출액투여량이증가함에따라감소하는경향을나타내었다. 또한 IL-10 농도는調胃升淸湯추출액투여군모두가대조군보다높은경향을보였다 (Table 9). 이와같은결과는調胃升淸湯추출물이생체내전염증성 cytokines 생산을억제하고항염증성 cytokines 를증가시키는기능성물질을내재하고있을가능성을시사해준다. 간장내 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 농도는調胃升淸湯투여군모두가대조군보다낮은경향을보였다. 그러나 IL-1β 및 TNF-α 농도는전처리군간에통계적유의성을나타내지는않았다. IL-10 농도는調胃升淸湯처리군모두가대조군보다높은경향을나타내었다 (Table 10). 간장에서도각종 cytokines 들이합성되어혈류로방출된다. 따라서간장의항상성체계는간장내의 cytokines 합성과방출에직접적으로영향을줄것으로생각된다. 본연구의실험결과에서처리군별결과가확연한차이를나타내지않은것은이러한요인들이작용한것으로생각되며, 미미한차이를나타내었지만調胃升淸湯의기능성물질이간장에서염증반응에긍정적인방향으로 cytokines 의합성에영향을주었음을시사한다. 혈장내 AST와 ALT 의활성치는전처리군간에유의한차이를나타내지않았다 (Table 11). ALT 와 AST는간장세포의파괴가있을경우혈액내수치가증가한다. 따라서調胃升淸湯추출물이투여량에상관없이간장기능에어떤장애를일으키지않았음을시사해준다. RT-PCR 분석에의한 apo-b 및 apo-e 의 gene expression 모두가調胃升淸湯추출물투여군들이대조군보다확연하게낮은 expression 을나타내었 10
오성원 김병우 으며, 調胃升淸湯추출물투여량이증가함에따라 gene expression의수준이하락했다 (Fig. 1). β-actin expression에대한 apo-b 및 apo-e 의 gene expression 비율은調胃升淸湯추출물 200 mg/kg 및 300 mg/kg 투여군이대조군보다유의하게낮은값을나타내었으며, 調胃升淸湯추출물의투여량이증가함에따라감소했다 (Fig. 2, 3). Apo-B 는동맥경화인자인 LDL-cholesterol 의단백질성분으로 cholesterol 의수송과세포내유리등에중요한역할을담당하고 chylomicron 과 LDL의간장내생합성및분비에관여하고관상동맥질환에서높은수치를나타낸다 36. Apo-E 는 VLDL-cholesterol, chylomicron remnants 등의동맥경화성지단백을구성하는아포단백으로동맥경화성지단백의이동과대사에관여하는중요한단백질로알려져있으며 37,38, gene의변이는비정상적인혈중지질의구성과농도에영향을주기때문에성인병의진단지표로이용된다 39. 따라서본연구에서調胃升淸湯투여군들에서 apo-b 및 apo-e 의 gene expression 이대조군보다낮은결과로나타난것은調胃升淸湯기능성물질들이간장내 lipoprotein 합성에긍정적인영향을주었을것으로생각된다. 이상의결과를종합해보면, 調胃升淸湯은지질강하, 항산화및염증반응조절에긍정적으로작용하여, 비만의예방과비만으로인한각종질환들의치료효과가있음을시사한다. Ⅴ. 結論비만을예방하고비만으로인한각종질환들의치료효과를개선하기위하여비만을유도한쥐에게調胃升淸湯추출액을투여한후, 체내지질대사, 항산화계및면역계에미치는영향을검토하여다음과같은결론을얻었다. 1. 혈장과간장내 FFA 농도, triglyceride 농도, total cholesterol 및 LDL-cholesterol 농도는調胃升淸湯추출물의투여량이증가함에따라감소했고혈장내 HDL-cholesterol 농도는調胃升淸湯추출액투여군이대조군보다높은경향을나타냈다. 2. 혈장및간장내 TBARS 농도는調胃升淸湯추출액투여군모두가대조군보다유의하게낮은값을나타냈고, 간장내 GSH-Px, SOD 및 CAT 의활성치모두가調胃升淸湯추출액투여군들이대조군보다높은경향을나타냈다. 3. 혈장과간장내 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 농도는調胃升淸湯추출액투여군모두가대조군보다낮은경향을보였으며, IL-10 농도는調胃升淸湯추출액투여군들이대조군보다높은경향을보였다. 4. Apo-B 및 apo-e의 gene expression 은調胃升淸湯추출물투여군들이대조군보다확연하게낮은 expression 을나타내었으며, 調胃升淸湯추출물투여량이증가함에따라 gene expression 의수준이하락했다. 5. β-actin expression에대한 apo-b 및 apo-e의 gene expression 비율은調胃升淸湯추출물 200 mg/kg 및 300 mg/kg 투여군이대조군보다유의하게낮은값을나타내었으며, 調胃升淸湯추출물의투여량이증가함에따라감소했다. 이상의결과를종합해보면, 調胃升淸湯은지질강하, 항산화및염증반응조절에긍정적으로작용하여, 비만의예방과비만으로인한각종질환들의치료효과가있음을시사한다. 參考文獻 1. 서영성, 이인규, 김대현. Proinflammatory Cytokines and Insulin Resistance in Nonobsese Women with High Body Fat and Low Fat Free Mass. Diabetes and Metabolism J 2007;31(2):136-43. 11
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