(프7).fm

pissn 1229-1153 / eissn 2465-9223 J. Food Hyg. Saf. Vol. 33, No. 4, pp. 280~288 (2018) https://doi.org/10.13103/jfhs.2018.33.4.280 Journal of Food Hygiene and Safety Available online at http://www.foodhygiene.or.kr 두족류의진위판별을위한 Real-time Quantitative PCR 검사법개발및검증 정인영 서용배 1 양지영 2 권기성 3 김군도 * 부경대학교미생물학과, 1 부경대학교해양생명과학연구소, 2 부경대학교식품공학과, 3 식품의약품안전처신종유해물질팀 Development and Validation of Quick and Accurate Cephalopods Grouping System in Fishery Products by Real-time Quantitative PCR Based on Mitochondrial DNA In Young Chung, Yong Bae Seo 1, Ji Young Yang 2, Ki sung Kwon 3, and Gun Do Kim* Department of Microbiology, Pukyong National University, Busan, Korea 1 Institute of Fisheries Science, College of Fisheries Science, Pukyong National University, Busan, Korea 2 Department of Food Science & Technology, Pukyong National University, Busan, Korea 3 New Hazardous Substance Team, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety, Cheongju, Korea (Received May 10, 2018/Revised May 28, 2018/Accepted June 12, 2018) ABSTRACT - In this study, an approach for the analysis of the five cephalopod species (octopus, long-arm octopus, squid, wet-foot octopus, beka squid) consumed in the Republic of Korea is developed. The samples were collected from the Southeast Asian countries Thailand, Indonesia, Vietnam, and China. The SYBR-green-based real-time qpcr method, based on the mitochondrial DNA genome of the five cephalopods was developed and validated. The intergroup variations in the mitochondrial DNA are evident in the bioinformatic analysis of the mitochondrial genomic DNA sequences of the five groups. Some of the highly-conserved and slightly-variated regions are identified in the mitochondrial cytochrome-c-oxidase subunit I (COI) gene, 16s ribosomal RNA (16s rrna) gene, and 12s ribosomal RNA (12s rrna) gene of these groups. To specify each five cephalopod groups, specific primer sets were designed from the COI, 16s rrna and 12s rrna regions. The specific primer sets amplified the DNA using the SYBR-green-based real-time PCR system and 11 commercially secured animal tissues: Octopus vulgaris, Octopus minor, Todarodes pacificus, Dosidicus gigas, Sepia esculenta, Amphioctopus fangsiao, Amphioctopus aegina, Amphioctopus marginatus, Loliolus beka, Loligo edulis, and Loligo chinensis. The results confirmed by a conveient way to calculate relative amplification levels between different samples in that it directly uses the threshold cycles (Ct)-value range generated by the qpcr system from these samples. This genomic DNA-based molecular technique provides a quick, accurate, and reliable method for the taxonomic classification of the animal tissues using the realtime qpcr. Key words : Cephalopods, Mitochondrial DNA, Real-time quantitative PCR, SYBR green 지구온난화등으로인한해양환경변화와연근해수산생물의자원관리부족, FTA 체결국가에서수산물수입등으로국민의식생활에서중요한부분인수산물의수입 *Correspondence to: Prof. Gun-Do Kim, Department of Microbiology, Pukyong National University, Busan 48513, Korea Tel: 82-51-629-5618, Fax: 82-51-629-5619 E-mail: gundokim@pknu.ac.kr In Young Chung and Yong Bae Seo are contributed equally for the work. 이해마다늘어나고있다. 또한국민소득의향상과건강에대한사회전반의관심이높아짐에따른수산물에대한건강식품으로서소비자의선호도가높아지며수산물소비는늘어나는데비해수산물자급률은점차감소하고있다 1). 수입수산물의경우학명이나원산지명칭이부정확하고, 신고된사항과일치하는지알수가없는경우가많고, 수산물의절단이나분쇄가공품의경우에는대부분형태학적방법으로는판단이불가능하다. 일반적으로두족류의분류는형태에근거하여육안으로식별하는방법 280

Identification of Cephalopod Species by Real-time PCR 281 을사용하고있으나정확성이떨어지며특히, 가공처리될경우형태에근거한식별이불가능한경우가자주발생하고있다. 따라서, 원산지판별수산물검사의정확성을높이고처리속도를향상시키며, 가공품의종식별에도가능한객관적종판별방법의확립이요구된다. 다수의두족류중문어, 낙지, 주꾸미등이생물국내어획량감소에따라중국, 남미, 동남아시아로부터수입되고있으며, 생물이아닌절편이나가공식품에대한부정 불량식품사건사례가빈번히나타나고있다. 수산생물의종분류는생물자원관리의기본단위이며, 생태계연구뿐만아니라수산생물종의허위표시및부정혼입방지를위한식품의안전성확보및국민의안전한먹거리를위협하는부정 불량식품근절을위해그중요성이점차커지고있다. 전통적으로종구분을위한분석법은각종이나타내는특이적인단백질및 DNA 다형성을바탕으로한다. 단백질을이용한종판별법은등전점전기영동 (isoelectric focusing, IEF), 모세관전기영동 (capillary electrophoresis, CE), 고속액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatography, HPLC), 그리고항체를이용하는면역분석법 (immunoassay) 을이용한다 2-5). 이처럼단백질을이용한종판별법은열처리및건조같은물리 화학적조성의변화와단백질구조의변화로분석결과의신뢰성이낮아져가공식품에는적합하지못하고, 항체를필요로하는면역학적방법은유사한단백질사이의교차반응에의해영향을받을수있다 4,6). 이와대조적으로핵산기반의분석법은특이적이고민감한방법으로열처리나건조같은가공과정을거친식품에도적용이가능하여신뢰할수있는종구분을위한분석법이될수있다 7-10). 생물종의판별을위하여제한효소단편다형성 (restriction fragment length polymorphism, RFLP) 11,12) 무작위증폭다형 DNA PCR (random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction, RAPD-PCR) 12,13), 유전자증폭산물길이다형성 (amplified fragment length polymorphism, AFLP), 종특이 PCR 프라이머를이용한 PCR 14-16) 및 real-time qpcr 17-19), DNA 염기서열분석등 DNA염기서열을기반으로다양한분석방법이발전되었다 8,20-23). 이러한방법들은종구분을위해 DNA 서열의변이를검출하는정확하고신뢰할수있는기술이다. 특히, real-time qpcr 분석법의경우기존의 PCR 방법보다빠른시간내에높은감도로증폭할수있으며, 기존 PCR의허위양성 (false positive) 를효과적으로줄일수있어신뢰성을높일수있다. 또한, 제한효소반응, 아가로즈겔 DNA전기영동과정등을생략하여결과도출시간을줄일수있고, 한번에많은시료를분석할수있다. 본연구에서는부정 불량식품유통근절을위해형태학적으로판별이어려운두족류의정확한판별기술을확 립하기위해국제생물바코드컨소시엄 (Consortium for the Barcode of Life) 에서제안된종판별바코드영역인미토콘드리아 DNA 염기서열의 cytochrome c oxidase I (COI) 유전자및 16s ribosomal RNA (16s rrna), 12s ribosomal RNA (12s rrna) 유전자의특이유전자영역에서두족류그룹특이프라이머세트를설계하였고, 5개그룹에대한정확한판별이가능한 real-time qpcr 반응조건을확립하고자하였다. 국내수산물시장및마트, 태국과중국등국내및해외에서확보한각두족류그룹생물의조직에서 DNA를추출하였고, PCR (Polymerase Chain Reaction) 을통해 COI 유전자부분과 16s rdna 유전자부분을증폭시켜염기서열분석을통해종을확인한후판별법개발및검증을진행하였다. Materials and Methods 두족류시료선정및전처리실험에사용한문어류 ( 참문어 ; Octopus vulgaris), 낙지류 ( 낙지 ; Octopus minor), 오징어류 ( 살오징어 ; Todarodes pacificus, 아메리카대왕오징어 ; Dosidicus gigas, 갑오징어 ; Sepia esculenta), 주꾸미류 ( 주꾸미 ; Amphioctopus fangsiao, 모래주꾸미 ; Amphioctopus aegina, 하이야주꾸미 ; Amphioctopus marginatus), 꼴뚜기류 ( 참꼴뚜기 ; Loliolus beka, 창꼴뚜기 ; Loligo edulis, 한치꼴뚜기 ; Loligo chinensis) 는 2017년태국, 인도네시아, 베트남, 서울, 부산, 속초등에서확보하였으며, 구입후실험전까지 20 o C에보관하였다. 두족류의원물, 건조등의제품은액체질소와막자사발을이용하여균질하게분쇄한것을분석검체로사용하였다. Genomic DNA 추출 DNA 추출시하나의분석검체로부터적정량을 3회칭량하여동시에 DNA를추출하였고, 추출된각각의 DNA 는적절히희석하거나농축하여 PCR에사용하였다. DNA 는 AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea) 를사용하여제조사의매뉴얼에따라아래와같이추출하였다. 추출된 DNA 용액은바로실험에사용하거나그렇지않은경우 4 o C( 단기보관 ) 이나 20 o C( 장기보관 ) 에보관하였다. 추출된 DNA의농도는 Optizen TM NanoQ (K LAB KISWIRE, Korea) 를이용하여측정하였고, 추출된 genomic DNA의농도를 10 ng/μl로맞추어 real-time qpcr template로사용하였다. 염기서열분석두족류의판별법개발을위한 COI, 16s rrna, 12s rrna 유전자의염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 에등록된

282 In Young Chung, Yong Bae Seo, Ji Young Yang, Ki sung Kwon, and Gun Do Kim 각두족류미토콘드리아전체염기서열로부터확보하였다. 두족류판별을위한후보군으로문어류 (Octopus, Oc) 는참문어 (Octopus vulgaris, O. vulgaris, NC_006353.1) 1종, 낙지류 (Long arm octopus, Lao) 는낙지 (Octopus minor, O. minor, NC_009690.1), 대만주머니낙지 (Cistopus taiwanicus, C. taiwanicus, KF017605) 2종, 오징어류 (Squid, Sq) 는매오징어 (Watasenia scintillans, W. scintillans, AB086202), 살오징어 (Todarodes pacificus, T. pacificus, NC_006354), 아메리카대왕오징어 (Dosidicus gigas, D. gigas, EU068697.1), 호주대왕오징어 (Sepia apama, S. apama, NC_022466), 쇠갑오징어 (Sepiella japonica, S. japonica, NC_017749), 입술무늬갑오징어 (Sepia lycidas, S. lycidas, KJ162574), 참갑오징어 (Sepia esculenta, S. esculenta, NC_009690.1), 파라오갑오징어 (Sepia pharaonis, S. pharaonis, NC_021146) 8 종, 주꾸미류 (Wetfoot octopus, Wo) 는모래주꾸미 (Amphioctopus aegina, A. aegina, NC_029702.1), 주꾸미 (Amphioctopus fangsiao, A. fangsiao, NC_007896.1), 하이야주꾸미 (Amphioctopus marginatus, A. marginatus, unpublished sequence) 3종, 꼴뚜기류 (Beka squid, Bs) 는반원니꼴뚜기 (Loliolus japonica, L. japonica, NC_030208), 인디안꼴뚜기 (Uroteuthis duvauceli, U. duvauceli, NC_027729), 참꼴뚜기 (Loliolus beka, L. beka, NC_028034.1), 창꼴뚜기 (Loligo edulis, L. edulis, AB675081.1), 한치꼴뚜기 (Loligo chinensis, L. chinensis, NC_028189.1), 화살꼴뚜기 (Loligo bleekeri, L. bleekeri, AB029616), 흰꼴뚜기 (Sepioteuthis lessoniana, S. lessoniana, NC_007894) 7종등두족류 21 종을선정하였다. 확보된각두족류의미토콘드리아 DNA 서열중에서보존적인 COI, 16s rrna, 12s rrna유전자염기서열을이용하여유전자서열정렬 (sequence alignment) 를통해두족류를공통적으로증폭할수있는프라이머조합 (Ceph_COI_U_F_1; 5 - tat tyt cha caa ayc ata aag a -3, Ceph_COI_U_R_1, 5 - gtd ggr atd gca ata at tatt gt- 3, Ceph_16s_U_F_2; 5 -ttt aat cca aca tcg agg tcg caa - 3, Ceph_16s_U_R_2, 5 - ggc tag aat gaa tgg ttt gac gaa -3 ) 2쌍을제작하여종확인에사용하였으며, primer 서열중에는 y (c, t), h (a, t, c), d (g, a, t), r (a, g) 의 mixed base code가포함되어있다. PCR 증폭을위한반응액의조성은각시료에서추출한 genomic DNA 1 μl (10 ng/ μl), forward primer 1 μl (10 pmole), reverse primer 1 μl (10 pmole), AccuPower Taq PCR PreMix, distilled water 17 μl를포함하여총 20 μl이며, PCR 반응은 AllInOne- Cycler TM (Bioneer, Korea) 를사용하였다. PCR 조건은 94 o C 에서 7분동안 pre-denaturation 후 94 o C에서 30초간 denaturation, 50 o C에서 30초간 annealing 및 72 o C에서 1분간 extension의조건으로 35 cycle을진행하였고최종적으로 72 o C에서 7분동안 final extension을수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 DNA 염기서열분석서비스 (Macrogen, Korea) 를의뢰하여염기서열분석을진행하였다. 두족류그룹특이프라이머제작두족류 5개그룹에대한특이프라이머제작을위하여 European Molecular Biology Laboratory의 Clustal omega (EMBL, http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo) 를사용하여확보된두족류의미토콘드리아 DNA 서열중에서보존적인두족류의 COI 유전자염기서열, 16s rrna 유전자염기서열, 12s rrna 유전자염기서열을이용하여다중염기서열정렬을하였으며, 두족류의 COI, 16s rrna, 12s rrna 유전자염기서열을분석하였고, 분석된염기서열로부터각두족류그룹사이특이성을나타내는염기서열변이부분을탐색하였다. 그룹특이프라이머는 realtime quantitative PCR을고려하여증폭산물의크기는 120~150 base pair 사이가되도록하였고, 두족류그룹특이프라이머의제작은염기서열변이부위가프라이머의 3 말단에위치하도록제작하였다. Tm 값은 48~62 o C 범위 Table 1. Oligonucleotide primers used in qpcr Group Name Sequences Product size Target gene Octopus Long arm octopus Squid Wetfoot octopus Oc_1 Lao_1 Sq_1 Wo_1 5'- ttc tcc ttt cat ctg cag cag tt -3' 5'- caa gga ttg atg aaa tac ctg cta a -3' 5'- aat yaa tcc ttt cgt act aaa tta aat t -3' 5'- tta agg tgt aga ggc ttt rtt agg -3 5'- acg ggc gat atg tac rcr yta -3' 5'- aar tga gct acd rtt trt awt tt -3' 5'- aga ggw gyt ggt ach gga tg -3' 5'- gct cct ara atw gat gar att cct -3' 150 bp COI 1) 139 bp 16s rrna 2) 127 bp 12s rrna 3) 150 bp COI 5'- tyt tyg gwa ttt gag cag gvt tag -3' Beka squid Bs_1 150 bp COI 5'- aac crt gwg cag twa cta cwa c -3 1) COI : Cytochrome c oxidase subunit 1, 2) 16s rrna: 16s ribosomal RNA, 12s rrna: 12s ribosomal RNA (All oligonucleotide primers were designed using Primer3 and synthesized from Bioneer, ROK) Mixed base code: y (c, t); r (a, g); d (g, a, t); w (a, t); h (a, t, c); v (g, a, c)

Identification of Cephalopod Species by Real-time PCR 283 를가지며 30~70% 의 GC 비율을고려하여 Table 1과같이프라이머세트들을디자인하여올리고합성 (Bioneer, Korea) 을의뢰, 실험에사용하였다. Real-time qpcr 분석 Real-time PCR에사용된프라이머는두족류 5개의각그룹에특이적인각 1쌍을사용하였다 (Table 1). 두족류 5 개의각그룹에각각특이적인프라이머세트의 real-time PCR 효율을확인하기위해문어류의 Oc_1_F/R primer, 낙지류의 Lao_1_F/R primer, 오징어류의 Sq_1_F/R primer, 주꾸미류의 Wo_1_F/R primer, 꼴뚜기의 Bs_1_F/R primer 를이용하여각두족류그룹으로부터증폭된 PCR 산물을 pgem T-easy vector system (Promega, USA) 에클로닝하였고, DH5α competent cell (Takara, Japan) 에형질전환후 ampicillin (50 μg/ml) 첨가된 LB-agar에서 blue/white colony selection을통해단일 colony를선별하였다. 선별된 colony를 ampicillin (50 μg/ml) 첨가된 LB 액체배양액에배양후 AccuPrep Nano-Plus Plasmid DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea) 을이용하여 plasmid DNA를추출하였다. 추출된 plasmid DNA는각두족류그룹의판별을위한 standard curve를확인하기위한 standard plasmid DNA로서각각 10 ng/μl, 1 ng/μl, 100 pg/μl, 10 pg/μl, 1 pg/μl, 100 fg/μl, 10 fg/μl로희석하여 template로사용하였다. real-time PCR 반응액조성은 template DNA 1 μl, forward primer 1 μl (10 pmole), reverse primer 1 μl (10 pmole), 2X GreenStar Master Mix 10 μl, distilled water 7 μl를포함하여총 20 μl로준비하였다. Real-time PCR 기기는 QuantStudio 6 Flex real-time PCR instrument system (ABI, USA) 를사용하였으며, 플레이트를장착하고분석프로그램을작동시켜시료의정보를입력한후반응을개시하였다. 각두족류판별을위한 real-time qpcr 반응조건은 95 o C 에서 5분동안 pre-denaturation 후 95 o C에서 15초간 denaturation, 58 o C에서 15초간 ( 오징어류 Sq; 50 o C/15초간 ) annealing 및 72 o C에서 15초간 extension의조건으로 35회반복하여진행하였다. 각두족류조직에서추출한 genomic DNA를사용하여, 두족류그룹판별을위한 real-time PCR 증폭을위한반응액조성은각각의시료에서추출한 genomic DNA 1 μl (10 ng/μl), forward primer 1 μl (10 pmole), reverse primer 1 μl (10 pmole), 2X GreenStar Master Mix 10 μl, distilled water 7 μl, 총 20 μl로반응액을준비하여 standard curve 를확인하기위한동일한조건에서 real-time PCR을수행하였다. 두족류그룹판별을위한 real-time PCR은각두족류그룹중확보된시료에서추출된 genomic DNA를 template로사용하였고, 각각의시료는 3개씩 real-time PCR 반응을수행하고반응종료후실험결과를해석하였다. Results 두족류 5개그룹특이프라이머두족류그룹판별을위한그룹특이프라이머를디자인하기위하여미국국립보건원에서운영하는유전자은행 (www.ncbi.nlm.nih) 에등록되어있는 COI 유전자, 16s rrna 유전자, 12s rrna 유전자염기서열을이용하였다. 실험대상시료의 COI 유전자, 16s rrna 유전자, 12s rrna 유전자염기서열을각각 3 종류이상선정하여이들의유전적상동성을확인하였으며 (Fig. 1), 이결과로부터 real-time qpcr의적용성을고려하여두족류그룹판별을위한최적의프라이머를선정하였다. 본연구에서 real-time qpcr에사용된 5쌍의두족류그룹특이프라이머는 Table 1에표시되어있으며 ( 결합부위, supplement data), 제작된 5쌍의프라이머는각각의두족류그룹시료에서특이적으로증폭하여두족류그룹판별을할수있다. 두족류 5개그룹의 Quantified Plasmid DNA에서 Real- Time qpcr 결과두족류 5개그룹에서확보한각각의 standard plasmid DNA를 10배수희석하여 template로사용한 real-time qpcr 반응결과로문어류, 낙지류, 오징어류, 주꾸미류, 꼴뚜기류판별을위한각그룹프라이머세트의 standard curves 를확보하였고, Table 2에서나타나는것과각두족류그룹의표준시료의 real-time qpcr 3회반복한결과에서거의유사한 threshold cycle (Ct) 값을나타내며, 각두족류프라이머세트의 standard curves 결과에서기울기 (Slope) 는 3.373 ~ 4.082, 상관계수 (R 2 ) 는 0.998~1, 증폭효율은 75.8~97.9% 의범위를나타내었다 (Table 2). 두족류그룹특이 real-time PCR 특이성검사두족류 13개시료에서추출된 genomic DNA를동일한농도로맞추어 template로사용하고두족류그룹특이프라이머세트 (Oc_1, Lao_1, Sq_1, Wo_1, Bs_1) 를사용하여 real-time qpcr을수행하였다. 두족류 13개시료에서문어류특이프라이머세트를사용하여 real-time qpcr을진행한결과, 참문어의시료에서 Ct값평균이 16.30을나타내며다른시료에서 Ct값의평균은약 29 이상으로분석되었다. 동일한시료조건으로낙지류특이프라이머세트의 real-time qpcr 결과는, 낙지류시료에서 Ct값평균이 17.59, 다른두족류시료의 Ct값은검출되지않거나검출되는경우에도평균 31 이상으로분석되었고, 오징어류특이프라이머세트의 real-time qpcr 결과는, 오징어류시료에서 Ct값평균이 20.08, 다른두족류시료의 Ct값은검출되지않거나검출되는경우에도평균 31 이상으로분석되었으며, 일부주꾸미에서 Ct값이 25.83으로분석되었고, 주꾸미류특이프라이머세트의 real-time qpcr 결과

284 In Young Chung, Yong Bae Seo, Ji Young Yang, Ki sung Kwon, and Gun Do Kim Fig. 1. Evolutionary relationships of COI (A), 16s rrna (B) and 12s rrna(c) mitochondrial genes. The evolutionary history was inferred using the Neighbor-Joining method. The tree is drawn to scale, with branch lengths in the same units as those of the evolutionary distances used to infer the phylogenetic tree. The evolutionary distances were computed using the Poisson correction method and are in the units of the number of amino acid substitutions per site. All positions containing gaps and missing data were eliminated. Evolutionary analyses were conducted in MEGA7 to identify possible phylogenetic cade. 는, 주꾸미류시료에서 Ct값평균이 14.61, 다른두족류시료의 Ct값은평균 31 이상이었으며, 낙지류의 Ct값평균은약 25에서 27사이로분석되었고, 꼴뚜기류특이프라이머세트의 real-time qpcr 결과는, 주꾸미류시료에서 Ct값평균이 19.55, 다른두족류시료의 Ct값은평균 29 이상으로분석되었다. 두족류그룹의시료 genomic DNA 에서각종의그룹특이프라이머세트를사용한경우에 Ct값은 20 이하로나타나고, 반면에그룹특이프라이머세트가아닌경우에 Ct값이평균 30 이상으로 Ct값의차이가 10 이상나타내고있어특이적프라이머를이용하면두족류내의특정그룹을특이적으로분류할수있다. 그러나, 일부주꾸미는오징어류특이프라이머에교차반응을나타내지만 Ct값차이를통해비교적구분이가능하였고, real-time qpcr 결과에서두족류의그룹특이프라이머를사용하였을때유사그룹의증폭곡선은목적그룹의 증폭곡선과명확한차이는나타내고있다 (Table 3). 또한, 각그룹특이프라이머세트에의한 Ct값의분명한차이를나타내고있으므로두족류그룹판별을위한좀더명확한차이를확인할수있으며, 오징어류특이프라이머에비교적약한교차반응을나타내는주꾸미의경우에도특이프라이머세트에의한 Ct값의평균을분석하였을때, 평균 5 cycle 이상의차이를나타내고있으며, 주꾸미류특이프라이머를사용하여검증할수있으므로두족류의그룹구분을명확하게할수있다. 두족류 5 그룹의반응에서비특이프라이머의경우에도 Ct 값이타겟보다는높으나일부반응이일어나고있어서 SYBR을이용한반응에서 melting analysis를수행하였다. 문어특이프라이머의경우다른두족류에서 2개의 peak가나타나고 Tm 값이차이를나타내며, 낙지특이프라이머의경우다른두족류에서 2개의 peak가나타나고 Tm 값이차이를나타내

Identification of Cephalopod Species by Real-time PCR 285 Table 2. Threshold cycle (Ct) values of real-time PCR, quantitatively 3 reacted with standard plasmid DNA of Cephalopod group Group / primer Plasmid equivalents Mean Standard deviation Standard curve Octopus / Oc_1 Long arm octopus / Lao_1 Squid / Sq_1 Wetfoot octopus / Wo_1 Beka squid / Bs_1 10 ng/µl 09.748 0.057 Slope 3.373 1ng/µL 13.140 0.086 100 pg/µl 16.583 0.049 Correlation 1 10 pg/µl 19.932 0.045 1pg/µL 23.218 0.100 Efficiency (%) 97.9 10 ng/µl 11.857 0.110 Slope 3.686 1ng/µL 15.508 0.231 100 pg/µl 19.388 0.306 Correlation 0.998 10 pg/µl 23.169 0.244 1pg/µL 26.457 0.230 Efficiency (%) 86.8 10 ng/µl 12.998 0.097 Slope 4.082 1ng/µL 17.014 0.184 100 pg/µl 21.138 0.153 Correlation 1 10 pg/µl 25.267 0.106 1pg/µL 29.284 0.099 Efficiency (%) 75.8 10 ng/µl 13.047 0.120 Slope 3.504 1ng/µL 16.627 0.120 100 pg/µl 20.050 0.106 Correlation 0.999 10 pg/µl 23.749 0.336 1pg/µL 27.006 0.065 Efficiency (%) 92.9 10 ng/µl 11.482 0.268 Slope 3.633 1ng/µL 15.061 0.102 100 pg/µl 18.253 0.149 Correlation 0.998 10 pg/µl 22.254 0.119 1pg/µL 26.050 0.204 Efficiency (%) 88.5 며, 오징어특이프라이머의경우다른두족류에서 peak 및 Tm 값이차이를나타내었으나주꾸미와 Tm 값이유사하고 peak의수가같았고, 주꾸미특이프라이머의경우다른두족류에서 peak 및 Tm 값이차이를나타내었으나문어와낙지의 Tm 값과유사하고 peak의수가같았으며, 꼴뚜기특이프라이머의경우다른두족류에서 peak 및 Tm 값이차이를나타내었으나오징어와 Tm 값이유사하고 peak의수가같았다. 따라서, 그룹특이프라이머를이용한본판별법에서는대상두족류에따라 Tm 값이나 peak의수에따라판별이불가능한것으로판단되었다. Discussion 진핵생물체는대부분미토콘드리아를가지며, 동물의미토콘드리아에존재하는게놈 DNA는종에따라약 16,000~ 21,000개의염기로구성된이중나선 DNA로구성된다. 미 토콘드리아게놈은산화적인산화에필수적인 13개의소단위단백질및폴리펩타이드로구성되어있다. 여기에는 NADH 탈수소효소 (NADH-dehydrogenase) 소단위 7개 (ND1-6 and ND4L), 시토크롬 B(CytB) 1개, 시토크롬 C 산화효소소단위 3개 (COI-III), ATP 합성효소 2개 (ATPase 6 and 8) 가있다. 또한미토콘드리아단백질을합성하기위해 2개의리보솜 RNA (12s rrna and 16s rrna) 와 22 개의운반 RNA (trna) 를가지고있다 24). 전형적인동물의미토콘드리아 DNA는높은돌연변이율을가지며, 비암호화부분이작은 DNA이다. 동물의미토콘드리아 DNA 의진화율은핵 DNA와비교하여유사종사이의종구분방법에유용하고신뢰성을가진다. 또한, 대부분의동물종에서미토콘드리아 DNA는모계유전방식을가지고있으므로동물유사종구분을위한종판별결과를단순화할수있다 14,25). 또한미토콘드리아 DNA는머리카락과같이핵이없는조직으로부터추출할수있으며, 세포당많

286 In Young Chung, Yong Bae Seo, Ji Young Yang, Ki sung Kwon, and Gun Do Kim Table 3. Threshold cycle (Ct) values and standard deviation of real-time PCR with genomic DNA extracted from Cephalopod group using group specific primer Primer name Oc_1 Lao_1 Sq_1 Sample Ct value Ct value Primer name Sample Ct mean Ct SD Ct mean Ct SD Bs1 29.23 0.106 Oc3 - - Bs2 29.42 0.040 Lao1 - - Sq_1 Bs3 28.99 0.139 Lao2 - - Wo1 28.98 0.123 Sq1 20.082 0.138 Wo2 29.29 0.119 Bs1 32.37 0.685 Oc1 16.30 0.050 Bs2 33.48 0.927 Lao1 29.44 0.062 Bs3 32.34 1.308 Lao2 29.29 0.119 Wo1 14.61 0.122 Sq1 29.11 0.092 Oc1 29.51 0.345 Sq2 29.08 0.207 Oc2 29.10 0.192 Wo_1 Sq3 29.18 0.287 Oc3 32.68 0.633 Bs1 - - Lao1 26.82 0.176 Bs2 31.72 0.446 Lao2 24.98 0.576 Bs3 32.00 0.273 Sq1 32.73 0.525 Wo1 33.68 0.464 Sq2 32.06 0.773 Wo2 31.52 - Sq3 32.33 0.360 Oc1 32.00 0.298 Bs1 19.55 0.145 Oc2 - - Wo1 29.54 0.078 Oc3 - - Wo2 28.95 0.059 Lao1 17.59 0.156 Oc1 29.28 0.069 Sq1 33.59 0.613 Oc2 29.72 0.184 Sq2 - - Bs_1 Oc3 30.21 0.056 Sq3 - - Lao1 30.18 0.134 Bs1 34.54 - Lao2 30.46 0.145 Bs2 - - Sq1 30.02 0.097 Bs3 - - Sq2 30.25 0.114 Wo1 31.25 0.237 Sq3 29.74 0.194 Wo2 25.83 0.020 Oc_1, Lao_1, c1 33.29 0.192 Sq_1, Wo_1, NTC - - Oc2 34.26 0.118 Bs_1 은복제수를가지고있기때문에농도가낮거나손상된 DNA 표본으로부터유사종구분을위한미토콘드리아 DNA 추출이가능하다 26,27). 식품의약품안전처에서는종특이적 PCR 분석법을이용하여농 축 수산물및그가공품에대한 식품중사용원료진위판별지침서 를통해유사종사이의판별법을제시하고있다 28). 오징어류의경우종유사성이매우높아종판별을위해다중유전자검사법 (Multiplex polymerase chain reaction) 을사용하고있으나 29), real-time qpcr 방법에비해제한효소반응, 아가로즈겔 DNA전기 영동과정등이요구되며, PCR의허위양성 (false positive) 이나타나거나한번에많은시료를분석하기어렵다. 이에본연구에서는이러한문제점을극복하기위한방법으로 real-time qpcr을이용하여두족류를 5개의그룹으로구분하고, 각그룹을구분할수있는판별조건을확립하였다. 두족류를 5개의그룹판별을위한그룹특이프라이머세트를사용한 real-time qpcr system을이용하여 Ct값을비교분석하면두족류를 5개의그룹판별이가능하며, real-time qpcr 조건에서반응반복횟수를 30회이내로축소하면두족류를 5개의그룹판별에검출 / 비검출

Identification of Cephalopod Species by Real-time PCR 287 의판별법으로적용할수있을것으로판단된다. 따라서두족류를비롯하여그룹및종구분문제를야기하는생물종의경우, 판별에적합한특이프라이머세트를설계하여명확한그룹및종판별시스템으로적용할수있으며, 본연구에서개발된두족류를 5개의그룹판별분석법은식품의안전성확보및유통질서확립과소비자보호와생산자의소비자신뢰를회복을위해유용하게활용될수있을것으로판단된다. Acknowledgement 이논문은 2018년도식품의약품안전처의연구개발비 (17162미래사064) 로수행되었으며이에감사드립니다. 국문요약 본연구는국내에서생산되거나해외에서수입되어국내에서유통되는수산물중에서두족류를문어류, 낙지류, 오징어류, 주꾸미류, 꼴뚜기류의 5개그룹으로구분하여분석하였다. 두족류 5개그룹을판별을하기위해미토콘드리아에존재하는유전자를분석하였고, 그중에서 COI (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I), 16s rrna (16s ribosomal RNA), 12s rrna (12s ribosomal RNA) 내에서상당히유사한 DNA 서열부분과일부서열변화부분이확인되었다. 명확하게두족류 5개그룹판별을하기위해 COI, 16s rrna, 12s rrna 유전자의일부서열변화부분에서그룹특이적프라이머세트를디자인하였다. 국내 외에서확보한두족류시료 ( 참문어, 낙지, 살오징어, 아메리카대왕오징어, 갑오징어, 주꾸미, 모래주꾸미, 하이야주꾸미, 참꼴뚜기, 창꼴뚜기, 한치꼴뚜기 ) 의 genomic DNA 을추출하여각그룹의특이적프라이머를이용하여 SYBR 기반의 real-time PCR 시스템에의해분석되었고, threshold cycle (Ct) value와같은 real-time PCR 결과분석에의해두족류내그룹판별이가능하였다 (Table 3). References 1. 해양수산부 한국해양수산개발원 : 2017 년 3 분기수입수산물동향. pp.4-64 (2017). 2. Bataille M., Crainic K, Leterreux M, Durigon M & De Mazancourt P: Multiplex amplification of mitochondrial DNA for human and species identification in forensic evaluation. Forensic Sci. Int., 99, 165-170 (1999). 3. Civera T: Species identification and safety of fish products. Vet. Res. Commun., 27, 481-489 (2003). 4. Mackie I, et al.: Species identification of smoked and gravad fish products by sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis, urea isoelectric focusing and native isoelectric focusing: A collaborative study. Food Chem. 71, 1-7 (2000). 5. Moretti VM, Turchini GM, Bellagamba F, Caprino F: Traceability issues in fishery and aquaculture products. Vet. Res. Commun. 27, 497-505 (2003). 6. Teletchea F: Molecular identification methods of fish species: Reassessment and possible applications. Rev. Fish Biol. Fish. 19, 265-293 (2009). 7. Birstein VJ, Desalle R: Molecular phylogeny of acipenserinae. Mol. Phylogenet. Evol. 9, 141-155 (1998). 8. Brown JR, Beckenbach K, Beckenbach AT, Smith MJ: Length variation, heteroplasmy and sequence divergence in the mitochondrial DNA of four species of sturgeon (Acipenser). Genetics, 142, 525-535 (1996). 9. Chow S, Clarke ME, Walsh PJ: PCR-RFLP analysis on thirteen western Atlantic snappers (subfamily Lutjaninae): A simple method for species and stock identification. Fish. Bull. 91, 619-627 (1993). 10. Wolf C, Rentsch J, Hübner P: PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: a reliable method for species identification. J. Agric. Food Chem. 47, 1350-1355 (1999). 11. Wolf C, Burgener M, Hübner P, Lüthy J: PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: Differentiation of fish species. LWT - Food Sci. Technol. 33, 144-150 (2000). 12. Hubalkova Z, Kralik P, Tremlova B, Rencova E: Methods of gadoid fish species identification in food and their economic impact in the Czech Republic: A review. Veterinarni Medicina, 52, 273-292 (2007). 13. Liu ZJ, Cordes JF: DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics. Aquaculture, 238, 1-37 (2004). 14. Sezaki K, Itoi S, Watabe S: A simple method to distinguish two commercially valuable eel species in Japan Anguilla japonica and A. anguilla using polymerase chain reaction strategy with a species-specific primer. Fish. Sci. 71, 414-421 (2005). 15. Tisza Á, et al.: Identification of poultry species using polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) and capillary electrophoresis-single strand conformation polymorphism (CE-SSCP) methods. Food Control, 59, 430-438 (2016). 16. TANABE S, et al.: PCR Method of detecting pork in foods for verifying allergen labeling and for identifying hidden pork ingredients in processed foods. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71, 1663-1667 (2007). 17. Watanabe S, Minegishi Y, Yoshinaga T, Aoyama J, Tsukamoto K: A quick method for species identification of Japanese eel (Anguilla japonica) using real-time PCR: An onboard application for use during sampling surveys. Mar. Biotechnol. 6, 566-574 (2004). 18. Kim M, Yoo I, Lee SY, Hong Y, Kim HY: Quantitative detection of pork in commercial meat products by TaqMan realtime PCR assay targeting the mitochondrial D-loop region. Food Chem. 210, 102-106 (2016). 19. Amaral JS, Santos G, Oliveira MBPP, Mafra I: Quantitative detection of pork meat by EvaGreen real-time PCR to assess the authenticity of processed meat products. Food Control,

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