(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2014-0137185 (43) 공개일자 2014년12월02일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/232 (2006.01) A61K 36/28 (2006.01) A61P 29/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2013-0057790 (22) 출원일자 2013 년 05 월 22 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 11 항 2013 년 05 월 22 일 (71) 출원인 재단법인한국한방산업진흥원 경상북도경산시화랑로 94 ( 갑제동 ) 명지대학교산학협력단 경기도용인시처인구명지로 116 ( 남동, 명지대학교 ) (72) 발명자 이은경 대구수성구욱수천로 133, 105 동 1516 호 ( 사월동, 시지 2 차사월보성타운 ) 박영나 경북구미시박정희로 90-14, 104 동 305 호 ( 상모동, 세양청마루아파트 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 신동인 (54) 발명의명칭백지포함복합생약추출물을함유하는염증질환또는알레르기질환의치료및예방용조성물 (57) 요약 본발명은백지및창이자로구성된복합생약추출물을유효성분으로함유하는염증질환또는알레르기질환의예방및치료를위한조성물에관한것으로, 본발명의추출물은비만세포에서분비되는 b-hexaminidase(b-hex) 방출, 류코트리엔 (Leukotriene, LT) 생성, COX-2 의존적인프로스타글란딘 PGD 2 생성을억제하며, 오브알부민에 의해유도된비염동물모델에서혈청 IgE 농도감소및비장세포에서분비되는 IL-4, IL-5, 및 IL-13 의생성을억제하는항염증, 항알레르기및항비염효과를확인함으로써, 염증질환또는알레르기질환의예방및치료용조성물에이용될수있다. 대표도 - 도 1-1 -
(72) 발명자 이화동 경북경산시강변서로 17, 304 동 1102 호 ( 옥곡동, 서부부영 3 차두리마을 ) 박효현 대구동구동호로 132, 310 동 403 호 ( 신서동, 영조아름다운나날 3 단지 ) 김선건 부산수영구무학로 30-8, ( 광안동 ) 이지언 경기용인시처인구용문로 30-8, 604 호 ( 역북동, 라이프청수아파트 ) 서주원 경기용인시처인구포곡읍석성로 850 번길 84, 에버힐스 1 단지 1 호 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 PJ009023 부처명 농촌진흥청 연구관리전문기관 농생명바이오식의약소재개발사업단 연구사업명 차세대바이오그린21사업 연구과제명 알레르기비염개선천연물의약품개발을위한전임상연구 기여율 1/1 주관기관 명지대학교산학협력단 연구기간 2012.05.01 ~ 2014.12.31-2 -
특허청구의범위청구항 1 백지및창이자로구성된복합생약추출물을유효성분으로함유하는염증질환또는알레르기질환의예방및치료용약학조성물. 청구항 2 제 1항에있어서, 상기복합생약은백지및창이자의상대배합 (w/w) 비가 1 내지 20 : 20 내지 1인약학조성물. 청구항 3 제 1항에있어서, 상기추출물은물, 메탄올, 에탄올, 부탄올또는이들의혼합용매로부터선택되어진용매에가용한약학조성물. 청구항 4 제 1항에있어서, 상기염증질환은급성또는만성염증질환, 만성기관지염및관련폐쇄성기도질환, 상기도염및비염, 관절염또는염증성장질환, 통증, 동맥경화, 심장병질환, 다발성경화증, 파킨슨씨병, 알쯔하이머병또는결장암인약학조성물. 청구항 5 제 1항에있어서, 상기알레르기질환은비염, 천식, 접촉성피부염, 알레르기성결막염, 또는아토피성피부염인약학조성물. 청구항 6 제 1항에있어서, 상기약학조성물은스프레이제제, 비강제또는점비제인약학조성물. 청구항 7 백지및창이자로구성된복합생약추출물을유효성분으로함유하는염증질환또는알레르기질환의예방및개선용건강기능식품. 청구항 8 제 7항에있어서, 상기건강기능식품은정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 또는환형태인건강기능식품. 청구항 9 염증질환또는알레르기질환의예방및치료의효과를나타내는백지및창이자로구성된복합생약추출물을포함하는건강보조식품. 청구항 10 제 9항에있어서, 상기건강보조식품은분말, 과립, 정제, 캡슐, 음료, 껌, 차, 비타민복합제형태인건강보조식품. 청구항 11 염증질환또는알레르기질환의예방및개선효과를갖는백지및창이자로구성된복합생약추출물을주성분으로함유하는식품또는식품첨가제. 명세서 기술분야 - 3 -
[0001] 본발명은복합생약추출물을함유하는염증질환또는알레르기질환의예방및치료용조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] 배경기술 [ 문헌 1] Busse WW and Lemanske RF, Asthma, N Engl Med 2001, 344(5), 350-362 [ 문헌 2] Lemanske RF and Busse WW, Asthma, J Allergy Clin Immunol 2003, 110(5), 703-705 [ 문헌 3] Woodfolk JA, Cytokines as a therapeutic target for allergic disease: a complex picture, Curr Pharm Des 2006, 12(19), 2349-2396 [ 문헌 4] Harizi H, et al., Arachidonic-acid-derived eicosanoids: roles in biology and immunopathology, Trends Mol Med 2008, 14(10), 461-469 [ 문헌 5] Cicardo VH, Mechanism of the hypotensive effect of prostaglandins A2 and E2, Acta Physiol Lat Am 1981, 85-91 [ 문헌 6] Liu F, et al., Prostaglandin B2-induced pulmonary hypertension is mediated by TxA2/PGH2 receptor stimulation, Am. J. Physiol 1994, 267, 602-608 [ 문헌 7] Gollman HM et al., Comparative pyrogenic potency of endogenous prostanoids and of prostanoidmimetics injected into the anterior hypothalamic/preoptic region of the cat, Brain Res 1988, 449, 281-293 [ 문헌 8] Collins, et al., Cutaneous sympathetic motor rhythms during a fever-like response induced by prostaglandin E(1), Neuroscience, 2002, 110, 351-360 [ 문헌 9] Shiraishi, et al., Cyclooxygenase-2/prostaglandin D2/CRTH2 pathway mediates double-stranded RNA-induced enhancement of allergic airway inflammation, J Immunol 2008, 180, 541-549 [ 문헌 10] Dahlen SE, Treatment of asthma with antileukotrienes: first line or last resort therapy, Eur J Pharmacol 2006, 533, 40-56 [ 문헌 11] Kitamura S, Leukotriene (B4, C4, D4, E4), Nippon Rinsho 2005, Suppl 8, 28-33 [ 문헌 12] 정보섭및신민교저, 도해향약 ( 생약 ) 대사전, 영림사, pp 1080-1082, 1998 [ 문헌 13] 정보섭및신민교저, 도해향약 ( 생약 ) 대사전-약용식물편, 영림사, pp 409-411, 1998 [ 문헌 14] Choi JH et al., Flowers of Inula japonica attenuate inflammatory responses, Immune Network 2010, 10(5), 145-152 [ 문헌 15] Yang JH et al., Anti-inflammatory activity of ethylacetate fraction of Cliona celata, Immunopharmacol Immunotoxicol 2011, 33(2), 373-379 [ 문헌 16] Jeon EJ et al., The effects of peroxisome proliferator-activated receptor-g agonist on a murine model of experimental allergic rhinitis, Otolaryngology-Head and Neck Surgery 2008, 139, 124-130) 발명의내용 [0018] 해결하려는과제염증이란신체국소에일어나는상해에대하여생체조직의방어반응이다. 즉, 각종의유해한자극 (stressor) 에응답하여, 자극에의한상해를제거하여원래의상태로회복하려는생체방어반응이염증반응이다. 염증의자극에는, 감염혹은화학적, 물리적자극등이있다. 염증반응에관련된생체구성인자는자유라디칼 (free radical), 단백질, 당질, 지질등의저분자나고분자의화학물질과, 혈장, 혈구, 혈관및결합조직등이있다. 염증의과정은보통 2가지로나누며, 급성및만성염증으로나눌수있다. 급성염증은수일이내의단기적인반응이며, 혈장성분이나혈구등이미소순환계를개재하여이물제거에관련한다. 만성염증은지속시간이길며, - 4 -
조직의증식등이나타난다. [0019] [0020] 알레르기성질환은대부분이항원-항체반응에의해활성화된조직의비만세포및혈액의호염기성세포및호산구에서유리되는매개체들 ( 주로히스타민 (histamine), 류코트리엔 (leukotrienes), 종양괴사요인α(TNFα), 사이토카인 (cytokines) 등 ) 에의해서야기된다. 현재사용되는알레르기치료약물들의용도는증상완화에머무르고있기때문에보다근본적인치료약물의개발이절실히요구된다. 또한염증및천식과같은알레르기질환을유도하는핵심적인매개물질은프로스타글란딘류 (prostaglandines, PGs), 류코트리엔류 (leukotriens, LTs), 혈소판활성화인자 (PAF) 등의포스포리파아제 A 2 (phospholipase A 2 ), 시클로옥시게나제 (cyclooxygenase, COX) 및리폭시게나제 (lipoxygenase) 에의하여전구체인아라키돈산 (arachidonic acid) 으로부터생성된다 (Harizi H, et al., Arachidonic-acid-derived eicosanoids: roles in biology and immunopathology, Trends Mol Med 2008, 14(10), 461-469). [0021] 프로스타글란딘류는특이한세포표면수용체와결합하여 camp ( 경우에따라서는 cgmp) 의세포내농도를증가시 키는작용을한다. camp 의증가에의한효과는세포종류에따라다르며 PGA 2, PGB 2 는혈압을강하시키고 (Cicardo VH, Mechanism of the hypotensive effect of prostaglandins A2 and E2, Acta Physiol Lat Am 1981, 85-91; Liu F, et al., Prostaglandin B2-induced pulmonary hypertension is mediated by TxA2/PGH2 receptor stimulation, Am. J. Physiol 1994, 267, 602-608), PGD 2, PGE 1 은동통, 발열등의염증과정에관여한다고알려져있다 (Gollman HM et al., Comparative pyrogenic potency of endogenous prostanoids and of prostanoid-mimetics injected into the anterior hypothalamic/preoptic region of the cat, Brain Res 1988, 449, 281-293; Collins, et al., Cutaneous sympathetic motor rhythms during a fever-like response induced by prostaglandin E(1), Neuroscience, 2002, 110, 351-360). PGD 2 은특히기관지천식환자의평활근을수축하여천식을악화시키는주범으로알려져있다 (Shiraishi, et al., Cyclooxygenase-2/prostaglandin D2/CRTH2 pathway mediates double-stranded RNA-induced enhancement of allergic airway inflammation, J Immunol 2008, 180, 541-549). [0022] 류코트리엔은아라키돈산으로부터생체에서생성되는국소작용성호르몬그룹을구성하며, 중요한류코트리엔 으로는류코트리엔 B 4 (LTB 4 ), 류코트리엔 C 4 (LTC 4 ), 류코트리엔 D 4 (LTD 4 ) 및류코트리엔 E 4 (LTE 4 ) 가있다. 이들 류코트리엔의생합성은효소 5-리폭시게나아제가아라키돈산에대하여작용하여류코트리엔 A 4 로서알려진에폭사이드를생성시킴으로써시작되며, 이것은연속적인효소반응단계에의해다른류코트리엔 (LTB 4, LTC 4, LTD 4, LTE 4 ) 으로전환된다. 류코트리엔은폐동맥질환, 예를들면, 천식, 만성기관지염및관련폐쇄성기도질환, 알레르기성비염, 접촉성피부염, 알레르기성결막염등의알레르기및알레르기반응, 관절염또는염증성장질환, 통증등의염증등에관여하는것으로알려져있다. 최근에는알레르기성천식치료제로서주목을받고있는약물들은히스타민유리억제, 류코트리엔 C 4 생성억제, 혈소판활성화인자생성억제활성을동시에가지는약물들이다 (Dahlen SE, Treatment of asthma with antileukotrienes: first line or last resort therapy, Eur J Pharmacol 2006, 533,40-56; Kitamura S, Leukotriene (B4, C4, D4, E4), Nippon Rinsho 2005, Suppl 8, 28-33). [0023] [0024] 국화과에속하는일년생인창이자 (Xanthium strumarium L.(= X. sibiricum PATR ex WIDD.)) 는도꼬마리의과실이며, 약재로는경엽, 뿌리, 꽃을사용하며, 과실에는잔토스트럼마린 (xanthostrumarin) 1.2%, 수지 3.3%, 지방유, 알칼로이드 (alkaloid), 비타민 C(vitamin C), 색소등이함유되어있다. 건조한과실에는지방유 9.2% 를함유하며, 그지방산은리놀레산 (linoleic acid) 64.20%, 올레산 (oleic acid) 26.8%, 팔미트산 (palmitic acid) 5.32%, 스테아린산 (stearic acid) 3.36% 가차지하고있다. 또한불포화지방중에는세릴알코올 (ceryl alcohol), β-, γ-, ε-시토스테롤 (β-, γ-, ε-sitosterol) 이있고아세톤 (acetone) 불용의지방은레시틴 (lecithin) 33.2%, 세팔린 (cephalin) 66.8% 가차지하고있다. 종인은수분 6~7%, 지방유 40% 를함유하며종피에는펜토산 (pentosan) 이 15.86% 의성분이함유된것으로알려져있다 ( 정보섭및신민교저, 도해향약 ( 생약 ) 대사전-약용식물편, 영림사, pp 1080-1082, 1998). 미나리과에속하는다년생인백지 (Angelicae Dahurica (FISCH.) BENTH. et Hook. f.) 는구릿대및동속근연식물의뿌리에서얻어진생약이며, 구릿대전초에는정유가함유되어있고뿌리에는백-앵게리신 (byakangelicin), 백-앵게리콜 (byak-angelicol), 옥시포이세다닌 (oxypeucedanin), 임페라토린 (imperatorin), 토린 (torin), 이소임페라토린 (isoimperatorin), 펠롭터린 (phellopterin), 잔토톡신 (xanthotoxin), 마미신 - 5 -
(marmesin), 스코폴레텐 (scopoletin), 이소백-앵게리콜 (isobyak-angelicol), 네오백-앵게리콜 (neobyakangelicol), 알로이소임페라토린 (alloisoimperatorin), 5-메톡시-8하이드록시솔라렌 (5-methoxy-8- hydroxypsoralen) 성분이함유된것으로알려져있다 ( 정보섭및신민교저, 도해향약 ( 생약 ) 대사전, 영림사, pp 409-411, 1998). [0025] [0026] 그러나상기문헌어디에도창이자및백지로구성된복합생약혼합물추출물의염증질환또는알레르기질환에대한효과에대한어떠한개시또는교시된바가없다. 이에본발명자들은복합생약추출물이비만세포에서분비되는 b-hexaminidase(b-hex) 방출, 류코트리엔 (Leukotriene, LT) 생성, COX-2 의존적인프로스타글란딘 PGD 2 생성을억제하며, 오브알부민에의해유도된비 염동물모델에서혈청 IgE 농도감소및비장세포에서분비되는 IL-4, IL-5, 및 IL-13 의생성을억제하는 항염증, 항알레르기및항비염효과를확인함으로써본발명을완성하였다. [0027] [0028] [0029] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명은백지및창이자로구성된복합생약추출물을유효성분으로함유하는염증질환또는알레르기질환의예방및치료용약학조성물을제공한다. 구체적으로, 본원에서정의되는복합생약은백지및창이자의상대중량배합 (w/w) 비가 1 내지 20 : 20 내지 1, 바람직하게는, 1 내지 10 : 10 내지 1, 보다바람직하게는, 1 내지 5 : 5 내지 1의배합비로배합됨을특징으로한다. 본원에서정의되는추출물은물, 메탄올, 에탄올, 부탄올또는이들의혼합용매로부터선택되어진용매, 바람직하게는물, 메탄올, 부탄올또는이들의혼합용매에가용한추출화합물, 보다바람직하게는물및에탄올혼합용매, 보다더바람직하게는 50 내지 90% 에탄올혼합용매에가용한추출물을포함한다. [0030] [0031] [0032] [0033] 본원에서정의되는염증질환은급성또는만성염증질환, 만성기관지염및관련폐쇄성기도질환, 상기도염및비염, 관절염또는염증성장질환, 통증, 동맥경화, 심장병질환, 다발성경화증, 파킨슨씨병, 알쯔하이머병, 결장암등을비롯한질환, 바람직하게는, 급성또는만성염증질환, 관절염또는염증성장질환을포함한다. 본원에서정의되는알레르기질환은비염, 천식, 접촉성피부염, 알레르기성결막염등의알레르기및알레르기반응, 아토피성피부염등의알레르기성질환, 바람직하게는비염, 천식, 접촉성피부염또는비염또는아토피성피부염을포함한다. 이하, 본발명의추출물을수득하는방법을상세히설명한다. 예를들어, 추출물은원재료인건조상태의백지및창이자의상대중량배합 (w/w) 비가 1 내지 20 : 20 내지 1, 바람직하게는, 1 내지 10 : 10 내지 1, 보다바람직하게는, 1 내지 5 : 5 내지 1의배합비로배합하는제 1단계 ; 추출용매로서물, C 1 내지 C 4 의저급알콜또는이들의혼합용매, 바람직하게는물및에탄올혼합용매 를건조된상기원재료중량의약 1 내지 5배, 바람직하게는 2 내지 4배를가하여, 5 내지 100, 바람직하게는 20 내지 90 에서, 더바람직하게는실온또는 80 에서 10시간내지 30시간, 바람직하게는약 18 내지 25시간동안냉침추출, 열수추출, 초음파추출, 환류냉각추출또는가열추출법, 바람직하게는냉침추출법으로추출한후여과하고감압농축하여본발명의추출물을수득가능하다. [0034] [0035] 따라서, 본발명은상기제조방법으로얻어진백지및창이자로구성된복합생약추출물을유효성분으로함유하는염증질환또는알레르기질환의예방및치료용약학조성물을제공한다. 상기에서제조된생약복합추출물은비만세포에서분비되는 b-hexaminidase(b-hex) 방출, 류코트리엔 (Leukotriene, LT) 생성, COX-2 의존적인프로스타글란딘 PGD 2 생성을억제하며, 오브알부민에의해유도된비 염동물모델에서혈청 IgE 농도감소및비장세포에서분비되는 IL-4, IL-5, 및 IL-13 의생성을억제하는 - 6 -
항염증, 항알레르기및항천식효과를확인하였다. [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] 본발명의약학조성물은조성물총중량에대하여상기추출물을 0.1 내지 50 중량 % 로포함한다. 그러나상기와같은조성은반드시이에한정되는것은아니고, 환자의상태및질환의종류및진행정도에따라변할수있다. 본발명의추출물자체는독성및부작용이거의없으므로예방목적으로장기간복용시에도안심하고사용할수있는약제이다. 본발명의조성물은약학적조성물의제조에통상적으로사용하는적절한담체, 부형제및희석제를더포함할수있다. 본발명의조성물은각각통상의방법에따라산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸등의경구형제형, 외용제, 좌제및멸균주사용액의형태로제형화하여사용될수있으며, 추출물을포함하는조성물에포함될수있는담체, 부형제및희석제로는락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트및광물유를들수있다. 제제화할경우에는보통사용하는충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제등의희석제또는부형제를사용하여조제된다. 경구투여를위한고형제제에는정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이포함되며, 이러한고형제제는상기추출물에적어도하나이상의부형제예를들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는락토오스 (lactose), 젤라틴등을섞어조제된다. 또한단순한부형제이외에마그네슘스티레이트탈크같은윤활제들도사용된다. 경구를위한액상제제로는현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이해당되는데흔히사용되는단순희석제인물, 리퀴드파라핀이외에여러가지부형제, 예를들면습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이포함될수있다. 비경구투여를위한제제에는멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가포함된다. 비수성용제, 현탁제로는프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과같은식물성기름, 에틸올레이트와같은주사가능한에스테르등이사용될수있다. 좌제의기제로는위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴등이사용될수있다. 본발명의추출물을함유하는제제는비경구투여, 예를들어, 흡입형태의스프레이 (spray) 제제, 비강제, 등으로투여됨이바람직하다. 따라서본발명은상기제조방법으로추출물을유효성분으로함유하는염증질환또는알레르기질환의치료및예방을위한스프레이제제, 비강제또는점비제를제공한다. 본발명의조성물의바람직한투여량은환자의상태및체중, 질병의정도, 약물형태, 투여경로및기간에따라다르지만, 당업자에의해적절하게선택될수있다. 그러나바람직한효과를위해서, 본발명의추출물은 1일 0.5 g/kg 내지 5 g/kg으로, 바람직하게는 1 g/kg 내지 3 g/kg으로투여하는것이좋다. 투여는하루에한번투여할수도있고, 수회나누어투여할수있다. 따라서, 상기투여량은어떠한면으로든본발명의범위를한정하는것은아니다. 본발명의조성물은쥐, 생쥐, 가축, 인간등의포유동물에다양한경로로투여될수있다. 투여의모든방식은예상될수있는데, 예를들면, 경구, 직장또는정맥, 근육, 피하, 자궁내경막또는뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에의해투여될수있다. [0045] [0046] [0047] 또한, 본발명은백지및창이자로구성된복합생약추출물을유효성분으로함유하는염증질환또는알레르기질환의예방및개선용건강기능식품을제공한다. 본원에서정의되는 " 건강기능식품 " 은건강기능식품에관한법률제6727호에따른인체에유용한기능성을가진원료나성분을사용하여제조및가공한식품을의미하며, " 기능성 " 이라함은인체의구조및기능에대하여영양소를조절하거나생리학적작용등과같은보건용도에유용한효과를얻을목적으로섭취하는것을의미한다. 본발명의염증질환또는알레르기질환예방을위한건강기능식품은, 조성물총중량에대하여상기추출물을 0.01 내지 95 %, 바람직하게는 1 내지 80 % 중량백분율로포함한다. - 7 -
[0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] 또한, 염증질환또는알레르기질환예방을위한목적으로정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환등의형태인건강기능식품으로제조및가공이가능하다. 본발명은염증질환또는알레르기질환의예방및치료의효과를나타내는상기백지및창이자로구성된복합생약추출물을포함하는건강보조식품을제공한다. 상기추출물을첨가할수있는식품으로는, 예를들어, 각종식품류, 음료, 껌, 차, 비타민복합제, 건강기능성식품류등이있다. 본발명의추출물을포함하는조성물은염증질환또는알레르기질환의예방및개선을위한약제, 식품및음료등에다양하게이용될수있다. 본발명의추출물을첨가할수있는식품으로는, 예를들어, 각종식품류, 음료, 껌, 차, 비타민복합제, 건강보조식품류등이있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐또는음료인형태로사용할수있다. 또한, 본발명은염증질환또는알레르기질환의예방및개선효과를갖는백지및창이자로구성된복합생약추출물을주성분으로함유하는식품또는식품첨가제를제공한다. 본발명의추출물은염증질환또는알레르기질환의예방및개선을목적으로식품또는음료에첨가될수있다. 이때, 식품또는음료중의상기추출물의양은일반적으로본발명의건강식품조성물은전체식품중량의 1 내지 5 중량 % 로가할수있으며, 건강음료조성물은 100 ml를기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의비율로가할수있다. 본발명의건강음료조성물은지시된비율로필수성분으로서상기추출물을함유하는것외에액체성분에는특별한제한점은없으며통상의음료와같이여러가지향미제또는천연탄수화물등을추가성분으로서함유할수있다. 상술한천연탄수화물의예는모노사카라이드, 예를들어, 포도당, 과당등의디사카라이드, 예를들어말토스, 슈크로스등의및폴리사카라이드, 예를들어덱스트린, 시클로덱스트린등과같은통상적인당및자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨등의당알콜이다. 상술한것이외의향미제로서천연향미제 ( 타우마틴, 스테비아추출물 ( 예를들어레바우디오시드 A, 글리시르히진등 )) 및합성향미제 ( 사카린, 아스파르탐등 ) 를유리하게사용할수있다. 상기천연탄수화물의비율은본발명의조성물 100 ml당일반적으로약 1 내지 20g, 바람직하게는약 5 내지 12g이다. 상기외에본발명의조성물은여러가지영양제, 비타민, 광물 ( 전해질 ), 합성풍미제및천연풍미제등의풍미제, 착색제및중진제 ( 치즈, 초콜릿등 ), 펙트산및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에사용되는탄산화제등을함유할수있다. 그밖에본발명의조성물들은천연과일쥬스및야채음료의제조를위한과육을함유할수있다. 이러한성분은독립적으로또는조합하여사용할수있다. 이러한첨가제의비율은그렇게중요하진않지만본발명의조성물 100 중량부당 0 내지약 20 중량부의범위에서선택되는것이일반적이다. [0056] 발명의효과 본발명의복합생약추출물은비만세포에서분비되는 b-hexaminidase(b-hex) 방출, 류코트리엔 (Leukotriene, LT) 생성, COX-2 의존적인프로스타글란딘 PGD 2 생성을억제하며, 오브알부민에의해유도된비염동물모델에서 혈청 IgE 농도감소및비장세포에서분비되는 IL-4, IL-5, 및 IL-13 의생성을억제함을확인하여, 각종염증질 환및알레르기질환의예방및치료용조성물에유용하게이용될수있다. [0057] 도면의간단한설명 도 1 는복합생약추출물에대한 MTS 어세이법에의한세포생존율을나타낸도이고 ; 도 2 는복합생약추출물의오브알부민으로유도된마우스군에서혈청 IgE 의양으로나타낸도이며 ; 도 3A, 3B 및 3C 는오브알부민으로유도된비염동물모델의비장세포에서분비되는사이토카인인 IL-4, IL-5 및 IL-13 생성억제에미치는결과를나타낸도이다. - 8 -
[0058] [0059] 발명을실시하기위한구체적인내용이하, 본발명을실시예및실험예에의해상세히설명한다. 단, 하기실시예및실험예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명의내용이하기실시예및실험예에한정되는것은아니다. [0060] [0061] 실시예 1. 복합생약추출물의제조 ( 주 ) 옴니허브 (http://www.omniherb.com/) 에서구입한창이자 (20 g) 및백지 (20 g) 를일정한비율로혼합한복합제 (40 g) 를 70% 에탄올 7,650 ml에 60 에서 24시간침지시킨후실온에서추출액을수득하고, 다시 70% 에탄올 7,650 ml를가하여 2회더추출하여추출액을모은후, 상기각추출액을여과한여과물을감압회전농축기 (Vaccum rotary evaporator; 일본 Nihon Seiko사, VR-205c) 로용매를증발시키는감압농축및건조과정을통하여복합생약 70% 에탄올추출물 8.18 g( 수율 : 20.5%, 이하복합생약이라함 ) 를수득하였다. [0062] [0063] [0064] 참조예 1. 실험준비실험재료세포배양액인 RPMI-1640, Modifed Eagle Medium(MEM) non-essential amino acids solution, fetal bovine serum(fbs), streptomycine, penicillin 등의세포배양용시약들은 Hyclone사 (Logan, UT, USA) 에서구입하였다. 실험에사용된시약중 SCF(Stem cell factor, STEMCELL, Vancouver, Canada), LPS(Lipopolysaccharides, Sigma, St. Louis, MO, USA), IL-10(Recombinant Mouse IL-10, BD Pharmingen TM, San Jose, CA, USA) 을구입하여사용하였고, PGD 2 및 LTC 4 의측정 kit 은 Cayman 사 (Ann Arbor, MI, USA), IL 측 정용 kit 는 R&D System 사 (Minneapolis, MN, USA) 에서구입하였다. [0065] [0066] 세포배양쥐골수유래의비만세포 (BMMC, mouse bone marrow-derived mast cells) 는 BALB/C 마우스의대퇴골에서골수세포를분리하여, 10% FBS, 100U/ml penicillin, 100μg /ml streptomycine을포함한 RPMI-1640 배지에 IL-3공급원으로 PWM-SCM(containing pokeweed mitogen-stimulated spleen cell-conditioned medium) 을 final 20 % 되도 록넣은배양액으로약 3 주정도배양하여 90% 이상의균질한 BMMC 을얻어사용하였다. 세포는 37, 5% CO 2 incubator 에서배양하였고, BMMC 를 96-well plate 에일정한수의세포를분주하여실험하였다. [0067] [0068] 시료준비실험에사용하기위한시료로서복합생약추출물을 DMSO 용매에녹여농도 200μg/ ml, 100μg/ ml, 50μg/ ml, 25 μg/ ml, 12.5μg/ ml의농도로희석하여사용하였다. 오브알부민 (Ovalbumin, OVA) 으로유도한비염동물모델에서는복합생약추출물을 200 mg/kg으로투여하였다. [0069] [0070] 실험예 1. 세포생존수측정 (MTS assay) 상기실시예에서얻은시료의 MTS 어세이법에의한세포생존율에대한효과를알아보기위해기존문헌에기재된방법을이용하여하기와같이실험을수행하였다 (Choi JH et al., Flowers of Inula japonica attenuate inflammatory responses, Immune Network 2010, 10(5), 145-152). [0071] [0072] 1 X 10 6 cells/ml 농도의비만세포에복합생약추출물을농도별로처리하여 8 시간동안배양한후, 세포에 MTS 용액 (Promega, Madison, WI, USA) 을처리하여 1 시간뒤 490nm 에서흡광도를측정하였다. - 9 -
[0073] 본실험결과, 도 1 에나타난바와같이, 처리한복합생약추출물의농도에서독성을나타내지않았다. [0074] [0075] 실험예 2. b-hexaminidase(b-hex) 방출억제측정상기실시예의얻은 BMMC의탈과립지표 (marker) 물질인 β-hex 효소활성측정을통해탈과립의정도를확인하기위하여, 문헌에개시된방법을응용하여하기와같이실험을하였다 (Son JK et al, Ginkgetin, a Biflavone from Ginko biloba leaves, inhibits cyclooxygenases-2 and 5-lipoxygenase in mouse bone marrow-derived mast cells. Biol Pharm Bull 2005, 28(12):2181-84). [0076] 2X10 5 cells/well 의 BMMC 에복합생약추출물을농도별로처리하여 37, 5% CO 2 조건하에서 30 분동안전배 양한후에 KL(100ng/ml)(c-kit ligand, STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) 로자극하여 15분간배양하고 3000rpm, 4 에서 5분간원심분리하였다. 상등액을 β-hex 기질 [100mM citrate buffer (citric acid 0.955%, sodium citrate dihydrate 1.478%, ph 4.5), 1.3mg/ml p-nitrophenyl-n-acetyl-b-d-glucosaminide] 와 1:2(w/v) 의혼합비로혼합시키고 37 에서 1시간동안반응시킨후에 0.2M glycine(ph 10.7)(Sigma 사 ) 으로반응을정지시켜 ELISA 판독기 (Tecan System, San Jose, CA, USA) 를사용하여 405 nm 파장에서흡광도를측정하고그측정값을분비율 (release %) 로환산하였다. [0077] 본실험결과, 복합생약추출물은 25μg/ ml, 50μg/ ml, 100μg/ ml의농도에서각각 38%, 64%, 67% 저해를하였 으며, 표 1 에나타난바와같이 β-hex 방출저해에대한 IC 50 는 33.1mg/ml 이었다. [0078] [0079] 실험예 3. 류코트리엔 (Leukotriene, LT) 생성량측정상기실시예에서얻은시료의류코트리엔 (Leukotriene, LT) 생성량에대한억제효과를알아보기위해기존문헌에기재된방법을이용하여하기와같이실험을수행하였다 (Hua JM et al., 14.5-Methoxy-8-(2-hydroxy-3- buthoxy-3-methylbutyloxy)-psoralen isolated from Angelica dahurica inhibits cyclooxygenase-2 and 5- lipoxygenase in mouse bone marrow-derived mast cells. Arch Pharm Res 2008, 31:617-621). [0080] LT 생성을확인하기위해 1X10 6 cells/ml BMMC 에복합생약추출물을농도별로처리하여 37, 5% CO 2 조건하 에서 1 시간동안배양하고 SCF 를 50ng/ml 농도로 15 분간자극하여 3000 rpm, 4 에서 5 분간원심분리기 (Centrifuge 5415R, Eppendorf) 로상층액을분리하였다. 그상층액중 LTC 4 함량을 LTC 4 -EIA kit(cayman) 를이 용하여측정하였다. [0081] 본실험결과, SCF 에의해자극된세포에서는 LTC 4 의생성량이급격히증가 (16.1ng/ml) 하였다. 복합생약추출물 의 LTC 4 생성저해효과를확인하기위해전처리한결과, LTC 4 의생성량은 12.5 μg /ml, 25 μg /ml, 50 μg /ml 세농 도에서생성량이각각 13.3ng/ml, 12.3ng/ml, 2.6ng/ml 로농도의존적으로저해되었으며, 표 1 에나타난바와 같이 LTC 4 생성에대한 IC 50 는 33.3 mg/ml 이었다. [0082] [0083] 실험예 4. COX-2 의존적인프로스타글란딘 PGD 2 생성억제측정 상기실시예에서얻은시료의 COX-2 의존적인프로스타글란딘 PGD 2 생성에대한억제효과를알아보기위해기존 문헌에기재된방법을이용하여하기와같이실험을수행하였다 (Hua JM et al., 14.5-Methoxy-8-(2-hydroxy-3- buthoxy-3-methylbutyloxy)-psoralen isolated from Angelica dahurica inhibits cyclooxygenase-2 and 5- lipoxygenase in mouse bone marrow-derived mast cells. Arch Pharm Res 2008, 31:617-621). [0084] COX-2-dependent PGD 2 생성량 (generation) 을측정하기위하여, BMMC 에 1 mg/ml 아스피린 (aspirin) 을 2 시간처 리하여 COX-1을불활성시킨후에 1 10 6 cells/ml에복합생약추출물을농도별로 1시간처리한후 LPS, IL-10, SCF 세가지를각각 100μg /ml, 100ng/ml, 10ng/ml 농도로처리하여 6시간동안배양하고, 3000rpm, 4 에서 5분간원심분리기 (Centrifuge 5415R, Eppendorf) 로분리하여상층액을취하여유리된 PGD 2 를 PGD 2 -MOX-EIA - 10 -
kit(cayman) 를이용하여측정하였다. [0085] 본실험결과, LPS, IL-10 및 SCF 에의해자극된세포에서는 PGD 2 의생성량이급격히증가 (8.8ng/ml) 하였으며, 복합생약추출물로전처리한결과 PGD 2 의생성량의생성량은 25μg/ ml, 50μg/ ml, 100μg/ ml세농도에서 PGD 2 생성량이 7.0ng/ml, 6.7ng/ml, 4.3ng/ml 로농도의존적으로저해되었으며, 표 1 에나타난바와같이 PGD 2 생성 에대한 IC 50 는 63.0mg/ml 이었다. 표 1 [0086] β-hex LTC 4 PGD 2 IC 50 ( μg / ml ) of inhibition IC 50 ( μg / ml ) of production 33.1 μg / ml 33.3 μg / ml 63.0 μg / ml [0087] [0088] [0089] 실험예 5. 오브알부민 (Ovalbumin) 으로유도한비염동물모델제작상기실시예에서얻은시료의오브알부민 (Ovalbumin, OVA) 으로유도한비염동물모델을이용한비염에대한억제효과를알아보기위해하기와같이실험을수행하였다 (Jeon EJ et al., The effects of peroxisome proliferator-activated receptor-g agonist on a murine model of experimental allergic rhinitis, Otolaryngology-Head and Neck Surgery 2008, 139, 124-130). 6주령 BALB/C 마우스암컷 (17~18g, 코아텍 ) 을사용하여 OVA(A5503,Sigma) 을 200 μg / ml농도로 saline에녹여이용액과 alum(77161, Thermo) 을 1:1로섞어서마리당 200μl (OVA 20μg ) 를 0일과 14일째에복강으로감작하였다. 항원유발을위해마지막복강투여 6일후 5일간마우스의비강에 OVA(100ug) 을점적하였다. Dexamethasone(Dex, D4702, Sigma) 을대조약물로사용하여 2mg/kg으로, 복합생약추출물은 200mg/kg으로하루에 2회, 5일간총 10회경구투여를하였고, OVA을비강에점적할때에는 1시간전에먼저약물을경구투여하였다. [0090] [0091] [0092] [0093] 실험예 6. 오브알부민 (Ovalbumin) 으로유도한비염동물모델에서의 IgE 양측정상기실시예에서얻은시료의오브알부민 (Ovalbumin, OVA) 으로유도한비염동물모델을이용한비염에대한억제효과를알아보기위해기존문헌에기재된방법을응용하여하기와같이실험을수행하였다 (Jeon EJ et al., The effects of peroxisome proliferator-activated receptor-g agonist on a murine model of experimental allergic rhinitis, Otolaryngology-Head and Neck Surgery 2008, 139, 124-130). 비염관련단백질생성량을측정하기위하여상기비염모델의심장에서혈액을채취하여혈청을분리하고이혈청으로부터 IgE 생성량을 ELISA 방법으로측정하였다. 제품은 Mouse IgE ELISA Set(BD Bioscience) 를사용하였으며 ELISA reader(sunrise, TECAN) 로측정하였다. 본실험결과, 도 2에나타난바와같이, 오브알부민으로유도된마우스군에서혈청 IgE의양 (PC, 12993ng/ml) 이 negative control (NC, 237ng/ml) 과비교하였을때크게증가되었으나, 복합생약추출물을투여한마우스군에서는 IgE의양이감소 (8559ng/ml) 되었으므로 IgE level을조절한다는것을의미한다. [0094] [0095] [0096] 실험예 7. 오브알부민 (Ovalbumin) 으로유도한비염동물모델에서의 IL 측정상기실시예에서얻은시료의오브알부민 (Ovalbumin, OVA) 으로유도한비염동물모델을이용한비염에대한억제효과를알아보기위해하기와같이실험을수행하였다. (Jeon EJ et al., The effects of peroxisome proliferator-activated receptor-g agonist on a murine model of experimental allergic rhinitis, Otolaryngology-Head and Neck Surgery 2008, 139, 124-130). 비염관련단백질생성량을측정하기위하여상기비염모델의비장에서비장세포부유액을만들어 OVA(50 μg /m l) 을넣고 72시간배양하여원심분리한후상층액으로 IL-4, IL-5 및 IL-13의생성량을 ELISA 방법을이용하여측정하였다. 측정 kit는 R&D System사의 DuoSet ELISA kit를사용하여 ELISA reader(sunrise, TECAN) 로측정하 - 11 -
였다. [0097] 본실험결과, 도 3A, 3B 및 3C에나타난바와같이, 오브알부민으로유도된비염동물모델의비장세포에서분비되는사이토카인을정량한결과 negative control(nc) 과비교하였을때 IL-4의경우 194pg/ml, IL-5의경우 154pg/ml, IL-13의경우 2137pg/ml로크게증가되었으나, 복합생약추출물을투여한마우스군에서는각각 155pg/ml, 101pg/ml, 1547pg/ml로비장세포에서의사이토카인생성에대하여억제활성을나타냄을확인하였다. [0098] 하기에본발명의추출물을포함하는조성물의제제예를설명하나, 본발명은이를한정하고자함이아닌단지 구체적으로설명하고자함이다. [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] 제제예 1. 산제의제조복합생약추출물 --------------------------------------------- 20 mg 유당 ------------------------------------------------------- 100 mg 탈크 -------------------------------------------------------- 10 mg 상기의성분들을혼합하고기밀포에충진하여산제를제조한다. [0104] [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] 제제예 2. 정제의제조복합생약추출물 --------------------------------------------- 10 mg 옥수수전분 ------------------------------------------------- 100 mg 유당 ------------------------------------------------------- 100 mg 스테아린산마그네슘 ------------------------------------------ 2 mg 상기의성분들을혼합한후통상의정제의제조방법에따라서타정하여정제를제조한다. [0110] [0111] [0112] [0113] [0114] [0115] 제제예 3. 캅셀제의제조복합생약추출물 --------------------------------------------- 10 mg 결정성셀룰로오스 -------------------------------------------- 3 mg 락토오스 -------------------------------------------------- 14.8 mg 마그네슘스테아레이트 -------------------------------------- 0.2 mg 통상의캡슐제제조방법에따라상기의성분을혼합하고젤라틴캡슐에충전하여캡슐제를제조한다. [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] 제제예 4. 주사제의제조복합생약추출물 --------------------------------------------- 10 mg 만니톨 ----------------------------------------------------- 180 mg 주사용멸균증류수 ---------------------------------------- 2974 mg Na 2 HPO 4, 12H 2 O ------------------------------------------------- 26 mg 통상의주사제의제조방법에따라 1 앰플당 (2ml) 상기의성분함량으로제조한다. [0122] 제제예 5. 액제의제조 - 12 -
[0123] [0124] [0125] [0126] [0127] 복합생약추출물 --------------------------------------------- 20 mg 이성화당 ----------------------------------------------------- 10 g 만니톨 -------------------------------------------------------- 5 g 정제수 ------------------------------------------------------- 적량통상의액제의제조방법에따라정제수에각각의성분을가하여용해시키고레몬향을적량가한다음상기의성분을혼합한다음정제수를가하여전체를정제수를가하여전체 100ml로조절한후갈색병에충진하여멸균시켜액제를제조한다. [0128] [0129] [0130] [0131] [0132] [0133] [0134] 제제예 6. 스프레이제제의제조성분및함량 (100ml 중 ) ( 비중 : 0.812g/ml) 복합생약추출물 --------------------------------------------- 0.9g 글리세린 --------------------------------------------------- 6.30g 스테비오사이드 (100%) ------------------------------------- 0.020g 무수에탄올 ------------------------------------------------- 74.8g 통상의스프레이제제의제조방법에따라상기원료약품중글리세린 6.30g, 무수에탄올 70.0g 및 AR5 추출물 0.9g을먼저혼합용해시키고, 별도로스테비오사이드 ( 순도100%) 0.02g을정제수 0.1g에녹인액을상기용액에첨가한후무수에탄올 4.8g을첨가하여전체를 100ml로하여스프레이병에넣고마개를한다음사용시에는별도로첨부포장한분무장치를마개와교체조립한다음스프레이제제로제조한다. 도면 도면 1-13 -
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