(52) CPC 특허분류 A61K 47/48369 ( ) C07K 2319/30 ( ) C07K 2319/32 ( ) (72) 발명자 코스타레바, 이리나 미국, 코네티컷 06905, 스탬포드, 아파트 8, 15 퍼스트스트리트 아르추어즈,

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2016년11월04일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C07K 14/705 ( ) A61K 38/17 ( ) A61K 47/48 ( ) (52) CPC 특허분류 C07K 14/70578 ( ) A61K 38/177 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 ( 국제 ) 2014 년 03 월 06 일 심사청구일자 없음 (85) 번역문제출일자 2016 년 10 월 06 일 (86) 국제출원번호 PCT/US2014/ (87) 국제공개번호 WO 2015/ 국제공개일자 전체청구항수 : 총 29 항 2015 년 09 월 11 일 (54) 발명의명칭오스테오프로테게린유래의 RANKL 억제제 (57) 요약 (71) 출원인 알 - 팜오버씨즈, 인코포레이티드 미국, 캘리포니아 92130, 샌디에고, 하이블러프드라이브수이트 300 (72) 발명자 라브로프스키, 얀 미국, 캘리포니아 92104, 델마, 1969 자포스트리트 수, 팅 미국, 매사추세츠 01776, 서드베리, 11 도슨드라이브 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 골흡수와연관된질환, 특히전이성암종의치료또는예방에사용될수있는약제학적조성물이기술된다. 특정측면에서, 조성물은인간 IgG1 단백질의 Fc 부분이수반되는인간오스테오프로테게린 (osteoprotegerin) 의선두 215 개아미노산을포함하는폴리펩티드를토대로한다. 약제학적조성물을피하및정맥내경로를통해영장류에투여하기에적합한약제학적제형이제공된다. 대표도 - 도 4 손민 - 1 -

2 (52) CPC 특허분류 A61K 47/48369 ( ) C07K 2319/30 ( ) C07K 2319/32 ( ) (72) 발명자 코스타레바, 이리나 미국, 코네티컷 06905, 스탬포드, 아파트 8, 15 퍼스트스트리트 아르추어즈, 쇼르나 러시아, , 모스크바, 미티쉬치, 19/2 인스티투츠카야스트리트 삼소노프, 미하일 러시아, , 모스크바, 레닌그라드스키프로스펙트 이그나티에브, 바실리 러시아, , 모스크바, 아파트 212, 13 스콜콥스코예쇼셰 레픽, 알렉세이 러시아, , 모스크바, 아파트 106, 3 오세니이블러바드 - 2 -

3 명세서청구범위청구항 1 인간 RANKL을억제하는약제학적조성물로서, 상기조성물이 : 인간오스테오프로테게린의아미노산 1 내지 215를포함하는제1 아미노산서열, 및인간면역글로불린감마-1 Fc의아미노산 103 내지 329를포함하는제2 아미노산서열을포함하는폴리펩티드를포함하고, 상기폴리펩티드가약 5 1O -13 M 이하의 Kd 값으로인간 RANKL에결합하는것인, 약제학적조성물. 청구항 2 제1항에있어서, 상기폴리펩티드가서열번호 : 1의아미노산서열을포함하는것인, 약제학적조성물. 청구항 3 치료학적조성물로서, 상기조성물이인간 RANKL에결합하는폴리펩티드를포함하고, 상기폴리펩티드가인간오스테오프로테게린의생물학적활성부분및인간면역글로불린감마-1의 Fc 부분을포함하고, 상기폴리펩티드가약 5 1O -13 M 이하의 Kd 값으로인간 RANKL에결합하는것인, 치료학적조성물. 청구항 4 제3항에있어서, 약 25 mm 인산나트륨, 약 50 mm 내지약 100 mm NaCl, 약 20 내지약 25 mm L-아르기닌염산염을추가로포함하고, 약 6.3 내지약 6.8의 ph 값을갖는, 치료학적조성물. 청구항 5 제4항에있어서, 약 10 mg/ml의수크로스를추가로포함하는, 치료학적조성물. 청구항 6 제4항에있어서, 약 10 mg/ml 내지약 25 mg/ml의만니톨을추가로포함하는, 치료학적조성물. 청구항 7 제3항에있어서, 3 mg/kg의용량으로피하투여후사이노몰구스원숭이 (Cynomolgus monkey) 의체순환에서상기폴리펩티드의반감기가적어도 48시간인것인, 치료학적조성물. 청구항 8 제3항에있어서, 10 mg/kg의용량으로피하투여후사이노몰구스원숭이의체순환에서상기폴리펩티드의반감기가적어도 38시간인것인, 치료학적조성물. 청구항 9 골재형성 (bone remodeling) 과연관된질환의치료또는예방을위한약제의제조를위한물질의용도로서, 물질이서열번호 : 1의아미노산서열을포함하는폴리펩티드를포함하는것인, 용도. 청구항 10 제9항에있어서, 상기질환이암종인것인, 용도. 청구항

4 제9항에있어서, 상기질환이유방암인것인, 용도. 청구항 12 제9항에있어서, 상기질환이전립선암인것인, 용도. 청구항 13 제9항에있어서, 상기질환이다발성골수종인것인, 용도. 청구항 14 제9항에있어서, 상기질환이골육종인것인, 용도. 청구항 15 제9항에있어서, 상기질환이고형종양에기인한골전이인것인, 용도. 청구항 16 제9항에있어서, 상기질환이골다공증인것인, 용도. 청구항 17 제9항에있어서, 상기질환이류마티스관절염인것인, 용도. 청구항 18 제9항에있어서, 상기질환이건선관절염인것인, 용도. 청구항 19 골재형성과연관된질환또는병태를치료또는예방하기위한방법으로서, 상기방법이골재형성과연관된질환의치료또는예방을필요로하는환자에서열번호 : 1의서열을포함하는폴리펩티드를포함하는약제학적조성물의치료학적유효량을투여하는것을포함하는, 방법. 청구항 20 제19항에있어서, 상기질환이전이성암종인것인, 방법. 청구항 21 제19항에있어서, 상기질환이암종인것인, 방법. 청구항 22 제19항에있어서, 상기질환이유방암인것인, 방법. 청구항 23 제19항에있어서, 상기질환이전립선암인것인, 방법. 청구항 24 제19항에있어서, 상기질환이다발성골수종인것인방법. 청구항 25 제19항에있어서, 상기질환이골육종인것인, 방법. 청구항 26 제19항에있어서, 상기질환이고형종양에기인한골전이인것인, 방법

5 청구항 27 제19항에있어서, 상기질환이골다공증인것인, 방법. 청구항 28 제19항에있어서, 상기질환이류마티스관절염인것인, 방법. 청구항 29 제19항에있어서, 상기질환이건선관절염인것인, 방법. 발명의설명 [0001] 기술분야일반적으로, 본발명은생물학적제약뿐아니라골재흡수와연관된증상 (conditions associated with bone resorption), 예를들어, 종양학에사용되는그의용도와관련된분야에관한것이다. 더욱구체적으로, 본발명은 RANKL (Receptor activator of NF-kappaB ligand) 에결합하는오스테오프로테게린 (osteoprotegerin)-유래의조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] 배경기술본부분에기술된접근법은추구될수있는것이고, 반드시이전에구상되거나추구되었던접근법이라고할수없다. 따라서, 다르게표시되지않는한, 본부분에포함되어있다는것만으로, 본부분에기술된어떠한접근법도선행기술로서자격이있다고추정되어서는안된다. 골 (bone) 전이는고형암환자의 15-75% 및다발성골수종환자의거의 100% 발생정도를갖는, 고형암 (solid tumors) 및혈액암 (hematologic cancers) 양쪽의일반적인합병증이다. 암은대부분골로전이할개연성이높으며, 유방암, 폐암, 전립선암, 갑상선암, 및신장암을포함한다. 골전이비율은암의다른종류에따라다음과같다 : - 다발성골수종 % - 유방암 % - 전립선암 % - 폐암 % - 신장암 - 40% - 방광암 % - 흑색종 %. 골전이의골격합병증 (Skeletal complications) 은통증, 병적골절, 척수압박, 및다른신경-암박증후군에기인한유의한병적상태를차지한다. 골전이는골용해성 (osteolytic), 골형성성 (osteoblastic), 또는둘의혼합일수있다. 정상골재형성은균형잡힌순서 (balanced sequence) 안에서조골세포 (osteoblast) 및파골세포 (osteoclast) 에의해조절된다. 종양괴사인자 (tumor necrosis factor) 패밀리의멤버인 RANKL (RANK (Receptor activator of nuclear factor κβ) ligand) 는조골세포표면상에서발현된다. RANKL은파골세포상의 RANK 수용체에결합하고, 이는 TRAFs (TNF receptor-associated factors) 를통한신호전달을이끌고, 골을분해하거나재흡수하는성숙한파골세포로의분화를포함하는핵내의핵인자 κβ (nuclear factor κβ) 의궁극적인활성화를이끈다. 다른파골세포-활성화인자는부갑상선호르몬-연관단백질, 인터류킨, 및케포카인을포함한다. RANKL의미끼수용체 (decoy receptor), 오스테오프로테게린 (OPG), 는골수에존재하고, 조골세포에의해분비되고, 조골세포및파골세포간의균형자 (balance) 로작용한다. 암에서골전이의환경 (setting) 에서, RANKL, RANK 및 OPG간의교차대화가파괴된다. 파골세포활성화는전이가인터류킨, 부갑상선호르몬-연관단백질, 및다른인자가분비될때증대되고, 이는 RANKL 발현을상향조절한다. 이러한인자들은또한 OPG를억제한다. 게다가, 골병변으로부터분비되는성장인자는종양세포의성장을자극하고, 악순환을경화시킨다 (Roodman GD. Mechanisms of bone metastasis. N Engl J Med 2004; 350: ; Vallet S, smith MR, Rage N. Novel bone-targeted strategies in oncology. Clin Cancer Res 2010;16: ; Marathe A, Peterson MC, Mager DE. Integrated cellular bone homeostasis model for denosumab pharmacodynamics in multiple myeloma patients. J Pharmacol Exp Ther 2008; 326: ; George S, Brenner A, Sarantopoulos J, Bukowski RM. RANK ligand: effects of inhibition. Curr Oncol Rep 2010;12: 80-86)

6 [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] 인간 OPG (GenBank: U ) 는 401개아미노산단백질로 21개아미노산의시그널펩타이드를포함하고, 이는글루탐산 22 전에서잘려서 380개아미노산의성숙한용해성단백질 (mature soluble protein) 이된다. OPG는 TNFR (tumor necrosis factor receptor) 패밀리의멤버로, 이의 N-말단영역에 4개의시스테인-풍부 TNFR 유사도메인을포함한다. OPG는골의발달에서역할을갖는것으로나타나졌었고, OPG 유전자가부족한쥐는골공증 (osteoporotic) 형질 (phenotype) 을갖고, 골격기형 (skeletal abnormalities) 이증대한다. 골수기질세포 (stromal cells) 및조골세포에의해생성되는 OPG는명확한직접적인신호전달기능이없는, 분비된미끼수용체로작용한다. OPG는또한 RANKL로알려진, 이의자연적리간드-오스테오프로테게린리간드 (OPGL) 에결합하여작용한다. OPG 및 RANKL 간의결합은 RANKL이이의동족수용체 (cognate receptor) 인 RANK 를활성화하는것을막고, 이는파골세포수용체로파골세포분화, 활성화및생존에중요하다. 재조합 OPG는단량체 (monomeric) 및이량체 (dimeric) 형태로명확한분자량이각각약 55 kda 및약 110 kda 이다. TNFR-유사도메인의디설파이드결합을아마파괴함에따라, N-말단도메인의시스테인 185 잔기절단은 OPG 비활성화결과를가져오고, 반면에단백질의 194 잔기의 C-말단영역의절단은생물학적활성을변화시키지않는다. 형질전환쥐 (transgenic mice) 내의 OPG 과발현은쥐안의파골세포의거의완전환부족에의해특징되는엄청난골석화증 (osteopetrosis) 을이끈다. 정반대로, OPG 유전자의절제는쥐에서심각한골다공증을이끌며, 이는골재흡수조절에서 OPG가중요한생리적인역할을하는것을나타낸다. 조골세포및기질세포로부터의 OPG 및 RANKL의분비는다수의호르몬및사이토카인에의해조절된다. OPG 및 RANKL 생산의상대적수준은골재흡수의정도 : 골재흡수를증가하는 RANKL의발현을조절한다고생각되고, 반면에과도한 OPG는반대효과를갖는다. 재조합 OPG는시험관및생체내에서파골세포를자극하는어마어마한대부분의인자의효과를차단한다. OPG는또한, 난소절제술, 유도된골다공증, 악성의체액성고칼슘혈증 (humoral hypercalcemia), 및실험적골전이를포함하는다수의동물질환모델에서골재흡수를억제한다. 따라서, OPG는과도한파골세포활성과연관된질환의효과적인치료옵션을대표할것이다 (Kostenuik PJ, Shalhoub V., Curr Pharm Des May;7 (8):613-35). RANK/RANKL 경로 (pathway) 는골전이의효과적인치료로입증된타겟으로잘알려져있다. 데노수맙 (Denosumab) 은인간 RANKL에결합하는고친화성모노클로날항체이고, RANK와의이의상호작용을억제하고, 따라서, OPG의활성화모드와유사하다. 데노수맙은 IgG2 서브클래스의전장인간모노클로날항-RANKL 항체이고, 2개의중쇄, 및 2개의카파서브클래스의경쇄로이루어져있고, CHO (Chinese hamster ovary) 세포에서제조된다. 데노수맙은프롤리아 (Prolia) 상표명으로미국 FDA (Food and Drug Administration) 에의해폐경후여성의골다공증치료제로승인되었다. 데노수맙은엑스제바 (Xgeva) 상표명으로미국 FDA (Food and Drug Administration) 에고형암의골전이를갖는환자의골격-관련증상의예방용으로승인되었다. 추가적인데노수맙의다른골재형성관련증상과관련된임상적시험이, 즉다른형태의암으로부터의골전이에대해현재진행되고있다 (Lipton A et al. Randomized Active-Controlled Phase II Study of Denosumab Efficacy and Safety in Patients With Breast Cancer-Related Bone MetastasesJ Clin Oncol 25 : (2007); Neville- Webbe HL, Coleman RE. Bisphosphonates and RANK ligand inhibitors for the treatment and prevention of metastatic bone disease. Eur J Cancer 2010; 46: ; Santini D, Galluzzo S, Zoccoli A, Pantano F, Fratto ME, et al. New molecular targets in bone metastases. Cane Treat Rev 2010; 36S3:S6-10). 따라서, RANKL에결합할수있고, 허용할수있는약리학적프로파일을갖으면서도, 넓은치료학적가능성을갖는, 자연적으로발생하는 OPG 분자에근거한치료학적조성물을갖는것이바람직할것이다. 발명의내용 [0014] [0015] 해결하려는과제이요약은상세한설명에서더자세히기술되는, 단순화된형태로개념의선택을도입하기위해제공된다. 이요약은청구된주제의핵심적특징또는필수적특징을확인하기위한것으로의도되지않으며, 또한청구된주제의범주를결정하는데보조물로서사용되는것으로도의도되지않는다. 특정측면에서, 본발명은약 5 1O -13 M 이하의 Kd 값으로인간 RANKL에결합하는폴리펩티드를함유하는약제학적조성물을제공한다. 폴리펩티드는인간오스테오프로테게린 (GenBank: U ) 의아미노산 1 내지 215를 - 6 -

7 포함하는제 1 아미노산서열을포함한다. 폴리펩티드는인간면역글로불린감마 -1 Fc (GenBank: J ) 의아 미노산 103 내지 329 를포함하는제 2 아미노산서열을추가로포함한다. 폴리펩티드는서열번호 : 1 의아미노산 서열을포함할수있다. [0016] 특정측면에서, 본발명은치료학적조성물을제공한다. 조성물은인간 RANKL 에결합하는폴리펩티드를포함한 다. 폴리펩티드는인간오스테오프로테게린의생물학적활성부분및인간면역글로불린감마 -1 의 Fc 부분을포 함한다. 폴리펩티드는약 5 1O -13 M 이하의 Kd 값으로인간 RANKL 에결합한다. [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] 폴리펩티드는 3 mg/kg의용량으로치료학적조성물의피하투여후사이노몰구스원숭이 (Cynomolgus monkey) 의체순환에서적어도 48시간의반감기를나타낼수있다. 폴리펩티드는 10 mg/kg의용량으로치료학적조성물의피하투여후사이노몰구스원숭이의체순환에서적어도 38시간의반감기를나타낼수있다. 치료학적조성물은또한약 6.3 내지약 6.8의 ph 값을가지면서, 약 25 mm 인산나트륨, 약 50 mm 내지약 100 mm NaCl, 약 20 내지약 25 mm L-아르기닌염산염을함유할수있다. 치료학적조성물은또한약 10 mg/ml의수크로스를함유할할수있다. 치료학적조성물은또한약 10 mg/ml 내지약 25 mg/ml의만니톨을함유할수있다. 특정측면에서, 본발명은골흡수또는재형성과연관된질환의치료또는예방을위한약제의제조를위한물질의용도를제공한다. 물질은인간 RANKL에결합하는폴리펩티드를포함한다. 폴리펩티드는인간오스테오프로테게린의아미노산 1 내지 215를포함하는제1 아미노산서열을포함한다. 폴리펩티드는인간면역글로불린감마-1 Fc의아미노산 103 내지 329를포함하는제2 아미노산서열을추가로포함한다. 폴리펩티드내제1 아미노산서열이제2 아미노산서열에선행할수있다. 폴리펩티드는서열번호 : 1의아미노산서열을포함할수있다. 골흡수또는재형성과연관된질환은암종, 유방암, 전립선암, 다발성골수종, 고형종양에기인한골전이, 골다공증, 류마티스관절염, 또는건선관절염일수있다. 특정측면에서, 본발명은골흡수또는재형성과연관된질환을치료또는예방하는방법을제공한다. 방법은골흡수또는재형성과연관된질환의치료또는예방을필요로하는환자에인간 RANKL에결합하는폴리펩티드를포함하는약제학적조성물의치료학적유효량을투여하는것을포함한다. 폴리펩티드는인간오스테오프로테게린의아미노산 1 내지 215를포함하는제1 아미노산서열을포함한다. 폴리펩티드는인간면역글로불린감마- 1 Fc의아미노산 103 내지 329를포함하는제2 아미노산서열을추가로포함한다. 폴리펩티드내제1 아미노산서열이제2 아미노산서열에선행할수있다. 폴리펩티드는서열번호 : 1의아미노산서열을포함할수있다. 골흡수또는재형성과연관된질환은암종, 유방암, 전립선암, 다발성골수종, 고형종양에기인한골전이, 골다공증, 류마티스관절염, 또는건선관절염일수있다. 본원에기술된본발명의이들및다른측면과이점은하기도면및상세한설명의고려시자명해질것이다. [0022] [0023] [0024] 과제의해결수단본원에개시되는내용은, 부분적으로, 인간 IgG의 Fc 부분에결합하는, 생물학적으로활성된 OPG의 N-말단부위를포함하는단백질분자의엔지니어링에의존한다. 상기와같은 OPG 유래 (OPG-derived) 단백질분자의재조합생산을가능하게하기위해, 이종단백질발현시스템 (heterologous protein expression system) 에서단백질분자를과생산 (overproducing) 하기위한 DNA 발현벡터를제조하였다. 또한, 높은발현수준으로안정적으로단백질분자를발현하는포유류세포를준비하였다. 본발명의구성 (composition) 의설계 (design), 제조 (preparation), 및예비캐릭터리제이션 (preliminary characterization) 는부분적으로국제특허공개제 WO/2013/147899호 (2013년 10월 3일 ) 에개시되어있으며, 이는전체로서본발명에참조로포함된다. 재조합원천유래단백질분자 (the protein molecule from the recombinant source) 는용액에서호모다이머 (homo-dimmer) 및호모테트라머 (homo-tetramer) 를형성한다. 단백질정제과정은생리학적으로관련있는상당히순수한 (physiologically relevant substantially pure), 단백질분자의호모다이머제조를가능케하도록고안되었다. 예상외로, 정제된단백질분자는인비트로결합어세이 (in vitro binding assay) 에서 RANKL에대해예외적으로높은수준의결합력을보였다. 약학적제제는영장류에단백질분자의피하및정맥투여가가능하도록고안되었다. 이에제제화된단백질분자는영장류에피하및정맥투여시허용가능한약물동태학프로파일 (pharmacokinetics profile) 을나타낸다. 더나아가, 제제화된단백질분자는인간에피하투여시상당한전신약물노출 (substantial systemic exposure) 을나타내었다. 본발명에서사용되는용어는본발명의맥락 (context) 및각용어가사용되는구체적인맥락내에서당업계에 - 7 -

8 서보통사용되는의미를가진다. 당업자에게본발명의조성물및방법을설명하고, 어떻게제조하고사용하는지에관한추가적인설명을제공하기위한특정용어는하기또는본명세서의다른곳에서설명한다. 용어사용의범위또는의미는상기용어가사용되는특정문맥에서명확할것이다. " 약 " 또는 " 대략 " 은측정의본질 (nature) 또는정밀성 (precision) 에의한측정되는양 (quantity) 의허용가능한정도의오차를의미한다. 보통, 예시적인오차의정도는주어진값또는값의범위의 20% 내이며, 바람직하게는 10% 내이며, 보다바람직하게는 5% 이다. 대체하여, 또한, 특히, 생물학적시스템에서는 " 약 " 및 " 대략 " 이라는용어는크기차수 (order of magnitude) 내중간값 (mean value) 을의미할수있다. 바람직하게는주어진값의 5배 (5-fold) 내, 보다바람직하게는 2배 (2-fold) 내를의미할수있다. 여기에서주어지는수치량 (numerical quantity) 은다르게표현되지않는한, 근사값 (approximate) 이며, 이는 " 약 " 또는 " 대략 " 이라는용어없이도이를유추할수있다는것을의미한다. [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] 본발명의방법은서열을서로비교하는단계를포함할수있고, 이는야생형서열을한개또는그이상의변이체 ( 서열변이체 ) 에비교하는것을포함할수있다. 상기와같은비교는통상적으로폴리머서열의정렬 (alignment) 을포함하고, 예를들어당업계에알려진서열정열프로그램및 / 또는알고리즘 ( 예를들어, 몇가지만나열하자면 BLAST, FAST, 및 MEGALIGN) 을사용하는것을포함한다. 숙련된당업자는이러한정렬에서, 변이가잔기의도입또는결실을포함하는경우, 서열정렬은도입되거나결실된잔기를포함하지않는폴리머서열에 " 갭 (gap)"( 통상적으로대쉬 (dash) 또는 "A" 로표현된다 ) 을도입하는것을손쉽게인식할수있다. 본발명의방법은통계학적인계산, 예를들어 IC50 또는 EC50 값의결정등을포함할수있다. 숙련된당업자는이러한계산은다양한상업적으로이용가능한소프트웨어, 예를들어 PRISM (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA) 또는이와유사한것을이용하여수행될수있음을손쉽게인식할수있다. " 상동 ", 이의모든문법적형태 (grammatical form) 및철자변형 (spelling variation), 은동일종의생물내상과 (superfamilies in the same species of organism) 으로부터유래된단백질및다른종의생물로부터유래된상동단백질을포함하는, " 공통된진화적기원 (common evolutionary origin)" 을가지는두단백질간의관계를의미한다. 이러한단백질 ( 또한이들을코딩하는핵산 ) 은퍼센트동일성 (percent identity) 측면또는또는특정잔기또는모티프 (motif) 및보존된위치 (conserved position) 가존재하는지여부에따라이들의서열유사성에의해반영되는서열상동성을가진다. 그러나, 통상적인사용및본발명에서, " 상동 " 이라는용어는 " 높은 " 과같은부사로수식될경우, 서열유사성을의미할수있고, 통상적인진화적기원에관계될수도있고, 아닐수도있다. 본발명에서, " 서열유사성 " 이란용어는, 이의모든문법적형태에서, 공통의진화적기원을공유하거나공유하지않는핵산또는아미노산서열간의동일성또는상응성의정도를의미한다. 본발명에서, " 단백질 " 및 " 폴리펩티드 " 는상호교환적으로사용된다. 보통, 포유류에서사용되는본발명의 OPG-유래단백질은 CHO 또는 HEK293 세포주 (cell line) 와같은포유류세포에서발현되어, 적절한번역후수식 (post-translational modification) 이가능하지만, 다른포유류발현세포주역시유용할것으로예상할수있다. OPG-유래단백질이생물학적기능에큰영향을미치지않고번역후수식될것으로예상할수있다. 특정측면에서, 본발명의 OPG-유래단백질분자의기능적인변이체 (functional variant) 는최소한인간 OPG의생물학적으로활성된부위및하나또는그이상의융합도메인을포함하는융합단백질을포함할수있다. 이러한융합단백질의잘알려진예는, 폴리히스티딘 (polyhistidine), Glu-Glu, 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (glutathione S transferase, GST), 티오레독신 (thioredoxin), 프로테인 A (protein A), 프로테인 G (protein G), 면역글로불린중쇄불변영역 (an immunoglobulin heavy chain constant region, e.g., an Fc), 말토스결합단백질 (maltose binding protein, MBP), 또는인간혈청알부민 (human serum albumin) 을포함할수있으나, 이에제한되는것은아니다. 융합도메인은바람직한성질을얻을수있도록선택될수있다. 예를들어, OPG 폴리펩티드부위는 OPG 폴리펩티드를생체내 (in vivo) 에서안정화시키는도메인 (" 안정화 (stabilizer)" 도메인 ) 과융합될수있고, 선택적으로적합한펩티드링커를통해융합될수있다. 용어, " 안정화 (stabilizing)" 은체순환 (systemic circulation) 내폴리펩티드의반감기를증가시키는어느것이든의미할수있고, 분해 (destruction) 의감소에의한것인지, 제거 (clearance) 의감소에의한것인지, 또는다른약물동태학적인효과에의한것인지고려하지않는다. 면역글로불린 (immunoglobulin) 의 Fc 영역과의융합은특정단백질의바람직한약물동태학적인성질을부여하는것으로알려져있다. 유사하게, 인간혈청알부민에의융합도바람직한성질을부여할수있다. 선택가능한다른유형의융합도메인은다량체화 (multimerizing, 예를들어, 이량체화 (dimerizing), 4량체화 (tetramerizing)) 도메인, 및생체내 (in vivo) 에서목적하는부위에서 - 8 -

9 의활성 (action) 의축적을촉진시키는것과같은추가적인생물학적기능을부여하는기능적도메인 (functional domain) 을포함한다. [0031] [0032] 특정측면에서, 본발명은인간 OPG (GenBank: U ) 의선두 215개아미노산, 및이에연결된인간 Ig 감마 -1 (GenBank: J ) 의 Fc 부분의 227개아미노산을포함하는폴리펩티드를제공한다. 하나의구체예로서, 본발명의단백질분자는서열번호 : 1의아미노산서열을포함한다. hopg-higg1-fc 폴리펩티드 ( 서열번호 : 1) [0033] [0034] [0035] 특정측면에서, 본발명은인간 OPG의선두 215개아미노산, 및이에연결된, 선택적으로플렉서블링커 (flexible linker) 에의해연결된, 인간 Ig 감마-1의 Fc 부분의 227개아미노산을포함하는폴리펩티드를코딩하는오픈리딩프레임 (open reading frame) 을가지는재조합 DNA 분자를제공한다. 하나의구체예로서, 본발명의상기재조합 DNA 분자는서열번호 : 2의뉴클레오티드서열을포함한다. hopg-higg1-fc DNA ( 서열번호 : 2) [0036] [0037] 특정측면에서, 본발명은인간 OPG의선두 215개아미노산, 및이에연결된, 선택적으로플렉서블링커 (flexible linker) 에의해연결된, 인간 Ig 감마-1의 Fc 부분의 227개아미노산을포함하는폴리펩티드를과발현 (high expression) 하기위한재조합포유류발현플라스미드를제공한다. 상기플라스미드는상기폴리펩티드를코딩하기위한유전자의전사를유도 (drive) 하기위한사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus, CMV) 프로모터, 및이에연결된 bgh 폴리아데닐화 (polyadenylation) 및전사종료서열 (transcriptiton termination sequence) 을포함한다. 상기플라스미드는또한, 박테리아에서플라스미드증식및선택을돕기위한, puc 복제원점 (origion of replication) 및앰피실린저항성을부여하는 β-락타마제유전자 (β-lactamase gene) 을포함한다. 상기플라스미드는안정적인 CHOK1 및 NSO 세포주를형성하는데폭넓게사용되는선택마커인글루타민 - 9 -

10 합성효소 (Glutamine synthetase) 를코딩하는유전자를추가적으로포함한다. [0038] [0039] 하나의구체예로서, 본발명의포유류발현플라스미드는서열번호 : 3 의뉴클레오티드서열을포함한다. hopg-higg1-fc 발현플라스미드 ( 서열번호 : 3) [0040]

11 [0041]

12 [0042]

13 [0043] [0044] [0045] 특정측면에서, 본발명은인간 OPG의선두 215개아미노산, 및이에연결된, 선택적으로플렉서블링커 (flexible linker) 에의해연결된, 인간 Ig 감마-1의 Fc 부분의 227개아미노산을포함하는폴리펩티드를생산하기위한포유류발현시스템을제공한다. 상기본발명의발현시스템은인간 OPG의선두 215개아미노산, 및이에연결된, 선택적으로플렉서블링커에의해연결된, 인간 Ig 감마-1의 Fc 부분의 227개아미노산을포함하

14 는폴리펩티드를과발현하기위한재조합포유류발현플라스미드를가지는포유류세포를포함한다. [0046] [0047] 하나의구체예로서, 본발명의포유류발현시스템은서열번호 : 3의뉴클레오티드서열을포함하는플라스미드를가지는중국햄스터난소세포 (chinese hamster ovary cell, CHO-K1) 를포함할수있다. 특정측면에서, 본발명은골재흡수 (resorption) 또는골재형성 (remodeling) 연관된질환에의해영향을받은포유류의치료방법을제공한다. [0048] 도면의간단한설명 하기의도면및설명은본발명을이해하는것을돕기위해제공된다. 도 1은 BIAcore X100에의해생성된, 다양한 rshrankl 농도에서의데노수맙 (Denosumab) 의결합및해리곡선에관한도이다. 도 2는 BIAcore X100에의해생성된, 다른 RANKL 농도에서의서열번호 : 1의폴리펩티드의결합및해리곡선에관한도이다. 도 3은 0일차시점 ( 패널 A), 67일차시점 ( 패널 B), 및 176일차시점 ( 패널 C) 에서분석된, 서열번호 : 1의폴리펩티드의대표적인크기-배제 HPLC 크로마토그램 (size-exclusion (SEC) HPLC chromatogram) 에관한도이다. 도 4는 0.3, 3, 10, 및 30 mg/kg의용량으로피하경로 (subcutaneous route of administration) 로투여되는, 서열번호 : 1의영장류단일폴리펩티드 (primate single polypeptide) 의 C max 및 AUC last 에관한용량선형성 (dose linearity) 에관한도이다. 도 5는서열번호 : 1의영장류단일폴리펩티드 (primate single polypeptide) 의용량시험 (dose study) 결과에관한도로서, 0.3, 3, 10, 및 30 mg/kg의용량으로피하경로 (subcutaneous route of administration) 로투여된복용량에대한 C max 및 AUC last 의한용량에의해보정된도이다. [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] 발명을실시하기위한구체적인내용실시예다음의실시예는상술한양태및본발명의다른측면을설명한다. 이러한비제한적인실시예는본발명에서기재된화합물, 조성물, 물품, 장치, 및 / 또는방법을제조또는평가하는방법에대한예시적인실험양태를당업자에게제공하기위해기재되었다. 상기실시예들은본발명을예시하기위한것일뿐본발명의범위가이들로한정되는것은아니다. 숫자 ( 예를들어, 양, 온도등 ) 의정확성을확실히하기위해노력하였지만, 오차및편차는고려되어야한다. 실시예 1: 본발명의폴리펩티드제조서열번호 : 1의 hopg-higg1-fc 폴리펩티드는당업계에공지된세포배양및단백질생화학적기술을이용하여분자생물학적으로 CHO-K1을발현하였고, PCT 공보 (WO/2013/147899) 에설명하였다. 구체적으로, 폴리펩티드를발현하는 CHO-1 세포는잘기술된프로토콜을사용하여수집하고용해시켰다. 세포용해물의여과 (clarification) 후, 발현된 hopg-higg1-fc 폴리펩티드를포함하는상등액은단백질 A 친화성컬럼에먼저적용하였다. 단백질 A 컬럼용출액에 ph를맞추고, Q ㅅ세파로스레진을사용하여양이온교환크로마토그래피 (AIEX) 로추가정제하였다. AIEX 관류 (flowthrough) 는크기배제 HPLC (SEC-HPLC), SDS-PAGE, 및다른적절한분석기술에의해분석하였다. 후속연구의경우, HOPG-hIgG1-FC 폴리펩티드를포함하는치료용조성물은 1 % 수크로스, 100 mm 염화나트륨, 20 mm L-아르기닌염산염및 25 mm 인산나트륨 (ph 6.3) 를포함하는 4 ml에 40 mg hopg-higg1-fc 폴리펩티드를포함하여제조하였다. 싱글바이얼은 4 ml 안에약 40 mg higg1-fc 폴리펩티드를포함한다. 따라서, 바이얼의단백질농도는 10±1 mg / ml이다. 실시예 2: 표면플라즈몬공명 (SPR) 분석을통해본발명의 RANKL에대한 affinity 결합의폴리펩티드평가핵인자카파-B 리간드 (Nuclear Factor Kappa-B Ligand) (rshrankl) 의재조합수용성인간수용체활성제에대한서열번호 : 1의 hopg-higg1-fc 폴리펩티드의결합친화도는특별히설계된표면플라즈몬공명 (SPR) 분석을이용하여측정하였다. 분석은 hopg-higg1-fc 폴리펩티드를다른농도의 rshrankl 재조합단백질 A 용액을센서

15 표면에분배함으로써 SPR 센서표면에서포착하여결합및해리동역학을모니터링하였다. [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] 친화도는데이터에랑뮤어 (Langmuir) 결합모델이 1:1로피팅되게하여계산하였다. 실험재료, 시약및실험장비 : Biacore CM5 Sensor Chip (GE Healthcare); Amine Coupling Kit (GE Healthcare); 50 mm 수산화나트륨 (GE Healthcare); 1O mm Na아세테이트 ph 4.5 (GE Healthcare); Surfactance P20 (GE Healthcare); 글리신 (Sigma-Aldrich); 1Ox PBS 버퍼 (GE Healthcare) 버퍼 : 작용버퍼 : PBS+0.05% Surfactance P20 (ph7.26) 재생버퍼 (Regeneration Buffer): 5.4 ml의 lo mm 글리신버퍼 ml의 lo mm 글리신버퍼 (ph 1.7) 실험재료 : 데노수맙 (Prolia, commercial product, Amgen) 농도 60 mg/ml 상기실시예 1에따라제조한 hopg-higg1-fc 폴리펩티드 rshrankl 농도 0.76 mg/ml (13 μμ) 실험장비 : Biacore X100 Instrument (GE Healthcare) Biacore X100 Evaluation Software V2.0.1 (GE Healthcare) 과정 : 재조합단백질 A는 10 mm Na아세테이트 (ph 4.5) 로희석하여최종농도 mg/ml로하였다. 단백질 A를커플링키트및다음의파라미터 : a) 1:1 EDC:NHS를 7분간주입 ; b) 10 mm Na아세테이트 (ph 4.5) 로희석한단백질 A를 10 ul/ 분으로 5분간주입 ; c) 1 M 에탄올아민 (ph 8.5) 를 7분간주입 ; 을사용하여 Flow-Cell 1-2에고정시켰다. rshrankl (MW 57.9 kda) 는 BIAcore 작용버퍼를사용하여원하는농도로희석하였다. 5가지다른 rshrankl 희석액 ( nm, nm, nm, nm, nm) 은친화도측정에사용되었다. 6가지다른 rshrankl 희석액 ( nm, nm, nm, nm, nm, nm) 은데노수맙친화도측정에사용되었다. 데노수맙은 BIAcore 작용버퍼를사용하여최종농도 0.8 μm로희석하였다. hopg-higg1- Fc 폴리펩티드샘플은 BIAcore 작용버퍼를사용하여최종농도 37 nm로희석하였다. 분석프로토콜 : 분석은제조사프로토콜샘플실온도 (manufacturer's protocol Sample compartment temperature) 에따라 25 에서수행하였다.; 데이터수집속도-1 Hz; 유속-30 ul/ 분 ; rshrankl의 5가지다른농도는 hopg-higg1-fc 펩티드평가 (4.166 nm 희석액은 2번측정 ); rshrankl 리간드의 6가지다른농도는데노수맙평가에사용하였다. 모든측정은다음과같이수행하였다 : 180초접촉시간으로데노수맙 / hopg-higg1-fc 캡쳐 ; 3600초동안작용버퍼로해리 ; 70초동안재생버퍼를사용하여재생. Biacore X100 평가소프트웨어는각샘플에대한동력학결합 (ka) 및해리 (Kd) 상수, 평형해리상수 (KD) 및최고 RANKL 결합수준 (R max ) 을측정하는데사용하였다. 모델파라미터는데이터에대해랑뮤어결합모델이 1:1 이되도록하여독립적으로각샘플에대하여측정하였다. [0074] [0075] [0076] 각기다른 RANKL 농도에서의데노수맙의결합및해리곡선은도 1에나타내었다. 각곡선에대한상관데이터는표 1에나타내었다. Biacore X100 평가소프트웨어를통해측정된데노수맙-RANKL 결합의모델파라미터는표 2에나타내었다. RANKL 에결합하는항-RNAKL 항체데노수맙의친화도 (KD) 는제조사의데이터와일치한 2.6 1O -11 M 이였다. [ 표 1]

16 [0077] 데노수맙 -rshrankl 결합에대한상관데이터 [0078] [0079] [0080] [ 표 2] 데노수맙 -rshrankl 결합을측정하는데사용한모델파라미터 [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] rshrankl의다른농도별 hopg-higg1-fc 폴리펩티드의결합및해리커브는도 2에나타내었다. 각커브의상관데이터는표 3에나타내었다. Biacore X100 평가소프트웨어를이용하여측정한 hopg-higg1-fc-rankl 결합의모델파라미터는표 4에나타내었다. RANKL에결합하는 hopg-higg1-fc의 affinity (KD) 는 O -13 M 이였다. [ 표 3] hopg-higg1-fc-rankl 결합의각커브에대한상관데이터 [0086] [0087] [ 표 4] [0088] [0089] 따라서, rhsrankl 에결합하는서열번호 : 1 의 hopg-higg1-fc 폴리펩티드의친화도 (KD) 는약 4.9 1O -13 M 이였고, 실질적으로유사한실험조건에서약 2.6 1O -11 M 로측정되는시중의데노수맙에비해약 50 배높은 것이다. [0090] [0091] 실시예 3: hopg-higgl-fc 폴리펩티드의제형 (formulation) 안정성연구서열번호 : 1의 hopg-higgl-fc 폴리펩티드를앞서기본적으로개시된대로발현및정제하였다. hopg-higgl-fc 폴리펩티드의장기간안정성연구 (Long-term stability study) 는 2-8 에서제품 (product) 안정성예측 (estimate) 을수행하였다. hopg-higgl-fc 폴리펩티드가속안정성연구 (accelerated stability study) 는서로다른조성의제형버퍼에서제품안정성을평가하기위해 40 에서수행하였다. 폴리펩티드안정성은 SEC HPLC

17 로분석하였다. SEC HPLC 크로마토그램의통합 (Integration) 은 hopg-higgl-fc 폴리펩티드단량체 (monomers), 응집체 (aggregates) 및분해제품 (degradation products) 의평가및단백질조성의변화를모니터링하기위해수행하였다. hopg-higgl-fc 폴리펩티드를스크류캡으로닫힌바이알 (screw capped vials) 에분주하였다 (aliquoted). 분취물 (aliquots) 은지정된온도에서어두운곳에요구되는시간의기간 (required periods of time) 동안보관하였다. [0092] [0093] 재료및장치 : 모든시약 (reagents) 은적어도 HPLC 등급을사용하였다 : Milli-Q 워터 ( 또는등가물 ); 염화나트륨 (JT Baker); 이염기성인산나트륨 (Sodium 포스페이트 Dibasic), 헵타하이드레이트 (Heptahydrate)(Na 2 HP0 4.7H 2 0, JT Baker) 또는이염기성인산나트륨무수물 (Sodium 포스페이트 Dibasic Anhydrous)(Na 2 HP0 4, JT Baker); 6 N 염산 (Hydrochloric Acid)(JT Baker); 수산화나트륨 (Sodium Hydroxide) 6 N NaOH(BDH); 아지드나트륨 (Sodium Azide)(Sigma Aldrich); 메탄올 (JT Baker); rhsrankl(alphamab, Inc.); 염소항-인간 IgG:HRP 콘쥬게이트 (goat anti-human IgG:HRP conjugate)(perkin-elmer). [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] ph 미터 (ph Meter)(Coming Pinnacle 542); 분석저울 (Analytical Balance)(Mettler Toledo XS603S); PDA 및엠파워소프트웨어를갖는워터 HPLC 시스템 (Waters HPLC System with PDA and Empower Software); YMC-Pack Diol 300, 6.0 mm ID 30 cm, (YMC 카탈로그넘버 (Catalog Number) DL06S053006WT); G2000 SWxl, 7.5 mm 300 mm (TOSOH Bioscience); TSK Guard SW, 7.5 mm 75 mm (TOSOH Bioscience); 2 μm프릿을갖는인라인필터 (Inline Filter with 2 μm Frit)(VWR 카탈로그넘버 ); 교체의 (replacement) 2 μm프릿 (Frit)(VWR 카탈로그넘버 ); 필터, PES, 1000 ml (Nalgene, 카탈로그넘버 ); 토탈리커버리바이알 (Total Recovery Vial), PTFE/ 실리콘셉타를갖는스크류탑 mm 캡 (screw top mm cap with PTFE / Silicone septa)(waters); 접합된프리-슬릿 PTFE/ 실리콘셉타를갖는캡 / 셉타 스크류넥 (Cap/Septa screw neck with bonded pre-slit PTFE/Silicone septa)(waters). 버퍼 (Buffers): 이동상버퍼 (Mobile Phase buffers): 100 mm Na포스페이트, YMC-Pack Diol 300 컬럼 (column) 을위한 200 mm NaCl ph 7.0 (PBS) 20 mm Na포스페이트, 300 mm NaCl, ph 7.4 버퍼. 여과및탈기된 (Filtered and degassed) G2000SWxl 컬럼약물제형 (drug formulation) 버퍼는다음과같이준비하였다 : mm Na포스페이트, 100 mm NaCl, 25 mm L-아르기닌 HCl (L-Arginine HCl), 10 mg/ml 수크로스, ph mm Na포스페이트, 100 mm NaCl, 25 mm L-아르기닌 HCl, 10 mg/ml 수크로스, ph mm 히스티딘 (Histidine), 100 mm NaCl, 25 mm L-아르기닌 HCl, 10 mg/ml 만니톨 (Mannitol), ph mm 히스티딘, 50 mm NaCl, 25 mm L-아르기닌 HCl, 25 mg/ml 만니톨, ph mm 히스티딘, 50 mm NaCl, 25 mm L-아르기닌 HCl, 25 mg/ml 만니톨, 0.1 mg/ml 메티오닌 (Methionine), ph mm 히스티딘, 100 mm NaCl, 25 mm L-아르기닌 HCl, 10 mg/ml 만니톨, ph mm 히스티딘, 50 mm NaCl, 25 mm L-아르기닌 HCl, 25 mg/ml 만니톨, ph mm 히스티딘, 50 mm NaCl, 25 mm L-아르기닌 HCl, 25 mg/ml 만니톨, 0.1 mg/ml 메티오닌, ph 6.3 과정 (Procedures): 1 mg/ml 또는 2 mg/ml의단백질농도로도달시키기위하여샘플을이동상으로희석하였다. 크로마토그래피파라미터 (Chromatography parameters): 유량 (Flow Rate): 0.5 ml/ 분컬럼온도 : 25 ± 3 오토샘플러 (Autosampler) 온도 : 5 ±

18 [0114] [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] [0122] [0123] [0124] 주입부피 (Injection Volume): 2 mg/ml의폴리펩티드농도를갖는샘플의경우 15 μl 1 mg/ml의폴리펩티드농도를갖는샘플의경우 25 μl탐지기파장 (Detector Wavelength): 2 mg/ml의폴리펩티드농도를갖는샘플의경우 280 nm 1 mg/ml의폴리펩티드농도를갖는샘플의경우 214 nm 작동시간 (Run Time): 35분두벌 (two lots) 의 hopg-higgl-fc 폴리펩티드각각의제조물 (preparations) 을테스트하였고, 둘모두는약 10 mg/ml 단백질농도에서 25 mm Na포스페이트, 100 mm NaCl, 25 mm L-아르기닌 HCl, 10 mg/ml 수크로스, ph 6.3으로제제화된것이었다. hopg-higgl-fc 폴리펩티드의다른두벌의제조물에대한 2-8 안정성연구는하기표 5 및표 6에요약하였다. [ 표 5] 안정성연구시점에서 hopg-higgl-fc 폴리펩티드조성 [0125] [0126] [0127] [ 표 6] 안정성연구시점에서 hopg-higgl-fc 폴리펩티드조성 [0128] [0129] [0130] [0131] [ 표 7] 가속안정성연구시점에서 hopg-higgl-fc 폴리펩티드조성 ( 제형버퍼 F1-F8) F1-25 mm Na 포스페이트, 100 mm NaCl, 25 mm L- 아르기닌 HCl, 10 mg/ml 수크로스, ph 6.3 [0132]

19 [0133] F2-25 mm Na 포스페이트, 100 mm NaCl, 25 mm L- 아르기닌 HCl, 10 mg/ml 수크로스, ph 6.8 [0134] [0135] F3-20 mm 히스티딘, 100 mm NaCl, 25 mm L- 아르기닌 HCl, 10 mg/ml 만니톨, ph 6.8 [0136] [0137] F4-20 mm 히스티딘, 50 mm NaCl, 25 mm L- 아르기닌 HCl, 25 mg/ml 만니톨, ph 6.8 [0138] [0139] F5-20 mm 히스티딘, 50 mm NaCl, 25 mm L- 아르기닌 HCl, 25 mg/ml 만니톨, 0.1 mg/ml 메티오닌 (Methionine), ph 6.8 [0140] [0141] F6-20 mm 히스티딘, 100 mm NaCl, 25 mm L- 아르기닌 HCl, 10 mg/ml 만니톨, ph 6.3 [0142]

20 [0143] F7-20 mm 히스티딘, 50 mm NaCl, 25 mm L- 아르기닌 HCl, 25 mg/ml 만니톨, ph 6.3 [0144] [0145] F8-20 mm 히스티딘, 50 mm NaCl, 25 mm L- 아르기닌 HCl, 25 mg/ml 만니톨, 0.1 mg/ml 메티오닌, ph 6.3 [0146] [0147] [0148] [0149] [0150] 표 7에요약된결과에서명백한것은, 제형버퍼에 10 mg/ml까지의만니톨의추가는 hopg-higgl-fc 폴리펩티드조성안정성을향상시켰다. 그러나, 제형버퍼에 6.3부터 6.8까지의 ph 증가는제품안정성에영향을미치지않으며, NaCl 농도에서도변하지않았다. Lot No 2 제조물의안정성을또한상온 (room temperature, RT) 에서테스트하였다. 제조물을 0.9% NaCl로희석하였고, 각각 0.6, 1.2, 1.8 mg/ml의총단백질농도를갖도록하였다. 샘플을상온에서 24시간동안보관하였고, 0 hr 시점및 24 hr 시점에서분석하였다. hopg-higgl-fc 폴리펩티드조성안정성을단백질조성의강도및 ELISA를모니터하는 SEC HPLC로분석하였고, RANKL에대한표준시료 (reference standard) 결합의 % 의허용기준 (acceptance criteria) 으로 RANKL에대한 hopg-higgl-fc 폴리펩티드결합을평가하였다. 연구의결과는표 8에요약하였다. [ 표 8] RT 안정성연구시점에서 hopg-higgl-fc 폴리펩티드조성 [0151] [0152] [0153] [0154] [0155] 표 8에요약된결과에서명백한것은, hopg-higgl-fc 폴리펩티드 10 mg/ml 스톡 (stock) 을 0.6 mg/ml, 1.2 mg/ml 및 1.8 mg/ml으로희석하고, 상온에서 24시간동안보관하면조성의강도및결합활성은표준시료와유사해진다는것을입증하였다. 따라서, 상기데이터를통해약물제조및정맥내투여를위한충분한시간동안후에재구성된 (postreconstituted) hopg-higgl-fc 폴리펩티드용액의안정성을확인하였다. Lot No 2의장기간안정성 (Long-term stability) 을 2-8 에서테스트하였다. 이연구의결과는표 9에요약하였다. [ 표 9]

21 [0156] hopg-higgl-fc 폴리펩티드 2-8 장기간안정성연구결과 [0157] [0158] [0159] [0160] [0161] [0162] [0163] 표 8에요약된결과에서명백한것은, 100 mm NaCl, 25 mm L-아르기닌 HCl, 10 mg/ml 수크로스, ph 6.3으로제형화된서열번호 : 1의 hopg-higgl-fc 폴리펩티드는 10 mg/ml에서구조적안정성및구체적인활성을적어도 6개월동안유지하였다. 실시예 4: 영장류에서 hopg-higg1-fc 폴리펩티드단일용량 (Single dose) 의약동학 (Pharmacokenetics) 연구 0.3, 3, 10, 30 및 100 mg/kg의용량수준 (dose level) 으로피하주입또는 0.3, 3 및 10 mg/kg의용량수준으로정맥내주입통해 hopg-higg1-fc 폴리펩티드단일용량을받은 12 마리의사이노몰거스원숭이 (Synomolgus monkey) ( 수컷 6 마리및암컷 6 마리 ) 로, 피하및정맥내 ( 볼러스 ) 주입에따른 hopg-higg1-fc 폴리펩티드의약동학프로파일및최대내성용량 (maximum tolerated dose) 을연구하였다. 피하투여 (dosin g) 는 1 ml/kg의용량부피 (dose volume) 로이루어진반면, 정맥내투여는 2 ml/kg의용량부피로이루어졌다. 상기실험물질의농도는 9.73 mg/ml 이었으며, 고용량수준 (higher dose level) 을위하여상기용량부피는상기표적용량수준 (target dose level) 을달성하기위하여조정되었다 ( 동물체중에좌우됨 ). 요구되는투여농도 (dose concentration) 에대한시험물질의준비를위하여다음의담체 (vehicle) 가이용되었다 ; 포뮬레이션버퍼 (formulation buffer)(1% w/v의수크로스, 100 mm의염화나트륨, 20 mm의 L-아르기닌염산염 (L-Arginine Hydrochloride), 25 mm의탄산수소나트륨 (Sodium Bicarbonate), 6.3의최종조절된 ph (final adjusted ph)). 상기담체는냉장보관되었으며, 준비후 1주일이내에사용되었다. 실험이시작된당시, 상기동물은약 2 내지 4세의수명및약 2 내지 4kg의체중을가졌다. 하루두번상기동물의임상증상 (clinical sign) 을관찰하였다. 각각의용량증가 (dose escalation) 에앞서체중을기록하였다. 실험이진행되는동안사료소비량 (food consumption) 은육안으로평가하였다. 혈액학 (haematology) 의임상병리학적조사 (clinical pathology investigation) 및임상화학을위하여, 임상 1회의사전평가 (pretrial) 및각각의용량수준이후 24시간에혈액샘플을수집하였다. 초기에상기동물을두투여그룹 (2 dose group) 으로나누었으며다음과같이처리하였다. [0164]

22 [0165] 이후, 상기동물에다음과같이투여하였다. [0166] [0167] [0168] * 사전적으로 0.3 mg/kg의 hopg-higg1-fc 폴리펩티드가투여된동물, ** 순수동물 (Naive animals) 두마리의동물 (2 animals) 에대한추가적인피하투여는간효소활성을평가하기위하여이루어졌으며 ( 즉, 아스파르트산아미노기전달효소 (Aspartate Aminotansferase), 알라닌아미노기전달효소 (Alanine Aminotransferase) 및젖산탈수소효소 (Lactate Dehydrogenase)), 용량은다음과같다 : [0169] [0170] [0171] *** 피하경로를통해사전적으로 0.3 mg/kg 의 hopg-higg1-fc 폴리펩티드가투여된동물 두마리의동물은용량관찰기간후 2 주뒤에 100 mg/kg 의 1 회피하주입을받았다. 간효소활성에대한혈 액샘플을수집하였다. [0172] [0173] [0174] [0175] 두동물모두피하경로를통한 0.3 및 10 mg/kg, 정맥내경로를통한 0.3 및 3 mg/kg의 hopg-higg1-fc 폴리펩티드가사전적으로각각투여되었다. 각용량증가의지정된시점에서약동학적조사를위한혈액샘플을수집하였다. 윈논린 (WinNonlin ) 의피닉스 (Phoenix )( 파사이트코포레이션 (Pharsight Corporation) 으로부터의버전 6.1) 를사용한비구획적방법 (non-compartmental method) 을사용하여, hopg-higg1-fc 폴리펩티드플라즈마수준에대한약동학적분석에착수하였다. 관찰된개별적인수치로부터 Co (T = 0일때정맥주입에서의추론농도 ), C max ( 피하주입에서의최대농도 ) 를얻었다. 혼합대수-선형회귀 (mixed logarithmic-linear regreesion) 로 AUC last ( 마지막데이터지점에서의곡선아래의면적 (Area Under the Curve to the last data point) 을결정하였다. [0176] PK 데이터로부터의결과는 hopg-higg1-fc 폴리펩티드의 C max 가 0.3, 3, 10, 30 mg/kg 의용량수준의피하주입 후약 6 내지 8 시간에, 0.3 및 3 및 10 mg/kg 의용량수준의정맥내주입후약 1 시간에나타남을보여주었다. hopg-higg1-fc 폴리펩티드의클리어런스 (clearance) 는정맥내및피하경로투여로부터약 168 시간후에나타 났다. [0177] 피하 (SC) 경로의경우, 최저용량 (0.3 mg/kg) 및동물 0590 (3 mg/kg) 각각에서관찰된 1 시간및 2 시간의 T lag 에서보듯이 hopg-higg1-fc 폴리펩티드가항상즉시흡수되는것은아니었다. 3 및 10 mg/kg 용량값에근거 하는, 정맥내및피하경로에대한약 55시간및 45시간의 T half 와함께, 상기 T half 값은 hopg-higg1-fc 폴리펩티드의제거가상대적으로느리다는것을나타냈다. 정맥내 (IV) 경로의경우, 상기 T half 는 27.5시간내지 57.8 시간으로분포하였고, 피하내경로에서는 35.5시간내지 53.3시간으로분포하였다. 상기제거속도는투여속도와동시에증가됨 (concomitant increase) 을보이지않았다. 상기제거는두경로에서유사했다. 정맥내및피

23 하경로에서, Cl 및 V d 는투여용량에관계없이유사했다. 정맥내경로에서, 상기 Cl 및 V d 는각각 0.75 내지 1.22 ml/h/kg 및 48.3 내지 76.6 ml/kg의범위를이루었다. 피하경로에서상응하는범위는 0.97 내지 1.69 ml/h/kg 및 65.3 내지 94.6 ml/kg이었다. Cl 및 V d 는용량이증가함에따라증가되지않았다. 상기결과는상기 T half, Cl 및 V d 가투여용량에독립적임을나타낸다. hopg-higg1-fc에대한노출의선형성 (linearity) 은오직선형회귀 (linear regression) 로부터의 C max 및 AUC last 에의해피하경로에대하여도표로서결정되었으며, 이는도 4에나타내었다. 노출값 (Exposure) 은선형적으로증가하였는데, AUC last 및 C max 에대한 R 2 는각각 0.96 및 0.98이다. [0178] SC 경로의경우, C max 값에근거할때, 용량비례값 (dose proportionality) 이관찰될수있는것으로보였다 ( 도 5). 용량에의해수정된평균 C max 는 0.3, 3 10 및 30 mg/kg 용량에대하여각각 6410, 11309, 및 (ng/ml)/(mg/kg) 이었다. 용량비례는 3부터 0.3 mg/kg 용량으로명확하게증명되었다. 상기노출값 (exposure) 은다른세용량과비교할때 0.3 mg/kg 용량사이의비례값보다더욱증가하였다. 실제로, 0.3 내지 3 mg/kg 사이에서 10배의용량증가, 0.3 내지 10 mg/kg 사이에서 33.3배증가및 0.3 내지 30 mg/kg 사이에서 100배증가에대하여, 각각 C max 는 17.6, 54.1 및 183.1배증가하였다. 상응하는 AUC last 값은각각 82.3, 및 이며, 이는용량비율에비하여노출값이약 10배증가하였음을나타내었다. [0179] 3 내지 10 mg/kg 사이에서, 상대적용량비례값은 C max /D 및 AUC last /D 에근거하여나타났으며, 이는이론적용량 비율 (theoretical dose ratios) 에가까운상기용량비례값계산에의해확인되었다. [0180] [0181] 정맥내경로에서, 노출값은용량비례값보다약간증가했으며, 용량이 3.3 배증가함에따라 AUClast 및 Cmax 가 각각 4.3 및 4.1 배증가했다. 따라서, AUC last 및 C max 는상대적으로용량 - 비례적인오직 3 내지 30 mg/kg 의노출값에따라연속적으로증가했 다 (R 2 1.0). 상기결과는조직상의 (systemic) 노출값이피하투여후 3 내지 30 mg/kg 까지의용량증가에 따라거의비례적으로증가했음을나타낸다. [0182] [0183] 3 및 10 mg/kg과, 3 및 10 mg/kg에서대표적인 88.6% 및 59.2% 에서획득한평균값을이용하여 hopg-higg1-fc 폴리펩티드생체이용율 (bioavailability) 을측정하였다. hopg-higg1-fc 폴리펩티드는 10 mg/kg (59.2%) 에비해 3 mg/kg (88.6%) 에서우수한생체이용율을가지는것으로보였다. 따라서, 본연구의결과에서명백하듯이, 모든동물은측정된두가지투여경로로모든투여용량으로 hopghigg1-fc 폴리펩티드에노출되었다. 피하주입이후, hopg-higg1-fc 폴리펩티드 (AUC last and C max ) 에대한조직 노출값이용량의증가에따라, 오직 3 내지 30 mg/kg인상대적으로용량-비례적인노출값과함께연속적으로증가했다. 제거속도는용량증가에영향을받지않았으며, 두경로에서유사하게나타났다. Cl 및 V d 는투여경로에관계없이, 투여용량과무관하게유사하게나타났다. 상기결과는 T half, Cl 및 V d 가투여용량에독립적임을보여준다. 본결과는 hopg-higg1-fc 폴리펩티드가 10 mg/kg (59.2%) 에비하여 3 mg/kg (88.6%) 에서더우수한생체이용율을가지는것을나타낸다. [0184] [0185] [0186] 영장류에서피하및정맥내일회량투여이후 hopg-higg1-fc 폴리펩티드에대한평균플라즈마약동학적파라미터 (mean plasma pharmacokinetic parameter) 를하기표 9에요약하였다. [ 표 9] 영장류에서피하및정맥내일회량투여이후 hopg-higg1-fc 폴리펩티드에대한평균플라즈마약동학적파라미터의요약

24 [0187] [0188] [0189] [0190] [0191] [0192] *NC: 계산되지않음실시예 5: 영장류에서 hopg-higg1-fc 폴리펩티드의반복투여량약동력학연구반복투여량약동력학분석은각각메인그룹과 2주연속으로주당 2회씩 0, 0.3, 3 및 10 mg/kg (n=3마리/ 성별 / 그룹 ) 을피하투여처리된회복그룹에서 3마리의수컷과 3마리의암컷으로이루어진네그룹의사이노몰구스원숭이들의독물동력학연구를진행하는동안완료되었다. 독물동력학분석은오직 hopg-higg1-fc 폴리펩티드가주입된동물들에서만진행되었다. 혈장수준의독물동력학분석은 Phoenix for WinNonlin (version 6.1, Pharsight Corporation) 을이용하여비구획적방법 ( 동역학의일수마다, 1일차와 13일차 ) 을통해진행되었다. 따라서, 약동력학적매개변수는각각 1일차와 13일차에투여가완료된후비교되었다. 본연구는하기한것과같다. 통제그룹 ( 그룹 1) 의암컷한마리와수컷한마리에서 hopg-higg1-fc 폴리펩티드가측정되었는데도해당그룹에서수치화할수없는농도가측정되었다. 모든동물들은 2주간주당 2회씩 0, 0.3, 3 및 10 mg/kg 분량의 hopg-higg1-fc 폴리펩티드에노출되었다. hopg-higg1-fc 폴리펩티드 ( 평균적 AUC 72 및평균적 C max ) 로부터의전신적노출은수컷과암컷모두의투여량과함께증가되었다. 2주투여후 hopghigg1-fc 폴리펩티드의적당한축적이관찰되었다. 투여기간은투여량수준에의존하지않았다. C max 와 AUC 72 는수컷과암컷모두모든투여량에서의반복투여에따라증가되었고, 이는 13일차와 1일차사이의 AUC 72 비율로나타냈다. 이비율은 0.28부터 2.50의범위로 hopg-higg1-fc 폴리펩티드의적당한혈장축적이확인되었다. 이축적은투여량에따라증가되었다. 개인간다양성보다높은성별효과는나타나지않았다. 결론지을수있는뚜렷한성별차이도없었으며이는수컷과암컷사이에차이가없다는것으로판단될수있었다. 성별차이측면에서노출은수컷과암컷모두 0.3부터 10 mg/kg의농도차이에걸쳐서비슷했다. 1일차와 13일차에 hopghigg1-fc 폴리펩티드로부터의전신적혈장노출이 0.3과 10mg/kg 사이에서양쪽성별모두투여량에비례한것보다증가되었다. 1일차를제외하고 AUC 72 와관련하여중간투여량및낮은투여량사이의암컷들과 C max 를기반으로한높은투여량과낮은투여량사이의수컷들에서투여량의비례성은관찰되지않았다. 13일차에, 혈장노출의증가는높은수준에서목표로한투여비율의최소 5배이상이었다. [0193] [0194] [0195] 영장류의반복투여량피하투여후 hopg-higg1-fc 폴리펩티드를위한평균혈장약동력학적매개변수는아래표 10에요약되어있다. [ 표 10] 2주간주 2회피하투여후 hopg-higg1-fc 폴리펩티드를위한수컷및암컷사이노몰구스원숭이들의평균혈장약동력학적매개변수의요약 (N=3/ 성별 / 투여그룹 )

25 [0196] [0197] [0198] [0199] 실시예 6: 사람의 hopg-higg1-fc 폴리펩티드단일투여량약동력학연구피하투여에따른서열번호 : 1의 hopg-higg1-fc 폴리펩티드의약동력학적프로필은 10mg, 30mg 그리고 60mg의투여량을피하투여를통해 hopg-higg1-fc 폴리펩티드의단일투여를받은건강한남성지원자들 (19-39세) 에서연구되었다. 약 10 mg/ml의총단백질농도에서 hopg-higg1-fc 폴리펩티드가사용된약제는 ph 6.3에서 25 mm 인산나트륨, 100 mm 염화나트륨, 25 mm L-아르기닌염산염, 10 mg/ml 수크로스로만들어졌다. 실험된세가지투여량을위한투여후다양한시간대에서의 hopg-higg1-fc 폴리펩티드혈액수준이표 11-13에요약되었다. 이결과는사람대상의체순환에서연구하에약물의중대한피하투여후생물학적이용도를나타낸다. [ 표 11]

26 [0200] 단일 10mg 투여량의피하투여후건강한지원자의 hopg-higg1-fc 폴리펩티드혈액수준 [0201] [0202] [0203] [ 표 12] 단일 30mg 투여량의피하투여후건강한지원자의 hopg-higg1-fc 폴리펩티드혈액수준 [0204]

27 [0205] [0206] [ 표 13] 단일 60mg 투여량의피하투여후건강한지원자의 hopg-higg1-fc 폴리펩티드혈액수준 [0207] [0208] [0209] [0210] [0211] [0212] 실시예 7: hopg-higg1-fc 폴리펩티드의인간조직에결합되는특성연구면역조직화학 (IHC) 의목적은서열번호 : 1의 hopg-higg1-fc 폴리펩티드의조직결합특성을결정하고, 상업적으로이용가능한치료제 (Prolia) 의패턴결합과비교하기위한것이다. 상업적으로가능한 TNF-α 결합된치료적에타너셉트 (therapeutic etanercept) 는이소형대조군 (isotype control) 으로서사용되었다. 방법적정실험은최소한의배경및신호의최대탐지로농도를설정하기위해 3개단백질치료제 (therapeutic) 인 hopg-higg1-fc-fitc, 프롤리아 (PROLIA) 및엔브렐 (ENBREL) (Covance에의해수행된 FITC (fluorescein isothiocyanate) 라벨링 ) 로수행되었다. LifeSpan에의해제공된냉동된인간조직에연속희석법은 20 μg/ml, 10 μg/ml, 5 μg ml, and 2.5 μg/ml로수행되었다. 또한, ENBREL은 1.25 μg/ml, 0.6 μg/ml, and 0.3 μ g/ml에서추가로적정하였다. hopg-higg1-fc-fitc, PROLIA-FITC, 및이소형대조군치료제인 ENBREL- FITC는주결합시약으로사용되었고, fuchsia-colored deposit 제조에사용된주검출시스템은항-마우스이차항체 (Vector, BA-2000), 및 ABC-AP 키트 (AP = alkaline phosphatase secondary, Vector, AK-5000) 레드기질키트 (Red substrate kit (Vector, SK-5100)), 및항-FIRC 마우스이차항체 (Sigma-Aldrich, catalog# F5636) 로구성되었다. 조직은조직항원이면역조직화학분석을위한접근및보존이되었는지확인하기위해양성대조군항체 (CD31 및 vimentin) 로염색하였다. 음성대조군은주요시약의부재또는일차시약및항-FITC 이차항체 ( 모든사례에서항-마우스 3차및전부다른하류시약을사용 ) 에인접하는부분의전체면역조직화학을수행하는것으로구성된다. 슬라이드는병리학자에의해해석되고, 각시약은특정신호의유무, 배경레벨및문헌에보고된표현결과의일치에대해평가되었다. 염색정도는 0-4 규모로기록되었다 (0= 음성, 1= 블러쉬, 2= 희미함, 3= 보통, 4= 강함 ). 슬라이드는니콘 (Nikon) 현미경이결합된 DVC 13 IOC 디지털카메라로촬영하였다. 실험결과는하기표 14에요약되어있다. [ 표 14]

28 [0213] 인간조직에서 IHC 연구의결과 [0214] [0215] [0216] [0217] [0218] [0219] [0220] hopg-higg1-fc-fitc의결과 : 5-10 μg/ml의농도의 hopg-higg1-fc-fitc는, 흉선내의흉선세포및맨틀영역포함한편도선림프구에서비정기 (occasional) 중등염색 (Moderate staining) 만보였다. 중등염색은가슴샘소체 (Hassall's corpuscle s) 에서보였다. 전립선은주로음성을나타내거나평활근에서비정기블러쉬염색을보였다. 고환내에서정조세포 (spermatogonia) 및비정기정모세포는드문블러쉬염색을보였고, 간질세포에서는음성을나타내었다. 자궁은자궁근층평활근에서블러쉬염색을보였고, 난소는기질세포에서블러쉬염색을보였다. 태반은융합세포영양막 (syncytiotrophoblasts) 의보통염색을보였으며, 내피세포및비정기기질세포에서보통염색으로희미하게나타났다. 소장은브러시테두리의강한염색과술잔세포무친 (goblet cell mucin) 의점액중간에상피의블러쉬염색을보였다. 혈관 (Vessels), 섬유아세포, 신경절 (ganglia) 및점막하의평활근및근층은음성이었다. 간부분은간세포의중간염색에서희미하게보였고, 시누소이드의라이닝세포의비정기중간염색에서희미하게보였다. 프롤리아-FITC의결과 : 벡터 g/ml의농도의프롤리아-fitc는편도선의림프구의하위집합, 특히, 림프여포의맨틀영역내에서보통부터가끔강한정도까지의염색을보여주었다. 그리고흉선의수질림프구의가끔씩강한염색과함께흉선세포의희미한정도부터중간정도의염색을보여주었다. 전립선은염색에서음성을나타내었다. 고환은정조세포 (spermatogonia) 에서드문블러쉬염색 (blush staining) 를보였으나, 정모세포및간질세포에서주로음성을나타내었다. 자궁은자궁근층의평활근의희미한염색을보였으며, 난소부분은혈관평활근의희미한염색을보였다. 태반은융합세포영양막 (syncytiotrophoblasts) 의보통염색을보였으며, 내피세포및비정기기질세포에서보통염색을희미하게보였다. 소장은브러시테두리강한염색을중간으로상피세포의희미한염색을보여주었다. 혈관, 섬유아세포, 신경절 (ganglia) 및점막하의평활근및근층은음성이었다. 간부분은간세포의희미한염색을보였다. 엔브렐-FITC의결과 : 1.25 μg /ml의농도의엔브렐-fitc는흉선및편도선림프구에서때때로강한멤브레인염색도보였다. 전립선은상피세포의중등염색및평활근의염색이희미하게보였다. 태반은융합세포영양막 (syncytiotrophoblasts) 의부분집합의때때로강한염색에서적절하게보여주었고, 때때로세포영양막 (cytotrophoblasts) 의보통염색에서희미하게나타났고, 내피세포의희미한염색을나타내었다. 난소기질은세포의약한염색을보였다. 자궁샘플은자궁근층의평활근의희미한염색을보였고, 혈관내피세포와혈관평활근의대부분은음성적인염색을보였다. 고환내에서정조세포및비정기정모세포는보통염색을보였고, 간질세포는음성을보였다. 소장은상피세포의보통염색, 브러시테두리의강한염색및점막하혈관및섬유아세포의음성적인염색을보였다

29 [0221] [0222] 요약하면, 5 μg/ml의 hopg-higg1-fc-fitc 및 2.5 μg / ml의프롤리아-fitc는비장의적색펄프 (splenic red pulp) 의시누소이드 (sinusoidal) 내피세포의양성적인염색과함께편도선및흉선의림프구에서양성적인염색을보여주었다. 두시약은또한태반영양세포 (trophoblasts) 및내피세포에서양성적인염색을보였으며, 자궁의자궁근층의평활근의희미한염색은전립선에서주로음성적이었다. 간세포는두시약에양성을나타냈다. 양성적인염색을나타낸세포유형은프롤리아-FITC 및 hopg-higg1-fc-fitc와매우유사하였다. 엔브렐- FITC는림프구, 태반영양세포 (trophoblasts), 내피세포와평활근은긍정적인염색을보였다. 또한, 다른두시약달리전립선상피및고환의정세관에서도양성염색을나타내었다. 엔브렐-FITC 염색의패턴은서로유사한프롤리아-FITC 및 hopg-higg1-fc-fitc와달리차이를보였다. " 프롤리아 (Prolia)", " 엑스제바 (Xgeva)" 및 " 엔브렐 (Enbrel)" 은암젠사 (Amgen Inc), 델라웨어법인 (Delaware Corporation) 의등록상표이다. 각개별공보또는특허출원이구체적으로그리고개별적으로참조로포함되는것으로표시되더라도, 모든문헌및본출원에언급된특허는본출원에그전체가참조로인용된다. 요지의특정실시예를설명하였지만, 상술한명세서는제한적인것이아니라예시적인것이다. 많은변화가본명세서의검토및이하의청구범위로부터당업자에게명백해질것이다. 본발명의전체범주는이러한변형과함께, 그들의전체균등범위및명세서와함께청구범위를참조하여결정되어야한다. 도면 도면 1 도면

30 도면

31 도면

32 도면 5 서열목록 SEQUENCE LISTING <110> R-Pharm Overseas, Inc. <120> OSTEOPROTEGERIN DERIVED RANKL INHIBITOR <130> IPA US <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 442 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><221> hopg <222> (1)..(215)

33 <220><221> higg1-fc <222> (216)..(442) <400> 1 Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

34 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys <210> 2 <211> 1326 <212> DNA <213> Recombinant

35 <400> 2 atgaataagc tgctgtgctg tgccctcgtg tttctcgata taagcattaa gtggactacc 60 caggagacat tccctcctaa gtatctgcac tatgacgagg agacaagcca tcagctgctg 120 tgcgataagt gtcctcctgg gacctatctc aaacaacatt gtacagccaa atggaagaca 180 gtctgcgctc catgtcctga ccactactac accgactctt ggcatactag cgacgaatgt 240 ctgtattgtt cacccgtgtg caaggagctg caatacgtga aacaggaatg caataggaca 300 cataaccgcg tgtgtgaatg caaagagggc aggtatctgg agatcgaatt ttgtctgaag 360 caccggagct gcccacccgg ctttggagtg gtccaggccg ggactcccga gagaaacact 420 gtgtgcaaaa gatgcccaga cggattcttt tcaaacgaga catcttctaa ggcaccatgt 480 cggaagcaca ctaactgttc cgtctttggg ctgctgctca cccagaaggg caatgccacc 540 cacgataata tttgctccgg aaactccgaa tccacccaaa agtgcgggat agatgttacc 600 ctctgcgaag aggcattctt ccgcttcgct gttcctacca agttcgacaa aactcacaca 660 tgcccaccgt gcccagctcc ggaactcctg ggcggaccgt cagtcttcct cttcccccca 720 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 780 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 840 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 900 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 960 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1020 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1080 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1140 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgttgg actccgacgg ctccttcttc 1200 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1260 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1320 ggtaaa 1326 <210> 3 <211> 8871 <212> DNA <213> Recombinant <400> 3 gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60 cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt

36 gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 180 agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 240 tgtctggcgg ccgcgagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac 300 cgatccagcc tccgcggccg ggaacggtgc attggaacgc ggattccccg tgccaagagt 360 gacgtaagta ccgcctatag agtctatagg cccaccccct tggcttctta tgcatgctat 420 actgtttttg gcttggggtc tatacacccc cgcttcctca tgttataggt gatggtatag 480 cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac tcccctattg gtgacgatac 540 tttccattac taatccataa catggctctt tgccacaact ctctttattg gctatatgcc 600 aatacactgt ccttcagaga ctgacacgga ctctgtattt ttacaggatg gggtctcatt 660 tattatttac aaattcacat atacaacacc accgtcccca gtgcccgcag tttttattaa 720 acataacgtg ctccacgcga atctcgggta cgtgttccgg acatgggctc ttctccggta 780 gcggcggagc ttctacatcc gagccctgct cccatgcctc cagcgactca tggtcgctcg 840 gcagctagtg gaggccagac ttaggcacag cacgatgccc accaccacca gtgtgccgca 900 caaggccgtg gcggtagggt atgtgtctga aaatgagctc ggggagcggg cttgcaccaa 960 aaattttcgc gtcgactata ccgtccacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1020 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 1080 caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 1140 gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1200 cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1260 tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1320 gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1380 cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1440 tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1500 tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 1560 caaacaaacc accgctggta gcggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 1620 aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 1680 aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 1740 tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 1800 cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 1860 catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 1920 ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat

37 aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 2040 ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 2100 caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 2160 attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 2220 agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 2280 actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 2340 ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 2400 ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 2460 gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 2520 atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 2580 cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 2640 gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 2700 gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 2760 ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacctc gacggatcgg gagatctccc 2820 gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat 2880 ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg cgagcaaaat ttctgtggaa 2940 tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag 3000 catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag 3060 aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc 3120 catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt 3180 ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc tgcctctgag ctattccaga agtagtgagg 3240 aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa aaagctaagc tacaacaagg ctctggctaa 3300 ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaagctagct taatacgact caatgaatca 3360 gggtgcaaac aagacggtat tagaccgata tttacggtta gatatcccgg accagaaatg 3420 tcaagctatg tacatctggg tcgatggaac cggcgaaaac ctccgctcta agaccaggac 3480 actcaacttt actcctaaat ctcccagtga gctgccaata tggaatttcg atgggtcatc 3540 aacgggccag gccgaacgga gcaacagtga cgtgtacctg tatccagtcg ctgtttatcg 3600 agatccattc aggctgggta acaataagct ggtcctctgt gaaacctaca aatacaacaa 3660 gaagcctgct gatactaacc agcgttggaa gtgtatggaa gtaatgacaa gggcagcaga

38 ccagcaccca tggttcggca tggaacaaga atatactctt ttggacattg acaaacatcc 3780 cttgggttgg cccaagaatg gctatccagg ccctcagggt ccctattact gtggtgtggg 3840 tgctaatagg gtgtatgggc gcgatgtggt cgaggctcac tacagggcgt gtctttgcgc 3900 tggcatcaac atctctgggg agaacgcgaa agtcatgccg gcccaatggg agttccaggt 3960 tggtccgtgt gaaggcataa ccatgggcga cgacctctgg atggctcgct accttcttca 4020 cagggtcgct gaggactttg atgttgtagt aacactcgac cccaagccaa tccctggtga 4080 ctggaacggc gctggaatgc acactaattt ctctactgaa gccatgcgtg gtcccaatgg 4140 cattctggaa attgagagtg ccatcgacaa attgtcgaag gttcatgaga aacacatcaa 4200 ggcatacgac ccacacgcag gcaaggataa cgaaaggcgc ttgactggtc attatgaaac 4260 ttcctccatc catgactttt ctgcaggtgt ggccaaccgt ggtgcctcca tccgcatccc 4320 cagaggagtg gctgaggaga aaaccggcta cctggaggac cgtcgccctt cctccaacgc 4380 tgacccttat gtggtgtctg agaggcttgt gcgtaccatc tgcctgaacg agcagtgact 4440 atagggagac ccaagctgac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcgccc gggctggtgg 4500 ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct 4560 tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc 4620 ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg 4680 atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt 4740 ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg 4800 tctattcttt tgatttataa gggattttct ctagctagag cttggcgtaa tcatggtcat 4860 agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa 4920 gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc 4980 gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc 5040 aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctgtccacct 5100 cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 5160 ggttagagat ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt 5220 ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca 5280 ccccaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 5340 cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 5400 atcttatcat gtctgtatac cgtcgacctc aaggcttgac cgacaattgc atgaagacgc

39 gtaatctgct tagggttagt tttacaggat ggggtctcat ttattattta caaattcaca 5520 tatacaacac caccagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag 5580 acaccgggac cgatccagcc tccgcggccg ggaacggtgc attggaacgc ggattccccg 5640 tgccaagagt gacgtaagta ccgcctatag agtctatagg cccaccccct tggcttctta 5700 tgcatgctat actgtttttg gcttggggtc tatacacccc cgcttcctca tgttataggt 5760 gatggtatag cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac tcccctattg 5820 gtgacgatac tttccattac taatccataa catggctctt tgccacaact ctctttattg 5880 gctatatgcc aatacactgt ccttcagaga ctgacacgga cgcgttttgc gctgcttcgc 5940 gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 6000 attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 6060 aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 6120 gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 6180 taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac 6240 gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt 6300 cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 6360 cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 6420 attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 6480 aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 6540 agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac 6600 ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg 6660 cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gagtctatag gcccaccccc 6720 ttggcttctt atgcatgcta tactgttttt ggcttggggt ctatacaccc ccgcttcctc 6780 atgttatagg tgatggtata gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca 6840 ctcccctatt ggtgacgata ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac 6900 tctctttatt ggctatatgc caatacactg tccttcagag actgacacgg actctgtatt 6960 tttacaggat ggggtctcat ttattattta caaattcaca tatacaacac caccgtcccc 7020 agtgcccgca gtttttatta aacataacgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt 7080 tccggacatg ggctcttctc cggtagcggc ggagcttcta catccgagcc ctgctcccat 7140 gcctccagcg actcatggtc gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt 7200 aggcacagca cgatgcccac caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat 7260 gtgtctgaaa atgagctcgg ggagcgggct tgcaccgctg acgcatttgg aagacttaag

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