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- 오민 영
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1 제 1 장제 21 장 Human Papilloma Virus 감염증 Human papilloma virus (HPV) 는피부나점막에사마귀나상피암종을일으키는병원체이다. 지금까지약 100여종의 HPV가알려져있으며, 이들중약 70여종은이미염기서열분석이완료되었고약 30여종이성병에관여한다고알려져있다 [4]. 1980년대에 Hausen 등이 HPV-16, HPV-18과자궁경부암 (cervical cancer) 과의연관관계를규명함으로써자궁경부암의원인병원체로 HPV가알려지기시작하였다. 그이후약 25가지이상의 HPV가생식기에감염됨이밝혀졌으나특정유전형 (type) 만이지속적으로자궁경부암과관련있음이확인되었다. HPV는단한번의성접촉에의해서도감염위험이있으나대부분의경우는감염이자연소실되거나불현성감염으로지나간다. 즉, HPV 감염이곧생식기종양의발생을의미하는것은아니지만본장에서는주로여성생식기 ( 질, 자궁경부등 ) 와남성생식기, 항문에종양을일으킬위험이높은고위험군 HPV의감염특성을다루고자한다. 병원체 HPV는 Parvoviridae 과, Papillomavirus 속으로불리는바이러스로약 8 kb의환상이중나선 DNA와정 20면체의뉴클레오캡시드를가지는피막비보유바이러스이며분자량은 dalton이다. HPV는 early region (E:E1, E2, E4, E5, E6, E7) 과 late region (L:L1, L2) 의 8개유전자와이들을조절하는영역인 long control region 984 감염병실험실진단제 4 부바이러스질환
2 (LCR) 으로구성된다. 특히, E1과 E2 영역은바이러스 DNA 복제를담당하고, E6과 E7은숙주의발암억제단백질인 p53과 prb (retinoblastoma protein) 에각각결합하여 keratinocyte를불멸화시켜악성종양 (malignant tumor) 상태로진행시킨다 [7, 15]. Late region은 2개의유전자로이루어져있으며, HPV의캡시드단백질을암호화하는영역으로 L1은주요캡시드단백질 (major capsid protein) 을 L2는부캡시드단백질 (minor capsid protein) 을암호화하여 HPV의항원성을결정한다 [14]. HPV는전세계적으로약 100여가지의유전형이알려져있는데, 암조직으로발전가능성을높이는유전형을 고위험군 이라하며 HPV-16, 18, 31, 33, 35, 39, 42, 51, 52, 56, 58, 59, 68 유전형을의미하며그렇지않은 저위험군 은 HPV-6, 11, 42, 43, 44 유전형을포함한다. 자궁경부상피내종양 (cervical intraephithelial neoplasia, CIN), 편평상피세포종양 (squamous cell carcinoma, SCC) 조직의 90% 이상에서고위험군인 HPV-16과 18이검출되며이들은숙주유전자에삽입되어증식한다. 바이러스유전자의복제는핵내에한정되어있으므로감염세포에서는부정형핵이자주관찰된다 [12]. 저위험군 HPV는숙주유전자에삽입되지않고세포질내에존재하면서특정한임상증상없이잠복상태로존재하며, 고위험군에속하는 HPV는숙주유전자에삽입된상태로발견된다. 임상증상 HPV 감염증은저위험군에감염되었을경우, 불현성으로감염사실을모르고치유되는경우가대부분이지만 HPV-16, 18을포함한고위험군에감염되었을경우암으로진행될가능성이높다. 자궁경부암은자궁경부상피내종양이라는암전단계를거쳐진행되고고위험군 HPV의유전자가숙주의감염부위세포유전자에삽입되어종양을형성하는것으로알려져있으며, E6와 E7 단백질이숙주의발암억제인자인 p53이나 prb 등의기능을불활성화함으로써숙주세포의세포주기조절의실패를야기하여결국발암과정이진행된다고알려져있다 [11, 15]. 자궁경부이형성 (dysplasia) 은병변의암진행단계에따라 CIN Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 단계가있으며단계가올라갈수록병증이더욱진행된것을의미한다. HPV 감염에의하여자궁경부이형성이시작되더라도곧바로암으로진행되는것은아니지만 CIN Ⅰ단계의약 1% 에서침윤성암으로진행된다. CIN Ⅰ에서 Ⅱ는빠르게진행되는데 CIN Ⅱ 단계의약 5% 가침윤성암으로발전하며 CIN Ⅲ 상태는적절하게치료하지않을경우 제 21 장 Human Papilloma Virus 감염증 985
3 12% 이상이악성암으로진행될수있다. 사마귀 (nongenital skin warts) 는양성파필로마 (benign papillomas) 로대부분손, 발에서많이나타나며, 생식기를제외한신체모든부위에서나타날수있다. 양성파필로마는청년기에많이관찰되는데외국의경우학령기아동의약 10% 에서양성파필로마감염을관찰하였다는보고가있다 [7]. 대부분의감염은수개월간지속되다가약 2년정도후에는거의사라진다. 감염부위는복합적으로나타나는것이일반적이며대칭적으로분포하는경우도있고, 한쪽으로분포하는경우도있다 [8]. 일반적으로사마귀는혹같이돌출되지만얼굴이나팔에편평한모양으로나타날수도있으며 (flat warts), 실사마귀 (filiform warts) 는얼굴이나목에주로발생한다. 손, 발바닥사마귀는두껍고각질화되어있는것이대부분이다. HPV-1, HPV-2, 및 HPV-4는주로일반사마귀와손발사마귀를일으키며, HPV-3, HPV-10, HPV-28과 HPV-41은편평사마귀에서주로확인된다 [3]. 사마귀표피형성이상 (epidermodysplasia verruciformis, EV) 는피부형 HPV에감염된사람중특이하게나타나는병변으로주로어린시기에감염되나자연소멸되지않고전신증상으로퍼져나가때로는 SCC로진행되기도한다. EV 환자의약 50% 는가족력이있으며, 유전인자와관련하여두개의유전자위치가암호화되어있다. 또한, EV는 Human immunodificiency virus (HIV) 감염과도연관이되어있어 HPV의감염에의한 EV 발생은면역기능약화와밀접한관련이있는것으로알려져있다 [7]. 비흑색종피부암 (non-melanoma skin cancer, NMSC) 은기저세포암 (basal cell carcinomas, BCC) 과 SCC 두가지로구분된다. NMSC는일반적으로피부의노출 ( 특히, 자외선 ) 과밀접한연관이있으며, 면역기능약화환자에서발생위험이높다. HPV의생식기감염은의학적으로가장중요하다. HPV 감염은주로질경, 자궁경부, 그리고항문등생식기표피, 점막등에서나타난다. 생식기감염은무증상에서악성종양에이르기까지매우다양한임상증상으로나타나는데그특성은바이러스요인과숙주요인에의해결정된다. 대부분의생식기감염은주로 HPV-6이나 HPV-11에의해나타나는데그중 HPV-6이보다광범위하게나타난다. 간혹 HPV-16을포함한다른형에의해서도발생되지만대부분구진을동반한다. 성인의경우와는달리소아의생식기감염원인은성인에있어서비생식기유전형으로분류된 HPV가자주관찰되는데, 이는소아의생식기점막이성인보다여러가지유전형에대한감수성이있기때문인것으로생각되고있다 [13]. 986 감염병실험실진단제 4 부바이러스질환
4 역학 HPV는주로인체의생식기주변에감염되나대부분의사람들은감염사실을모르고치유되는불현성감염인경우가대부분이지만고위험군 HPV는자궁경부, 질, 대음순, 항문, 음경등특정생식기부위에지속적인감염을일으키어치명적인종양을유발하기도한다. 이러한고위험군바이러스를제외한대부분의 HPV는저위험군이라고한다. 고위험군 HPV의감염경로는성관계시생식기피부접촉으로전파되며, 저위험군 HPV에의해손이나발에생기는사마귀는보통생식기로전염되지않는것이일반적이다. 성병으로서의 HPV는극히일반적인감염양상을나타내는데, 성경험을가진성인의약 80% 이상이일생동안한번이상의감염기회를가진다고알려져있다 [5]. 한국여성에게발생하는암중자궁암의 90~95% 는 HPV 감염과관련된자궁경부암이다. 환자의자궁경부암발생연령을보면일반적으로 30대를지나면서나타나게되고, 40~50대에가장많으며이후의나이가되면서서히줄어든다. 이러한자궁경부암은 90% 이상이편평상피세포암으로, 성행위를통하여 HPV의지속적인감염에의한만성후유증 이라고정의될만큼 HPV의감염이가장중요한발병원인이라할수있다. 자궁경부암은국내여성의암발생률 1위로매년약 6,000여명이발병되고여성의사망원인으로는위암다음으로 2위에해당된다. 질병관리본부국립보건연구원연구결과, 일반여성 97명에대한 HPV 감염빈도는 15.5% 였으며, 연령별 HPV 감염빈도는 35~ 39세의연령군에서 33% 로가장높았고, 다음은 45~49세가 19.0% 이었다 [1]. 생식기의 HPV 감염위험이높다고생각되는특수업태부, 유흥업소종사자 (commercial sex worker, CSW) 417명에대한 HPV 감염빈도는 46.8% 로일반여성보다현저히높았으며, 20~24세연령군에서고위험군바이러스와고위험군과저위험군이동시에감염된빈도는각각 36.6% 와 18.3% 로가장높았다. 또한국내 HPV 감염실태조사결과고위험 HPV 검출빈도는일반여성에서 10.3%, 특수업태부와유흥업소종사자에서는 40.0% 이었고, 저위험 HPV 검출빈도가일반여성에서 8.2%, 특수업태부와유흥업소종사자에서 21% 이었다 ( 그림 1). 특수업태부집단에서 HPV microarray 방법을이용하여 HPV 형을분석한결과 HPV-16, 18, 58 형이주로발견되었고, HPV가검출된검체에대하여두가지이상의 HPV 형이감염된경우가 43.8% 이었다. 제 21 장 Human Papilloma Virus 감염증 987
5 100% CSW Normal 80% Infection (%) 60% 40% 20% 40% 21% 10.3% 8.2% 0% HIGH HPV Type LOW 그림 3. Hybrid capture 방법으로확인된우리나라유흥업종사자 (CSW) 집단과일반여성 (normal) 집단의생식기의 HPV 감염양상 [1] 자궁경부암환자의 95~99.7% 에서 HPV의감염이확인되었으며, 항문암환자의경우 88% 정도가 HPV와관련이있는것으로알려져있다. 자궁경부암은저개발국가에서여성암의수위를차지하고있으며개발도상국에서여성사망률중가장높고, 선진국에서는두번째사망원인으로알려져있다 [2]. 2003년 CDC 보고에따르면전세계적으로자궁암발병추이는미국, 북아메리카, 중국등은인구 10만명당 7명이하이고, 오스트리아등의지역은 7~14명, 북유럽등지에서는 14~27명, 아프리카와동남아지역에서는가장높아서인구 10만명당 27명이상으로보고되었다. 또한미국은해마다 550만명의새로운 HPV 감염자가발생된다고알려져있다 [7]. 예방및관리 HPV 감염및위험성을감소시키기위한일차적인접근은 HPV 백신을개발하는것이다. HPV와의접촉을막기위하여라텍스콘돔및피임용살정제를사용할수도있지만음순, 음낭, 항문등의다른신체적접촉으로도감염될수있기때문에콘돔사용은 HPV로부터완전히안전하다고할수는없다. HPV 백신은주로바이러스 DNA가첨가되어있지않은주요캡시드단백질인 L1 즉, 바이러스유사입자 (virus-like particles, VLPs) 로구성되어있다 [2, 7, 9]. 이단백질은 L1, L2 ORFs를진핵세포에서발현시켜생산하며높은면역반응을일으킬 988 감염병실험실진단제 4 부바이러스질환
6 수있고, HPV 캡시드항원에대하여높은항원특이성이있으므로 HPV 형사이에교차반응이없다. 따라서여러가지 HPV 유전형을방어하기위해서는각각의형에맞는백신이필요하므로일반적인고위험군에속하는 HPV 형의 VLPs를혼합한형태가최적의백신이라고할수있다. 2005년현재 HPV L1 단백질을이용한두개의백신제품이 (Merck, Cervarix: GSK) 개발에성공한것으로보고하고있다 [6]. Merck에서는 HPV-6, 11, 16, 18에대한다가백신을개발하였는데, 임상실험한결과침윤암에서는 70%, CIN Ⅱ, Ⅲ 단계에서는 60%, 그리고생식기부분의사마귀에는 90% 가제거되는것을확인하였다. GSK사에서개발한 HPV-16, 18에대한다가백신은임상실험을통하여면역원성, 안정성, 효율성을검증하였다. 15에서 25세의여성 1,113명을대상으로실시한결과, 일시적으로감염된경우에서는 96.1%, 지속적인감염의경우는 100% 백신효율을나타내었다. 실험실진단 HPV의감염을진단하는방법으로는 PCR 진단, DNA microarray 및 hybrid capture법이있다. 또한 HPV 자체를검출하는방법은아니지만자궁경부암의진단을목적으로시행하고있는세포진검사 (Pap test) 는 HPV 감염으로유발되는자궁경부내세포의모양을관찰하여정상과비정상을구분하는방법으로써향후 HPV 감염위험성을예견한다. PCR 진단법은자궁경부내의세포를채취하여유전물질을추출한뒤, HPV의특이적 primer를이용하여유전자를증폭함으로써 HPV의감염여부를판단하는방법이다. 설계된 primer의종류에따라검출되는 HPV 유전형이다를수있으며 PCR 증폭과정시정확성이요구된다. 최근개발된 HPV DNA microarray 방법은이러한 PCR 방법에기초하여여러가지유전형을동시진단및감별이가능한방법으로써 15개의고위험군 HPV 유전형과 7개의저위험군 HPV 유전형을검출할수있다. 주로자궁경부에서발견되는 HPV 유전형에집중되어있으며, 검출할수있는유전형수가한정되는단점이있다. DNA와 RNA hybrid에대한항체를이용하는 hybrid capture Ⅱ 방법은 13가지고위험군과 5가지저위험군이감염되어있는경우검출이가능하며유전자형을검출하는것이아니라고위험군또는저위험군의감염여부를판단하는방법이다. HPV는유전자형이 100여가지이상으로많고감염되는부위에따라발견되는유전자형이다르며중복감염되는특성이있으므로한가지의진단방법을선 제 21 장 Human Papilloma Virus 감염증 989
7 택하기보다는 HPV 특성에맞는방법들을병행하는것이효과적인진단법이라고하겠다. 1. 검체 HPV 진단을위한검체채취방법은사용하는진단법에따라다양하나, 이장에서는 PCR 및 microarray 진단에필요한검체채취방법을기술하기로한다. 남성의경우에생식기의포피낭을세포채취용솔 (cytobrush) 로문질러검체를채취하며, 여성의경우에자궁경부의점막상피세포를세포채취용솔을이용하여채취한다. 따라서이들검체의채취는보건소및의료기관에서수행되어야하며, 검체채취후운송및보존용액은전용운반용액및시험관을이용하여야하지만, PCR 검사법의경우에일반 15 ml시험관에 1 ml의 PBS (0.01 M) 를분주하여검체를문질러획득한세포채취용솔을 PBS에적신상태에서뚜껑을닫아냉장으로보관한다. 채취된검체는가능한한 24시간이내에 3,000 rpm에 15분간원심하여검체상피세포의침전물을만든후상층액을버린다. 침전물은 75 μl의 proteinase K 용액 (200 μg / ml ) 으로재부유하여 37 에서하루밤동안반응시킨후 10분간가열하고, proteinase K를불활화시킨다. 이것을 PCR 에이용하거나상용화된 DNA 분리키트로 DNA를분리한후 PCR 진단에사용한다. 또한최근패드를이용한검체채취에의하여 HPV 유전형검사가이루어지고있다. 2. 검사방법 HPV 감염증검사는자궁경부와성기부위의병변조직및도찰물을이용하여조직학적검사인세포진검사, 유전자형검사인 PCR과 DNA microarray, 유전자검사인교잡방법을이용하여수행한다 ( 그림 2). 1) 세포진검사 (Pap test) 자궁암검사의가장기본적검사로서자궁경부의세포를채취하여특수염색을한뒤조직학적으로암세포존재여부를검사하는방법이다. 이방법은매년정기적으로시행하여조직학적소견을관찰하여야한다 ( 그림 3). 검사결과는 PAP Class I, II, III, IV, V로구분하고다섯단계중에 I, II는정상, III은암세포존재가능성시사, IV 이상은암을의미한다. III 이상의결과가나왔을때추가적정밀검사를시행받아야한다. 990 감염병실험실진단제 4 부바이러스질환
8 HPV 감염증 Human papillomavirus 병변부위조직및도찰물 - 자궁경부 - 성기부위 유전자검사 - Hybridization assay 유전형검사 - PCR - DNA microarray 조직학적검사 - 세포진검사 양성음성양성음성양성음성 유전형검사 - 염기서열분석 - 유전형확인 그림 2. HPV 감염의실험실진단을위한전략 그림 3. 세포진검사결과 ( [10] 제 21 장 Human Papilloma Virus 감염증 991
9 2) PCR 진단자궁경부암의원인체로알려진 HPV의유전자를증폭하여유전자존재여부를판정하는분자생물학적진단법이다. HPV 형별로진단하는 monoplex PCR법과한번에여러가지중요한형을진단하는 multiplex PCR법, 그리고대부분의중요한 HPV 형을진단하는 universal PCR법이있다. 본장에서는 universal PCR 진단법을설명하기로한다. 1 자궁내세포가채취된채취용솔로부터 DNA를분리한다. 2 MY09/11 primer를이용하여 PCR로증폭하고, 전기영동을실시하여 450 bp의산물을확인하여 HPV를검출한다 ( 표 1, 그림 4). 3 PCR 반응은 5 μl의 10X PCR buffer, 4 μl의 25 mm MgCl 2, 2 μl의 2.5 mm dntps (datp, dgtp, dctp, dttp), 1 μl의 MY09 primer (25 pmol/ μl ), 1 μl의 MY11 primer (25 pmol/ μl ), 5 μl의 Taq polymerase (5 U/ ml ), 5 μl의 DNA 주형에 3차증류수를첨가하여 50 μl반응액을만든다. 4 PCR 반응조건은 94 에서 4분동안전변성시켜, 94 30초, 58 30초, 72 30초동안 30회반복한후, 72 에서 4 분간후연장한다음 4 를유지하였다. 5 이때 beta globin (BG) 유전자를동시에검출하여실험의대조군으로사용한다. 표 1. HPV 검출을위한 MY09/11 primer 구성 표적유전자 Primer 염기서열 (5 3 ) 산물크기 (bp) HPV BG MY09 MY11 KM29 PC04 CGTCCMARRGGAWACTGATC GCMCAGGGWCATAAYAATGG 450 GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG CAACTTCATCCACGTTCACC 205 Degenerated base code: M = A or C, W = A or T, Y = C or T, and R = A or G 992 감염병실험실진단제 4 부바이러스질환
10 그림 4. MY09/11 HPV consensus primer 를이용하여 PCR 증폭된 HPV DNA 자궁경부채취물등임상검체로부터 DNA 회수가정확하게이루어졌는지를확인하기위하여 β-globin (BG) 을동시에증폭한다. M:Marker. 3) DNA microarray HPV oligonucleotide microarray 법은고위험군 HPV 형인 HPV-16/18/31/33/ 35/39/45/51/52/56/58/59/66/68/69의 15종과저위험군형인 HPV-6/11/34/40/42/43/44 의 7종의 HPV 형을확인할수있는검사법이다. 최종결과는슬라이드글라스를 scan하여형광의스팟이검출되는위치를확인하여형을결정한다 ( 그림 5, 6). Principles of HPV chip Detection + target DNA (from sample) capture DNA (on the glass) glass DNA chip 그림 5. HPV DNA microarray 모식도 제 21 장 Human Papilloma Virus 감염증 993
11 그림 6. 임상검체를이용하여 HPV DNA microarray 진단을수행한결과 단일감염일경우는 duplex spot 만발색이되며, 중복감염일경우여러가지 HPV 유전형의 multi-spot 이발색된다. (1) 시료준비 :HPV DNA 분리는상용화된제품 (Qiagen 사의 genomic DNA isolation kit) 을사용한다. (2) PCR 증폭 1 β-globin 유전자의증폭준비된검체가적절한지를조사하기위하여 PC03/04 primer를이용하여 β-globin 을증폭하여 110 bp의산물을확인한다. PCR 반응액은 5 μl의 10X PCR buffer (Mg 2 + free), 8 μl의 25 mm MgCl 2, 1 μl의 primer PC03 (25 pmol/ μl ), 1 μl의 primer PC04 (25 pmol/ μl ), 1 μl씩의 2 mm datp, dttp, dgtp와 1 mm dctp, 0.1 μl의 Cy5-dCTP, 33 μl의 3차증류수, 2 U의 Taq DNA polymerase (5 U/ μl ), 2 μl의주형 DNA (0.1 μg / μl ) 를넣어준비한다. β-globin 유전자절편의확인을위한 PCR은 94 5분동안변성시킨후, 94 1분, 55 2분, 72 2분동안 35회수행한뒤 72 에서 5분동안연장하여수행한다. 2 HPV의 L1 유전자절편의증폭 ( 약 150 bp) β-globin의증폭이확인된검체에대해서 HPV L1 유전자를증폭한후확인한다. PCR 반응액은 5 μl의 10X PCR buffer (Mg 2 + free), 8 μl의 25 mm MgCl 2, 0.5 μl의 primer I (50 pmol/ μl ), 0.5 μl의 primer II (50 pmol/ μl ), 1 μl씩의 2 mm datp, dttp, dgtp와 1 mm dctp, 0.1 μl의 25 nmol Cy5-dCTP, 34 μl의 3차증류수, 2 U의 Taq DNA polymerase (5 U/ μl ), 2 μl의주형 DNA (0.1 μg / μl ) 를넣어준비한다. HPV L1 유전자절편의확인을위한 PCR은 94 에서 5분동안변성시킨후, 감염병실험실진단제 4 부바이러스질환
12 1분, 50 2분, 72 30초동안 5회실시한다. 그리고 94 1분, 50 2분, 72 15초동안 35회실시한뒤 72 에서 2분동안연장하여수행한다. (3) 교잡교잡 (hybridization) 반응은표적유전자 (PCR 증폭산물 ) 의양이매우적은경우도감지가가능하므로보통 HPV 증폭산물 10 μl와 β-globin 증폭산물 5 μl를취한다. 표적 DNA (10 μl의 HPV PCR 증폭산물, 5 μl의 β-globin PCR 증폭산물, 그리고 25 μl의멸균수의혼합 ) 에 4 μl (1/10 vol.) 의변성용액 (3N NaOH) 을가한후실온에서 5분간방치한다. 2 μl (1/20 vol.) 의 1 M Tris-HCl (ph 7.2) 와 4 μl (1/10 vol.) 의변성용액 (3N HCl) 을가한후얼음위에서 5분간방치한다. 50 μl의 12X SSPE (100 μl volume의커버글라스 ) 와 0.5 μl의 10% SDS를가하여잘섞는다. 커버글라스 (4-웰챔버 ) 가덮여져있는슬라이드상에구멍을통하여위의용액을기포가들어가지않도록넣는다. 40 의항습배양기에서 2시간동안교잡반응을실시한다. (4) 세척및검출 3X SSPE에서 2분간, 1X SSPE에서 2분간 50 rpm 정도로흔들어주면서세척후공기중에서건조한다. 스캐너를이용하여발색된신호를관찰하여유전형을확인한다. 4) 교잡방법교잡방법 (hybridization assay) 의하나인 hybrid capture는 DNA와 RNA hybrid 에대한항체를이용하는검사이다. Hybrid capture II는 HPV 고위험군 13가지의유전형 (HPV-16/18/31/33/35/39/42/51/52/56/58/59/68) 과저위험군 5가지의유전형 (HPV-6/11/42/43/44) 검출을위한시험방법이다. Digene사의 HPV용가검물배양액 1 ml에자궁경부검체를채취하여 -20 에보관하였다가시험에사용한다. 최종결과는마지막반응액을 Luminometer에서측정하여고위험군과저위험군의감염여부를확인한다. 1 시약조제변성시약에 5방울의지시약을첨가한후잘섞어주면짙은자색을띤다. HPV probe A와 B를 5초간원심분리한후 probe 희석액으로 1:25로희석한후잘섞어준다. 만일 HPV probe A, B가점성이높은 probe 희석액에서완전히섞이지않으면민감도가낮은결과를유발할수있다. 농축세척액 100 ml을 2.9 l의증류수로희석한다. 제 21 장 Human Papilloma Virus 감염증 995
13 2 변성준비한변성시약을각각의검체시험관과양성표준시험관에 500 μl씩분주하고, 음성표준시험관에는 1 ml을분주한후, 5초동안진탕하여잘섞어준다. 이때표준시험관과검체는자색을나타낸다. 65±2 항온수조에서 45±5분동안배양한다. 3 교잡조제된 HPV probe A와 B를각각의교잡시험관에 25 μl씩분주한다. 항온수조에서검체를꺼내 5초동안진탕한후, 각각의표준과검체를미리 HPV probe가첨가된교잡시험관에 75 μl씩분주한다. 플레이트를잘덮은후회전혼합기로 1,100±100 rpm 에서 3±2분동안잘섞어준다. 65±2 항온수조에서 60±5분동안배양한다. 4 Hybrid capture 항온수조에서교잡시험관을꺼내 100 μl피펫을이용하여표준과검체를모두각각의 capture 시험관으로옮긴다. Capture 시험관을잘덮고회전혼합기로 1,100±100 rpm, 20~25 에서 60±5분동안잘섞어준다. 반응이끝나면 capture 시험관의여액을버린후, 2~3회깨끗한흡수지에두들겨서여액을완전히제거한다. 5 Hybrid detection 각 capture 시험관에검출시약 1을 75 μl씩분주한다. 파라필름으로 capture 시험관을덮고 20~25 에서 30±3분동안배양한다. 6 세척배양이끝나면 capture 시험관위에깨끗한흡수지를올려놓고 1~2분동안뒤집어놓는다. 각 capture 시험관을 6회세척한후깨끗한흡수지에두들겨서여액을완전히제거한다. 7 신호증폭 (signal amplification) 각 capture 시험관에검출용액 2를 75 μl씩분주한다. 파라필름으로 capture 시험관을덮고 20~25 에서 15분동안직사광선을피하여배양한다. 배양이끝나면 DML2000 Luminometer를이용하여측정한다. 996 감염병실험실진단제 4 부바이러스질환
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