대한임상병리사회지 : 제 23 권 1 호 1991 인체와동물에서분리된 Coagulase Positive 포도상구균에대한연구 신흥전문대학임상병리과 최승구 박은병 Key words : Acetoin reaction, P AGE. I 1. 서론 일반적으로 S.aure μs

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성민 야
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1 대한임상병리사회지 : 제 23 권 1 호 1991 인체와동물에서분리된 Coagulase Positive 포도상구균에대한연구 신흥전문대학임상병리과 최승구 박은병 Key words : Acetoin reaction, P AGE. I 1. 서론 일반적으로 S.aure μs 를분리동정하는데있어서 coagulase 시험을중요시한다 6) 그러나, coagulase 양성에해당하는포도상구균은 S.aμ reus 뿐만아니 라 S. interediμ5, S. hyicμ5 subslρ hyicμs 등이포 함된다 15, 19, 24) 특히 S.aureus 는면역성이떨어진인 체에대하여병원성이있다고알려졌으며 1, 2, 3 >, S. inteηηediμs 와 S. hyicus subsp hyicμs 는동물등에 서피부, 요로, 뼈, 중추신경계통등에주감염원이 된다고알려지고있다. 이렇게인체와동물사이에 서병원성을갖는 S. aureus, S. interedius. S. hyicμs subsp hy icμs 의미생물학적동정에있어서생 물학적, 생화학적성상이유사하기때문에절대적인 주의를필요로한다고한다 8, 9) 따라서본실험은위에서열거했던동정상의특정 을명백히하고자가검물을인체및동물 ( 개 ) 에서 채취하여각종생화학적 생물학적특정을조사했 고, 또한항균제감수성검사및전기영동에서의 band 특정을조사했다. 또한아래와같이결과를얻 었기에보고하는바이다. II. 실험재료및방법 본실험에서사용된균주는 K 의료원으로부터분주받아서검사에임했고, 또한가축병원의개 (dog) 등에서분리된균주를시험에이용했다. 1. 미생물학적검사 평판배지에서 24 시간, 48 시간별로판독하고, coagulase 생성시험은사람혈장을이용한슬라이드법을 이용하여검사했다. Acetoin 생성시험은 MR-VP broth (Difco) 를이용하여 3TC 에서 시간배 양시킨후 5% a-naphtol 3 방울, 40% KOH 2 방울 을첨가한후 15 분후판독했으며양성은퇴색하지 않는 pink-redish 인것을관찰할수있었다. 2. 항균제감수성검사 S.aureus 는 NCCLS disk 감수성검사를 Muller -Hinton 배지를사용해서검사했다. 3. Protein 으 분석 1) Total cell protein 모든 saple 은 nutrient agar plate 에정종후 3TC 에서 24 시간배양했으며, nutrient agar plate 에나타난집락들을 250l 의 nutrient broth 에접종 하여 3TC 에서하룻밤방치시킨다. 그후 3, 000 rp 에서 15 분간원섬시키며농축된침전물을멸균 된증류수 10 l 에서부유시키며 3, 000 rp 으로다 시원심을한다 침전물은증류수 1l 에부유시키며, 이를 sonication 시키기위하여 ice bath 에위치시킨다. 또한 protein 을추출하기위하여 sonicator 를 45W 로써 5 분간작용시킨후 protein 을얻을수있었으 며, -70 o C 에서보관한다 Protein 농도측정은 Lowary et al 방법을이용했다 13) 용혈현상은 3% packed cell 을첨가한혈액한천 %

2 2) Poly Acrylaide Gel Electrophoresis (PAGE) 위과정을통하여얻어진 whole-cell protein을최종농도가 2 g/l가되도록증류수로써조절한다 P AGE technique는 3-6% stocking gel과 11% acrylaide separating gel을사용했다. 전기영동을 stocking하는동안 100V를사용했으며, running하는동안은 150V를이용하여단백의 band를분리했다. 이때소유되는시간은 3시간에서 5시간정도이다. 전기영동이끝난 gel을 coassie brilliant blue 등으로염색을하여 7% acetic acid 등으로 overnight함으로써탈색을한다. Table 1. Biocheical characteristics of Staplz_vlococClfs sp S.α urcus S. intennedius S. hyiclts subsp S. hyirus subsp hyic1ts chroogenes Colony diaeter > 5 b + 十 + + Colony pigent (caroteroid) +w + Aerobic growth Auaerobic growth (thioglycolate) + (+) + + Growth on N acl agar 10% (W/V) % (W/V) w d --w v Cytochroe (oxidase test) Acetoin production + Acid (aerobically) fro D-Xylose L -Arabinose D-Cellobiose D-Fucose Raffinose Salicin Maltose + (w) d D-Mannitol 十 (d) d D-Mannose D-Trehalose + + 十 + a-lactose 十 d f + D-Galactose

3 ß-D. Fructose + 十十十 D-Melezitose D-Turanose +w d d D-Ribose Xylitol N itrate reduction + 十 + + Alkaline phosphatase Arginine dihydrolase +w ds + + Urease +\Y 十 d d Coagulase(rabbit plasa) + + d Cluping factor + d Fibrinolysin de d Heolysis + d Deoxyribonuclease (DN ase agar) - 十 + + w Heat-stable nuclease w β-glucosidase + d d d β-glucuronidase d β-galactosidase ds Sybols +, 90% or ore strains positive, 90% or ore strains positive d, 11-89% strains positive ( ), delayed reaction -w, negative to weak reaction 十 w, positive to weak reaction ds, test differentiates subspecies(not separated out above in heading) de, test differentiates ecotypes w, weak reaction ND, test not deterined III. 성 ; 띤 --, 반응으로명백한분리가가능하다. S. interedi;μs 와 S. hyicus subsp hyicμs 차이점은 annitol (72 시 1. 미생물학적특성 Coagulase positive 포도상구균의미생물학적특 정은 Table 2 에서잘나타내고있다. Coagulase 반 응은모두양성반응으로판독했으며, heolysis, annitol 분해능에있어서 S. inte γedius 는일반적반응이늦게일어났으며, S.aμ reμs 로부터 S. interediμ5, S. hyicus subsp hyicμs 분리는 acetoin 간 ), altase(72 시간 ) heolysis (48 시간 ) 등으로 분리할수있다. 또한 coagulase 양성 Staphylococci 의당 test 에서는 S.aμγeμs 경우 ADH, MAL, TRE, MNE 등에서 100% 를나타냈으며, S. 낌 terediu5는 ADH와 MNE에서 100% 분해를 나타냈다. 또한 S. hyicμ5 subsp hyicμs는 S. interediu5 와유사한당분해결과를나타냈다

4 μtable 2. Microbi이 ogical reaction of coagulase positive Staphylococcμs sp. % Positive for Mannitol Heolysis DNase Acetoin Pigent Bile Coag- Cata- 24h 48h 72h 24h 48h 24h 48h esculin ulase lase S. interedi;μ8(12) S. hyicus subsp hyicus (4) S.aμ reus(35) Table 3. Bicheical reaction of coagulase positive Staþlz_vlococcus sþ % Positive on substrate Xylose ADH MAL MAN URE TRE MNE RAF SAL S. interediμs (12) o S.h) lcμs subsp hyicus (4) S.a μ reus (35) L Table 4. Antibiotic susceptibilities of coagulase positive Staphylococcμs ψ. % susceptible for antiicrobial CF OX EM MI MA SPT P Tob SM TM S. interedius (12) S. hyicμs subsp hyicus (4) CF : Cephalothin MI : Minocine P : Penicillin S. aureμs (35) TM : Tetracycline OX : Oxacillin MA : Cephanadole Tob: Tobraycin SM : Streptoycin 빠h 싸띠n 꾀 띠 e 2. 약제감수성 3. 전기영동에서의 8and 특성 Coagulase positive 포도상구균의항균제감수성 검사는 Table 4 에잘나타내고있다. 도표에나타내있듯이 S. iη terediμs 와 S. hyicμs subsp hyicμs 는본실험에서사용된항균제에대하 여높은감수성을나타냈다. 반면에 S.aμγeμs 는 MI(93%), MA(67%), Tob (67%) 의감수성을보이고, 그나머지항균제에대 해서는대단히높은내성률을나타내고있다. Polyacrylaide gel electrophoresis 에서 protein band 형태를 Fig.1 에서잘나타내고있다. 본실험에서는 S.aμ reus 표준균주와 9 개의 S. aμ reμs 균주를이용하여실시했다. 성적은표준균주 와임상에서분리된 strain 의 band 는똑같이 개정도를나타냈고또한각각의균주는항균제내 성차이, 가검물차이에관계없이동일한 band 양상 을나타내고있다

최근논문에의하면 S. interedius 와 S. hyicus subsp. hyicus 는 penicillin 을비롯하여모든항균제 에대하여더욱감수성이있다는것을나타냈으며 8), 본실험과유사한결파를나타내고있다. 분리된모 든균주는색소를생성치않았으며, Coagulase 양성 그러고 acetoin 음성이었다. S.aμ reμs 와 S. int,ι redius, S.

고찰 Coagulase 양성포도상구균은다양한동물줌의 3-72% 에서코와구강에서인정되었다. 1976 년 Hajek 는생화학적반응파세포벽의 protein 조성등에서 S.aμ re μs 와상이한 S.aμ reαs biotype E 와 F 로써전에분리된바있는 coagulase 양성포도상구균의 S. interedius 를언급했다 10, 11) R.

5 최근논문에의하면 S. interedius 와 S. hyicus subsp. hyicus 는 penicillin 을비롯하여모든항균제 에대하여더욱감수성이있다는것을나타냈으며 8), 본실험과유사한결파를나타내고있다. 분리된모 든균주는색소를생성치않았으며, Coagulase 양성 그러고 acetoin 음성이었다. S.aμ reμs 와 S. int,ι redius, S. hyicus subsp. hyicμs 는 acetoin 생성실험 에의하여명백히분리되었다. API-Staph-Ident 는 S. interedius 와 S. hyicμs > -"_ -ι } 8 - _"" - Fig. 1. P AGE analysis of whole-cell protein of S.aμ reμs IV. 고찰 Coagulase 양성포도상구균은다양한동물줌의 3-72% 에서코와구강에서인정되었다 년 Hajek 는생화학적반응파세포벽의 protein 조성등에서 S.aμ re μs 와상이한 S.aμ reαs biotype E 와 F 로써전에분리된바있는 coagulase 양성포도상구균의 S. interedius 를언급했다 10, 11) R.schulan 등은 S. inte γη'l ediμs 와 S. hyicus subsp. hyicαs 는인체와관련된포도상구균이라고 동정한바있다 8) 즉, S. 껴 teηnediμs 와 S. hyicus subsp. hyicμs 는 개, 비둘기, 밍크, 고양이, 말의코와구강에서발 견되며여러동물에있어서펴부, 요로, 호흡기, 뼈, 생식기관등지에서병원성으로작용한다고한 다. 특히이들균주사이에생화학적반응이매우유 사하여잘못동정이되며, Staph-Ident kit 이용시 생화학적반응이불규칙하여판정이애매모호하기 때문에일반 anual 방법파동시에시행하여최종 동정해야한다. 이는본실험에서도일치했다. 이들 Staphylococcκs hyicμs subsp hyicus, S. interηzediμs 균주들은대부분의 penicillin 에내성을가 지고있었으나약간의논문들은 penicillin 에감수성 이있다는것을주목했다 4) subsp. hyicus 동정에있어서우리들의처음동정을 확인동정으로사용했다. Jeffrey L. 처럼 API Syste 은 S. interedius 와 S. hyicus subsp hyicμs 의구별에있어서만족할만한결과는나타내지못 했다 5, 7) 요약을하면 S. 띠 tι redius 와 S. hyicμs subsp hyicμs 는 acetoin 음성 (0%, 0%) phosphatase 양성 (100%, 100%) 색소생성능음성등은서로일치한 다. Mannitol(100%, 0%), altose(100%, 0%), heolysis (66%, 0%) 등은서로상이하기때문에 감별의요인으로써작용할수있다고사료된다. Whole-cell protein profile 은 bacteria group 의 siilarity 를측정하기위하여여러학자들에의하여 연구되어왔다 20, 21 쩌. 이방법은 DNA-DNA hybridization ethod 를 비교할수있다고생각했으며 Wanger-Danny 는동 일한균주를갖고다른 specien 으로부터분리한후 genetic siilarity 를측정하여상이한 serotype 이 존재하는지를실험했으며상이한 serotype 이존재할 때유전학적관련여부를확인하기위하여 DNA -DN A hybridization 을이용했다 12, 18) 또한 J osiane Pierre 등은 coagulase negative Staphylococci 를이용하여 species 사이에확실한 siilarity 의차이가있다고결론을얻었다 16) 이와같이 polyacrylaide gel 을이용한전기영동 은분류학적목적에유용하여이와같은방법은상당 한결론을낸다고한다 13, 14) 본실험은 K 의료원에서 S.aμ reus 를분주받았으 며이들사이에 siilarity 의관계를관찰하고자 PAGE 를이용한 protein profile 을실험했다. 실험에서나타났듯. 이같은종류의균주에있어서 band profile 은매우 siilarity 가높은것을보였으 며기타논문파일치한다. 또한 protein profile 측정 결파표준균주의 S.aμγcμs (ATCC 25923) 와병원 에서분주받은균주사이에똑같은 band 양상을보 이고있다. 또한 9 개의 S.aμ reμs 는항균제감수성 정도, 분리된장소 ( 가검물 ) 에관계없이대략적인 -190-

6 OJ=AJ-- :- ~;;i;l -ot.c ~ _9_~ t.-l-t:-t);tt:.-p6.i7,i8). ~ol ~ uj ~ ~- :- 'fr~u}t:.-t.9-l band *.5:...9-l ;;i;tol, ul A1l i>j ~1?;1 ;;i;tol ~ ~~_9_t.-l- t1lj:1l~_9_5:. ~;;i;l~t:.-}..jl * 4- 'Xl t:.-}. Protein pattern.9-l *11-~ ttjl rojl.iij-&-5t7l7t 4-l ~~.g. o}y~,.:e~ if~~ o}~ PlA1l~?:} 0 Ht ~ ~~ 4- <Xl~t:.-}. o lt~-1 ~ u 1 A1l ~ protein pattern.9-l?:} 0 l.c 7~ 7~ $l 'fr~p}t:.-} *t!-l~ tj-ttj:l1l'cj=:i1t ~l;;i;l~ XJ-±_oJlJ.l ~:{} ~?:t 0 l~ t.-1-t:-}~..jl <Xlt:.-t. o l.c ~~ ~ ;t;~ -ot..jl <Xl.C S. aureus 'fr~llj_ ~xd.9_ ~ A~7-{-~ 4- ~t:.-}..:e ~ S. aureus 7t llj t!-l ~ AJ-% ~ 0 1 uj J.-1 4f~ ~- t:-1 *t!-l l.c ~ _5f- J.l7J- 0 l ~ :i1}-~ojl tt:}t!-} ~"51 *oj- 78~ tj-ttj:11lol ~?:}~ ±_.-{J_ l.c 7J:i1}-.5:_ ti~;t;~~ 4- ~ t:.-}. :2 9-l S. aureus ~ *t!-l 78 /\11 -ot.c :i1l-78 ojl J-1 + t!-l7t XJ' ~Al *-et-c Jl oj ojl.9-l -ote:j 15~ t:j" tj-ttj:l *~ ol ~AJS-l.C ~.5:.. A~ 7-{15~ of ~ ~ ol t:.-}. v. ~ 1. S. interedius 91- S. hyicus subsp. hyicus..91 A~~"&~ ~xj-& acetoin.%~, annitol.9-l ~<5~ 7} C?_}-Q}71 Y- %~% Ltl:-}~ t:.-}. 2. isj'frj;1l ~4-~ ~ J.}.C ~ BJ-~.9_~ S. aureus.c S.interediust.-l- S.hyicus subsp. hyicusojl 1:1l-5te:j ~.g. 111 ~% t+t:-tt1l..jl <Xl t:.-}. 3. S. interedius.q} S. hyicus subsp hyicus.c S. aureus.q} ~.R ~: :}'&~ BJ-%01 %A-ot7l ttllrojl ~ * %78 7t-3-~ 0 1 ~t:.-}. :lei t.-1- acetoin {I J.} annitol, altose ~..s~--3- %% AJJ.l-5tuJ ~* % 78.9-l.!ij oj%?;1]71 ~ 4- ~ t:.-}..jl Ail~ t:.-}. 4. S. aureus.9-l PAGE~ -%-ote:j protein profile 7J:i1}-.C l band~ ~~-ot..jl, 7-{ if~ J.}ol.9-l siilarity7t u~_5f- ~~it:-}. Characteristics of Coagulase Positive Staphylococci Isolated fro Huan and Anial (dog) Choi, S.G. Park, E.B. Dept. of Clinical Pathology, Shinheung junior College ABSTRACT Coagulase positive Staphylococci was characterized in cultures fro Huan and Anials(dog). S. interedius and S. hyicus subsp hyicus was distinguished fro S. aureus by the following characteristics ; Coagulation of plasa at 4 h, heolysis of blood at 24 hand anitol ferentation at 24 h. A clear separation of the coagulase positive cocci was apparent only with the acetoin reaction. Susceptibility of S. interedius, S. hyicus subsp hyicus and S. aureus were 92%, 75%, 8%, respectively, to penicillin G. PAGE was conducted to classify for protein of S. aureus. The siirality of S. aureus used in this experient very highed. REFERENCES 1. Adegoke, G. 0. : Characteristics of Staphylococci isolated fro an, poultry and soe other anials. ]. Appl Bacterial., 60 : , Adekeye, ]. D. : Studies on possible cross transission of ercuric chloride resitant Staphylococcus aureus beteween dogs and kennel attendants. Int. ]. zoonoses., 8 : 72-76, -191-

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대한임상병리사회지 : 제 21 권저 11 호 1989 최근에동물병원성으로인정된 S.i ntermedius 와 S. hyicus subsp. hyicus 에대한연구 신흥전문대학임상병리과 최승구 안양중앙병원임상병리과 구정서 1. 서료르 전세계적으로개에게물리는사람은대단히많다

대한임상병리사회지 : 제 21 권저 11 호 1989 최근에동물병원성으로인정된 S.i ntermedius 와 S. hyicus subsp. hyicus 에대한연구 신흥전문대학임상병리과 최승구 안양중앙병원임상병리과 구정서 1. 서료르 전세계적으로개에게물리는사람은대단히많 또한이들중 5-29% 는셰군에의하여감염되는데 그중에서도 S. aureus 가주 Pathogenes