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1 동의생리병리학회지제 21 권 6 호 Korean J. Oriental Physiology & Pathology 21(6): , 2007 산수유의유리자유기에의한간손상보호효과 하기태 김영미 김철호 1 김동욱 2 최달영 김준기 * 동국대학교한의과대학병리학교실, 1 : 성균관대학교자연과학부생명과학과, 2 : 목포대학교생명공학부생약자원전공 Study on the Protective Effect of Corni Fructus against Free Radical Mediated Liver Damage Ki Tae Ha, Young Mi Kim, Cheorl Ho Kim 1, Dong Wook Kim 2, Dall Yeong Choi, June Ki Kim* Department of Pathology, College of Oriental Medicine, Dongguk University, 1 : Molecular and Cellular Glycobiology Unit, Department of Biological Sciences, SungKyunKwan University, 2:Department of Pharmacognostic Resources, College of Natural Science, Mokpo National University Carbon tetrachloride (CCl 4)-induced liver injury depends on a toxic agent that has to be metabolized by the liver NAPDH-cytochrome P450 enzyme system to a highly reactive intermediate. Alternations in the activity of cytochrome P450 enzymes affect the susceptibility to hepatic injury from CCl 4. In this study, we evaluated the potential protective activity of the traditional Korean medicinal herb, Corni fructus (CF), against an experimental model of hepatotoxicity induced by CCl 4. The CF exhibited a hepatoprotective activity against CCl 4-induced liver damage in Sprague-Dawley (SD) rats, as measured by GOT, GPT, ALP and histological observation. The CF also showed significant decrease of malodialdehyde (MDA) and increase of glutathion (GSH), catalase activity in rat liver homogenate. In addition, the expression of CYP2E1, as measured by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot analysis, was significantly decreased in the liver of CF treated SD rats. But CCl 4 and CF has no significant effect on 1A1 and 3A1 isoform of cytochrome P450. Based on these findings, it is suggested that hepatoprotective effects of CF possibly related to antioxidative effects and regulation of CYP2E1 expression. Key words : Corni Fructus, cytochrome P450 2E1, carbon tetrachloride, hepatoprotection, antioxidative effect 서론 사염화탄소 (CCl 4) 는실험적인간독성유발에전형적으로사용되고있는약물로서혈청내 transaminase의증가등각종효소활성에변화를초래하며 1), 급성적으로는간세포의종창, 지방성혹은소엽중심성괴사등이일어나고만성적으로는간경변을초래한다 2). 사염화탄소는그자체로는무해하지만, 간세포의무과립내형질세망에들어있고지용성약제나기타화합물의대사에관여하는 - cytochrome P450에의해반응성이높은독성 free radical인 CCl 3 로전환되어 3) 세포막의인지질과산화및내형질세망의구조와기능파괴, 미토콘드리아및세포내효소활성의파괴등다양한세포상해를일으켜세포의괴사나지방변성을초래한다 4,5). 산수유 (Corni Fructus) 는층층나무과의낙엽성관목인산수 * 교신저자 : 김준기, 경북경주시석장동 707번지동국대학교한의과대학 graywolf@dongguk.ac.kr, Tel : 접수 : 2007/10/27 채택 : 2007/11/30 유 (Cornus officinalis Sieb. et Zucc.) 의성숙한과실의씨앗을제거한과육을건조한것으로 6), 補肝腎하는대표적인약재로사용되어왔다. 肝腎으로귀경하며氣味는酸澁, 微溫하며補益肝腎, 澁精固脫하는효능이있어서, 眩暈耳鳴, 腰膝酸痛, 陽痿遺精, 遺尿, 小便頻數, 崩漏帶下, 大汗虛脫등의질환을치료하는처방에다용되었으며 7), 溫肝, 補肝의대표적인약물로분류되고있다 8). 또한최근연구에의하면항당뇨 9), 항균및항산화성 10,11), 정자활동성증가 12) 등에대한보고가있다. 이와같이산수유는補肝腎하는효능이있으며, 또한항산화활성과같은약리작용이보고되고있으므로간독성에대한보호작용을할것으로기대된다. 따라서본연구에서는산수유열수추출물을백서에투여하여 GOT, GPT, ALP 및조직학적검사를통한간보호활성과 LPO, GSH, catalase를통한항산화성의검증및사염화탄소의대사과정에핵심적인작용을하는 cytochrome P450의발현에대하여실험하여유의한성적을얻었기에보고하는바이다

2 하기태 김영미 김철호 김동욱 최달영 김준기 재료및방법 1. 시료실험에사용된산수유는경북경주지방에서재배한것으로, 성심한약재 ( 경북경주 ) 에서구입하여동국대학교본초학교실에서검증한후정선하여사용하였다. 산수유 300 g에증류수 1.5 l를넣고 100 에서 3시간동안가열한후여과하여약 650 ml 의전탕액을얻었으며, 이를감압농축한후동결건조하여 6.3 g 의분말을얻었으며 ( 수율 2.1%), -20 에보관하였다가증류수에녹인후실험에사용하였다. 2. 실험동물및처치실험용동물은체중 150±20 g의 Sprague-Dawley (SD) 계웅성 rat를사용하였으며, 7일간동국대학교한의과대학동물실험실에서일정한조건 ( 온도 : 20±2, 습도 : 60%, 명암 : 12시간 light/dark cycle) 에서적응시킨후실험에사용하였다. 실험동물은 4개의군 ( 정상군, 대조군, 전처리군, 후처리군 ) 으로나누었으며, 6마리를한군으로사용하였다. 정상군은 mouse 용고형사료와물을제한없이공급하였으며, 대조군은 7일간고형사료와물을제한없이공급한후 CCl 4 를 0.5 ml/kg/day 용량으로복강주사하여간독성을유발시켰다. 산수유전처리군은 CCl 4 투여 7일전부터 10 mg/kg/day 용량으로경구투여한후 8 일째에 CCl 4 를 0.5 ml/kg/day 용량으로복강주사하여간독성을유발시키고, CCl 4 투여 24시간후에심장천자를통해혈액을채취하고간을적출하였다. 산수유후처리군은 7일간고형사료와물을제한없이공급한후 CCl 4 를 0.5 ml/kg/day의용량으로복강주사하여간독성을유발한후산수유를 10 mg/kg/day 용량으로경구투여하여 48시간후심장천자를통해혈액을채취하고간을적출하여실험에사용하였다. 3. 생체시료의제조실험동물을 ethyl-ether로마취시킨다음복부정중선을따라개복하여복부대동맥에서채혈하였으며채혈한혈액은실온에서 1시간동안방치한다음혈청을분리하여 GOT, GPT, ALP 측정효소원으로사용하였다. 생리식염수 (0.9% NaCl) 로관류시킨간은조직이손상되지않도록주의하여혈액이충분이제거될때까지생리식염수로잘씻어내고 whatman 여과지로생리식염수를제거한후 -70 에동결보존하여사용하였다. Western blot 및효소활성도측정을위해전체조직의 4배용량의 50 mm potassium phosphate buffer (ph 7.5) 를가하여 4 에서 homogenizer로 4분간균질화하였다. 이균질액을 1000 g에서 15분간원심분리하여상층액은과산화지질 (lipid peroxide) 및 glutathion 함량을측정하기위한시료로사용하였고, 나머지상층액은 600 g에서 15분간원심분리하여핵과세포잔해를제거한상층액을취한후다시 12,000 g에서 30분간원심분리하여미토콘드리아를제거한상층액을 catalase 활성도를측정하기위한시료로사용하였다. 상기의조작은특별한언급이없는경우는모두 4 에서실시하였다. 4. 혈청내효소활성의측정 1) GOT 및 GPT의활성측정혈청중 GOT 및 GPT 활성측정은 Reitman-Frankel의방법 13) 에따라조제된시약 Kit( 아산제약 ) 를사용하여측정하였다. GOT, GPT 기질액 1.0 ml을시험관에가하여 37 에서 5분간방치한다음혈청 0.2 ml을넣어잘혼합한후 37 에서 GOT는 60분, GPT는 30분간반응시킨뒤정색시액 1.0 ml을첨가하여잘혼합하여실온에서 20분간방치하여반응을종료시키고, 0.4N NaOH 용액 10 ml을가하여잘혼합한다음실온에서약 10분간방치하였다가 60분이내에 505 nm에서증류수를대조로흡광도변화를측정하였다. 혈청중 GOT, GPT의활성도는작성한표준검량곡선에서산출하였으며혈청 1 ml 당 IU/l로나타내었다. 2) ALP의측정혈청중 ALP 활성측정은 Petkova 등 14) 의방법에따라조제된시약 Kit( 아산제약 ) 를사용하여실시하였다. 기질액 2.0 ml을시험관에가하여 37 에서 5분간방치한후여기에혈청 0.05 ml을가하여잘혼합하여 37 에서 15분간반응시켰다. 정색시약 2.0 ml을넣고충분히잘혼합한후실온에서 10분이상방치시키고 60분이내에 500 nm에서시약 blank를대조로흡광도의변화를측정하였다. 혈청중 ALP의활성도는표준검량곡선에서산출하였으며혈청 dl당 King-Amstrong unit (20K-A unit) 로나타내었다. 5. 조직절편의제작및염색간조직을 10% 중성포르말린에 2시간이상고정시킨다음 automated tissue processing 후 embedding하여 paraffin block 을만든다음 5 μm의절편을만들어 slide glass에부착후 xylene으로탈파라핀화한다. 그후 100%, 90%, 80%, 70%, 60% ethanol 순으로함수시키고 hematoxylin으로핵을염색한후 1% HCl로탈색한다음 0.3% ammonia water로중화를시켰다. 세포질염색을위해 eosin으로염색한후 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ethanol 순으로탈수과정을거쳤다. 청명과정으로 xylene I 및 II 에담갔다가 canada balsam으로 mounting하여광학현미경으로조직을관찰하였다. 6. 항산화활성에대한측정 1) 단백질의정량단백질의정량은 Bradeford의방법에따라 Sigma사 (USA) 의 Bradford reagent를이용하였으며, bovine serum albumin을사용하여표준곡선을산출하여단백질을측정하였다. 2) 간조직의 Lipid peroxide(lpo) 함량측정조직내지질과산화물의함량측정은 Ohkawa 등 15) 의 TBA법으로측정하였다. 즉조직마쇄균질액을 1,000 g에서원심분리한후 20% 간조직균질액 0.4 ml에 8.1% sodium dodecyl sulfate 0.2 ml, 20% acetate buffer (ph 3.5) 1.5 ml와 0.8% thiobarbituric acid (TBA) 1.5 ml을가한다음 95 항온수조에서 1시간동안반응시키고실온으로냉각한다음 n-butanol:pyridine (15:1, v/v)

3 산수유의유리자유기에의한간손상보호효과 의혼합액 5 ml를첨가하여잘혼합하였다. 이혼합액을 3,000 rpm에서 15분간원심분리하여 TBA 반응물질이존재하는 n-butanol c층을취하여파장 532 nm에서흡광도를측정한다음, 검량표준곡선에준하여과산화지질함량을간조직 1 mg당생성된 malondialdehyde (MDA) 함량을 nmol로나타내었다. 3) 간조직의 Glutathion (GSH) 함량측정간조직중의 glutathione 함량은 Ellman 16) 의방법에의하여측정하였다. 먼저간조직균질액을 1,000 g에서원심분리한후상층액에 4% sulfosalicylic acid를가하여혼합한후 1,000 g에서 10분간원심분리하고상층액을취하여 sulf-hydryl group이발색제인 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (1 mm DTNB) 용액과혼합하여실온에서 20분간방치한후 412 nm에서흡광도를측정하였으며 Glutahthion 함량은 protein 1 mg당 nmol로나타내었다. 4) 간조직의 Catalase 활성측정조직내 catalase 활성도는 Aebi 17) 의방법에따라측정하였다. 50 mm potassium phosphate buffer (ph 7.0) 에효소원일정량을넣고기질로서 10 mm H 2O 2 용액을가하여파장 240 nm에서흡광도의변화를 1분간측정하였다. 대조실험으로는기질인 10 mm H 2O 2 용액대신에 50 mm potassium phosphate buffer (ph 7.0) 을가해다른조건은위와동일하게하여흡광도의변화를측정하였으며, 효소의활성도는 1분동안에 1 μm의 H 2O 2 를분해시키는효소의양을 1 unit로하였다. 7. Cytochrome P450 isoform의 mrna 발현측정 1) Total RNA의분리및정량 Total RNA의분리는 takara사의 catrimox-14tm RNA isolation kit ver 2.11을사용하였다. Rat liver total RNA의경우에는 -70 에보관중이던간조직 1 g을 homogenizer을이용하여잘분쇄한다음 cartrimix-14 buffer 1 ml로 lysis시켜실온에서 10,000 rpm으로 5분간원심분리를한다. 원심분리후상등액을제거하고 pellet에 DEPC 1 ml을첨가하여 12,000 rpm으로 2분간다시원심분리를한다. 상등액을제거시킨 pellet에 guanidinium 0.5 ml 첨가하여 vortex한후 phenol/chloroform/iso-amylalchol (25:24:1) 을 0.5 ml 첨가시켜 vortex하여 12,000 rpm으로 3분간원심분리한후상등액을취해 iso-propylalcol을 equeal volume 넣어잘혼합한후 -20 에 30분간방치시킨다. 다시 12,000 rpm으로 10분간원심분리를하여상등액을제거시킨 pellet을 70% 에탄올로 washing시키고나서진공하에건조시켜 1 μg/μl가되도록 0.1% DEPC 용액에녹여사용하였다. 2) cdna 합성및 RT-PCR cdna 합성은 RNA PCR kit (AMV) 를사용하였다. 본실험에서는 total RNA 1 μg를주형으로사용하였으며, MgCl 2 (2.5 mm), 10X RNA PCR buffer, RNase free distilled H 2O, dntp (10 mm), AMV reverse transcriptioase XL, Oligo dt (2.5 pmol/ μl) 가되게넣고 total volume을 20 μl가되게해서혼합한후 RT 반응을수행하였다. 즉 30 에서 10분간반응시키고 42 에서 30 분간 annaling시켜신장할수있도록만들어주고 99 에서 5분, 5 에서 5분간 1 cycle을실시한다. 합성된 cdna는 sense 및 antisense primer(20 pmol) 각각 1 μl 첨가하고 10x PCR buffer 5 μl, 2.5 mm dntp 1 μl, LA taq polymerase 1 μl를첨가한다음 sterile distilled H 2O로 total volume 50 μl가되도록 PCR tube에서혼합한후, 95 에서 5분간 95 에서 1분간 denaturation 후 68 에서 1분간 annaling시키고, 72 에서 1분 30초동안 35 cycle 반응시킨다음 72 에서 5분동안 elongation한다. 각각의 PCR product는 10 μl 씩 1.2% ETBR stained agarose gel 상에서 loading하여전기영동을시행하여분석하였다. Cytochrome P450 isoform 각각의 PCR을위하여사용된 sense, antisense primer는아래의표와같다 (Table 1). Table 1. The primer sequences which were used in PCR reaction of three cytochrome P450 isoforms and β-actin. Gene sense primer antisense primer product size CYP1A1 GTTCCCAAAGGTCTGAAGA G CYP3A1 GGAAATTCGATGTGGAGTG C CYP2E1 ACCACCAGCACAACTCTGA GATATGG β-actin GCTGCCTGACGGTCAGGT CA 8. Cytochrome P450 의단백질발현측정 CATATGGCACAGATGAC ATTGG AGGTTTGCCTTTCTCTTG CC CAATTCCATGCGGGCCA GGCCTTCTCC CTTGCGCTCAGGAGGAG CAA 509 bp 329 bp 435 bp 266 bp 생리식염수 (0.9% NaCl) 로관류시킨후 -70 에동결보존한간조직 1 g을전체조직의 4배용량의 50 mm potassium phosphate buffer (ph 7.5) 를가하여 4 에서 homogenizer로 4 분간균질화한다음, 4 12,000 rpm에서 10 min간원심분리를하여 supernatent만모아서 -70 에보관하였다가실험에사용하였다. 단백질의정량은앞에서언급한바와같이 Bradeford의방법에따라시행하였다. 냉동보관한단백질을얼음위에서녹여 20 μg이되도록계산하여 loading한후 10% SDS-PAGE로전기영동하여분리시켰다. 분리된단백질을 nitrocellulose membrane으로 electroblotting에의해 transfer시킨후, 5% skim milk를함유한 TBS-T (0.1% Tween 20 in TBS) 를이용하여상온에서 1시간 incubation하여비특이적인단백질에대한 blocking을실시하였다. TBS-T로 10분간 2회 washing 후 0.5% BSA가첨가된 TBS-T 에 1:1,000으로희석한 anti-cyp1a1, CYP3A1 및 CYP2E1 antibody (Chemicon, USA) 를 primary antibody로하여 4 에서 overnight inbubation하여항원항체반응을일으킨후, TBS-T로 10분간 2회 washing하고 2차항체로 0.5% BSA가첨가된 TBS-T 에 1:2,000으로희석한 HRP-conjugated anti-rabbit IgG를사용하여상온에서 1시간 incubation한다음 ECL solution을사용하여암실에서 X-ray film에약 30분감광시킨후 develop하여단백질의발현양상을분석하였다. 또한 cytochrome P450의단백질발현을분석한것과동일한방법으로 GAPDH에대한 western blot 을시행하여단백질의발현을정량하였다. 9. 실험성적의통계처리

4 하기태 김영미 김철호 김동욱 최달영 김준기 실험결과에대한통계적인분석은 SAS (SAS Institute, USA) 을이용하였다. 실험성적은평균 ± 표준편차 (mean±sd) 로나타내었으며, 각실험군간의유의성을검증할때에는 Student's t-test로 p-값이 0.05 미만일때유의한차이가있는것으로판정하였다. 결 과 1. Rat 혈청 GOT, GPT 및 ALP 에대한산수유의영향 각각실험군의 Rat를희생시켜혈액을채취하여혈청을분리한후 GOT, GPT 및 ALP 활성을측정한결과를 Table 2에나타내었다. GOT, GPT, ALP 모두정상군에비하여 CCl 4 만처리한대조군은증가하였으며, 산수유추출물을 7일간투여한후 CCl 4 로간독성을유발한전처리군과 CCl 4 로간독성을유발한후 2일간산수유추출물을투여한후처리군에서모두감소하였다. 특히 GPT와 ALP는전처리군과후처리군모두에서유의한감소를나타내었으나, GOT의경우에는전처리군에서는유의한감소를나타내었으나후처리군에서는통계적유의성은없었다. 전체적으로산수유의전처리가후처리에비하여간보호활성이뛰어난것으로나타났다. Table 2. The effect of the hot water extract of Cornus Fructus (CF) on serum GOT, GPT and ALP levels with hepatic damage induced by carbon tetrachloride (CCl 4). GOT (IU/l) GPT (IU/l) ALP (20K-A unit) Control 24.2± ± ±0.6 CCl ± ± ±2.95 CF + CCl ±7.79* a) 38.15±5.59* a) 10.43±1.07* a) CCl 4 + CF 58.94± ±8.55* b) 10.61±0.68* b) Each value represents the mean±s.d. of 6 rats Significantly different from the CCl 4 b) group (* : P < 0.05) Significantly different from the CCl 4 group (* : P < 0.05) 2. Rat liver 의조직소견에미치는산수유의영향 각각의실험군을 CCl 4 로간독성을유발한 24시간후에희생시켜간조직을적출하여생리식염수 (0.8% NaCl) 로관류시키고잘씻은다음 -70 에동결보존하였다가포르말린고정및파라핀포매등의조작을통하여조직절편을제작하였으며, hematoxylin and eosin 방법으로염색하여광학현미경으로관찰하였다. CCl 4 를처리하지않은정상대조군은간세포들이 central vein을중심으로정상적인소엽구조를유지하면서잘배열되어있으며, 기타의조직학적인구조또한정상으로나타났다 (Fig. 1A). CCl 4 를처리하여간독성을유발한대조군의간조직은간소엽의정상적인구조가명확하지않으며, 세포질내에많은액포 (vacuole) 와 central vein 주위에서는중성구의침윤과간세포의종창이관찰되다 (Fig. 1B). CCl 4 를처리하기 7일전부터산수유추출물을투여한전처리군및 CCl 4 를처리한후 2일간산수유추출물을투여한후처리군에서는정상군과마찬가지로 central vein 을중심으로간세포가정상적인소엽구조를이루면서배열되어있으며, 일부세포에서액포가발견되고있으나 CCl 4 만처리한군에비하면현저한감소를나타내었다 (Fig. 1C, D). a) Fig. 1. Light micrograph of paraffin-embedded mouse liver tissues. All section were stained with hematoxylin and eosin. (A) Photomicrograph (X 100) of a section taken from the liver of normal control rat treated with olive oil. (B) Photomicrograph (X 100) of a section taken from the liver of rat treated with CCl 4 (0.5 ml/kg/day). (C) Photomicrograph (X 100) of a section taken from the liver of rat treated with CCl 4 (0.5 ml/kg/day) after administration with CF (10 mg/kg/day) for 7 days. (D) Photomicrograph (X 100) of a section taken from the liver of rat treated with CCl 4 (0.5 ml/kg/day) and then treated with CF (10 mg/kg/day) for 2 days. 3. Rat liver 의항산화활성에대한산수유의영향 각각의실험군의 Rat를희생시켜간조직을채취한후균질화하여원심분리한후지질과산화, GSH 및 catalase를측정한결과는 Table 3과같다. MDA 방법으로지질과산화도를측정한결과정상군에비하여 CCl 4 만처리한군에서지질과산화도가증가하였으며, 산수유추출물을 7일간투여한후 CCl 4 로간독성을유발한전처리군에서는지질과산화도가감소하였으나통계적인유의성은없었으며, CCl 4 로간독성을유발한후 2일간산수유추출물을투여한후처리군에서는유의성있는감소를나타내었다. GSH의함량및 catalase의활성을측정한결과, 정상군에비하여 CCl 4 만처리한군에서는감소하였으며, 전처리군및후처리군모두에서현저한증가를나타내었다. Table 3. The effect of CF on lipid peroxidation(lpo), GSH and catalase levels with hepatic damage induced by CCl 4. LPO (nmol/g) GSH (nmol/g) Catalase (unit/mg) Control 6.62± ± ±0.6 CCl ± ± ±0.68 CF + CCl ± ±0.36* a) 13.29±0.63* a) CCl 4 + CF 5.44±0.23* b) 2.39±0.26* b) 18.31±0.8* b) Each value represents the mean±s.d. of 6 rats a) Significantly different from the CCl 4 b) group (* : P < 0.05) Significantly different from the CCl 4 group (* : P < 0.05) 4. Rat liver 의 cytochrome P450 유전자발현에대한산수유의영향 각각의실험군을 CCl 4 로간독성을유발한후희생시켜간조직을채취하여 mrna를추출한다음 Table 1에서언급한 primer를이용하여 RT-PCR을시행하여그산물을 1.5% agarose gel에서전기영동하였다. Fig. 2에나타난바와같이, 정상대조군과비교했을때 CCl 4 의처리에의하여 CYP2E1의유전자발현은현저히증가하였으나, CYP1A1 및 3A1 type의경우에는 CCl 4 의처리에의하여유전자발현에영향을받지않았다 (Lane 1, 2). 또한산수유추출물을전처리한군에서는 CYP1A1, CYP3A1 및 CYP2E1 type이모두유전자발현이감소함을확인하였으며, 산수유추출물을후처리한군에서는 CYP3A1 및 CYP2E1 type에서만현저한감소를확인하였다. 이것으로보아 CYP2E1의 mrna

5 산수유의유리자유기에의한간손상보호효과 발현량은 CCl 4 에의하여특이적으로증가하며, 산수유추출물의전처리및후처리에의해서발현량이억제되는것을알수있다. 특이적으로증가하며, 산수유추출물의전처리및후처리에의해서발현량이억제되는것을알수있다 고 찰 CYP1A1 CYP3A1 CYP2E1 β-actin 509 bp 329 bp 435 bp 266 bp Fig. 2. The cytochrome P450 mrna expression levels of CCl 4 and CF treated rat liver. The RT-PCR product of CYP1A1 (509bp), CYP3A1 (329bp) and CYP2E1 (435bp) were loaded in 1.5% ETBR-stained agarose gel. The templates of the reaction were total mrnas from the liver of rats which were treated with olive oil (0.5 ml/kg) as normal control (lane 1), treated with CCl 4 (0.5 ml/kg/day) as positive control (lane 2), treated with CCl 4 (0.5 ml/kg/day) after administration of CF (10 mg/kg/day) for 7 days (lane 3) and treated with CCl 4 (0.5 ml/kg/day) before administration of CF (10 mg/kg/day) for 2 days. (lane 4) CYP1A1 CYP3A1 CYP2E1 GAPDH Fig. 3. The cytochrome P450 protein expression levels of CCl 4 and CF treated rat liver. Western blot analysis was carried out by using rat CYP1A1, CYP3A1 and CYP2E1 specific polyclonal antibody. The sample of the SDS-PAGE were total proteins from the liver of rats which were treated with olive oil (0.5 ml/kg/day) as normal control (lane 1), treated with CCl 4 (0.5 ml/kg/day) as positive control (lane 2), treated with CCl 4 (0.5 ml/kg/day) after administration of CF (10 mg/kg/day) for 7 days (lane 3) and treated with CCl 4 (0.5 ml/kg/day) before administration of CF (10 mg/kg/day) for 2 days. (lane 4) 7. Rat liver 의 cytochrome P450 단백질발현에대한산수유의영향 각각의실험군을 CCl 4 로간독성을유발한후희생시켜간조직을채취하여단백질을추출하여전기영동하여 nitro-cellulose membrane에이동시킨다음, CYP1A1, CYP3A1 및 CYP2E1에특이적인 1차항체와 anti-rabbit IgG를이용하여 Western blot analysis를시행하여 Fig. 3의결과를얻었다. RT-PCR의결과와같이정상대조군과비교했을때 CCl 4 의처리에의하여 CYP2E1 의단백질발현은현저히증가하였으나 CYP1A1 및 3A1 type의경우에는 CCl 4 의처리에의하여유전자발현에영향을받지않았으며 (Lane 1, 2), 산수유추출물을전처리한군에서는 CYP1A1, CYP3A1 및 CYP2E1 type이모두유전자발현이감소하였으나후처리한군에서는 CYP3A1 및 CYP2E1 type에서만현저한감소가확인되었다. 이것으로보아 CYP2E1 단백질은 CCl 4 에의하여 간손상의실험적인모델로는 CCl 4, D-galactosamine, thioacetamide ethionine 등을이용한독성동물모형과담관결찰을통한수술적인방법등이사용되고있다 18). 이가운데 CCl 4 는 free radical에의한대표적인세포손상으로서실험적인간실질장해를유도하기위해서많이사용된다 19). 사염화탄소는그자체로는무해하지만간세포의무과립내형질세망에존재하는약물대사효소인 cytochrome P450에의하여반응성이높은독성 free radical인 CCl - 3 로전환되어세포상해를일으킨다 20). CCl - 3 는 OH - 처럼지질과산화를일으키는강력한물질로서, 세포막의인지질내에있는불포화지방산에서수소원자를공여받아자신은 CHCl 3 로변하고불포화지방산에여분의전자를제공함으로써지질의 free radical화를유발하고, 이 radical이산소와반응 (peroxidation) 하여유기과산화물 (organic peroxide) 을형성한다. 이러한유기과산화물은그자체가 free radical로작용하여새로운 free radical 을형성하며, 따라서인지질의과산화는더욱가속화된다 21). 이반응은세포막에서가까운내형질세망으로급속히진행되어세포내소기관중내형질세망의구조와기능이먼저파괴되며, CCl 4 투여후 30분이내에간세포의단백질합성이저하되며 2시간이내에전자현미경으로내형질세망의종창과리보솜의탈락, 그리고폴리솜의해리를관찰할수있다고보고되었다 22,23). 세포손상이진행됨에따라지질이내형질세망에서부터축적되기시작하여세포질로확산되는데, 지질의축적은간세포의단백질합성이저하되어지질수용단백질의합성까지장애를받기때문이다. 즉간세포가 tryglyceride를분비하기위해서는지질수용단백질과 tryglyceride가결합한지질단백의형태를만들어야하는데, 간세포에서지질수용단백질이생산되지않기때문에지질단백을형성할수없게된다. 따라서세포질내에 tryglyceride가다량으로축적되어 CCl 4 중독의특징인지방간이된다 24). 내형질세망의지질과산화과정중작은조각으로잘린비교적안정된 fatty aldehyde 가생겨나는데, fatty aldehyde는주위로확산되어세포막이나미토콘드리아등에손상을일으킨다고보고되고있다. 따라서내형질세망에이어서미토콘드리아가손상되므로세포막의이온채널의에너지원이되는 ATP가감소되어세포막의투과성이증가되고세포전체의종창이일어난다. 세포막의손상은다량의칼슘을세포내로들어오게하여칼슘이미토콘드리아내에축적되어미토콘드리아의기능이소실된다. 이후의세포변화는허혈성손상에서와비슷하게진행되어결국세포의괴사로이어진다 25). 산수유 (Corni Fructus) 는층층나무과의낙엽성관목인산수유 (Cornus officinalis Sieb. et Zucc.) 의성숙한과실의씨앗을제거한과육을건조한것으로, 肝腎으로귀경하며氣味는酸澁, 微溫하며補益肝腎, 澁精固脫하는효능이있어서補肝腎하는약재로사용되었다 1). 대표적인주치증으로는眩暈耳鳴, 腰膝酸痛, 陽痿遺精, 遺尿, 小便頻數, 崩漏帶下, 大汗虛脫등이있어서 2), 六味地

6 하기태 김영미 김철호 김동욱 최달영 김준기 黃丸와地黃飮子 26), 補肝散 27) 등의처방에사용되었다. 또한東醫寶鑑 湯液 에서는五臟補瀉의肝편에서 補用木瓜 阿膠 川芎 黃芪 山茱萸 酸棗仁 五加皮 28) 라고하여간을補하는약물로분류하고있으며, 淸代王泰林은西溪書屋夜話錄에서산수유를溫肝, 補肝의대표적인약물로분류하였다 29). 산수유에대한최근의연구를살펴보면먼저국내에서는박 4) 이 streptozotocin으로유발된고혈당백서에대한항당뇨효과를보고하였으며, 박 5) 은산수유약침의항산화작용에대하여보고하였다. 또한국외에서도 Mau 등 6) 이항균작용에대하여보고하였으며, 또한 Jeng 등 7) 은정자활동성증가에대하여보고하였다. 현재까지발표된문헌에는산수유의간독성보호작용에대한보고가없지만, 산수유가補肝腎하는효능이있고補肝하는약물로분류되었으며또한항산화활성등여러가지약리작용이보고되고있어서간독성에대한보호작용을할것으로기대되어본연구를진행하게되었다. 간세포의손상을검사하기위하여임상적으로흔히혈청내의 GOT, GPT 및 ALP와같은효소의활성도를검사하는데 30), 혈청내에서의 GOT와 GPT의활성치증가는간세포의장애정도와비교적상관성이좋을뿐아니라, 간에서혈액으로유출되는다른효소에비하여예민하게변동한다. 또한다른조직보다간은 transaminase의조직내농도가현저하게높고혈중으로유출이쉬운혈행구조를갖고있기때문에 GOT와 GPT의혈중농도를간질환의진단에널리이용하고있다 13). 또한 ALP는생체내에서널리분포하지만혈중에출현하는것은한정된장기의 ALP에의한것이다. 즉흡수, 분비가활발한부위인간에서는 ALP가풍부하여통상밖으로배설되고있는데, 간염, 간경변, 폐쇄성황달, 기타간담도계질환등이있을때증가한다 31). 본연구에서는이러한효소활성을 in vivo와 in vitro에서실험하여간손상의정도를간접적으로측정하였다. 먼저동물실험의경우각각의실험군을 CCl 4 로간독성을유발한후전처리군은 24시간, 후처리군은 48시간후에희생시켜혈액을채취하여혈청을분리한후효소활성을측정하였다. 그결과 GOT, GPT, ALP 모두정상대조군에비하여 CCl 4 만처리한대조군에서증가하였으며, 산수유추출물을 7일간전투여한실험군에서는각효소의활성이모두유의성있게억제되었다. 후처리군에서는 GPT 및 ALP는유의하게감소하였으며 GOT의경우감소하였으나통계적인유의성은없었다. 또한각각의실험군에서적출한간조직을절편으로제작하여 hematoxylin and eosin 방법으로염색한후광학현미경으로관찰한결과, 혈청효소치에서나타난바와같은간보호작용을확인할수있었다 (Fig. 1). 따라서산수유추출물이 CCl 4 로유도된실험적간손상에있어서간보호활성을가짐을확인할수있었으며, 그기전을확인하기위하여 rat의간조직에서 CCl 4 에의한간손상의경로로알려진산화적손상기전과연관된지질과산화 (LPO), 생체내천연항산화물질인 GSH 및항산화효소인 catalase의활성을검사하였으며, 또한 in vivo 및 in vitro에서 CCl 4 를 CCl - 3 로전환하는효소인 cytochrome P450의발현조절에대하여실험하였다. 지질과산화 (Lipid Peroxdation; LPO) 는식물및동물에서잘 정립된세포상해기전으로세포나조직에있어서산화적스트레스의지표로서사용되고있다. 과산화지질은불안정하며반응성 carbonyl 화합물을포함하는여러가지화합물의복합물로분해된다. 불포화지방산이과산화되면 malonaldehyde (MDA) 와 4-hydroxyalkenals을분해산물로생성하는데, Malonaldehyde (MDA) 와 4-hydroxyalkenals의측정은지질과산화의지표로사용되고있다 32). 본연구에서는각각의실험군에서채취한간조직을균질화하여원심분리한후지질과산화물인 MDA를측정한결과, 정상군에비하여 CCl 4 만을처리한대조군에서증가하였으나산수유추출물을전처리한실험군에서는 MDA의생성이억제되었으나통계적인유의성은없었으며, 후처리한군에서는유의성있게억제됨을알수있었다. Glutathione (gamma-glutamylcysteinylglycine or GSH) 은핵친화적이고대부분의호기성세포의항산화시스템뿐만아니라대사과정에있어서도중심적인역할을하는자연발생적인 tripeptide이다 33). GSH는 glutathione peroxidase, glutathione S-transferase and thiol transferase 등여러가지효소에중요한역할을하는조효소 (coenzyme) 로작용한다. 그리고약물대사와칼슘대사, gamma-glutamyl cycle, 혈소판및세포막기능에있어주된역할을한다. 또한 GSH는생체이물질의독성제거및단백질의 -SH기레벨의유지, thiol-disulfide의교환, 과산화물과 free radical의제거, 세포막에서아미노산의통과등여러가지생명현상에있어서핵심적인역할을한다. 세포내 GSH의생리적인수치는대채로 1~10 mm의범위를유지하고있다 34). 본실험에서는 GSH를측정한결과정상군에비하여 CCl 4 만을처리한대조군에서유의하게감소하였으며, 산수유추출물을전처리한군및후처리군에서모두유의성있게증가함을알수있었다. 세포내의효소성항산화제로는 SOD, catalase, glutathion peroxides (GSH-PX), glutathione reductase 등이있다. 이러한항산화효소들은 O - 2, H 2O 2 그리고유기 peroxide, OH - 라디칼등의독성을탈독성화하거나약화시키는데, 이들항산화제중 SOD, catalase, gluthathion peroxide 등에대하여많은연구가시행되고있다 35). 활성산소종의하나인과산화수소는정상적인호기성대사과정및병리적인활성산소종의생산에의한독성산물이다. Catalase (EC , 2H 2O 2 oxidoreductase) 는 dismutation을통해서또한 peroxidatic activity를나타냄으로써과산화수소를파괴하는효소이다 36). 본연구에서는각각의실험군에서 catalase 활성을측정한결과정상군에비하여 CCl 4 만을처리한대조군에서는유의하게감소하였고, 산수유추출물을 7일간전처리한군및 2일간후처리한군에서유의성있는증가를나타내었다. Cytochrome P450은체외에서들어오는환경물질을대사하는중추적인역할을하는효소로서, 간, 폐, 신장, 뇌, 피부및태반등전반적인기관의내형질세망 (endoplasmic reticulum; ER) 에존재하며특히간에서다량으로발현하는것으로알려져있다 37,38). Cytochrome P450에는여러가지다양한 isozyme이존재하는데, 그중에서 gene subfamily 1, 2, 3, 4의 isoform이약물대사와관련되어흔히발현하는것으로알려져있다 39). 특히 ethanol에의해서유도되는 2E1 isoform이사염화탄소로인한간

7 산수유의유리자유기에의한간손상보호효과 손상에주로관여하는것으로알려져있으며 40), 1A1 isoform도 3-methylcholanthrene (MC) 와사염화탄소의동시투여에서 3-MC의단독투여보다더높은발현을보인다는보고가있었다 41). 또한 ergosterol biosynthesis inhibiting fungicides (EBIFs) 에의한 rat의간독성모델에서 1A1/2 및 3A isoenzyme의발현이증가한다는보고가있었다 42). 따라서본연구에서는산수유추출물이사염화탄소를통하여유발되는 cytochrome P450 isoform 중간독성모델과관련있는것으로알려진 1A1, 3A1 및 2E1의발현을조절하는지살펴보기위하여 RT-PCR과 western blot을이용하여 mrna 및단백질의발현정도를비교하였다. 먼저동물실험에서는각각의실험군을 CCl 4 로간독성을유발한후산수유추출물전처리군은 24시간후, 후처리군은 48시간후에희생시켜간조직을채취하여 mrna를추출한다음 Table 1에서언급한 sense와 antisense primer를이용하여 RT-PCR을시행하여그산물을 0.5% agarouse gel에서전기영동하여분석하였다. CYP1A1 의경우에는 CCl 4 를처리하였을때정상군과 mrna의발현정도에큰차이를보이지않았으나, 산수유추출물의전처리군에의하여발현이감소함을확인할수있었다. CYP3A1은 CCl 4 처리에의하여발현이변화하지는않으나산수유추출물의전처리, 후처리에의하여발현량이낮아지는것을확인할수있었다. 그러나 2E1 isoform의경우정상군에서는매우낮은농도로발현하고있으나 CCl 4 를처리한대조군에서는매우높은농도로발현하였으며, 산수유추출물을전처리한실험군과후처리한군에서는매우낮은농도로발현되는것을알수있었다 (Fig. 2). 또한 western blot을통하여 CYP1A1, 3A1 및 2E1 단백질의발현을확인한결과 RT-PCR과일치하는결과를확인할수있었다 (Fig. 3). 이러한결과는 Wong 등 43) 이 CYP2E1 유전자를결실시킨생쥐에는사염화탄소를투여하여도정상대조군과는달리 GOT, GPT 수치가증가하지않으며간손상이발생하지않음을보고한것과일치하는것으로 CCl 4 를통하여유도된간손상모델에서는 cytochrome P450 isoform 중에서 2E1이핵심적인역할을하는것을알수있으며, 산수유추출물이 2E1의발현을억제함으로써간보호작용을나타내는것으로생각된다. 이상의결과에서산수유는 CCl 4 로유발된실험적간손상모델에서간보호활성을가지고있음을확인하였으며, 그기전으로는간세포내항산화계활성증가와 CCl 4 의 CCl - 3 로의전환에관여하는 cytochrome P450 특히 2E1 isoform의발현조절과관련된것임을시사한다. 결론 사염화탄소 (CCl 4) 로유발된간손상모델을통하여산수유의간보호활성및사염화탄소의활성화에관여하는효소인 cytochrome P450의발현조절에대하여연구한결과다음과같은결론을얻게되었다. 간손상의혈청학적지표인 GOT, GPT, ALP 을검사한결과모두 CCl 4 를투여한군에비하여산수유를처리한군에서유의성있는감소가나타났으며, 특히후처리군에비하여전처리군에서더유의성있는감소가나타났다. 또한간조직에 대한병리조직학적검사에서는 CCl 4 로유발된간조직의파괴가산수유의처리에의하여회복되는것을확인하였다. 지질과산화물 (MDA) 의함량은 CCl 4 를투여한대조군에비하여산수유를처리한군특히후처리군에서현저히감소하였으며, 간조직내 GSH 함량및 catalase 활성은 CCl 4 를처리한군에비하여산수유를처리한군에서전처리및후처리군모두에서증가하였다. Cytochrome P450의 mrna 및단백질발현을살펴본결과 1A1 및 3A1은 CCl 4 에의한간손상모델과는큰관련성이없었으며, 2E1 type은 CCl 4 에의하여증가되었으나산수유추출물의투여에의하여전처리및후처리군에서유의한감소를나타내었다. 이상의결과에서산수유는 CCl 4 로유발된간손상에대하여보호활성이있음을확인할수있었으며, 그기전은간조직내항산화계의활성화및 CYP2E1의발현억제에의한것으로생각된다. 참고문헌 1. 조병권. 사염화탄소투여로인한血淸內各種酵素의活性變動에關하여, 경북대학교대학원박사학위논문, 서혜진. 사염화탄소의반복투여가백서간장에미치는병리조직학적연구, 영남대학교대학원석사학위논문, Fernandez, G., Villarruel, M.C., de Toranzo, E.G., Castro, J.A. Covalent binding of carbon tetrachloride metabolites to the heme moiety of cytochrome P-450 and its degradation products. Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 35(2): , Tomasi, A., Albano, E., Banni, S., Botti, B., Corongiu, F., Dessi, M.A., Iannone, A., Vannini, V., Dianzani, M.U. Free-radical metabolism of carbon tetrachloride in rat liver mitochondria. A study of the mechanism of activation. Biochem. J. 246(2): , Le Page, R.N., Cheeseman, K.H., Osman, N., Slater, T.F. Lipid peroxidation in purified plasma membrane fractions of rat liver in relation to the hepatoxicity of carbon tetrachloride. Cell. Biochem. Funct. 6(2):87-99, 陳存仁. 圖說漢方醫藥大辭典 (III). 東京, 講談社, p 208, 전국한의과대학본초학교수공편. 본초학. 서울, 영림사, pp , 王旭高. 西溪書屋夜話錄 王旭高醫書六種. 北京, 學苑出版社, p 110, 朴瑛卿. 山茱萸種子의抗糖尿效果 -Streptozotocin 유발고혈당흰쥐에미치는영향. 中央大大學院, 석사학위논문, 朴炫宣. 산수유약침의항산화작용에관한실험적연구. 大田大大學院, 석사학위논문, Mau, J., Chen, C., Hsieh, P. Antimicrobial effect of extracts from Chinese chive, cinnamon, and corni fructus. J Agric Food Chem. 49(1): , Jeng, H., Wu, C.M., Su, S.J., Chang, W.C. A substance isolated from Cornus officinalis enhances the motility of

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