J Koren So Foo Si Nutr 한국식품영양과학회지 47(10), 957~965(2018) https://oi.org/10.3746/jkfn.2018.47.10.957 3T3-L1 지방세포및제 2 형당뇨마우스모델에서건지황열수추출물의항당뇨효능연구 조란 1 민정란 1 정상희 1,2 1 바이오의과학연구소 2 호서대학교임상병리학과 Anti-Dieti Effets of Wter Extrts of Rehmnni glutinos Liosh Root in 3T3-L1 Aipoytes n C57BL/KsJ-/ Mie Rn Jo 1, Jeong-Rn Min 1, n Sng-Hee Jeong 1,2 1 Biomeil Siene Reserh Institute 2 Deprtment of Biomeil Lortory Siene, Hoseo University ABSTRACT Type 2 ietes mellitus is hrterize y linil isorer of sugr n ft metolism use y ellulr insulin resistne. In our stuy, the nti-ieti effets of wter extrt of Rehmnni glutinos Liosh (RG) root (40, 200, 1,000 μg/ml) were investigte in mture 3T3-L1 ipoytes. RG root ws foun to inrese gluose uptke uner insulin (1 μm)-stimultion onitions ut h no effets on gluose uptke without insulin in 3T3-L1 ipoytes. Aitionlly, the nti-ieti effets of RG root were stuie in ietes mellitus niml moel (C57BL/KsJ-/) y orl ingestion of RG for 4 weeks (50, 500 mg/kg w/). During the experimentl perio, foo intke, oy weight, n fsting loo gluose level were mesure every week. At the en of the tretment, orl gluose tolerne, loo gluose level, HA1, plsm insulin level, n loo profile prmeters, inluing AST, ALT, TG, totl n HDL-holesterol levels, were mesure. Tretment with RG root resulte in lower loo gluose level, HA1, totl holesterol, ALT, orl gluose tolerne, n serum insulin levels. The mrna expression of gluokinse (GCK) n solute rrier fmily 2 (SLC2A2) ws signifintly inrese in liver tissue were reue y wter extrt of RG. These results explins the nti-type 2 ieti effets of wter extrt of RG. Key wors: Rehmnni glutinos Liosh root, type 2 ietes, C57BL/KsJ-/, gluose uptke 서 당뇨병은전세계적으로확대되고있는건강문제로비만및각종성인병과밀접한관련이있다. 당뇨병에서고혈당이조절되지못하고만성화될경우고지혈증, 고혈압및동맥경화등의심혈관성장애를비롯한여러합병증이초래되며지속적인고혈당으로인해신장기능의저하, 망막층출혈로인한시력저하, 족부궤양, 말초신경병증등의발병률도높아진다 (1). 당뇨병은체내인슐린부족으로유발된제1형당뇨병과인슐린저항성 (insulin resistne) 을보이는제2 형당뇨병으로나눌수있다. 전체당뇨병의 90% 에해당하는제2형당뇨병은간, 지방조직, 근육에서인슐린에대한반응성저하로인해근육등각종조직으로흡수되는포도당양이감소하여식후고혈당이유발되며, 이후간에서의포도 Reeive 11 Jnury 2018; Aepte 21 Septemer 2018 Corresponing uthor: Sng-Hee Jeong, Biomeil Siene Reserh Institute n Deprtment of Biomeil Lortory Siene, Hoseo University, Asn, Chungnm 31499, Kore E-mil: jeongsh@hoseo.eu, Phone: +82-41-540-9675 론 당유출 (hepti gluose output, HGO) 이증가하여공복혈당치도상승하여소변으로포도당배출이증가하는것이특징이다 (2,3). 혈당의증가는 gluokinse(gck) 효소의활성감소와밀접하게관련되는데이효소는간세포내에서포도당대사의첫번째반응인 gluose-6-phosphte로의인산화반응을촉매하여세포내 gluose 이용을증가시키는역할을하며, GCK의활성감소는세포로의당유입차단을유발하게된다 (4). 또한혈액으로부터간세포와췌장베타세포로포도당을수송하는역할을수행하는 gluose sensor인 gluose trnsporter 2(GLUT2, oing y solute rrier fmily 2, SLC2A2) 도혈당조절에매우중요하다. GCK 및 SLC2A2는당에대해높은기질특이성을갖고있어혈당의변화에따라포도당의세포내유입속도및당인산화속도를적절히변화시킨다 (5). 현재임상에서사용되고있는경구용혈당강하제는탄수화물의소화흡수를제한하는혈당조절제로서 α-gluosise 억제제인 rose와인슐린분비를촉진하는 sulfonylure, 간에서포도당생성을감소시키는 metformin,
958 조란 민정란 정상희 PPAR-γ gonist로서인슐린민감성을증가시키는 thizoliineione 등의약물이있다 (6). 그러나이들약물은구토나복부팽만감등소화기의부작용을유발하며이러한부작용으로인해당뇨치료를중단하는경우도많다 (7). 따라서이와같은약물부작용을최소화하고일상적으로복용해도안전하며인슐린저항성을감소시키거나혈당수준을조절하는천연자원식품소재개발이절실하게요구된다. 한약재는전통의학의치료수단이면서기능성식품소재로서도그가치가높다. 우리나라의대표적인한의서인동의보감, 방약합편에서는당뇨병과관련된주치증상으로 소갈 이명시되어있으며이러한증상을치료하는한약재로지황 (Rehmnni glutinos Liosh, RG) 이소개되고있다. 지황은현삼과에속하는다년생초목으로특성은시원 ( 凉 ) 하고맛은쓰 ( 苦 ) 며, 뿌리와뿌리줄기를약으로사용한다 (8,9). 가공방법에따라채취후파지에저장한생지황, 외피를죽도로벗겨서태양으로자연건조시킨건지황, 생지황을찌고말리기를 9회반복 ( 구증구포 ) 한숙지황등 3가지유형이알려져있다 (10). 지황은보혈, 이뇨, 당뇨병, 고혈압등의질환에효과가있으며, 특히빈혈, 하혈또는허약병, 결핵에좋은것으로동의보감에수록되어있다. 지황의주성분은 tlpol, phytosterol류, 당류, irioi glyosies, hrysoeriol, luteolin 등으로알려져있으며 (11,12), 생지황과속지황분말에서지황의지표성분으로알려진 tlpol은생지황분말에서 144.9 mg/ml, 숙지황분말에서 47.2 mg/ ml로보고되어있다 (13,14). 수십년간이루어진지황의약리학적기능성연구결과혈관계강화, 면역증강, 내분비계개선, 심혈관계기능보호등신경보호효과와항종양, 항노화효과가있는것으로보고되어있으며 (12), 국내에서건강기능식품소재의부원료로허가되어있어식품가공시활용도가높은것으로추정된다. 그러나제2형당뇨병 in vivo 질환모델등을통하여당질분해효소발현조절효과및혈당강하효능에대한직접적인연구는상대적으로부족한실정이다. 본연구는인슐린민감물질탐색시널리사용되고있는 3T3-L1 지방전구세포에서국내산건지황열수추출물의당대사개선효과와 gluose uptke 효과를조사하고제2형당뇨병동물모델에건지황열수추출물을투여하여혈당변화, 간기능및당대사관련효소의변화를관찰함으로써건지황열수추출물의항당뇨에대한영향을조사하여기능성소재로서의가능성을확인하고자하였다. 재료및방법건지황열수추출물의제조본연구에서사용한건지황은열수추출하여제조하였다. 즉건조된지황뿌리를분쇄하여분쇄시료 20 g에증류수 200 ml를넣고 65 C 항온수조에서 24시간동안진탕혼합한후원심분리하여상등액을얻었다. 이를여과지 (No.42, Whtmn Interntionl Lt., Delhi, UK) 에감압여과후회전진공농축기 (EYELA CCA-110, Tokyo Rikkiki Co., Tokyo, Jpn) 로 4 C에서농축한다음이를 3차멸균증류수로재용해하여동결건조기 (FD8508, Ilshin, Ilsn, Kore) 를이용하여 -70 C에서건조한후시료를냉동보관하면서적당한농도로희석하여사용하였다. 세포배양세포주는한국세포주은행 (Seoul, Kore) 으로부터분양받은 3T3-L1 지방전구세포 (KCLB No.10092.1) 를사용하였으며, 세포를 10% 소태아혈청 (FBS, Gio BRL, Crls, CA, USA), 1% peniillin-streptomyin(gio BRL) 이함유된 Duleo s moifie Egle mei(dmem, Gio BRL, Grn Isln, NY, USA) 에서배양하였다. 세포배양 3일간격으로인산완충액 0.01 M(PBS, Gio BRL) 을사용하여세척한후 75 ml 배양플라스크당 1 ml의 0.25% trypsin-edta(gio BRL) 를넣고실온에서 3분간처리하여세포를탈착하여원심분리에의해세포를수거한후 10% FBS가첨가된 DMEM 배양액 15 ml에부유시킨 37 C, 5% CO 2 조건의배양기 (Snyo, Osk, Jpn) 에서계대배양하였다. 3T3-L1 지방세포의분화유도및지방분화세포로의포도당흡수능측정 3T3-L1 전구지방세포를계대배양과동일한방법으로탈착시켜 1 10 6 ell/ml의농도로 96-well plte에 100 μl/well로분주한다음완전한 onfluent 상태까지배양하였으며, 이로부터 2일후에분화유도물질인 0.25 M exmethsone(sigm-alrih Co., St. Louis, MO, USA), 인슐린 10 μg/ml 및 0.5 μm 3-isoutyl-1-methylxnthine(IBMX, Sigm-Alrih Co.) 을함유한분화유도배지로교환하여 2일간배양하고, 이후 2일마다 10 μg/ml의인슐린이포함된상기배지로교환하면서 12일간분화를유도한후포도당흡수시험을실시하였다. 포도당흡수시험을하기위하여분화된지방세포를 serum free DMEM mei로 14시간처리하여 strvtion 시킨후 Kres-Ringer-Phosphte-HEPES(KRPH) uffer (20 mm HEPES, 5 mm KH 2PO 4, 1 mm MgSO 4, 136 mm NCl, 4.7 mm KCl, ph 7.4) 용액으로 3번 wshing 하였다 (15). 여기에 KRPH uffer를넣고 37 C에서 30분간배양하고건지황열수추출물 40, 200 및 1,000 μg/ml를인슐린 1 μm과함께또는인슐린을함유하지않은 serum free DMEM mei에복합또는단독처리하여 30분간반응시켰다. 포도당흡수는 Gluose Uptke Assy Kit(136955, Am, Cmrige, UK) 을이용하여실행하였다. 실험동물및시험물질투여본연구에사용된제2형당뇨동물모델은 8주령수컷 C57
3T3-L1 지방세포및제 2 형당뇨마우스모델에서건지황열수추출물의항당뇨효능연구 959 BL/KsJ-/ 마우스 (Hrln Lortories, In., Houston, TX, USA) 로서온도 23±2 C, 습도 55±10%, 명암주기 12 시간 (08:00~20:00) 조건이자동설정된동물사육실에서 2 주일간순화시킨후실험에사용하였다. 본동물실험은호서대학교동물실험윤리위원회의승인을받은후 ( 승인번호 : THRC-16-36) 실험동물관리및이에관한지침 (Guie for the Cre n Use of Lortory Animls, NRC) 에따라진행하였다. 투여개시전의체중을기준으로실험군당 5마리씩정상군 (C57BL/KsJ-/+ mie, Norml Control, NC), 당뇨대조군 (C57BL/KsJ-/ mie, Dieti Control, DC), pioglitzone 20 mg/kg w/를투여한양성대조군 (Pio), metformin 300 mg/kg w/를투여한양성대조군 (Met), 50 mg/kg w/의건지황열수추출물투여군 (RG 50), 500 mg/kg w/의건지황열수추출물투여군 (RG 500) 등총 6개군으로나누어매일 9~10시사이에경구투여용존대를이용하여 4주간각각의물질을투여하였다. 매일실험동물의건강상태및일반임상증상을관찰하였으며매주 2회체중변화, 사료및음수섭취량을측정및기록하였다. 경구내당능검사 (orl gluose tolerne test, OGTT) 각실험군의포도당내성능을평가하기위하여약물투여 3주째에 16시간절식시킨후 50% gluose 용액을체중 kg 당 gluose 0.01 g이되도록경구투여하였다. 포도당투여전 (16시간공복혈당 ), 포도당투여후 30, 60, 90 및 120분에꼬리정맥에서혈액을채취하여혈당측정기 (G otor AGM-4000, Allmeius, In., Suwon, Kore) 를이용하여혈당변화를측정하였다. 경구내당능검사에따른혈당상승폭면적 (re uner the urve, AUC) 은 trpezoil formul에의해계산하였다. 공복혈당, 당화혈색소및인슐린함량측정시험물질을투여하면서매주 1회 12시간절식시킨후꼬리정맥에서채혈하여혈당측정기 (G otor AGM-4000) 를이용하여공복혈당을측정하였다. 또한실험종료시점인부검시채취된혈청샘플에서인슐린검사용 ELISA kit (MIoBS, Tokyo, Jpn) 을사용하여혈중인슐린의농도를측정하였다. 부검시채취된혈청샘플에서혈당관련기능성지표로이용되는당화혈색소의함량을 Mouse glyte hemogloin A1(HA1) ELISA Kit(Myiosoure, Sn Diego, CA, USA) 으로 450 nm에서흡광도를측정하였다. 또한인슐린저항성의지표인 HOMA-IR(Homeostsis Moel Assessment of insulin resistne) 을산출하였다 (16). HOMA-IR=[Fsting insulin (μu/ml) Fsting plsm gluose (mmol/l)]/22.5 혈중지질및 AST, ALT 측정혈중지질함량분석을위한혈청은인슐린함량측정시 사용한혈청과동일한조건으로준비하였으며, triglyeries 등지질함량및효소활성도를 Triglyerie Assy Quntifition ssy kit(65336, Am), HDL n LDL/ VLDL holesterol ssy kit(65390, Am), sprtte minotrnsferse(ast) tivity ssy kit( 105135, Am) 과 lnine trnsferse(alt) tivity ssy kit (105134, Am) 을사용하여 450 nm에서흡광도 (Hiex Sense, Turku, Finln) 를측정하였다. 혈청및간조직채취약물투여최종종료전에 16시간동안절식시키고체중과공복혈당을측정하였으며, 이후 CO 2 로마취시켜복강을열어복대동맥에서혈액을채취하여 3,000 g에서 20분원심분리하여혈청을분리한후, -80 C에서냉동보관하여생화학적분석에사용하였다. 또한간조직일부 (0.2 g) 를채취한후 4 C에서완전히분쇄한다음 -80 C에서냉동보관하여유전자발현분석에사용하였다. Totl RNA 추출및 DNA 합성각시험물질을 4주간경구투여한후부검하여채취한간조직을 PBS(pH 7.4) 용액으로세척한후, RNesy Mini Kit(Qigen, Hilen, Germny) 을이용하여 RNA를추출하였다. 각각의투여군의개체에서얻어진 2 μg의 RNA 는 DNA synthesis kit(biored, Erkulles, CA, USA) 을이용해역전사하여 first strn DNA를얻었다. Rel-time PCR을이용한 GCK 및 SLC2A2 mrna 발현분석 RT-PCR은 QPCR Mster Mix(2X GreenStr, Bioneer, Dejon, Kore) 를이용하여최종반응용량을 20 μl로하여 QPCR System(Mx3000P, Agilent, Snt Clr, CA, USA) 에서 SYBR Premix QPCR Mster Mix(BioLs, MA, USA) 를이용하여진행하였다. PCR 반응의특이도를확인하기위해서증폭할때마다 melting urve 분석을수행하였고 β-tin을기준으로 2 -ΔCt 로계산하였으며유전자의발현량은대조군을 1.0으로간주하여상대적인값을측정하였다. 본실험에서사용한 PCR primer는다음과같다 : GCK Forwr: 5 -GCACTGCTGAGATGCTCTTC-3, Reverse: 5 -TGTTCCCTTCTGCTCCTGAG-3 ; SLC 2A2 Forwr: 5 -ACCAATTCCAGCTACCGACA-3, Reverse: 5 -GTTTACAGCGCCAACTCCAA-3 ; β-tin Forwr: 5 -AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3, Reverse: 5 -AG CACTGTGTTGGCGTACAG-3. 통계처리본실험은 SPSS(Sttistil Pkge for Soil Siene, version 23.0, SPSS In., Chigo, IL, USA) 통계프로그램을사용하였다. 각실험군의측정항목의결과는평균
960 조란 민정란 정상희 2-Deoxygluose uptke. (% fol ontrol). 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Insulin (1 μm) Pioglitzone (2 μm) RG (40 μg/ml) RG (200 μg/ml) RG (1,000 μg/ml) - + - + - + - + - + - - + + - - - - - - - - - - + + - - - - - - - - - - + + - - - - - - - - - - + + Fig. 1. Effet of Rehmnni glutinos Liosh (RG) root wter extrts or pioglitzone on gluose uptke in 3T3-L1 ipoytes in the sene ( ) or presene (+) of insulin. Serum-strve 3T3-L1 ipoytes were ulture in 96-well plte n trete with 40, 200, n 1,000 μg/ml of RG wter extrts or pioglitzone (2 μm) with or without insulin (1 μm) for 30 min n followe y mesurement of 2-eoxygluose-6-phosphte (2- DG6P) level in ells. Results expresse s men±sd (n=3). Mens with ifferent letters (-) re signifintly ifferent mong groups y ANOVA followe y Dunn s multiple rnge test t P< 0.05. PPAR-γ 작용제로작동하며말초조직의포도당대사를증가시키고간에서의지질대사를촉진시키며지방세포분화를활성화시킴으로써인슐린저항성을낮추는약물로개발되었으나심혈관계부작용을증가시키는문제점을갖는약물이다 (15,17). 본연구에서는 RG40, 200, 1,000 μg/ml 및 pioglitzone(2 μm) 은높은포도당흡수능이관찰되었으며이는인슐린에대한감수성을증가시켜포도당흡수능을향상시킴을통해혈당조절효과가있는것으로기대되었다. 사료섭취량, 음수섭취량및체중변화제2형당뇨동물모델인 C57BL/KsJ-/ 마우스에건지황열수추출물을 4주간경구투여하면서실험기간동안실험동물의음수량, 식이섭취량및체중변화를관찰한결과 Tle 1과같았다. 당뇨대조군 (DC) 은정상대조군 (NC) 에비하여사료섭취량은약 2배, 음수량은약 4배, 증체량은약 2배증가하였으며, 음수섭취량은현저히증가하는것을볼수있었다. RG군에서는평균음수량은 DC군에비하여감소하는경향이었다. 본연구에서는건지황섭취에의한당뇨증상인음수량, 음수횟수증가등이완화되는경향이있는것으로사료되었다. 값 ± 표준편차 (men±sd) 로표시하였으며, 실험군간평균차이를 one-wy ANOVA로확인한후그룹간의통계적유의성을 Stuent s t-test와 Dunn s multiple rnge test를이용하여실시하였다. 실험군간의유의성을 P<0.05 수준에서검정하였다. 결과및고찰 3T3-L1 지방세포내포도당흡수능측정 3T3-L1 지방세포에건지황열수추출물을처리하여포도당흡수능을측정한결과는 Fig. 1에제시한바와같다. 건지황열수추출물을인슐린없이단독으로처리하였을경우에는포도당흡수능이상승하지않았으며건지황열수추출물을 1 μm 인슐린과병용처리하였을때인슐린을추가하지않는대조군 (91.81±8.99%) 에비하여포도당흡수능이각각 159.48±9.05%(pioglitzone), 187.65±6.52%(RG 40 μg/ml), 193.06±3.82%(RG 200 μg/ml) 및 179.91± 3.81%(RG 1,000 μg/ml) 로증가하였다. Pioglitzone은 경구내당능변화경구내당능검사는체내포도당이용과인슐린분비능에대한지표로서 (18) 본연구에서각각의물질을 3주간투여후포도당 (0.01 g/kg w) 을투여하여경시별혈장의당함량을분석한결과 (Fig. 2A) 에서제시하였다. 포도당투여 60분후 RG50군및양성대조군 (Met 또는 Pio) 혈당이감소하였다. 120분후에는 RG50군과 RG500군의혈당이각각 568±37 mg/l와 608±41 mg/l였으며 DC군보다는혈당이감소하는것으로나타났다. Met군의혈당은 120분에서 452±29 mg/l로떨어져가장우수한내당능효과를보였다. 혈당상승폭을 AUC로계산하였을때 DC군에비하여 Met군과 RG50군은각각 82.23±2.4% 및 93.12±1.7% 로 RG군에서단시간내혈당을조절하는효과가현저히나타나지않음을알수있었다 (Fig. 2B). 공복혈당변화당뇨쥐에게 4주간 RG를투여하는동안공복혈당변화는 Fig. 3A에제시하였다. DC군의혈당은 4주동안지속해서 Tle 1. Chnges of foo intke, wter intke n oy weight gins of eh group Prmeters 1) NC DC Pio Met RG50 RG500 Foo intke (g/) Wter intke (g/) Boy weight gin for 4 weeks (g) 3.01±0.41 2) 6.37±0.88 8.05±3.35 6.27±1.89 24.12±2.70 16.25±3.90 6.43±0.69 18.26±3.65 13.67±2.21 5.18±0.46 16.32±1.21 14.43±2.72 6.11±1.93 20.45±5.48 13.00±4.37 5.55±1.62 20.56±5.05 11.88±4.79 1) NC: norml mie (C57BL/KsJ-/+) untrete; DC: ietes mie (C57BL/KsJ-/) untrete; Pio: ieti mie fe pioglitzone (20 mg/kg w/); Met: ieti mie fe with metformin (300 mg/kg w/); RG50 n RG500 ieti mie fe RG wter extrts 50 mg/kg w/ n 500 mg/kg w/, respetively. 2) Men±SD (n=5). Mens with ifferent letters (,) within row re signifintly ifferent mong groups y ANOVA followe y Dunn s multiple rnge test t P<0.05.
3T3-L1 지방세포및제 2 형당뇨마우스모델에서건지황열수추출물의항당뇨효능연구 961 A Bloo gluose level (mg/l). B AUC of loo gluose 120 min. (% of norml ontrol). 1200 1000 800 600 400 200 0 500 400 300 200 100 NC DC Pio Met RG50 RG500 0 30 60 120 Time (min) e A Fsting loo gluose. (mg/l). B HA1 (ng/ml). 600 550 500 450 400 350 150 NC DC Pio Met RG50 RG500 50 0 week 1 week 2 week 3week3 4 week 4 3 2 1 0 NC DC Pio Met RG50 RG500 Fig. 2. The effet of the orl ministrtion of RG wter extrts on the gluose tolerne in C57BL/KsJ-/ mie. (A) Bloo gluose level of eh group uring orl gluose tolerne test (OGTT). (B) AUC OGTT: the re uner urve of gluose (mg/ L min). Results re from five nimls per eh group n expresse s men±sd. Mens with ifferent letters (-e) re signifintly ifferent mong groups y ANOVA followe y Dunn s multiple rnge test t P<0.05. 높게유지되었으나 RG 투여군에서는 3주째부터당뇨병대조군에비해감소하기시작하여투여 4주째에는 RG50 및 RG500군혈당은각각 452±16 mg/ml 및 438±19 mg/ml 로혈당이유의하게감소하였다. 간에서포도당생성을감소시키는 2형당뇨치료약물인 metformin을투여한 Met군에서는투여 3주째부터 DC군에비하여감소하였으며 4주째에는혈당이 373±9 mg/ml로뚜렷한혈당저하효과가나타났다. 공복혈당과간의포도당대사의개선에의한항고혈당작용을나타내는지황의기능성주성분은 tlpol, phytosterol류, 다당류라고보고된바있으며. Ren 등 (19) 은지황열수추출물을급여한 Nrf-2 유발당뇨질환생쥐에서인슐린민감도가증가하고인슐린저항성을감소시켜혈중포도당농도를강하시킨다고보고하였다. 선행연구에의하면지황의기능성성분인 tlpol은 streptozotoin으로유발된당뇨병쥐에서췌장의손상을감소시키고장기간급여시에는공복혈당치가감소하고당화혈색소함량도감소하는것으로보고되었다 (20). Lee 등 (21,22) 은 C57BL/KsJ/ 마우스에서건지황열수추출물을 300 mg/kg w로투여시혈당감소가유의적으로나타났음을보고한바있으며, 본연구에서 RG 투여군에서투여기간에비례하여지속 0 NC DC Pio pio met RG50 RG500 Fig. 3. Chnges of the fsting gluose levels (A) n serum HA1 (B) y RG wter extrt tretment pioglitzone or metformin orlly for 4 weeks. Results re from five nimls per eh group n expresse s men±sd. Mens with ifferent letters (-) re signifintly ifferent mong groups y ANOVA followe y Dunn s multiple rnge test t P<0.05. 해서낮아져혈당조절능이기대되는천연물로판단되어단기간복용보다는 4주이상지속적인복용시혈당강하효과가더큰것으로생각되었다. 당화혈색소함량변화제2형당뇨병진행을나타내는지표로써당화혈색소 (HA1) 는많이사용되며이의평균농도가 1% 정도감소할때심근경색, 뇌졸중등합병증발생률이 14%, 미세혈관질환발생위험이 37% 정도감소하는것으로알려져있다 (23). 본연구에서양성 Pio군과 Met군은유의한수준으로당화혈색소함량을감소시켰으며시험물질투여종료후혈청당화혈색소함량을분석한결과 RG50 및 RG500군에서각각 2.23±0.19 ng/ml 및 2.22±0.25 ng/ml로 2.95± 0.24 ng/ml인 DC군보다유의적으로낮게측정되었으며, 건지황열수추출물을지속해서복용시혈당조절을통하여당뇨합병증발생의위험도감소시킬수있을것으로판단된다 (Fig. 3B). 혈청내인슐린함량및인슐린저항성평가제2형당뇨병의병인은주로인슐린저항성과췌장의베타세포기능저하를동반한다 (24). 정상상태에서는인슐린
962 조란 민정란 정상희 Plsm Insulin (ng/ml). 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 NC DC Pio Met RG50 RG500 Fig. 4. Chnges of the serum insulin levels y RG wter extrt, pioglitzone or metformin ws supplie to mie ily y orl ministrtion for 4 weeks. Results re from five nimls per eh group n expresse s men±sd. Mens with ifferent letters (-) re signifintly ifferent mong groups y ANOVA followe y Dunn s multiple rnge test t P<0.05. 이증가하면간에서는이를인지하고당신생을중지하고당분해과정으로들어가야하는데제2형당뇨병에서는인슐린저항성으로이러한작용이나타나지않아이미높아져있는혈당은더욱증가하게된다. 혈당의증가는다시췌장에서인슐린을많이생산하게하며상태는악화되어베타세포의기능이약화된다 (25,26). 본연구에서혈장인슐린함량은 DC군에서는 0.33±0.04 ng/ml였으나, RG50 및 RG500군에서는각각 0.16±0.01 ng/ml 및 0.14±0.04 ng/ml로유의하게감소하는것이확인되었으며 Pio군의인슐린감소효과와거의유사한정도의효과를나타내는것으로관찰되었다. Met군에서는 0.33±0.01 ng/ml로나타났으나, 유의적인차이는없었다 (Fig. 4). 또한, 4주간투여후각투여군의 HOMA-IR 수치가유의하게감소하는것을관찰되었고 Pio군, RG50군및 RG500은특히뚜렷하게인슐린저항성이강하되는것이확인되었다 (Tle 2). 따라서건지황열수추출물투여가공복혈당을감소시킴으로써인슐린감수성을향상시키고인슐린저항성을저하시켜제2형당뇨병의원인이되는고인슐린혈증을개선하는데효과를보여항당뇨에대한긍정적인영향을끼칠것으로사료되었다. 혈중지질농도변화 비만은제2형당뇨병에서매우중요한위험인자로작용하며특히복부비만상태에서는당뇨병또는인슐린저항성을촉진하는매개물질인유리지방산의혈중농도가높아진다 (27). 지방조직에서전신혈액순환으로유리되는유리지방산이증가하면말초조직, 근육에서포도당이용이감소하여인슐린저항성이증가하며, 특히복부비만이있는경우이과정이더욱촉진된다. 또한제2형당뇨병은만성대사질환이합병증으로나타나중성지방 (TG) 농도증가와 HDL- 콜레스테롤농도가감소하는특징을나타낸다 (28,29). 췌장이고농도의지방산에장기간노출되면포도당-지방산사이클에의해지방산산화가증가하고포도당산화를감소시켜췌장베타세포의기능저하가발생할수있으며, 중성지방은간에저장된지질의축적에관여하여제2형당뇨환자의신진대사장애를유발한다 (30). 본연구에서건지황열수추출물에의한이상지질대사의개선효과를조사한결과는 Tle 2에제시한바와같다. RG50군과 RG500군에서는총콜레스테롤함량은각각 215.17±15.39 mg/l 및 214.25±18.35 mg/l로 DC군의 272.89±13.25 mg/l에비하여유의하게감소하였으며, 이는기존의다른선행연구와도유사한경향을보였다 (31,32). 한편제2형당뇨병에서나타나는또다른혈청지질대사이상으로 HDL-콜레스테롤감소가흔히나타나는데, HDL-콜레스테롤은 LDL-콜레스테롤의생성을억제하고혈관에축적된콜레스테롤을감소시킴으로써동맥경화의발생을억제하는기능을한다 (33). 본연구에서 RG50 및 RG500군에서 HDL-콜레스테롤함량은유의한증가를보이지못했지만 DC군 (185.53±26.26 mg/l) 에비하여높게나타나는경향을보였으며, RG 투여군은당뇨대조군에비하여혈청중중성지방, HDL-콜레스테롤의함량이유의한차이는없었지만개선하는경향이었고, 당뇨로증가된총콜레스테롤함량은감소시켰다. 따라서건지황열수추출물은당뇨로인하여발생하는혈중지질이상의개선을보여당뇨의증상을완화시키고합병증인동맥경화등질환의위험성을낮출수있을것으로기대된다. 간질환은당뇨병진행정도에따라합병증으로나타나며간조직의괴사에의한혈중 AST 및 ALT의증가가지표로이용되고있다. ALT는급성간손상을나타내는민감한지표로서주로간세포내에존재하기때문에간, 신장등전신 Tle 2. Effets of RG wter extrt, pioglitzone or metformin on serum totl n HDL-holesterol, TG, AST n ALT level, n HOMR-IR in C57BL/KsJ-/ mie Prmeters 1) NC DC Pio Met RG50 RG500 T-Cho (mg/l) HDL-Cho (mg/l) TG (mg/l) AST (mu/ml) ALT (mu/ml) HOMA-IR 207.01±19.20 2) 287.25±45.14 76.99±24.15 1.35±0.33 6.21±0.88 0.71±0.03 272.89±13.25 185.53±26.26 119.74±9.91 1.90±1.45 10.66±0.38 7.53±0.70 190.13±20.20 217.78±16.71 68.14±1.24 1.13±0.15 9.38±0.50 2.83±0.64 224.25±22.14 204.65±12.68 92.93±15.18 2.10±1.59 11.16±1.50 5.28±0.09 215.17±15.39 216.69±37.02 96.47±11.20 2.03±0.09 7.50±1.28 3.12±0.02 214.25±18.35 222.21±29.07 106.20±18.28 1.96±0.23 7.14±0.75 2.62±0.28 1) Groups re the sme s in Tle 1. 2) Men±SD (n=5). Mens with ifferent letters (-) within row re signifintly ifferent mong groups y ANOVA followe y Dunn s multiple rnge test t P<0.05.
3T3-L1 지방세포및제 2 형당뇨마우스모델에서건지황열수추출물의항당뇨효능연구 963 에존재하는 AST보다간질환에대한특이도가높다 (34). 건지황열수추출물이당뇨로인한간기능저하에대한개선효과가있는지를알아보기위해혈중 AST 및 ALT 함량을조사한결과 RG50 및 RG500군에서 DC군에비하여 AST는차이가없었으나 ALT는유의하게감소하였다. 건지황열수추출물이천연소재로서일반당뇨병치료약물보다간손상을억제하는효과가있을수있으며당뇨로인한간기능회복및유지에긍정적인효과가있는것으로사료되었다. GCK mrna 와 SLC2A2 mrna 발현변화 GCK는간에서당대사의항상성유지에필수적인효소이며제2형당뇨병에서는 GCK 발현감소가특징적으로나타나고발현감소시당대사장애가발생하여혈당의이용률을저하시킨다 (34). 현재임상에서많이사용하고있는제2형당뇨병치료제인 metformin은 GCK 발현을증가시키며, 활성화된 GCK 단백질에의해혈당이에너지생산을위해사용되거나간에 glugon 형태로서저장을유도하여혈당을감소시킨다 (35). 본연구에서는건지황열수추출물을투여한제2형당뇨마우스의간조직으로부터 GCK mrna 발현수준을측정한 A GCK mrna reltive expression. / β-tin. B SLC2A2 mrna reltive. expression/ β-tin. 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 NC DC Met Pio RG50 RG500 NC DC Met Pio RG50 RG500 Fig. 5. GCK mrna n SLC2A2 mrna expression in liver tissues y RG wter extrt, pioglitzone or metformin ws trete to mie y orl ministrtion ily for 4 weeks. (A) Chnges of the GCK mrna expression levels. (B) Chnges of the SLC 2A2 mrna expression levels. Results re from five nimls per eh group n expresse s men±sd. Mens with ifferent letters (-) re signifintly ifferent mong groups y ANOVA followe y Dunn s multiple rnge test t P<0.05. 결과를 Fig. 5A에제시하였다. DC군에서 GCK 발현은 NC 군에비하여 0.42±0.14배감소하였으며, Met군및 Pio군은 DC군에비하여유의하게증가하였으며, RG50군및 RG500 군에서는 DC군에비하여용량의존적으로증가함이확인되어그정도는 Met군과유사한정도로관찰되었다. SLC2A2는혈액으로부터간세포와췌장베타세포로의 gluose 이동통로에존재하는 gluose sensor로서혈당을세포내로수송하며유입된혈당은간세포의 GCK의촉매작용에의하여즉시 gluose-6-phosphte로인산화되어당대사가진행된다. 또한 SLC2A2 mrna 발현은간에서는증가하는반면, 베타세포에서는감소하는것으로보고되어있다 (36-38). Fig. 5B에서보는바와같이 RG50군및 RG 500군에서는 DC군에비하여 SLC2A2 mrna 발현정도는유의하게용량의존적으로증가하였다. 특히 RG500군에서는 Met군 (1.93±0.09배) 보다는 2.71±0.37배로뚜렷하게증가하는것이확인되었다. 본연구에서건지황열수추출물은 4주간제2형당뇨병동물모델에투여하였을때 GCK mrna 및 SLC2A2 mrna 발현을증가시킴이확인되었으며이로서 RG는포도당을 gluose-6-phosphte로인산화하는과정을활성화하여당대사능개선에영향을줄것이라사료되었다. 요약본연구에서는대표적인한의서인동의보감및방약합편에수재된농식품소재중당뇨병과같은대표증상에효과가있는것으로소개된건지황에대해 3T3-L1 지방세포와제 2형당뇨질환모델인 C57BLKsJ-/ 마우스에서항당뇨효과를조사하였다. 건지황열수추출물을제조하여 3T3- L1 지방세포에서포도당흡수능을관찰한결과, 3T3-L1 지방세포의인슐린감수성을향상시켜세포내로의포도당흡수를대조군대비약 2배증가시켰다. 제2형당뇨모델인 C57BLKsJ-/ 마우스에양성치료약물인 metformin (300 mg/kg w/), pioglitzone(20 mg/kg w/) 과건지황열수추출물 (50, 500 mg/kg w/) 을 4주간각각경구투여한후항당뇨효능을평가한결과, 체중감소량의변화없이식이섭취량및음수섭취량이감소하는경향을나타내었다. 공복혈당및 HA1 수준은건지황열수추출물을투여했을때당뇨대조군에비하여유의적으로감소시켰지만경구내당능은당뇨대조군에비하여유의한차이는없었지만개선하는경향이있었다. 혈중인슐린및 HOMA-IR 수준은당뇨대조군에비해양성대조군및건지황투여군에서현저하게낮은수치를나타내었으며, 혈중중성지방및 HDL- 콜레스테롤함량은당뇨대조군에비해유의한변화는없었지만총콜레스테롤농도는유의한감소를나타내었다. 또한간조직에서 GCK mrna 및 SLC2A2 mrna 발현정도가유의적으로증가하였으며, 특히 RG 500 mg/kg w 투여군에서제2형당뇨병의치료제인 Met 투여군과비슷한수준
964 조란 민정란 정상희 의 GCK 증가효과가확인되었다. 이러한결과로건지황열수추출물은당뇨증상중음수량, 음수횟수증가등을완화시키고지질대사이상을조절하면서인슐린저항성을감소시켜혈당을개선하므로항당뇨생리활성을나타내는식품소재로써당뇨개발의가능성이있을것으로사료되었다. 감사의글 본결과물은농림축산식품부의재원으로농림수산식품기술기획평가원의전통식약동원지식의과학적인프라구축고부가가치식품개발사업의지원을받아연구되었음 ( 과제번호 314071-03). REFERENCES 1. Joson PB, von Gelern TW, Ohmn L, Osterln M, Wng J, Zinker B, Wilox D, Nguyen PT, Mik A, Fung S, Fey T, Goos-Nilsson A, Grynfr M, Brkhem T, Mrsh K, Beno DWA, Ng-Nguyen B, Kym PR, Link JT, Tu N, Egerton DS, Cherrington A, Efeni S, Lne BC, Opgenorth TJ. 2005. Hepti gluoortioi reeptor ntgonism is suffiient to reue elevte hepti gluose output n improve gluose ontrol in niml moels of type 2 ietes. J Phrmol Exp Ther 314: 191-200. 2. Cheng S, So WY, Zhng D, Cheng Q, Bouher BJ, Leung PS. 2016. Clitriol reues hepti triglyerie umultion n gluose output through C 2+ /CMKKβ/AMPK tivtion uner insulin-resistnt onitions in type 2 ietes mellitus. Curr Mol Me 16: 747-758. 3. Im SS, Kim SY, Kim HI, Ahn YH. 2006. 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