JOrientalRehabMed 2009;19(4):59-78 毛棶枝葉 (Cornus walteri Wanger) 추출물이비만쥐의지질강하, 항산화효과및전염증성 cytokines 농도에미치는영향 박원형 차윤엽 상지대학교한의과대학한방재활의학과교실 Effects of Stem Bark Extracts of Cornus walteri Wanger on the Lipid Lowering, Anti-oxidative Activity and Concentration of Proinflammatory Cytokines in Rat Fed High Fat Diet Won-Hyung Park, O.M.D., Yun-Yeop Cha, O.M.D. Dept. of Oriental Rehabilitation Medicine, College of Oriental Medicine, Sang-Ji University Objective: Thisstudywasdesignedtoexaminetheefectsofstem barkextractsofcornuswalteriwangeronthelipidlowering,anti-oxidativeactivityand concentrationofproinflammatorycytokinesinhyperlipidemicrat. Methods: Maleratsweighing195.21±5.85gfedhighfatdietfor8weeksand40rats(above400g)weredividedinto4groups.Eachgroupsweredividedinto acontrolgroupand3experimentalgroups.wefedacontrolgroupofratsabasaldietandadministerednormalsaline(100 mg / kg,1time/1day)for 4weeks.AndwefedeachexperimentalgroupofratsBasaldietandadministeredanextractofCornuswalteriWanger(100 mg / kg,200 mg / kg,300 mg / kg,1time/1day)for4weeks.attheendoftheexperiment,theratsweresacrificedtodeterminetheirchemicalcomposition.wemeasuredlipidof plasmaandliver,concentrationofproinflammatorycytokines,anti-oxidativeactivityandgeneexpression. Results: 1.Concentrationofplasmafreefatyacid,LDL-cholesterolshowedatendencytodecreaseinCornuswalteriWangerext.groups.Concentrationof plasmatriglyceride,totalcholesterolshowed asignificantlydecrementinalcornuswalteriwangerext.groupthan thatofcontrolgroup. HDL-cholesterolshowedasignificantlyincrementinthe300 mg / kg CornuswalteriWangerext.group. 2.ConcentrationoflivertotalcholesterolshowedatendencetodecreaseinCornuswalteriWangerext.groups.Concentrationoftriglycerideliver showedasignificantlydecrementinalcornuswalteriwangerext.groupthanthatofcontrolgroup. 3.ConcentrationofplasmaandliverTBARSshowedatendencetodecreaseinCornuswalteriWangerext.groups.ThevaluesofGSH-Px,SODand CATactivityshowedasignificantlyincrementinthe300 mg / kg CornuswalteriWangerext.groupthanthatofcontrolgroup. 4.ThevaluesofplasmaASTandALTactivityshowednosignificantlydiferentinaltreatmentgroups. 5.ConcentrationofplasmaIL-1β,IL-6andTNF-α showedatendencytodecreaseinthecornuswalteriwangerext.groups.howeverthe concentrationofil-10inthe200and300 mg / kg CornuswalteriWangerext.groupsshowedasignificantlyincrementthanthatofcontrolgroup. ConcentrationofliverIL-1β,TNF-α andil-10showednosignificantlydiferenceinaltreatmentgroups.howeverconcentrationofil-6inthe200 and300 mg / kg CornuswalteriWangerext.groupsshowedasignificantlydecrementthanthatofcontrolgroup. 6.IntheanalysisofRT-PCR,geneexpresionofTNF-α,Apo-B,Apo-EandleptinintheCornuswalteriWangerext.groups showedalower expressionthanthatofcontrolgroup. 7.TheratioofTNF-α,Apo-E andleptinexpresionperβ-actinexpresioninthe200and300 mg / kg CornuswalteriWangerext.showeda significantlydecrementthanthatofcontrolgroup.theratioofapo-bexpresionperβ-actinexpresioninthe300 mg / kg CornuswalteriWanger ext.showedasignificantlydecrementthanthatofcontrolgroup. Conclusions: Acordingtoaboveresults,inloweringlipidefect,antioxidativeactivityandantinflammatoryefect,theCornuswalteriWangerext.givespositiveefect. Keywords:CornuswalteriWanger,Cytokines,Loweringlipidefect,Antioxidativeactivity,Antinflammatoryefect 접수 :2009 년 9월 15 일, 수정 :2009 년 10 월 4일, 채택 :2009 년 10 월 16 일 교신저자 : 차윤엽, 강원도원주시우산동 283 번지상지대학교부속한방병원한방재활의학과교실 Tel:(033)741-9260,Fax:(033)732-2124,E-mail:oringa@hanmail.net 59
Ⅰ. 緖論 비만은섭취한에너지가신체활동과성장에필요한소비에너지양보다많아서, 초과된에너지가중성지방의형태로조직에침착되어대사장애를유발하는질환으로 1), 경제수준의향상과더불어식생활의서구화와운동량의감소로우리나라도과거에비하여비만이점차증가되고있는추세이다 2). 비만의원인은유전적, 환경적, 심리적, 에너지대사의불균형등이복잡하게연관되어발생하며이로인해고혈압, 당뇨병, 심혈관계질환, 퇴행성질환을야기한다 3). 비만의주된치료법은식이요법과운동요법이라할수있으나바쁜현대인의생활에는실행하기어려운점이많아효과적인비만치료약물에대한필요성이대두되고있다 4). 한의학에서는비만을肥, 肥胖, 肥人, 肉人, 肥貴人 5) 등으로표현하였고氣虛, 濕痰, 瘀血, 七情所傷을기본病因으로보아鍼灸, 藥物, 氣功, 附缸療法등을이용하여치료하고있다 6). 이러한이론을배경으로비만에대한실험적연구가지속적으로진행되고있는데, 특히한약을이용한약물치료에대한조사가다양하게이루어지고있다 7). 한편비만에대한최근의연구에서생체내과잉으로축적된지방조직은내분비계에관여하고, 에너지과잉상태, 스트레스및감염등의다양한생리반응에직접영향을미친다는것이밝혀졌다 8,9). 특히지방세포가분비하는 Cytokines, 즉 leptin 과 TNF-α 및 IL-6 등은비만시의인슐린저항성과밀접한관련이있으며 10-12), 당뇨병의주요원인이된다는것이밝혀졌다 13,14). 또한과잉축적된지방세포는간장내지방산의합성과분해및출납에이상을일으켜간장질환을야기하고, 혈 중지질농도를증가시켜순환계질환을유발할 수도있으며 15,16), 과잉축적된지질과산화물은세 포의노화및파괴를가져와암을유발하거나염 증상태를초래하여생체내제기관들의기능을 하락시킬수있다는것이보고되었다 17-19). 이와 같은연구결과는비만이각종질환의발병에보 다더깊이관여하고있음을인지시켜주었으며, 각종질환의예방및치료차원에서비만을개선 해야할필요성이한층더높아졌다. 毛棶枝葉 20) 은층층나무과 (Cornaceae) 에속하 는말채나무 (CornuswalteriWanger) 의가지와잎 의韓藥名으로收斂과止瀉의효능 21) 20) 이있어漆瘡 과强壯 22) 등에사용한다. 함유성분으로는 galic acid 와 isoquercitrin 이있으며 21) 최근연구에서는 수피에서 8 종의페놀성화합물이있음이밝혀졌 다 23). 그외에도 mouse 를이용한말채나무추출 물투여실험에서혈당강하효과와체중감소효 과가있음이나타났다 24). 하지만말채나무의이 용가치에대한연구는아주미미하다. 따라서본연구에서는모래지엽에대한기초 연구로비만으로야기되는고지질및이와관련 된지표변화에대해비만을유도한흰쥐에게毛 棶枝葉추출물을투여한후지질강하효과, 항산 화효과및생체면역체계와관련되는각종생물 학적수치들을검토하여유의한결과를얻었기에 보고하는바이다. Ⅱ. 實驗材料및方法 1. 실험동물, 실험군및비만유도 평균체중이 195.21±5.85 g 의 Sprague-Dawely 계수컷 50 두를고지방식이 (TableⅠ) 를 8 주간급 여한후, 체중이 400g 이상인 40 두를선발하여, 60
毛棶枝葉 (CornuswalteriWanger) 추출물이비만쥐의지질강하, 항산화효과및전염증성 cytokines 농도에미치는영향 평균체중이유사하게대조군 ( 생리식염수 100 mg / kg ), 처리 1군 ( 毛棶枝葉추출액 100 mg / kg ), 처리 2군 ( 毛棶枝葉추출액 200 mg / kg ) 및처리 3군 ( 毛棶枝葉추출액 300 mg / kg ) 으로나누어각처리군당 10 두씩임의배치하였다. 단, 추출농도는기존논문 24) 의동물실험투여농도 (160 mg / kg ) 에근거하여설정하였다. ( 건조중량 ) 을수조상에서냉각수환류하에 5시간씩 3회추출하고여과, 감압농축하여에탄올추출물 90g 을만들었다. 투여는처리군별정량을매일오후 5시경에 needlezonde 를이용하여경구투여하였다. 4. 채혈및간장적출 2. 식이급여식이급여는시험기간 4주동안전처리군동일하게기본식이 (TableⅠ) 를급여하였으며, 급여량은각처리군간에섭취량의차이가 5% 이내가되도록균등급여하였다. 물은자유급여하였다. 채혈은실험종료일에 12 시간절식을시킨후, 심장천자법에의해약 7ml를하였으며, 채취한혈액을분석항목별로나누어각각의시료로사용하였다. 간장은채혈을마친후, 채취하여각각의분석항목별처리방법에따라처리한후,-80 에냉동보관하였다. TableⅠ.CompositionofExperimentalDiets Ingredients(%) Basaldiet Highfatdiet Casein 20.0 20.0 α-cornstarch 35.0 30.0 Sucrose 11.0 10.0 Lard 4.0 25.0 Cornoil 1.0 5.0 Mineralmix* 3.5 3.5 Vitaminmix 1.0 1.0 Celulosepowder 23.5 5.2 DL-methione 0.3 0.3 *Mineralmix.(g/ kg diet):caco3,29.29;cahpo4 2H2O, 0.43;KH2PO4,34.30;NaCl,25.06;MgSO4 7H2O,9.98;Feric citrate hexahydrate,0.623;cuso4 5H2O,0.516;MnSO4 H2O,0.121;ZnCl2,0.02;KI,0.005;(NH4)6MO7O24 4H2O, 0.0025. Vitamin mix.( mg / kg diet):thiamine-hcl,12;riboflavin, 40;Pyridoxin-HCl,8;Vitamin-B12,0.005;Ascorbicacid,300; D-biotin, 0.2; Menadione, 52; Folic acid, 2; D-calcium pantothenate,50;p-aminobenzoicacid,50;nicotinicacid,60; Cholin choloride,2000 (IU/ kg diet);rethinylacetae,5000 (IU/ kg diet);cholecalciferol,250(iu/ kg diet). 3. 毛棶枝葉추출액및투여 5. 생화학적분석 1) 혈장및간장내지질혈장내 totalcholesterol,triglyceride (TG), LDL-cholesterol 및 HDL-cholesterol 농도는혈액자동분석기 (BoehringerManheim, 독일 ) 에의해분석하였다. 혈장 freefaty acid (FFA) 함량은 V-NEFA kit( 일수제약, 일본 ) 를이용한효소법에의해측정하였다. 간장내 totalcholesterol 및 TG 량은정량용 kit(wakoco., 일본 ) 를이용하여분석하였다. 2) 혈장내 thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) 혈장내 TBARS 량은혈장을분리하여,37 에서 120 분간배양후 Buge 와 Austa 25) 의방법에의해정량하였다. 시중에서구입한양질의말채나무수피 500g 3) 간장내 thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) 61
간장내 TBARS 량은 1~2g 정도의간장절편을 0.9% 생리식염수로세척하여혈액을제거하고,1.15% KCl 수용액과혼합한후,homogenizer 로충분히마쇄하여 10% homogenate 를만들었다. 이중 0.1 ml의 homogenate 를취하여 Screw cap tube 에넣고 8.0% sodium dodecylsulfate 0.2 ml와 20% aceticacid solution (ph 3.5)1.5 ml그리고 0.8% TBA solution1.5 ml를첨가하였다. 총 4ml가되도록증류수를넣은다음진탕하여 95 waterbath 에넣고 1시간동안가열하였다. 가열한시험관을흐르는수돗물에서냉각시킨후, 증류수 1 ml와 n-butanol:pyridine (15:1,v/v) 혼합용액 5ml를가하고 voltex 하였다. 1,500 g 에서 10 분간원심분리한후상층액 (n-butanol :pyridine 층 ) 을채취하여 532 nm에서흡광도를측정하였다. 표준물질로는 TMP(1,1,3,3-tetraamitoxypropane) 를사용하였고,lipidperoxide 수준은 nm MDA (malondialdehyde) 로표시하였다. 4) 간장내 glutathione peroxidase (GSH-Px) 간장내 GSH-Px 활성은 Levander 등 26) 의방법에준해분석하였다. 일정량의간장절편을생리식염수로세척하여혈액을제거시킨후,0.15M Kcl 수용액과함께 homogenizer 로 20% homogenate 가되도록마쇄하여 9,000 g 에서 15 분간원심분리하였다. 이상층액을다시 15,000 g 에서 1시간동안원심분리한후, 상층액을단백질의함량이 100~200 μg이되도록취하여분석에사용하였다. 원심분리시의온도는 4 를유지하였으며, 조제한시료를 stock solution (K bufer,40mm glutathione,kh bufer, ml당 1Unit 의 glutathione reductase) 에넣어 37 에서 10 분간항온시킨후,20mM NADPH 를첨가하여다시 2분동안방치시켰다. 그리고 15mM t-butylhydroperoxide 를가하여그반응을 340 nm에서 1 분간흡광도가 감소하는속도를측정하였다.GSH-Px 활성도의 unit 는mg protein 당 1 분동안 NADPH 가 NADH 로산화되는 nm 수로나타내었다. 5) 간장내 superoxide dismutase (SOD) 간장내 SOD 측정은 Xanthineoxidase 에의해 Superoxide 를생성하고, 이 superoxide 가 fericytochrome C (Fe 3+ ) 를 ferouscytochromec (Fe 2+ ) 로환원시 키는데이때 SOD 가존재하면 SOD 가 superoxide 에대해경쟁하여 cytochromec 의환원속도가 감소되는원리를이용한 Flohe 등 27) 의방법으로 측정했다. 본실험에서는 fericytochromec 의환 원이방해되는정도를 550 nm에서 30 초간격으로 3 분간비색정량한후 fericytochromec 의환원 을 50% 방해하는 SOD 의양을 1unit 로하여분 당활성정도를나타내었다. 6) 간장내 catalase (CAT) 간장내 CAT 활성을측정하기위하여간장 0.2 g 을 20 배의 25 mm KH 2PO 4-NaOH bufer (ph 7.0) 에넣어균질화시키고이 homogenate 를같은 bufer 로 60 배희석한후 icebath 상태 에서 ultrasonicator(heatsystem Ultrasonics.Inc., UltrasonicPropessorW-385,USA) 로 15 초씩 2 회 반복하여이시료를 Spectrophtometer(550 nm ) 에서흡광도를측정한후 formaldehyde 를표준 용액으로하여얻은표준곡선으로부터활성을계 산하였다 28). 7) 혈장내 aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) 혈장내 AST,ALT 는혈액자동분석기 (Boehringer 62
毛棶枝葉 (CornuswalteriWanger) 추출물이비만쥐의지질강하, 항산화효과및전염증성 cytokines 농도에미치는영향 Manheim, 독일 ) 로측정하였다. 8) 혈장및간장내 cytokines 혈장내 cytokines 정량용시료는채혈직후, 혈장을분리하여 -80 에냉동보관하였다. 간장 내 cytokines 정량용시료는 1g 의간장을채취 하여 5 ml의 coldphosphatebuferedsaline(pbs, ph7.4,containingaproteaseinhibitorscocktail) 과함께혼합하여얼음위에서분쇄하였다. 분쇄 혼합물을 4,15,000rpm,15 분간원심분리한후, 상층부를 0.45 μm필터로여과하고, 다시원심분 리해서상층부를 -80 에냉동보관했다.Cytokines (IL-1β,TNF-α,IL-6 및 IL-10) 정량은시판 Kit (BiosourceInternational,USA) 를이용했다.TNF-α 의최저측정농도는 0.7pg/ ml이며, 다른 cytokines 들은 3~8pg/ ml이다. 간장내 cytokines 량은 5 ml의 PBS 에생간장 1g 을혼합한조정액으로 측정하였으며,pg/ mg단위로나타내었다. 9) RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction) 분석 TRIreagent(SigmaalderichCo.USA) 를이용 하여분화된세포의 totalrna 를추출하였다. cdna 합성은 M-MLV reverse transcriptase kit (Promega) 를사용하여 5 mg / ml totalrna 로하 였다. 합성된 cdna 는각각의 mouse TNF-α, Apo-B,Apo-E,leptin 및 β-actingenes 의 primer (TableⅡ) 를이용하여 PCR 을수행하였다.PCR 의 reaction mixture 는 3 μl 10 Ex-Taqbufer, 2.5 μl dntp mixture (2.5 mm each),0.5 μl Ex-Taq polymerase(5units/ μl,takara),2 μl forward 및 reverseprimers( 각각 100pM/ μl ), 1 μl cdna template 및 21 μl의증류수를혼합 한 30 μl이며,pcr 반응은 94 에서 5 분,94 에 서 30 초간 denaturation35cycles,57~60 에서 30 초간 annealing,72 에서 45 초간 extension, 마 지막으로 72 에서 10 분간 extension 을실시했다. PCR products 는 1.5% agarose gel(0.1 mg / ml ethidium bromide) 을이용하여전기영동을하였 으며,sizemarker 로 GeneRulerDNA laddermix. (Fermentas,#SM0333) 를사용하였다 (TableⅡ). Table Ⅱ. The Primers Used in RT-PCR and the EstimatedSizeoftheAmplifiedFragments RNA TNF-α: 446bp Primersequences(5 to3 ) 5 -AGC CCA CGTCGTAGC AAA CCA CCA A-3 5 -AAC ACC CATTCC CTTCAC AGA GCA AT-3 5 -AGA AAG AGA ACA AAG CAG ApolipoproteinB: AGA TTG TGG-3 170bp 5 -CAT GCT CCA TTC TCA CAT GTT TA-3 ApolipoproteinE: 5 -GTG GGCAAA CCTAATGGA GA-3 300bp 5 -GCTGAA GCTGTGTGGAATCA-3 Leptin: 458bp β-actin: 348bp 6. 통계처리 5 -GTG GCT TTG GTC CTA TCT GTC CTA TG-3 5 -TCA GGG CTA AGG TCC AAC TGT TGA AG-3 5 -TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA-3 5 -TAA AAC GCA GCTCAG TAA CAG TCC G-3 실험결과는 SPSS 12.0 version 을이용하여 one-wayanova 검정을수행하였으며, 각처리 군간의유의성검정은 Duncan'smultiplerange test 에의해 P<0.05 수준에서실시했다. Ⅲ. 實驗結果 63
1. 혈장내 freefatyacid(ffa) 및 triglyceride (TG) 농도 FFA 농도는毛棶枝葉처리군이대조군보다낮 은경향을보였다. 그러나毛棶枝葉 100 mg / kg 처리군은대조군과유의한차이를나타내지는않 았다.TG 농도는毛棶枝葉처리군모두가대조 군보다유의하게낮았다. 毛棶枝葉처리군간에 는유의한차이를나타내지않았다 (TableⅢ). TableⅢ.EfectsofCornuswalteriExt.onPlasmaFFA andtriglycerideconcentrationinratfedhigh FatDiet Groups FFA(uEql) Triglyceride( mg / dl ) Control 907.29±28.44* 272.74±21.11* Treatment1 871.93±30.61* 217.49±25.81 Treatment2 729.15±28.38 188.14±20.39 Treatment3 737.51±22.27 225.73±24.31 *, :Meansinthesamerow withdiferentsuperscriptsare significantlydiferent(p<0.05). Treatment1:100 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment2:200 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment3:300 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 2. 혈장내 cholesterol 농도 Totalcholesterol 농도는毛棶枝葉처리군모 두가대조군보다유의하게낮았다. 그중毛棶枝 葉 300 mg / kg처리군이가장낮은값을나타내었 다.HDL-cholesterol 농도는毛棶枝葉 300 mg / kg 처리군만이대조군보다유의하게높았으며,LDLcholesterol 농도는毛棶枝葉처리군들이대조군 보다유의하게낮았으나 200 mg / kg毛棶枝葉처 리군은대조군과유의한차이를보이지않았다 (TableⅣ). TableⅣ.EfectsofCornuswalteriExt.onPlasmaTotal Cholesterol,HDL-cholesterolandLDL-cholesterol ConcentrationinRatFedHighFatDiet Groups TotalCholesterol HDL-cholester LDL-cholestero ( mg / dl ) ol( mg / dl ) l( mg / dl ) Control 271.65±10.14* 21.95±5.55* 24.72±2.41* Treatment1 213.29±15.85 24.91±3.19* 19.55±2.72 Treatment2 235.11±18.73 31.38±3.54* 20.61±2.45* Treatment3 194.72±15.28 34.75±4.11 19.11±2.35 *,, :Meansinthesamerow withdiferentsuperscripts aresignificantlydiferent(p<0.05). Treatment1:100 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment2:200 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment3:300 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 3. 간장내 totalcholesterol 및 triglyceride (TG) 농도 간장내 totalcholesterol 농도는간장내 total cholesterol 농도는毛棶枝葉 200 및 300 mg / kg 처리군에서대조군보다유의하게낮았으며, 毛棶 枝葉첨가량이증가함에따라감소했다. 毛棶枝 葉처리량이증가함에따라감소했다.TG 농도 는毛棶枝葉처리군모두가대조군보다유의하게 낮았다. 毛棶枝葉처리군들사이에서는유의한 차이를나타내지않았다 (TableⅤ). TableⅤ.EfectsofCornuswalteriExt.onLiverTotal CholesterolandTriglycerideConcentrationin RatFedHighFatDiet Groups TotalCholesterol( mg /g) Triglyceride( mg /g) Control 18.33±2.27* 19.75±1.88* Treatment1 16.37±1.85* 12.08±1.16 Treatment2 12.52±2.05 11.51±2.71 Treatment3 11.53±1.97 11.95±1.44 *,, :Meansinthesamerow withdiferentsuperscripts aresignificantlydiferent(p<0.05). Treatment1:100 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment2:200 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment3:300 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 64
毛棶枝葉 (CornuswalteriWanger) 추출물이비만쥐의지질강하, 항산화효과및전염증성 cytokines 농도에미치는영향 4. 혈장및간장내 thiobabituricacidreactive substance(tbars) 농도 혈장및간장내 TBARS 농도는毛棶枝葉처 리군모두가대조군보다낮은경향을보였으나, 毛棶枝葉 300 mg / kg처리군만이대조군보다유 의하게낮은값을나타내었다 (TableⅥ). TableⅥ.EfectsofCornuswalteriExt.onPlasmaand LiverTBARS ConcentrationinRatFedHigh FatDiet Groups PlasmaTBARS LiverTBARS (nm MDA/ ml ) (nm MDA/g) Control 18.51±2.92* 15.88±3.05* Treatment1 17.34±2.75* 11.74±2.69* Treatment2 14.29±3.11* 11.39±2.85* Treatment3 10.71±3.55 7.52±3.11 *, :Meansinthesamerow withdiferentsuperscriptsare significantlydiferent(p<0.05). Treatment1:100 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment2:200 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment3:300 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 5. 간장내 glutathioneperoxidase(gsh-px), superoxidedismutase(sod) 및 catalase (CAT) 활성치 GSH-Px 활성치는毛棶枝葉 300 mg / kg처리군 만이대조군보다유의하게높은값을나타내었 다.SOD 활성치는毛棶枝葉 200 및 300 mg / kg 처리군들이대조군보다높은경향을나타내었으 나, 毛棶枝葉 200 mg / kg처리군은통계적으로유 의성을나타내지는않았다.CAT 활성치는毛棶 枝葉처리군모두가대조군보다유의하게높은 값을나타내었다 (TableⅦ). Table Ⅶ.EfectsofCornus walteriext.on GSH-Px, SOD,CATActivityinRatFedHighFatDiet Groups GSH-Px (nmoles/min/ mg protein) SOD (unit/ mg protein) CAT (μmoles(h2o2) /min/ mg protein) Control 121.74±5.25* 15.58±2.49* 55.96±5.48* Treatment1 130.22±6.14* 15.32±3.05* 71.15±4.72 Treatment2 127.15±4.98* 19.62±2.17* 80.55±3.51 Treatment3 142.88±4.33 21.84±2.75 78.29±3.38 *, :Meansinthesamerow withdiferentsuperscriptsare significantlydiferent(p<0.05). Treatment1:100 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment2:200 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment3:300 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 6. 혈장내 aspartateaminotransferase(ast) 및 alanine aminotransferase (ALT) 활성치 혈장내 AST 및 ALT 의활성치는전처리군 간에유의한차이를나타내지않았다 (TableⅧ). Table Ⅷ.EfectsofCornuswalteriExt.on Aspartate Aminotransferase(AST)andAlanineAminotransferase (ALT)ActivityinRatFedHighFatDiet Groups AST(Karmenunit) ALT(Karmenunit) Control 38.71±5.98* 30.14±4.25* Treatment1 44.85±5.03* 32.61±4.18* Treatment2 40.18±4.98* 32.02±3.84* Treatment3 33.27±4.55* 28.21±2.17* *:Notsignificantlydiferent(P>0.05). Treatment1:100 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment2:200 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment3:300 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 7. 혈장내 cytokines 농도 혈장내 IL-1β 농도는毛棶枝葉 200 및 300 mg / kg 처리군에서대조군보다유의하게낮았다. 혈장 내 IL-6 농도는毛棶枝葉 300 mg / kg처리군만이 대조군보다유의하게낮은값을나타내었다. 혈 장내 TNF-α 농도는毛棶枝葉첨가량이증가함 65
에따라감소하는경향이었으나, 毛棶枝葉 300 mg / kg처리군만이대조군보다유의하게낮은값 을나타내었다. 혈장 IL-10 농도는毛棶枝葉 200 및 300 mg / kg처리군이대조군보다유의하게높 은값을나타내었다 (TableⅨ). TableⅨ.EfectsofCornuswalteriExt.onPlasmaCytokines ConcentrationinRatFedHighFatDiet IL-1β IL-6 TNF-α IL-10 Groups (pg/ ml ) (pg/ ml ) (pg/ ml ) (pg/ ml ) Control 34.37±3.12* 53.17±8.41b* 47.95±6.82* 12.57±1.95* Treatment1 30.72±4.71* 57.39±9.05 40.71±8.54* 15.33±2.71* Treatment2 21.81±3.25 41.37±6.17* 37.15±4.27* 17.46±3.38 Treatment3 25.88±4.38 38.55±4.31 33.52±3.84 21.54±2.03 *,, :Meansinthesamerow withdiferentsuperscripts aresignificantlydiferent(p<0.05). Treatment1:100 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment2:200 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment3:300 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 8. 간장내 cytokines 농도 IL-1β,TNF-α 및 IL-10 농도는전처리군간에 유의한차이를나타내지않았다. 간장내 IL-6 농 도는毛棶枝葉 200 및 300 mg / kg처리군이대조 군보다유의하게낮은값을나타내었다 (TableⅩ). TableⅩ.EfectsofCornuswalteriExt.onLiverCytokines ConcentrationinRatFedHighFatDiet Groups IL-1β IL-6 TNF-α IL-10 (pg/ mg ) (pg/ mg ) (pg/ mg ) (pg/ mg ) Control 20.52±3.14* 4.75±0.95 1.71±0.63* 1.15±0.66* Treatment1 18.35±4.01* 3.61±0.81 1.11±0.75* 1.57±0.75* Treatment2 16.81±3.27* 2.75±0.88 1.08±0.54* 1.94±0.51* Treatment3 18.11±3.85* 2.54±0.51 1.41±0.51* 1.88±0.62* *:Notsignificantlydiferent(P>0.05)., :Meansin thesamerow with diferentsuperscripts aresignificantlydiferent(p<0.05). Treatment1:100 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment2:200 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Treatment3:300 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 9. RT-PCR 분석에의한 TNF-α,Apo-B, Apo-E 및 leptingeneexpression 4 개 gene 모두毛棶枝葉처리군이대조군보다 낮은 expression 을나타내었으며, 毛棶枝葉처리 량이증가함에따라 4 개 geneexpression 모두가 하락했다 (Fig.1). Fig.1.RT-PCR analysisfortnf-α,apo-b,apo-e and Leptingeneexpression. 100 : 100 mg / kg concentration of Cornus walteri Ext 200 : 200 mg / kg concentration of Cornus walteri Ext 300 : 300 mg / kg concentration of Cornus walteri Ext 10.β-actinexpression 에대한 TNF-α,Apo-B, Apo-E 및 leptingeneexpression β-actin expression 에대한 TNF-α 의 gene expression 비율은毛棶枝葉 200 mg / kg,300 mg / kg처리군에서대조군보다유의하게낮은값을 나타내었다 (Fig.2).Apo-B 의 geneexpresion 비 율은毛棶枝葉 300 mg / kg처리군에서대조군보다 유의하게낮은값을나타내었고 (Fig.3),Apo-E 의 geneexpression 비율은毛棶枝葉 200 mg / kg,300 mg / kg처리군에서대조군보다유의하게낮은값 을나타내었다 (Fig.4).Leptin 의 geneexpression 비율은毛棶枝葉 200 mg / kg,300 mg / kg처리군에 서대조군보다유의하게낮은값을나타내었다 (Fig.5). 66
毛棶枝葉 (CornuswalteriWanger) 추출물이비만쥐의지질강하, 항산화효과및전염증성 cytokines 농도에미치는영향 diferent(p<0.05). 100:100 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 200:200 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 300:300 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Fig.2.The ratio oftnf-α/β actin in RT-PCR gene expression. *,,, :Means with diferentsuperscripts are significantlydiferent(p<0.05). 100:100 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 200:200 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 300:300 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Fig.5.The ratio ofleptin/β actin in RT-PCR gene expression. *,, :Meanswithdiferentsuperscriptsaresignificantly diferent(p<0.05). 100:100 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 200:200 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 300:300 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Ⅳ. 考察 Fig.3.The ratio ofapo-b/β actin in RT-PCR gene expression. *,, :Meanswithdiferentsuperscriptsaresignificantly diferent(p<0.05). 100:100 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 200:200 mg / kg concentrationofcornuswalteriext 300:300 mg / kg concentrationofcornuswalteriext Fig.4.The ratio ofapo-e/β actin in RT-PCR gene expression. *,, :Meanswithdiferentsuperscriptsaresignificantly 산업의발달과고에너지식품의증가로성별, 연령에관계없이비만인구가증가하고있다. 근래우리나라에서도경제발전으로식생활이개선되고생활양식이편리해지면서비만의빈도가크게증가하여 2007 년도국민건강통계 에따르면우리나라만19 세이상성인의비만유병률은 31.7% 로 1998 년 26.0% 에비해지난 10 년간 5.7% 증가하였으며그중남자 36.6%, 여자 27.8% 가비만인것으로나타났다 29). 비만이란과잉체중의상태를말하는것이아니라대사장애로인해체내에지방이과잉축적된상태를말하며그원인으로는식사습관, 활동부족, 유전, 중추신경계이상, 호르몬요인, 심리적장애, 사회 문화 경제적요인등과관련이있다 1). 비만은단지용모의손상뿐만아니라당뇨병, 67
고지혈증, 고혈압, 관상동맥질환등과밀접한관련이있기때문에사회적인문제로대두되고있으며 30) 이러한성인병의예방과치료를위해비만을효과적으로관리하는것이중요하다 31). 한편최근의연구에서는생체내의지방세포가세포기능을조절하는데관여하며뇌하수체, 췌장, 간, 근육, 신장, 혈관내피및면역계통의다양한조직에도영향을준다는것이밝혀졌다. 또한지방세포는단순히지방축적의기능만있는것이아니라 TNF-α,IL-6 등을분비하는내분비기관으로서의역할을하며 32), 대사증후군과인슐린저항성과관련있는것으로알려져있다 33). 비만으로인한에너지의불균형은에너지대사에관여하는주요장기와효소기능에이상을초래하고각종질환을야기하게된다. 또한생체내지질대사의이상은과산화물을체내에대량으로축적하게되고, 축적된과산화물은세포의노화를촉진하고이상세포를만들어결국암의원인이되기도한다 34-36). 이와같은연구결과는비만이타질병의발병과진행에직 간접적으로작용하고있음을알려주는것으로, 각종질환의예방및치료차원에서비만을개선해야할필요성이한층높아졌다. 한의학에서는비만에대해黃帝內經 靈樞 37) 의 逆順肥瘦第三十八 에 年質壯大血氣充盈膚革堅固因加以邪刺此者深而留之此肥人也, 衛氣失常第五十九 에는 人有肥有膏有肉 膕肉堅皮滿者肥膕肉不堅皮緩者膏皮肉不相離者肉 이라고최초로언급 38) 하였고그원인에대하여先天稟賦, 外感濕邪, 過食肥甘厚味, 久臥久坐, 內傷七情등으로인한氣滯, 痰濁, 水濕및血瘀등이肌膚나腹膜, 臟腑등에留滯되어형성되는것으로보았으며 39) 치료는변증에따라健脾利濕, 淸熱利濕, 疏肝利氣, 溫腎健脾, 理氣活血의치법과사상의학적접근에따른치료를하고 있다 1). 비만에대한한의학적약물연구는湯劑와單味가주를이루는데 2000 년이후의논문조사에따르면湯劑는四象處方과體感薏苡仁湯등이있었고, 單味는麻黃이제일많았고그외枳實, 人蔘, 生薑등이있었다 7). 최근의연구경향은비만을유도한쥐에약물을투여한뒤혈장지질의변화와비만관련유전자발현여부를살펴보는것이대부분이었다 40-42). 毛棶枝葉 (CornuswalteriWanger) 은층층나무과 (Cornaceae) 에속하는낙엽활엽교목으로전국에야생하며 43) 이나무의가지로말의채찍을만들었다하여말채나무라는이름이붙어졌다고한다 44). 속명으로는朝鮮松楊, 朝鮮山茱萸, 車梁木, 毛棟 22) 이라하며중국에서는등대목, 일본에서는미즈기 ( 水木 ) 또는團子木이라한다 44). 한방에서는말채나무의가지와잎을毛棶枝葉이라부르며紅零子, 紅梗山茱萸, 癩樹, 八樹라고불리기도한다 20). 性은凉, 味는微苦 澁 21) 하며凊熱解毒과解毒斂瘡의효능이있어止痒과漆瘡에주로쓰인다 45,46). 일반적으로관상수및목재 ( 木材 ), 기재 ( 器材 ) 로쓰며민간에서는수피와잎을强壯 22) 과止瀉劑 21) 로사용하였다. 함유성분으로는 galicacid 와 isoquercitrin 이있으며 21) 최근연구에서는수피에서 8종의페놀성화합물이있음이밝혀졌다 23). 약리적인연구에따르면말채나무추출물이 α-amylase 를저해하여식후혈당상승을억제하였다는보고가있었다 24). 또한같은연구에서추출물을 mouse 에투여했을때유의하지는않았으나일정한체중감소효과가있었다고하였다 24). 그러나그외말채나무에대한약물로서의이용가치에대한조사나실험은없었다. 최근에는비만에대한민간요법의하나로말채나무를많이이용하는데, 달인물을마시면살이빠지고몸이가벼워진다하여일명빼빼목또 68
毛棶枝葉 (CornuswalteriWanger) 추출물이비만쥐의지질강하, 항산화효과및전염증성 cytokines 농도에미치는영향 는신선목이라하며단독또는다른약재와함께음용한다고한다. 따라서저자는기존연구에서나타난말채나무의식후혈당강하와체중감소효과에착안하여비만으로야기되는고지질과이와연관된 cytokines 및항산화지표변화를관찰하기위하여비만을유도한흰쥐에게毛棶枝葉추출물을투여한후지질강하효과, 항산화효과, 면역계및비만관련유전자에관련되는각종생물학적수치들을검토하였다. 혈액내 FFA,totalcholesterol,LDL-cholesterol 및 TG 농도는조직내지질축적의정도와밀접한관계가있으며 47), 당뇨병및순환계질환등의성인병의발병가능성을예측할수있는생물학적지표들이다 48). 비만인들은고지혈증의빈도가높은데, 이는혈액내중성지방과콜레스테롤의증가,HDL-cholesterol 감소등이특징적이다 2). 혈중지방산은화학적으로 2가지형태로존재하는데 carboxyl 기가다른분자와공유결합한것과결합하지않은것이다. 후자를유리지방산 (freefatyacid) 이라하는데비만일경우지방조직의증가와더불어 FFA 동원도커져혈중 FFA 가증가하게된다 49). Cholesterol 은인지질과함께세포막성분으로각종 steroid hormone 을비롯하여 hormone 생산의원료나담즙산의전구체로중요한지질이다 49).Cholesterol 은동물성식품을통하여섭취되거나체내에서 acetylcoa 로부터합성되며, 혈중에서는지단백 (LDL,HDL,VLDL,Chylomicron 등 ) 과결합하여존재하는데 50) 과잉콜레스테롤은그일부가결정형태로죽상동맥경화소를형성하며일부는 HDL 로운반되어간에서담즙산으로배출된다. 총 cholesterol 과관상동맥질환발생과는상관성이있기때문에중요시되고있다 49). Triglyceride (TG) 는흔히중성지방이라고도 하는데일종의 alcohol 인 glycerol 과지방산과의 ester 이다.TG 는에너지원으로중요하며대부분음식물로서섭취되어장관에서흡수되는데, 혈장중의농도는지방섭취량, 장관의흡수, 간장의합성및분비, 지방조직에서의흡수및저장등여러가지조건에따라달라진다 51). 관상동맥질환과심근경색등에서혈장 TG 가동맥경화증발생의지표가되며고 TG 혈증일때그위험이증가한다고알려져있다 49). Low densitylipoprotein(ldl) 은혈중 cholesterol 의 2/3 를운반하는데주로간에서말초세포로 cholesterol 을운반하며말초조직은 LDL 수용체를매개하여 LDL 을취입하여사용한다 49).LDL 은관상동맥경화증을일으키는데에가장위험한지단백질이며동맥경화증인자이다 50). Highdensitylipoprotein(HDL) 은간및소장에서합성되어혈액을타고온몸을순환하며세포내에있는여분의 cholesterol 을회수하여간으로이동시키는역할을하며, 간으로운송된 cholesterol 은담즙산으로배설된다 50).HDL-cholesterol 은항동맥경화작용이있어관상동맥질환의방어인자로서중요하며비만, 고지혈증, 당뇨병등에서저하되며혈장에서의감소는말초조직의콜레스테롤운반능력을감소시켜죽상경화병변을일으키기쉽게한다 49). 혈장내 FFA 농도는毛棶枝葉처리군이대조군보다낮은경향을보였으나毛棶枝葉 100 mg / kg처리군은대조군과유의한차이가없었고,tg 농도는毛棶枝葉처리군모두가대조군보다유의하게낮았다 (TableⅢ). Totalcholesterol 농도는毛棶枝葉처리군모두가대조군보다유의하게낮았다.HDL-cholesterol 농도는毛棶枝葉 300 mg / kg처리군이대조군보다유의하게높았으며 LDL-cholesterol 농도는毛棶枝葉처리군이대조군보다유의하게낮았으 69
나, 毛棶枝葉 200 mg / kg처리군은대조군과유의한차이가없었다 (TableⅣ). 따라서본실험의결과에서이러한생물학적수치들이하락하여毛棶枝葉내의기능성물질들은지질강하효과를가지고있으며, 성인병예방에효과적임을알수있다. 또한혈장 HDLcholesterol 농도가毛棶枝葉 300 mg / kg처리군에서증가하는경향을보여생체내지질의축적과구성을이상적으로개선할수있는우수한생물학적기능성물질을소지하고있을가능성을시사해준다. 간장내 totalcholesterol 농도는毛棶枝葉 200 및 300 mg / kg처리군에서유의하게낮았으며, 毛棶枝葉첨가량이증가함에따라감소했다. 간장 TG 농도는毛棶枝葉처리군모두가대조군보다유의하게낮았다 (TableⅤ). 간장은지질의합성과분해가이루어지는곳으로, 간장의지질농도는일반적으로적당량을유지하게된다. 그러나식이의종류나간장내의효소활성에영향을줄수있는요인들에의해다소차이를나타낼수있다. 본실험에서식이의종류와섭취량이처리군간에거의동일하였음을고려해보면毛棶枝葉추출물에내재하는기능성물질들이간장내지질의합성이나분해에어떤영향을주었을가능성을시사해준다. 비만은체내산화스트레스와인슐린저항성을증가시키는한편항산화체계의불균형을가져와궁극적으로동맥경화를야기할수있는것으로동물실험및인체실험을통해보고되었다 52-54). Thiobabituricacidreactivesubstance(TBARS) 는지질과산화생성물질중의하나로서지질과산화지표로서많이이용되고있다. 생체막의주요구성성분인다중불포화지방산이나체내각종지질은활성산소에의해 TBARS 와같은과산화지질물로전환되어세포에대한산화적손상을 유발하고각종기능장애를야기함으로써노화와질병의원인이되고있다 55). 항산화효과와관련된실험결과에서혈장및간장내 TBARS 농도는毛棶枝葉처리군들이대조군보다낮은경향을보였으나, 毛棶枝葉 300 mg / kg처리군만이대조군보다유의하게낮은값을나타내었다 (TableⅥ). 이러한결과는毛棶枝葉수피내의플라보노이드계물질들이항산화능에크게기여하였을것으로생각된다. 활성산소종 (Reactiveoxygenspecies,ROS) 은세포의노화나흡연, 자외선, 환경오염에노출이증가되고, 특히비만, 인슐린저항성등의원인에의해그생성속도가높아진다고알려져있다. 이러한활성산소종의일부는체내에서매우중요한역할도하고항산화방어기전에의해제거되면서균형을유지하게된다 56). 활성산화물질에대한세포내방어기전은항산화효소인 superoxide dismutase(sod),glutathioneperoxidase(gsh-px), catalase(cat) 등에의해이루어지는데그중 SOD 는 superoxideanion(o - 2 ) 을수소원자 (H + ) 와반응시켜과산화수소 (H 2O 2) 와산소분자 (O 2) 로만드는작용을통해항산화작용을하는데그작용의중요성으로인해산화적스트레스에대한지표로서현재까지가장많이측정되고있는물질중의하나이다 57,58). 또다른항산화효소인 GSH-Px 는세포와혈중에존재하며과산화수소 (H 2O 2) 와그밖의유리과산화물을제거하는작용을하며 59) GSH-Px 의결핍은지질과산화반응을촉진시킨다고알려져있다 60). CAT 는 SOD 에의해전환된 H 2 O 2 가더강력한유리기를형성할수없도록하는데필요한효소이다 61). 실험에서항산화계효소인 GSH-Px 활성치는毛棶枝葉 300 mg / kg처리군만이대조군보다유 70
毛棶枝葉 (CornuswalteriWanger) 추출물이비만쥐의지질강하, 항산화효과및전염증성 cytokines 농도에미치는영향 의하게높은값을나타내었다.SOD 활성치는毛棶枝葉 200 및 300 mg / kg처리군들이대조군보다높은경향을나타내었으나, 毛棶枝葉 200 mg / kg처리군은유의성이없었다.cat 활성치는毛棶枝葉처리군모두가대조군보다유의하게높은값을나타내었다 (TableⅦ). GSH-Px,SOD 및 CAT 활성치는毛棶枝葉 300 mg / kg처리군모두에서대조군보다유의하게높은활성치를보여혈장및간장의 TBARS 결과와잘부합된다. Aminotransferase 는 ketoacid 와 aminoacid 간의 amino 기의교환을촉매하는효소로여러가지가있으나임상적으로중요한것은 aspartate aminotransferase(ast) 와 alanineaminotransferase (ALT) 이다 49).ALT 는주로간에서나오는효소인데반해서 AST 는심장, 골격근, 신장, 뇌에도존재하는데간질환이있는경우이두효소가증가되는경우가많다 51). 간에는효소함량이많을뿐만아니라해부학적으로도효소의유출이용이하기때문에 AST, 특히 ALT 는간장애의예민한검사라할수있다 49). 혈장 AST,ALT 활성치는전처리군간에유의한차이를나타내지는않았다 (TableⅧ). 이러한결과는毛棶枝葉추출물이그처리량과는상관없이간장기능에어떤장애를일으키지않았음을시사해준다. Cytokines 란면역담당세포를비롯하여여러가지세포에서생산되는생리활성물질을총칭하는것으로 49) 염증에대한자기방어와세포의성장, 분화, 세포의사멸, 혈관형성, 항상성의회복과발달을위해서나타난다 62). 비만의경우에지방세포가분비하는 cytokines, 즉 leptin 과 TNF-α 및 IL-6 등은인슐린저항성과밀접한관련이있으며 10-12), 당뇨병의주요원인이된다는것이밝혀졌다 13,14). 또한이들 cytokines 들은전염증성 cytokines 들로생체내염증성질환과밀접한관계를가지고있다 63). IL-1β 는단핵구, 대식세포,B-cel,dendritic cel,endothelialcel, 호중구와간세포에서분비되며 TNF-α,IL-6 와함께전염증성 cytokines 으로서여러면역학적작용들과연관되어있다. 특히 IL-1β 는 T-cel 의 activation,b-cel 의 maturation, NK cel 의 activity 를활성화하며 hypothalamus 에작용하여발열을유도한다 64). IL-6 는내분비영역에서중요한 adipokine 으로면역계에관련된세포인단핵구, 섬유아세포, 림프구및교세포에서생성되며, 최근지방조직에서도생성되는것으로알려져있다 65).IL-6 은면역기능및대사기능의중요한조절자로작용하며, 인슐린저항성과관련된감염전구체인 TNFα의영향을억제하고, 간및지방조직에작용하여 glucose 및지질대사를조절한다 66). 지방조직에서 IL-6 와 TNF-α 의분비가긴밀한연관을보이기때문에현재는 IL-6 가 TNF-α/Leptin 축의한부분인것으로생각되고있다 67). TNF-α 는비만한설치류의지방조직에서과발현되며이후인간의지방조직에서 TNF-α 가발현되고지방의양에의존적으로그발현양이증가된다고보고되었고특히고인슐린증과관계있는것으로알려져있다 68).TNF-α 는지방세포에서도합성되며이것이조직의인슐린 receptor 에영향을주어조직내로의포도당유입을차단하는가능성이보고되어당대사및지질대사와도높은연관성을가지고있는것으로알려져있다 69). 또한 TNF-α 는간장에상처를주고간세포의사멸을일으키며,TNF-α 의과잉생산은광범위의 pathogenic 상태와도연관된다. 따라서최근의연구에서생체내에서 TNF-α 의생산을하락시키는방법을연구하고있다 70). IL-10 은 T-cel,B-cel, 단핵구등에의해생산 71
되며 T,B-cel 등에대하여다양한활성이있는데, 특히단핵구와 macrophages 계세포의 IL-1, IL-6,TNF-α 생산을억제하는항염증성 cytokines 로서의역할이주목되고있다 49). 본실험에서혈장내 IL-1β,IL-6 및 TNF-α 농도는毛棶枝葉처리량이증가함에따라감소하는경향이었으며, 혈장 IL-10 농도는毛棶枝葉 200 및 300 mg / kg처리군에서대조군보다유의하게높은값을나타내었다 (TableⅨ). 이러한실험결과들을고려해보면毛棶枝葉추출물은지방세포의감소와비만시의전염증성 cytokines 생산을억제하고항염증성 cytokines 을증가시키는기능성물질을내재하고있음을시사해준다. 간장내 IL-1β,TNF-α 및 IL-10 농도는전처리군간에유의한차이를나타내지않았다. 간장 IL-6 농도는毛棶枝葉 200 및 300 mg / kg처리군이대조군보다유의하게낮은값을나타내었다 (Table Ⅹ). 이러한결과는간장내에서각종 cytokines 들이합성되어혈류로방출됨을고려해보면지방세포에서분비되는 cytokines 들과달리간장내의 cytokines 합성에毛棶枝葉추출물이어떤영향을미쳤을것으로생각된다. Leptin 은 1994 년발견되었으며,leptin 유전자결함으로 leptin 이생성되지않는 ob/ob 마우스에 leptin 을주사하여체중감소와고혈당, 고인슐린혈증같은대사장애의개선이증명되어항비만호르몬으로작용한다 71) 고보고되었다. 또한 leptin 은지방조직에서분비되어열량섭취감소와에너지소비량의증가를유도하는 cytokines 로알려져있으며, 비만상태에서분비량이증가하지만감수성은억제되는것 72) 으로보고되고있다. 최근에는 leptin 이유리지방산의간으로의유입을감소시키고, 비지방조직에서의지방침착을억제하는효과를가지고있을것으로추정되고있다 73). Apolipoprotein (Apo) 은지단백을구성하는단백성분으로그역할은지질을혈중에서가용하여각장기로운반하는것과지단백을종류별로각각의수용체에결합시키는일, 지질대사에관여하는효소의활성화나억제화등이다 49). Apo B는동맥경화인자인 LDL-cholesterol 의단백질성분으로유일하게포함되어있다.ApoB 는 cholesterol 의세포사이로의수송과세포내유리등에중요한역할을담당하고 chylomicron 과 LDL 의간내생합성및분비에관여하고관상동맥질환에서높은수치를나타낸다 74). Apo E는단량체의당단백으로 299 개의아미노산으로구성되어있으며 75) VLDL-cholesterol, chylomicron remnants 등의동맥경화성지단백을구성하는아포단백으로동맥경화성지단백의이동과대사에관여하는중요한단백질로알려져있다 76,77).ApoE 는유전적변이에따른비정상적인혈중지질의형태와지질의양적수준변이에영향을주기때문에고지혈증으로인한성인병의유병률에진단적지표로이용될수있다 74). RT-PCR 분석에의한 TNF-α,Apo-B,Apo-E 및 Leptin 의 geneexpresion 에서 4개 gene 모두가毛棶枝葉처리군이대조군보다낮은 expresion 을나타내었으며, 毛棶枝葉처리량이증가함에따라 4개 geneexpression 모두가하락했다 (Fig.1). β-actin expression 에대한 TNF-α 의 gene expression 비율은毛棶枝葉 200 mg / kg,300 mg / kg처리군에서대조군보다유의하게낮은값을나타내었다 (Fig.2).Apo-B 의 geneexpresion 비율은毛棶枝葉 300 mg / kg처리군에서대조군보다유의하게낮은값을나타내었고 (Fig.3),Apo-E 의 geneexpresion 비율은毛棶枝葉 200 mg / kg,300 mg / kg처리군에서대조군보다유의하게낮은값을나타내었다 (Fig.4).Leptin 의 geneexpression 비율은毛棶枝葉 200 mg / kg,300 mg / kg처리군에 72
毛棶枝葉 (CornuswalteriWanger) 추출물이비만쥐의지질강하, 항산화효과및전염증성 cytokines 농도에미치는영향 서대조군보다유의하게낮은값을나타내었다 (Fig.5). 毛棶枝葉처리군에서 leptin 의발현감소가나타난것은 leptin 의수용체를활성화시켰거나 leptin 의민감도를증대시켜 leptin 의작용을활성화시킨것으로해석할수있으며,Apo-B 와 E 의낮은발현을통해동맥경화성지질의효과적인감소가있음을알수있다. 또한지방조직의감소는 TNF-α 의감소를통해서도확인할수있다. 간은지방분해의주요기관으로, 체내에들어오는에너지의저장과이용에불균형이발생하면체내지질대사의이상을초래하여간기능의이상및고지혈증, 고인슐린혈증등을야기 2) 하며아울러축적된지방에의한산화스트레스의증가와전염증성 cytokines 의분비는각종염증및질환의원인이된다. 따라서毛棶枝葉추출물의투여후혈장및간장의지질농도가유의하게저하된것은지질대사의호전을나타내는것으로궁극적으로간기능의개선도기대할수있다. 또한항산화효소의증가와전염증성 cytokines 의감소는동맥경화나당뇨병등의대사성질환의발생위험을낮출수있다는것으로비만으로인해야기될수있는여러가지질병의예방에도효과적임을말해준다. 이상의결과로미루어볼때, 毛棶枝葉내에있는기능성물질들이고지방식으로유발된비만에있어지질강하와항산화, 항염증효과를가지고있으며이를통해비만및성인병치료에이용할수있을것으로생각된다. Ⅴ. 結論 본연구는모래지엽에대한기초연구로비만 으로야기되는고지질과이와연관된 cytokines 및항산화지표변화를관찰하기위하여비만을유도한흰쥐에게毛棶枝葉추출물을투여한후지질강하효과, 항산화효과및생체면역체계와관련되는각종생물학적수치들을검토한결과다음과같은결론을얻었다. 1. 혈장내 freefatyacid,ldl-cholesterol 농도는毛棶枝葉처리군들이대조군보다낮은경향을보였다. 혈장내 triglyceride,total cholesterol 농도는毛棶枝葉처리군모두가대조군보다유의하게낮았다.HDL-cholesterol 농도는毛棶枝葉 300 mg / kg처리군이대조군보다유의하게높았다. 2. 간장내 totalcholesterol 농도는毛棶枝葉 200 및 300 mg / kg처리군에서유의하게낮았으며, 毛棶枝葉첨가량이증가함에따라감소했다. 간장내 triglyceride 농도는毛棶枝葉처리군모두가대조군보다유의하게낮았다. 3. 혈장및간장내 TBARS 농도는毛棶枝葉처리군들이대조군보다낮은경향을보였다. 간장내 GSH-Px,SOD 및 CAT 활성치모두가毛棶枝葉 300 mg / kg毛棶枝葉처리군이대조군보다유의하게높은활성치를나타내었다. 4. 혈장내 AST 와 ALT 활성치는전처리군간에유의한차이를나타내지않았다. 5. 혈장내 IL-1β,IL-6 및 TNF-α 농도는毛棶枝葉처리량이증가함에따라감소하는경향이었으며, 혈장 IL-10 농도는毛棶枝葉 73
200 및 300 mg / kg처리군에서대조군보다유의하게높은값을나타내었다. 간장내 IL-1β,TNF-α 및 IL-10 농도는전처리군간에유의한차이를나타내지않았다. 간장 IL-6 농도는毛棶枝葉 200 및 300 mg / kg처리군이대조군보다유의하게낮은값을나타내었다. 6.RT-PCR 분석에의한 TNF-α,Apo-B,Apo-E 및 leptin 의 geneexpression 은 4개 gene 모두가毛棶枝葉처리군이대조군보다낮은 expression 을나타내었으며, 毛棶枝葉첨가량이증가함에따라모두가하락했다. 7.β-actin expresion 에대한 TNF-α,Apo-E 및 leptin 의 geneexpression 비율은毛棶枝葉 200 및 300 mg / kg처리군이,apo-b 의 geneexpresion 비율은毛棶枝葉 300 mg / kg처리군이대조군보다유의하게낮은값을나타내었다. 이상의결과를종합해보면毛棶枝葉추출물이지질강하와항산화, 항염증등에효과를나타내어비만으로인한고지질및이와관련된대사성질환등에효능이있을것으로생각된다. 參考文獻 1. 한방재활의학과학회. 한방재활의학과학. 서울 : 군자출판사.2003:349,357-9,393-6. 2. 대한비만학회. 임상비만학. 서울 : 고려의학.2001 :24-6,115-6. 3. 비만관리를위한건강길잡이. 서울 : 한미의학. 2003:29-57. 4. 대한일차의료학회비만연구회편. 비만학이론과실제. 서울 : 한국의학.1996:267. 5. 洪元植. 精校黃帝內經. 서울 : 東洋醫學硏究院出版部.1991:61,94,219. 6. 허수영, 강효신. 비만의동서의학적고찰과치료. 한방재활의학회지.1997;7(1):272-86. 7. 황미자, 신현대, 송미연.2000 년이후비만치료에사용되는處方및本草에대한문헌연구. 대한한방비만학회지.2007;7(1):39-54. 8.BarkerJ,LiuJP,RobertsonEJ,EstratiadisA. Roleofinsulin-likegrowthfactorsinembryonic andpostnatalgrowth.cel.1993;75(1):73-82. 9.HilJO,LinD,YakybuF,PetersJC.Development ofdietaryobesityinrats:influenceofamount and composition ofdietary fat.intjobes RelatMetabDisord.1992;16(5):321-33. 10.WeigleDS.Appetiteand theregulation of bodycomposition.fasebj.1994;8(3):302-10. 11.NielsenS,JensenMD.Obesityandcardiovascular disease is body structure a factor.cur OpinLipidol.1997;8(4):200-4. 12.KissebahAH,AlfarsiS,AdamsPW,Wynn V.Roleofinsulinresistanceinadiposetissue andliverinthepathogenesisofendogenous hypertriglyceridaemiain man.diabetologia. 1976;12(6):563-71. 13.Mohamed-AliV,GoodrickS,CoppackSW. Subcutaneousadiposetisuereleasesinterleukin-6, butnottumornecrosisfactor-α,in vivo.j ClinEndocrinolMetab.1997;82:4196-200. 14.Mohamed-AliV,GoodrickS,CoppackSW. Adiposetisueanasendocrineandparacrine organ.intjobes.1998;22:1145-58. 15.LeeKU,LeeHK,KohCS,MinHK.Artificial induction of intravascular lipolysis by 74
毛棶枝葉 (CornuswalteriWanger) 추출물이비만쥐의지질강하, 항산화효과및전염증성 cytokines 농도에미치는영향 lipid-heparininfusionleadstoinsulinresistance inman.diabetologia.1988;31(5):285-90. 16.BrayGA.Obesityincreaseriskfordiabetes. IntJObesRelatMetab Disord.16(Suppl). 1992;4:S13-7. 17.HotamisligilGs,ShargilNS,SpiegelmanBM. Adiposeexpressionoftumornecrosisfactor-α: directroleinobesity-linkedinsulinresistance. Science.1993;259:87-91. 18.RonaldM,Kraus,MaryW.Obesity:Impact oncardiovasculardisease.circulation.1998;98 :1472-6. 19.RobertHE.Ronald M.Krauss.American heartassociation caltoaction:obesityas a major risk factor for coronary heart disease.circulation.1998;97:2099-100. 20. 김창민.( 完譯 ) 中藥大辭典. 서울 : 정담.1999:1317. 21. 옥천약용식물재배시험장. 약용식물도감. 서울 : 식품의약품안전본부.1997:158. 22. 김태정. 한국의자원식물Ⅲ. 서울 : 서울대학교출판부.1996:210. 23. 최우회, 박웅양, 황방연, 오갑진, 강신정, 이경순, 노재섭. 말채나무수피의페놀성화합물. 생약학회지.1998;29(3):217-24. 24. 임채성, 이춘영, 김용무, 이위영, 이해익. 말채나무추출물의 α-amylase 저해활성. 한국응용생명화학회지.2005;48(1):103-8. 25.BugeJA,AustaSD.Microsomallipidperoxidation. In:MethodsinEnzymology.FleicherS,Packer L.(eds).London:AcademicPres.1978;52:302-9. 26.LevanderOA,DeloachDP,MorisVC,Moser PB.Plateletglutathioneperoxidaseactivity asan index ofselenium statusin rats.j Nutr.1983:55-63,113. 27.FloheL,BeckerR,BrigeliusR,LengfelderE, OtingF.Convenientassaysforsuperoxide dismutase.crc Handbook offreeradicals andantioxidantsinbiomedicine.1992:287-93. 28.JohnsonLH,HakanBorgLA.Aspectrophotometric methodfordeterminationofcatalaseactivity insmaltisuesamples.analyticalbiochemistry. 1988:174,331-6. 29.2007 국민건강통계. 보건복지가족부.2007:56. 30. 서울대학교의과대학내과학교실. 내과학. 서울 : 군자출판사.1996:852-62. 31. 홍명호, 이영미, 최윤선, 김순덕. 비만의유형과심혈관계질환위험인자와의관련성. 가정의학회지.1996;17(9):784-96. 32.HotamisligilGS,ShargilNS,SpiegelmanBM. Adiposeexpresionoftumornecrosisfactor-α: directroleinobesity-linkedinsulinresistance. Science.1993;259:87-9. 33.DandonaP,AljadaA,ChaudhuriA,Mohanty P,GargR.Metabolicsyndrome:acomprehensive perspective based on interactions between obesity,diabetes,andinflammation.circulation. 2005;111:1448-54. 34.Graham S,MarshalJ,HaugheyB,Mitelman A,Swan son M,Zielezeny M,Byers T, WilkinsonG,WestD.Dietaryepidemiology ofcancer ofthe colon in western New York.Am JEpidemiol.1988;128(3):490-503. 35.Jain M,Cook GM,DavisFG,GraceMG, HoweGR,MilerAB.A case-controlstudy ofdietandcolorectalcancer.intjcancer. 1980;26(6):757-68. 36.YangSQ,Lin HZ,LaneMD,ClemensM, DiehiAM.Obesity increase sensitivity to endotoin liverinjury:implicationsforthe pathogenesis ofsteatohepatitis.proc Natl 75
AcadSci.USA.1997;94(6):2557-62. 37. 洪元植譯. 校勘直譯黃帝內經靈樞. 서울 : 傳統文化硏究會.1995:284,388. 38. 정지행, 정성희, 이종수. 비만에관한문헌적고찰. 동의물리요법과학회지.1992;2(1):141-55. 39. 변진우. 비만에대한문헌적고찰. 원광대학교대학원. 석사학위논문.1998. 40. 민홍규, 손영주, 심은섭, 김범회, 정혁상, 손낙원. 三黃湯이고지방식이,MSG 및난소적출로유발된흰쥐의비만에미치는영향. 한방재활의학과학회지.2008;18(1):33-46. 41. 김효영, 허동석. 加味八物湯이생쥐의비만억제에미치는영향. 한방재활의학과학회지.2008; 18(2):81-96. 42. 송미영, 김은경, 공재철, 이정한, 신병철, 류도곤, 권강범. 고지방식이유도비만에대한대시호탕추출물의억제효과. 한방재활의학과학회지.2008;18(3):41-9. 43. 육창수. 원색한국약용식물도감. 서울 : 아카데미서적.1993:368. 44. 최영전. 한국민속식물. 서울 : 아카데미서적.1992:107. 45. 國家中醫藥管理局中華本草編委會. 中華本草. 上海 : 上海科學技術出版社.1999:752. 46. 中國藥材公司. 中國中藥資源志要. 北京 : 科學出版社 1994:829. 47.KissebahAH,AlfarsiS,AdamsPW,Wynn V.Role of insulin resistance in adipose tissue and liver in the pathogenesis of endogenous hypertriglyceridaemia in man. Diabetologia.1976;12(6):563-71. 48.NielsenS,JensenMD.Obesityandcardivascular diseaseisbodystructureafactor.curopin Lipidol.1997;8(4):200-4. 49. 이귀녕, 권오헌. 임상병리파일. 서울 : 의학문화사.2000:148,155-6,164-5,169-171,182,717. 50. 한미의학편집부엮음. 비만관리를위한영양길잡이. 서울 : 한미의학.2003:30-2. 51. 李三悅, 權五憲, 鄭允燮, 宋慶順. 임상병리검사법. 서울 : 연세대학교출판부.1996:264,283,315. 52.UrakawaH,KatsukiA,SumidaY,Gabazza EC,Murashima S,Morioka K,Maruyama N,KitagawaN,TanakaT,HoriY,Nakatani K,Yano Y,AdachiY.Oxidative stressis asociatedwithadiposityandinsulinresistance in men.jclin EndocrinolMetab.2003;88 :4673-6. 53.MizunoT,MatsuiH,ImamuraA,Numaguchi Y,SakaiK,MuroharaT,OkumuraK.Insulin resistanceincreasescirculatingmalondialdehyde -modifiedldlandimpairsendothelialfunction inhealthyyoungmen.intjcardiol.2004;97 :455-61. 54.HiraiN,KawanoH,HirashimaO,Motoyama T,MoriyamaY,SakamotoT,KugiyamaK, Ogawa H, Nakao K,Yasue H. Insulin resistance and endothelial dysfuction in smokers:efectsofvitaminc.am JPhysiol HeartCircPhysiol.2000;279:H1172-8. 55.BruceAF,JamesD,CarpoMD.Biologyof disease:freeradicalsandtissueinjury.lab Invest.1982;47:412-26. 56.AmesBN,ShigenagaMK,HagenTM.Oxidants, antioxidantsand the degenerative diseases ofaging.procnatlacad SciUSA.1993;90 :7915-22. 57.Lioyd D.How to avoid oxygen.science. 1999:249,286. 58.SinghRJ,GossSPA,JosephJ,Kalyanaraman B.Nitrationofgamma-tocopherolandoxidation ofalpha-tocopherolbycopper-zincsuperoxid 76
毛棶枝葉 (CornuswalteriWanger) 추출물이비만쥐의지질강하, 항산화효과및전염증성 cytokines 농도에미치는영향 dismutase/h 2 O - 2 :Roleofnitrigendioxidefree radical.natlacadsci.1988;95(22):12912-7. 59.RotruckJT,PopeAL,GantherHE,Swanson AB,HafemanDG,HoekstraWG.Biochemical roleasacomponentofglutathioneperoxidase. Science.1973:179,588. 60.Kesavulu MM,GiriR,KameswaraRao B, ApparaoC.Lipidperoxidationandantioxidant enzyme levels in type 2 diabetics with microvascularcomplications.diabetesm etab. 2000;26(5):387-92. 61.KonoY,FridovichI.Superoxideradicalinhibits catalase.jbiolchem.1982;257(10):5751-4. 62.Oppenheim J.Cytokines:past,presentand future.intjofhematology.2001;74(1):3-8. 63. 양정화. 조릿대잎추출물이고지방식이유도비만마우스의 (C57/BL6J) 염증성사이토카인과인슐린저항성에미치는영향. 전남대교육대학원. 석사학위논문.2008. 64.Delgado AV,McManusAT,ChambersJP. Production of tumor necrosis factor-α, interleukin-1β,interleukin-2andinterleukin-6 byratleukocytesubpopulationsafterexposure to substance P.Neuropeptides.2003;37(6) :355-61. 65.JansonJO,WaleniusK,WernstedtI,Ohlson C,DicksonSLandWaleniusV.Onthesite andmechanism ofactionoftheanti-obesity efectsofinterleukin-6.growth Horm IGF Res.2003;13(A);28-32. 66.PedersenBK,SteensbergA,FischerC,Keler C,OstrowskiK,SchjerlingP.Exerciseand cytokineswith particularfocuson musclederivedil-6.immunolrev.2001;7:18-31. 67. 박철영, 유형준. 염증과비만. 대한내분비학회 지.2004;19(2):97-108. 68.Spiegelman BM,HotamisligilGS.Through thickandthin:wasting,obestyandtnf-α. Cel.1993;73(3):625-7. 69.HotamisligilGS.Adiposeexpressionoftumor necrosisfactor-α:directroleinobesity-linked insulinresistance.science.1993;359:87-91. 70.MariotJB,M Westby,SCookson,M Guckian, SGoodbourn,G Muler.CC-3052:awatersoluble analog ofthalidomide and potent inhibitorofactivation-inducedtnf-α production. JImmunol.1998;161:4236-43. 71.ZhangY,ProencaR,MafeiM,BaroneM, LeopeldL,FriedmanJM.Positionalcloning ofthe mouse obese gene and itshuman homologue.nature.1994;372(6505):425-32. 72.ConsidineRV,SinhaMK,HeimanML.Serum immunoreactiveleptinconcentrationinnormal -weightand obesehumans.n EnglJMed. 1996;334:292-5. 73.ParkJH.Insulinresistanceinnon-alcoholic faty liver disease.j Korean hepatology. 2006;12(1):16-30. 74.Vance DE,Vance JE.In Biochemistry of Lipids,Lipoprotein & membrance.usa: ElsevierSciencePublingCo.1991:403-85. 75.RalSC Jr,WeisgraberKH,Mahley RW. Human apolipoprotein E. The complete aminoacidsequence.jbiolchem.1982;257 :4171-8. 76.StiefelP,MontilaC,Muniz-GrijalvoO,Garcia -LozanoR,AlonsoA,MirandaML,PamiesE, VilarJ.ApolipoproteinEgenepolymorphism is related to metabolic abnormalities,but does notinfluence erythrocyte membrane 77
lipidcompositionorsodiumlithium counter transportactivity in essentialhypertension. Metabolism.2001;50:157-60. 77.OhJY,Baret-ConnorE.ApolipoproteinE polymorphism and lipid levels difer by genderand familyhistoryofdiabetes.the RanchoBernardoStudy.ClinGenet.2001;60 :132-7. 78