제출문 질병관리본부장 귀하 이보고서를 균혈증과요로감염원인균의내성실태및내성기전연구 ( 서울대학교의과대 학 / 김의종 ) 과제의연구결과보고서로제출합니다. 2006. 1. 25 주관연구기관명 : 서울대학교의과대학 주관연구책임자 : 김의종 제 1세부과제명 : 균혈증및요로감염을일으키는주요원인균의내성실태 ( 제1세부연구기관 / 세부과제책임자 ): 서울대학교의과대학 / 김의종 제 2 세부과제명 : 주요원인균의내성기전및지역간균주의 유전적상관성조사 : Escherichia coli ( 제2세부연구기관 / 세부과제책임자 ): 연세대학교의과대학 / 용동은 제 3 세부과제명 : 주요원인균의내성기전및지역간균주의 유전적상관성조사 : Enterococcus species ( 제3세부연구기관 / 세부과제책임자 ): 아주대학교의과대학 / 이위교 제 4 세부과제명 : Staphylococcus aureus 의내성기전및 지역간균주의유전적상관성조사 ( 제4세부연구기관 / 세부과제책임자 ): 울산대학교의과대학 / 김미나 - 1 -
연구결과보고서요약문 연구과제명 균혈증과요로감염원인균의내성실태및내성기전연구 중심단어항균제내성, 균혈증, 요로감염, 전국모니터링, 분자역학 주관연구기관서울대학교의과대학주관연구책임자김의종 연구기간 2005. 4. 26-2006. 1. 25 본연구에서는전국적규모의균혈증및요로감염원인균에대한내성률조사와내성기전연구를통하여주요원인균에의한항균제내성실태를파악하고감시체계를구축하고자하였다. 총괄및제 1 세부과제 : 2005년 4월부터 9월까지 6개월동안전국 10개대학병원환자의혈액및소변검체에서분리된주요세균, 즉 S. aureus, E. faecalis, E. faecium, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa의항균제내성률을조사하였다. 제 2, 3, 4 세부과제에서는각각 E. coli, Enterococcus species, S. aureus를대상으로항균제내성기전및유전적상관성을규명하였다. 제 2 세부과제 : 전국 10개의료기관에서수집한혈액및소변검체분리 E. coli를대상으로항균제감수성자료를분석하였다. 또한지역별, 권역별, 의뢰병실별및검체별로 ESBL 생성세균의분리빈도, AmpC b-lactamase 생성균주의비율, fluoroquinolone 내성균주의비율을파악하였다. 제 3 세부과제 : 국내전지역병원의환자로부터분리된장구균을대상으로항균제내성양상파악및내성균의유전적균형분석을실시하고, 병독성인자를검출분석하였다. 제 4 세부과제 : 전국 10개의료기관에서수집한혈액및소변검체분리 S. aureus를대상으로항균제감수성자료를모으고, MRSA에효과적인 vancomycin, linezolid, quinupristin/dalfopristin 등신약을포함하여감수성검사를실시하였다. 항균제감수성시험결과는원내감염과원외감염, 혈액과소변분리주로나누어해석하였다. 분자역학적상관성규명을위해 SCCmec 타이핑과 pulsed-field gel electrophoresis 분석을실시하고, MLS B 에의한 clindamycin 내성유무를확인하였다. - 2 -
Project Summary Title of Project The status and mechanisms of antimicrobial resistance in clinical bacterial isolates from bacteremia and urinary tract infection Key Words Anitimicrobial resistance, Bacteremia, Urinary tract infection, Nationwide surveillance, Molecular epidemiology Institute Seoul National University College of Medicine Project Leader Eui-Chong Kim Project Period 2005.4. 26. - 2006. 1. 25. The aim of this study is to determine the nationwide prevalence of antimicrobial resistance among major causative bacteria of bacteremia and urinary tract infection in Korea, and to investigate the resistance mechanisms of these bacteria. The first sub-project: The rates of resistance to various important antimicrobials in major organisms (S. aureus, E. faecalis, E. faecium, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa) were determined. These bacteria were isolated from blood or urine specimens of patients in ten university hospitals during a period of six months (from April 2005 through September 2005). The second sub-project: The antimicrobial susceptibility test results of blood- or urine-isolates of E. coli were analyzed. These E. coli strains were collected from ten university hospitals distributed nationwide. The rates of ESBL-producing strains, AmpC beta-lactamase-producing strains, and fluoroquinolone-resistant strains were determined and analyzed according to the districts, patient locations in the hospital, and the specimen types. The third sub-project: The enterococcal blood- or urine-isolates from ten university hospitals distributed nationwide were examined by antimicrobial susceptibility testing (AST) and pulsed field gel electrophoresis (PFGE). The virulence factors of Enterococcus species were detected and investigated by PCR. The fourth sub-project: The blood- or urine-isolates of S. aureus were examined by AST that includes vancomycin, linezolid, and quinupristin/dalfopristin. These S. aureus strains were also collected from the ten university hospitals. The AST results were discussed according to the nature of infection (nosocomial or community-acquired, bacteremia or urinary tract infection). SCCmec typing, and PFGE were performed to determine the molecular epidemiology, and the in vitro ability of erythromycin to induce clindamycin in staphylococcal isolates was tested. - 3 -
총괄및제 1 세부연구과제 균혈증및요로감염을일으키는주요원인균의내성실태 세부과제연구기관 : 서울대학교의과대학 세부과제책임자 : 김의종 - 4 -
목 차 제 1 장 서론 6 제 2 장 국내 외기술개발현황 14 제 3 장 연구개발수행내용및결과 15 제 4 장 연구개발목표달성도및대외기여도 27 제 5 장 연구개발결과의활용성과및계획 28 제 6 장 기타중요변경사항 29 제 7 장 참고문헌 29-5 -
제 1 장 서론 제 1 절미생물의항생제내성기전 세균이정상적으로원래부터갖고있는항생제내성을본태성내성 (intrinsic resistance) 이라고한다. 본태성내성의대상이되는항생제의종류는세균의종류에따라다른데, 이경우세균이동정되면굳이항생제감수성검사를하지않아도내성을갖는항생제를미리알수있다. 예를들면대부분의그람음성간균은본질적으로 vancomycin에대해내성이며, 그람양성구균은 aztreonam에대하여내성을갖는다. 세균이유전자의돌연변이또는플라스미드의획득을통하여갖게되는항생제내성을후천성내성 (acquired resistance) 이라고한다. 후천성내성은본태성내성과는달리균종이동일하더라도어떤특정한균주안에서만전달되는특징이있다. 따라서후천성내성은미리예측할수없기때문에항생제감수성검사가반드시필요하다. 최근내성의확산이심각한이유중하나는플라스미드또는트란스포존에들어있는인테그론 (integron) 이라는구조로인하여여러종류의내성유전자들이함께전달될수있기때문인것으로알려졌다. 예를들면, 1999년이전에는 ESBL 유전자가인테그론에있음이보고된바없었는데, 최근 VEB-1 과 GES-1 유전자가인테그론에있음이보고되어, 이러한내성유전자가확산될것이염려된다. 우리나라에서도 imipenem에대해내성인 Pseudomonas와 Acinetobacter baumannii 균종중에서 VIM-2 유전자가들어있는인테그론이적지않게발견된바있다. 1. 베타락탐계항생제내성 베타락탐계항생제에대한후천성내성은대부분베타락탐분해효소 (β-lactamase) 를세균이생산하기때문이며, 일부균주에서는세포벽의주요성분인 penicillin-binding protein (PBP) 의구조에변화를일으켜베타락탐계항생제가결합하지못함으로써내성을획득한다. 또한그람음성균의경우외막단백의변화로인하여항생제가통과하지못하거나세균내부로들어온항생제를강력하게세균밖으로퍼냄으로써내성을유지하기도한다. 모든 PBP와대부분의베타락탐분해효소는서로연관되어진화되고있으며, 베타락탐계항생제와반응할수있는 active-site serine peptidase에속하는단백이다. 베타락탐분해효소와 PBP는페니실린뿐만아니라다른베타락탐계항생제의 cyclic amide bond를끊는다. 이반응에관련된단백은 β -lactamase, 저분자 PBP (low-molecular-weight PBP; D,D-carboxypeptidase) 와고분자 PBP (high-molecular-weight PBP; transpeptidase- transglycosylase) 의세종류로나눌수있다. 이중에서저분자 PBP와고분자 PBP의활성은베타락탐계항생제에의해억제되기때문에베타락탐계항생제를파괴할수없다. PBP와 β-lactamase는베타락탐계항생제를분해하는속도에서서로큰차이를나타낸다. β-lactamase는베타락탐계항생제를완벽하게파괴하지만, PBP는매우느린속도로베타락탐계항생제에작용하여거의베타락탐계항생제를파괴하지않는다. 가. PBP 의변화에의한내성 고분자 PBP가변화하여페니실린에대해내성이생기는것은그람음성균보다그람양성균에서더흔하게관찰된다. 거의모든세균은세포막의외벽에 3종류내지 8종류의 PBP를갖고있다. PBP들은분 - 6 -
자량의순서에따라일련번호를매긴다. 동일한번호의 PBP일지라도균종이다르면동일한 PBP가아니다. 세균마다 2개내지 4개의 PBP는세균의생존을위하여필수적이기때문에베타락탐계항생제는강력하게세균을죽일수있다. (1) 그람양성균 메티실린내성황색포도구균 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA) 은페니실린계, 세팔로스포린계, 카바페넴계와모노박탐계항생제를포함하는모든베타락탐계항생제에대하여내성이다. S. aureus가메티실린내성을획득하는기전은 staphylococci 이외의다른균종에서는찾아볼수없는매우특이한기전으로서, 베타락탐계항생제에세균이노출되면정상적으로존재하는 4 개의 PBP 이외에베타락탐계항생제와반응하지않는새로운 PBP를생성할수있는유전자를획득함으로써메티실린에대하여내성으로된다. MRSA에서관찰되는베타락탐계항생제와반응하지않는 PBP는염색체 DNA의 meca 유전자에의해인코딩되며, 이를 PBP 2a라고한다. 이유전자는 Staphylococcus의다른균종에서도널리발견되며, 이들의염기서열은서로큰차이가없이잘보존되어있다. MRSA는모든베타락탐계항생제에대하여강력한내성을갖고있지만균주들은전부 (homogeneously) 또는일부만 (heterogeneously) 내성일수있다. 후자의경우대부분의세균은메티실린에대해약한내성을보이나, 소수의세균이강한내성을갖는다. 유전자 meca는 ph, 온도, 삼투압, 조절유전자등과같은여러요인에의해영향을받는다. PBP 2a는그생성기전에따라즉시유도형 (immediately inducible), 지연유도형 (delayed inducible) 및본질형 (constitutive) 의세가지유형으로나눌수있다. 즉시유도형을생성하는균주에는 β-lactamase (bla) 오페론을갖는플라스미드가존재한다. meca의 promotor는 blaz의 promotor와염기서열이유사하기때문에 meca는플라스미드에있는유전자에의해조절될수있다. 지연유도형을생성하는균주는 meci와 mecri 유전자를갖고있어 meca 를조절한다. 이균주는느리게내성을발현하기때문에내성유무를알기가어려워임상적으로문제가될수있다. 이경우내성을완전히발현시키려면메티실린이함유된배지에서 48시간까지연장하여배양해야한다. mec locus를형성하는 meca, meci와 mecri 이외에도이들과는별개로메티실린내성에관여하는유전자가있다. 이유전자는메티실린내성유무에관계없이모든 S. aureus의염색체 DNA에존재하는데, fem (factors essential for expression of methicillin resistance) 라고한다. fema와 femb는 PBP 2a 의합성에전혀관여하지않지만, peptidoglycan의형성에관여한다. 만일 fema 또는 femb가손상되어있으면 peptidoglycan 중 glycine 양이감소되어메티실린에대해감수성이된다. Streptococcus pneumoniae에서 β-lactamase는존재하지않으며, 베타락탐계항생제에대한내성은 6 개의 PBP들 (1a, 1b, 2a, 2x, 2b, 3) 중에서주로 PBP 2의변화로인하여획득된다. 페니실린에대해감수성인균주들은염색체 DNA의 pbp 유전자가잘보존되어있지만, 페니실린내성균주는 pbp 2x 또는 2b 유전자에서변화를보인다. 페니실린은주로 PBP 2X와반응하고 PBP 2b와는잘반응하지않기때문에 pbp 2b 유전자의변화를일으킨균주는페니실린에대해내성이거나감수성일수있다. Enterococcus faecalis와 E. faecium은처음부터 PBP 5가페니실린과거의친화성 (affinity) 이없기때문에이균종들은페니실린에대해본태성내성을갖고있다. 특히 E. faecium은 PBP 5를다량으로생산하기때문에강력한내성을갖는다. (2) 그람음성균 그람양성균과는달리그람음성균에서는 PBP 의변화가흔하지않다. 그러나 Pseudomonas - 7 -
aeruginosa, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae와같은몇개의균종에서 PBP 변화로인한내성기전이보고되었다. 나. β-lactamase 로인한내성 β-lactamase는그종류가매우많기때문에유사한것끼리묶어서분류를한다. 여러분류법중에서대표적인분류법은분자생물학적인분류법으로서 A, B, C, D의네그룹으로분류한다. 또한 Bush는 β -lactamase를기능에따라분류하였는데 1, 2a, 2b, 2be, 2br, 2c, 2d, 2e, 2f, 3, 4의 11 종류로분류하였다. A 그룹은일반적으로 β-lactamase inhibitor에의해활성이억제되는효소들인데 S. aureus의 β -lactamase (Bush 2a) 와그람음성균의플라스미드에있는 TEM 형및 SHV 형과같은 β-lactamase (Bush 2b, 2be) 가 A 그룹에속한다. 그람음성균에서 C 그룹 (Bush 1) 에는 AmpC 효소와같은염색체의 cephalosporinase가있고, D 그룹 (Bush 2d) 에는 oxacillin을가수분해하는효소 (OXA) 가있다. B 그룹 (Bush 3) 은 Zn 2+ 가필수적인효소들이다. Penicillin을처음사용하자마자 β-lactamase를생성하는 S. aureus가출현하여널리확산되었다. 이효소는 A 그룹에속하며오랜세월이흘렀으나진화가되지않았기때문에아직까지강력한내성을나타내지않아서이효소를생성하는 S. aureus는 penicillin에대하여내성이지만 methicillin, cephalosporin과 carbapenem에대해감수성이다. Ampicillin은 E. coli에작용할수있는최초의 penicillin계항생제이었다. 현재 E. coli의 30-50% 가 β-lactamase를생성함으로써 ampicillin에대해내성을갖는다. 그람음성균에서는여러종류의 β -lactamase가발견되지만 E. coli에서는 TEM-1이가장흔하고, Klebsiella pneumoniae에서는 SHV-I이주로발견된다. 이효소들은그유전자가플라스미드에있으며페니실린계와 1세대세파계항생제를강력하게파괴하지만, cefotaxime, ceftazidime, cephamycin, monobactam과 carbapenem에대한파괴력은거의없다. AmpC 와는달리이효소가다량으로생성되더라도항생제의파괴력이확장되지않는다. Staphylococci에서 β-lactamase는오랜시간이흘렀어도거의변화하지않았지만, 이와대조적으로그람음성균의 TEM 형과 SHV 형 β-lactamase는빠르게진화하여파괴할수있는베타락탐계항생제의종류가크게늘어났다. 이효소를 extended-spectrum β-lactamase (ESBL) 이라고하며 3세대세파계와 monobactam을파괴한다. 그러나 cephamycin (cefoxitin, cefotetan) 과 carbapenem (imipenem, meropenem) 은파괴하지않는다. 1990년이후에 β-lactamase inhibitor에의해억제되지않는강력한 β -lactamase가출현하였고, 이효소는주로 TEM-1의변형이며 SHV-1의변형인경우는드물다. 이효소는 ESBL이아니고, Bush의분류에따라 2br 그룹으로새로분류되었다. ESBL은주로 TEM과 SHV의변형이지만, 다른종류의 β-lactamase가변형되어생길수있다. 예를들면 P. aeruginosa의경우 D 그룹에속하는 OXA (oxacillin-hydrolyzing) 효소가변형되어 ESBL이되었다. ESBL의아형은매우다양하여 2001년 4월현재 88 종류의 TEM (23 inhibitor-resistant TEM 포함 ), 31 SHV 및 9개의 OXA형 ESBL이보고되었고, 그외 CTX-M형및 PER형의 ESBL이있다. 효소의종류에따라 cefotaxime, ceftazidime 및 aztreonam의내성정도가다르다. 예를들면, TEM-52를포함한많은 TEM형효소와 CTX-M형 ESBL은 cefotaxime에대한내성이높고, SHV-12와 SHV-5 등의 β-lactamase는 ceftazidime에대해고도내성을보인다. 우리나라에서가장흔한 ESBL 아형은 TEM-52 이며, 그외 SHV-2a, SHV-12 등과 CMY-1이비교적자주발견된다. 그외에도최근우리나라에서 TEM-88, CTX-M-14, TEM-15 ESBL을생산하는균주가발견되었다. Salmonella와 Klebsiella를제외한거의모든 family Enterobacteriaceae와 P. aeruginosa는염색체유전자에인코딩된 cephalosporinase인 AmpC 효소를정상적으로생산한다. 이효소는 C 그룹에속하며, - 8 -
균종에따라효소의생화학적성상이크게다르다. Enterobacter cloacae와 Citrobacter freundii는베타락탐계항생제, 특히 cefoxitin, imipenem과 clavulanic acid에의해유도 (induction) 되어 AmpC 효소를생산한다. 이효소는 cefoxitin과 clavulanic acid를파괴하지만 imipenem을파괴하지않는다. 이균종은평상시에는극소량의 AmpC를생상하지만베타락탐계항생제가존재하면효소의생산량이수백배로증가한다. 최근플라스미드가매개하는 AmpC 효소를갖는 E. coli와 K. pneumoniae가증가하고있다. 플라스미드매개 AmpC형효소로서, 우리나라균주에서처음발견된 CMY-1을비롯하여 CMY-2, MOX-1, FOX-1, MIR-1, BIL-1, LAT-1 등이있다. 플라스미드매개 AmpC형효소를생산하는균주는 cefoxitin 등 cephamycin에대해내성을보이고, clavulanic acid에의해상승효과를나타내지않으므로 double disk synergy test나 ESBL 확진검사에서음성이다. 2. 아미노글라이코사이드계항생제내성 아미노글라이코사이드는 streptococci와 enterococci를제외한호기성그람음성간균과그람양성구균에대해강력한항균효과를갖는다. 세균안으로항생제가침투하지못하여본태성내성을갖기도하지만주로분해효소유전자가인코딩되어있는플라스미드를획득함으로써후천성으로내성이된다. 또한리보솜의변형을일으키거나또는항생제의흡수를차단할수있는염색체유전자의돌연변이에의해서도내성이된다. 아미노글라이코사이드를파괴할수있는효소는플라스미드또는트란스포손에인코딩되어있다. 세균안으로침투한항생제만을파괴하기때문에배지중에함유된항생제에는영향을주지않는다. 아미노글라이코사이드분해효소는 acetyltransferase (AAC), adenyltransferase (ANT) 와 phosphotransferase (APH) 의세종류로나눌수있다. 이중에서수산기를인산화하는 APH가고도내성 (high-level resistance) 을갖는다. 각종류마다작용하는위치에따라다시분류를한다. 예를들면 AAC의경우 3, 2 또는 6 위치에서아미노기를아세틸화하는효소를각각 AAC(3), AAC(2') 또는 AAC(6') 으로각각명명하였다. 또한분해할수있는항생제의종류에따라다시로마자를첨부한다. AAC(3)-I는 gentamicin에대해내성을나타나게하며, AAC(3)-II는 gentamicin, netilmicin과 tobramycin에대해, AAC(3)-III는 gentamicin, tobramycin과 kanamycin에대해작용한다. 동일한기능을갖지만서로다른 isoenzyme인경우 a, b 등으로표기한다. 예를들면 AAC(6')-Ia와 AAC(6')-Ib를들수있다. Staphylococcus와 Enterococcus에서발견된 aac(6')-ie 유전자는 AAC(6') 과 APH(2") 의기능을둘다갖는효소를인코딩한다. AAC(6') 은 tobramycin, netilmicin, kanamycin과 amikacin에대해내성을보이나 gentamicin에는작용하지않는효소이다. APH(2") 은 gentamicin, tobramycin과 kanamycin을파괴한다. 따라서이중기능을갖는효소를인코딩한유전자를갖고있는 staphylococci와 enterococci는 gentamicin에대해고도내성을보이며, streptomycin을제외한모든아미노글라이코사이드에대해내성을보인다. 그람양성균은아미노글라이코사이드분해효소중에서이중기능을나타내는 AAC(6') + APH(2") 효소를가장흔하게갖고있다. 3. Macrolide, Lincosamide, Streptogramin B 내성 그람음성균은 macrolide. lincosamide와 streptogramin B (MLS B ) 항생제가세균안으로침투되지않기때문에 MLS B 에대해본태성내성을갖는다. MLS B 에속하는항생제들은화학구조가서로다르지만유사한작용을나타낸다. 즉세균의 50S 리보좀에결합하여단백합성을방해한다. 일반적으로 MLS B 내성은 erm (erythromycin resistance methylase) 유전자를획득하기때문이며, 이유전자는 23S rrna의아데닌기를메틸화하는효소를인코딩한다. 리보솜이메틸화되면리보솜구조의변화를일으켜모든 - 9 -
MLS B 항생제의친화력이크게떨어진다. erm 유전자는크게 4 종류, erma, ermc, ermam, ermf로분류한다. 유도성내성을갖는 staphylococci는 14형 macrolide (erythromycin, roxithromycin) 와 15형 macrolide (azithromycin) 에대하여만내성이고, 16형 macrolide (spiramycin, josamycin), lincosamide와 streptogramin B에대하여는감수성이다. 14형과 15형 macrolide만메틸화효소의합성을유도할수있기때문에이런현상을 해리내성 (dissociated resistance) 이라고한다. 이와는다르게 streptococci의경우모든 MLS B 항생제가효소합성을유도할수있기때문에 streptococci는모든 MLS B 항생제에대해교차내성 (cross resistance) 을갖는다. Staphylococci에서 MLS B 내성은흔히 ermc 유전자를함유한작은플라스미드에의해전달된다. 또한 S. pneumoniae를제외하고모든 streptococci에서 MLS B 내성플라스미드를관찰할수있다. 대부분의 S. pneumoniae의 MLS B 에대한내성은염색체유전자에삽입된트란스포손 Tn1545에의한것이다. 4. Tetracycline 내성 Tetracycline에대한내성은자연계에서가장흔하게관찰되는항생제내성이다. 염색체돌연변이로인한투과력의감소가내성의원인이되기도하지만, 능동유출 (active efflux) 또는리보솜방어와관계되는유전자를외부에서획득하여내성을갖게되는것이더흔한기전이다. Tetracycline을세균안으로들어오게하는 OmpF (outer membrane porin) 단백을인코딩하는유전자가돌연변이를일으키면 OmpF가생성되지않아 tetracycline은물론베타락탐, 클로람페니콜과퀴놀론에대해내성이된다. 더구나 tetracycline 또는 chloramphenicol에세균이노출되면고도내성을나타내는유전자에돌연변이가일어나구조적으로전혀다른항생제에대하여도내성을보인다. 이유전자시스템을 MAR (multiple antibiotic resistance) 이라고하며 marrab 오페론이관여하며, OmpF porin 단백은이시스템중의일부이다. 앞서말했듯이 marrab 오페론은 tetracycline과 chloramphenicol에의해조절된다. mar 유전자는 Salmonella, Shigella, Klebsiella, Citrobacter, Hafnia, Enterobacter에서발견되었다. 또다른내성기전은능동유출인데, 세균안으로들어온항생제를능동적으로퍼냄으로써 tetracycline에대해내성이된다. 항생제의유출에관여하는단백을 Tet membrane protein이라고한다. Tetracycline의능동유출에관여하는유전자는 8 종류가있는데, 그람음성균에서는 tet(a) 부터 tet(e) 까지있고, tet(p) 는 Clostridium spp. 에만있다. tet(k) 와 tet(l) 은그람양성균에서만관찰된다. Tetracycline에대한내성의세번째기전은리보솜을항생제로부터보호하는것이다. Tetracycline 은 30S 리보솜의 A와 P 위치에작용하여 trna의친화력을감소시킴으로써세균을억제한다. 리보솜과반응하는새로운단백을생성하여내성이된다. 리보솜을보호하는유전자는 5 종류 (M, O, P, Q, S) 가있다. tet(m) 은그람음성및그람양성세균뿐만아니라 mycoplasma와 ureaplasma에서도관찰된다. 5. Sulfonamide 및 trimethoprim 내성 몇개의아미노산과퓨린을합성하려면 tetrahydrofolate (THF) 가필수적이다. 더구나 THF는 thymidylate의합성에관여한다. 포유류는음식으로부터 folate를섭취하지만, 세균은반드시자신이 THF를합성해야한다. Dihydropteroate synthase (DHPS) 가 p-aminobenzoic acid (PABA) 에작용하여 dihydropteroic acid를만들고이는다시 glutamic acid와반응하여 dihydrofolic acid가된다. Dihydrofolic acid는 dihydrofolate reductase (DHFR) 에의해 THF가된다. Sulfonamide는 PABA와유사하여 DHPS 효소를억제하며, trimethoprim은 DHFR 효소를억제한다. - 10 -
가. 본태성내성 P. aeruginosa에서는 sulfonamide와 trimethoprim이세균의외막을투과하지못하여본태성내성을나타낸다. Trimethoprim에대한친화력이떨어진 DHFR 효소를갖고있어 trimethoprim에대해본태성내성을보이는균종에는 Neisseria, Clostrdium, Brucella, Bacteroides, Moraxella catarrhalis, Nocardia 등이있다. Enterococcus와 Lactobacillus는외부로부터 folate를이용할수있기때문에이균종에서는 sulfonamide와 trimethoprim의항균효과가떨어진다. 나. Trimethoprim 내성 DHFR 유전자 fola에서돌연변이가일어나변형된 DHFR 효소가다량생산되면 trimethoprim에대해내성이된다. 이러한염색체 DNA의돌연변이로인한내성뿐만아니라플라스미드가전달하는내성기전이알려졌다. Family Enterobacteriaceae에서는 DHFR 기능을나타내는유전자를함유한플라스미드를세균이획득하면내성으로변한다. 현재까지그람음성균에서는 16 종의 DHFR 효소들이밝혀졌으며, 그람양성균에서는 S1과 S2, 두가지만밝혀졌다. 가장널리퍼져있는효소는 DHFR type I으로서, 이에해당하는유전자는트란스포손 Tn7에위치한 dhfr1 유전자이다. Salmonella typhimurium과 Shigella spp. 에서는 type III DHFR이발견되며이는플라스미드보다염색체에존재한다. 다. Sulfonamide 내성염색체의돌연변이로인하여 PABA를과잉생산하게됨으로써 sulfonamide에대해내성을나타내는경우가 Neisseria와 S. aureus에서보고되었다. E. coli, S. pneumoniae와 N. meningitidis에서의내성은 DHPS 효소를인코딩하는 dhps 유전자의변화에기인한다. 또한내성 DHPS 효소의유전자를함유한플라스미드를획득함으로써 sulfonamide에대해내성으로된다. 그람음성균에서는 type I과 type II, 2 종류의내성 DPHS 효소가발견되었으며, 이들은각각 suli과 sulii 유전자에인코딩되어있다. suli 유전자는커다란접합형플라스미드안에있는 Tn21의인테그론 (integron) 에존재하면서다른내성유전자와거의항상연관되어있다. sulii 유전자는 streptomycin에대한내성과흔히연관되어있다. 6. Quinolone 내성 세균의염색체 DNA가복제를하기위해서는 DNA의이중나선이제대로풀어져야하는데이역할을하는효소가 type II DNA topoisomerase인 DNA gyrase이다. 이효소는 A와 B 단백이 2 개씩합쳐 A 2 B 2 의 tetramer 형태이며, 이단백을인코딩하는유전자는각각염색체에있는 gyra와 gyrb이다. Quinolone이일차적으로반응하는단백은 A 단백이며, 이중나선의 DNA가풀어지고 DNA gyrase가결합하면 quinolone이작용하게되어풀어진 DNA를다시붙을수없게만든다. 최근에새로운효소인 topoisomerase IV가발견되었고, 이효소도 quinolone의표적이됨이보고되었다. 이효소는 parc와 pare 유전자에인코딩된다. DNA gyrase와 topoisomerase IV는세균의증식을위하여필수적인효소이기때문에 quinolone은당연히살균 (bactericidal) 항생제이다. 그러나이효소의유전자에돌연변이가일어나면 quinolone에대해내성이된다. gyra 유전자에서일어나는돌연변이는 130-bp 안에국한되어있어서, 이부위를 quinolone resistance-determining region이라고한다. 그람음성균에서 quinolone의주된표적은 topoisomerase IV가아니라 DNA gyrase이다. 따라서그람음성균에서는 gyra의돌연변이가 parc에서보다먼저생긴다. 그러나그람양성균에서는 fluoroquinolone의주요표적이 topoisomerase IV이기때문에 parc 유전자의돌연변이가먼저생기게된다. 따라서 ciprofloxacin에대한내성인 S. aureus와 S. pneumoniae에서는 parc 유전자의돌연변이를 gyra에서보다먼저발견하게된다. - 11 -
7. Chloramphenicol 내성 Chloramphenicol은 70S 리보솜의 50S 단백과결합하여세균의단백질합성을방해한다. 그람양성균과그람음성균에서 chloramphenicol에대한내성은거의모두 chloramphenicol acetyltransferase (CAT) 효소를인코딩하는 cat 유전자가함유된플라스미드를획득하였기때문이다. 이효소는강력하게 chloramphenicol을분해할수있다. S. aureus에서발견되는 CAT는전기영동의양상에따라 A, B, C, D, pc194의다섯종류로나눌수있다. 그람음성균에서는 type I, II, III의세가지 CAT가발견되었다. 8. Glycopeptide 내성 Glycopeptide 항생제인 vancomycin과 teicoplanin은 peptidoglycan의전구체에결합하여 peptidoglycan의합성을방해한다. 그람음성균에서는큰분자의소수성 (hydrophobic) 인 glycopeptide가세균내부로침투하지못하기때문에그람음성균은본질적으로 glycopeptide에대하여내성을보인다. 그람양성균에서본질적으로내성을보이는균종은 Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Erysipelothrix rhusiopathiae이다. 후천성내성을보이는균종은 Enterococcus와 Staphylococcus이다. 특히 Enterococcus에서내성기전이잘밝혀졌으며, 이균종의후천성내성은 VanA와 VanB로나눌수있다. VanA형은 vancomycin과 teicoplanin에대해모두고도내성을나타내는형을말하며, 주로 E. faecium과 E. faecalis에서발견된다. 이유전자는 11-kb 크기의트란스포손인 Tn1546에존재하여, 접합을통하여감수성인균주에게로전달될수있다. VanB 형은 vancomycin에대한최소억제농도가 4 - >1,024 ug/ml이며 teicoplanin에대해감수성인형을말하며, 주로 E. faecium과 E. faecalis에서발견된다. Enterococcus spp. 중 3 균종, 즉 E. gallinarum, E. casseliflavus와 E. flavescens는 glycopeptide에대해본질적으로내성이다. 이들은 vancomycin에만약한내성을보이며, VanC 형이라고한다. 제 2 절연구개발의필요성 Penicillin이발견된이후지난 50여년동안수없이많은종류의항균제가개발되어임상에이용되고있다. 항균제에대한세균의내성현상은 penicillin 발견직후에이미알려졌으며이후이들항균제에대한내성균주가점차증가하고있어심각한문제가되고있다. 특히내성문제가심각한것으로그람양성구균중에는 methicillin 내성및 vancomycin 비감수성 Staphylococcus aureus (MRSA 및 VISA), vancomycin 내성 enterococci (VRE) 등이고, 그람음성간균중에는 extended-spectrum β-lactamase (ESBL) 또는플라스미드성 AmpC β-lactamase 생성 Escherichia coli와 Klebsiella pneumoniae, carbapenem 내성 Pseudomonas aeruginosa와 Acinetobacter baumanii 등이다. 임상적으로접하게되는여러가지감염증가운데균혈증과요로감염증은가장흔하고중요한것중하나이다. 균혈증은최대한빨리적절한항균제치료를시작하지않으면치명적인결과를초래할수있는중한감염증이다. 혈액배양에서분리되는균혈증의원인균으로가장흔한것은 E. coli, K. pneumoniae, S. aureus, P. aeruginosa, Enterococcus species 등이있다. 이들은균혈증뿐아니라다른여러가지감염증의주요원인균이며, 특히 E. coli는요로감염증에서가장흔히분리되는균이다. 이들균종은병독성이높은데다가앞서언급한것과같이여러가지항균제에대한다제내성이흔하여심각한임상적문제를많이야기할수있다. 요로감염은균혈증만큼심각한감염증은아닐지라도훨씬흔하여지역사회획득감염증중호흡기감염에이어두번째를차지하고, 이때문에전체항균제의약 15% 가사용된다고한다. 특히가장 - 12 -
흔한균혈증의일차병소라는점에서요로감염은결코경미한감염증으로취급될수없다. 또한도뇨관삽입등과관련된원내감염의형태로도흔하게발생하며이경우지역사회획득요로감염과는다른원인균종분포및항균제내성양상을보인다. 이처럼균혈증과요로감염은임상적으로중요한문제가되는감염이며그주요원인균들에서항균제내성이흔함에도불구하고, 현재국내에서는원인균별내성률조사와내성기전에관한연구가전국적으로광범위하고철저하게수행되지않았고, 지역간전파에관한조사도충분히이루어져있지는않은실정이다. 따라서본연구의목적은전년도에이어일차적으로균혈증과요로감염의원인균에대한내성률조사와내성기전연구를통하여주요원인균에대한항균제내성실태를파악하고감시체계를구축하는것이며, 궁극적으로는국내항균제내성실태를파악하고올바른항균제사용을유도함으로써내성률을감소시키는것이다. - 13 -
제 2 장 국내 외기술개발현황 외국의경우 European Union, Federal Drug Authority (FDA), House of Lords Select Committee on Science and Technology of the House of Lords 및 World Health Organization 등은항균제내성세균증가의심각성을염려하여광범위한내성양상조사를요구하고있다. 미국의 Centers for Disease Control and Prevention (CDC) 은 2000년 FDA와함께 "Public Health Action Plan" 을발표하고항균제내성세균과의전쟁을선포한바있다. 더욱이최근국가적인지원에힘입어국제적인 surveillance study가진행되고있다. 대표적인예로서, Alexander Project는하부호흡기감염환자분리주를대상으로, European Antimicrobial Resistance Surveillance System은임균내성을, National Antimicrobial Resistance Monitoring System은주요내성균을중심으로, SENTRY와 The Surveillance Network는광범위한균종을대상으로항균제내성양상을조사하고있다. 국내의경우는일부대학병원에서주요세균의항균제내성률을간헐적으로발표하고있으며, 전국적인내성률조사로는연세대학교의과대학세균내성연구소주관하에 1997년에구성된 Korean Nationwide Surveillance of Antimicrobial Resistance (KONSAR) group이전국 71개대학병원및종합병원에서분리된주요세균의항균제내성양상을매년정기적으로조사분석하고있다. 그러나균혈증및요로감염에대해서는임상적으로중요한감염증인경우나현재까지중요감염균에관한병원내의분포상황등만이보고되었을뿐국내전지역에서분리된주요원인세균에대한항균제내성양상및내성기전에관한연구는별로없다. 특히지역간균주의유전적상관성에관한연구도보고된바없어국내감염균의전파양상도잘알수없는실정이다. - 14 -
제 3 장 연구개발수행내용및결과 제 1 절연구내용 2005년 4월부터 9월까지 6개월동안전국 10개대학병원 ( 서울 3개, 경기 1개, 강원 1개, 충청 1개, 호남 1개, 영남 3개 ) 환자의혈액및요검체에서분리된세균에대하여균종, 분리된균주수및항균제별내성양상과내성률을각연구기관별로조사하였다. 대상균주는 2004년연구에서균혈증및요로감염의주요원인균으로조사되었던 S. aureus, E. faecalis, E. faecium, E. coli, K. pneumoniae 및 P. aeruginosa으로하였고, 각연구기관에서조사된자료를총괄연구기관이수집및분석하여대상균주의주요항균제내성률을산출하였다. 또한 E. coli, Enterococcus species (E. faecalis와 E. faecium), S. aureus는 10개공동연구기관에서 2005년 4월부터 20-40주씩 ( 입원및외래환자에서각각연속분리주 5-10주씩혈액및요검체별로수집 ) 총 200-400개균주를총괄기관이취합하였다. 오염균이아닌감염증 ( 균혈증또는요로감염 ) 의원인균인것만을선택하기위해각연구기관에서균주수집시해당환자의의무기록을검토하여가능한한다음과같은요건을충족시키는경우에수집하도록하였다. - 혈액분리주 : 임상적으로발열, 오한등이 8시간이상나타나는감염의소견과함께 1번이상의혈액배양에서균이검출된경우 - 소변분리주 : 발열, 빈뇨, 요급박, 배뇨곤란, 옆구리통증, 하복부및치골상부통증등의급성요로감염증상이있으면서, 소변검사상백혈구수가 5/HPF 이상이고, 요배양에서 10 5 CFU/mL 이상의세균집락이배양된경우이렇게수집된균주들을각세부과제별로적절히분배하여해당세부과제연구기관은각균종의항균제내성기전및유전적상관성규명연구를수행하였다 ( 세부과제별수행연구내용은아래표참조 ). 세부과제의연구제목및책임자 연구과제세부연구분야책임자 ( 연구기관 ) 제 1 세부균혈증및요로감염을일으키는주요원인균의내성실태김의종 ( 서울의대 ) 제 2 세부 제 3 세부 제 4 세부 Escherichia coli의내성기전및지역간균주의유전적상관성조사 Enterococcus species의내성기전및지역간균주의유전적상관성조사 Staphylococcus aureus의내성기전및지역간균주의유전적상관성조사 용동은 ( 연세의대 ) 이위교 ( 아주의대 ) 김미나 ( 울산의대 ) 제 2 절연구방법 1. 항균제내성률조사연구참여기관은총 10개기관으로서울, 경기, 강원, 충청, 영남, 호남지역에있는대학병원이었다. 항균제내성률은각연구참여기관의혈액및소변검체에서 2005년 3월부터 8월까지 6개월동안분리된주요원인균의항균제내성양상을검체의종류별 ( 혈액, 소변 ) 및의뢰처별 ( 입원, 외래 ) 로분석하였 - 15 -
다. 내성자료는중복분리주를가능한한제외하고한환자당균종별로맨처음분리된균주하나씩만 ( first isolate only") 추려정리하였다 (Table 1-5). 항균제감수성시험결과는각기관에서시험하여얻은자료를이용하였고, 시험방법은 CLSI의디스크확산법또는 commercial system의액체배지희석법을사용하였다. 최근 CLSI에서는 MRSA 검출시시험항균제로 oxacillin 보다 cefoxitin을권장하고있어 S. aureus의항균제감수성검사에서 oxacillin 대신 cefoxitin을사용한기관의경우 oxacillin 내성률대신 cefoxitin 내성률을통계에포함시켰다. 2. 주요내성균의항균제내성기전및유전적상관성규명 E. coli, Enterococcus species, S. aureus을상기연구내용부분에서서술한바대로각연구참여기관으로부터수집한후각세부과제별로분배하여항균제내성기전및유전적상관성규명연구를수행하였다 ( 자세한내용은각세부과제연구결과부분참조 ). 제 3 절연구결과 전반적으로입원환자검체분리주보다외래검체분리주에서, 혈액분리주보다소변분리주에서항균제내성률이높은경향을보였다. 외래검체분리주에서보다낮은내성률을보이는것은지역사회획득감염균을포함하기때문으로생각되었다. 소변분리주에서보이는높은내성률은대개요로감염을가진환자들은만성적인경과를보이는경우가많아외래검체에서분리되었지만대부분의환자들이반복또는지속적인치료력을가지고있기때문으로해석되었다. 1. S. aureus와 Enterococcus species (Table 1, 2) S. aureus, E. faecalis, E. faecium 세균종모두혈액분리주들과소변분리주들사이에주요항균제들에대한내성률에있어서큰차이는없었다. 그러나전반적으로입원검체에서분리된균주들이외래검체 ( 응급실의뢰검체포함 ) 에서분리된것들보다여러항균제에대한내성률이높은경향이뚜렷하였고, 혈액분리주보다는소변분리주에서내성률이높은경향을보였다. S. aureus는 penicillin 에대한총내성률이혈액분리주와소변분리주모두약 95% 정도였으며, 입원검체에서분리된균주들이외래검체에서분리된것들보다내성률이약 5% 정도씩높았다. 원내감염균으로서매우중요한위상을차지하는 MRSA (oxacillin 또는 cefoxitin 내성률 ) 는혈액과소변에서각각 71.6%, 66.4% ( 총내성률 ) 로모두 2004년의내성률보다높아졌으며, 특히혈액분리주는 2004년의 61.2% 에서 71.6% 로 10% 가량높은내성률을보였다. 미국국가병원감염감독위원회 (National Nosocomial Infections Surveillance System, NNIS) 가보고한 2003년미국의중환자실환자들에서분리된 S. aureus 중 MRSA의비율은 59.5% 로비록혈액또는소변분리주만을대상으로한것은아니지만국내의경우보다현저히낮은빈도를보였다 (A report from NNIS system). 의뢰처에따른 oxacillin ( 또는 cefoxitin) 내성률은입원검체의경우가외래보다혈액과소변이각각 15.9%, 40% 더높았다. Clindamycin, erythromycin, ciprofloxacin, tetracycline 및 gentamicin에대한내성률은혈액의경우 43.3-62.9%, 소변의경우 50.1-65.4% 이었다. 반면에 cotrimoxazole 내성률은혈액과소변이각각 15.0%, 13.0% 이었다. Vancomycin에내성인균주는혈액과소변공히없었다. Enterococcus species는대부분의항균제에대해 E. faecium이 E. faecalis보다훨씬내성률이높았지만, 2004년의결과와동일하게 tetracycline 내성률만은정반대의양상이었다. Ampicillin 내성률은 E. faecalis의경우혈액 1.1%, 소변 1.9% 로낮았으나, E. faecium은혈액, 소변각각 81.8%, 96.3% 로매우높았다. 이에반해서 tetracycline 내성률은 E. faecalis는혈액 68.1%, 소변 84.7% 로높았으나, E. - 16 -
faecium은혈액 4.5%, 소변 11.3% 로낮았다. Vancomycin 내성인장구균 (VRE) 은 E. faecalis에서는드물고 ( 혈액 3.5%, 소변 0.3%), E. faecium에서는비교적자주나타났다 ( 혈액 23.6%, 소변21.8%). 또한외래검체에서는혈액과소변모두에서 vancomycin 내성 E. faecalis는검출되지않았으나, E. faecium은혈액과소변에서각각 20%, 9.6% 로나타났다. 현재까지국내에서는지역사회에서 VRE가획득된경우는보고된바가없으므로외래검체에서분리된 VRE는이전의병원치료또는입원경험이있는환자에서분리된것으로생각된다. NNIS는미국중환자실환자들에서분리된장구균중 VRE의비율을 28.5%(2003년자료 ) 로보고하였고, 유럽에서는 4.4%(2002년 ) 로보고된바있다 (Biedenbach et al, 2004). 국내의 VRE 분리양상은대형병원의중환자실을중심으로빈도가증가해온미국의경우와유사하며원내장구균분리주에서의 VRE 비율이대부분 10% 이내인유럽에비해서는내성률이현저히높은상태이다. - 17 -
Table 1. Antimicrobial resistance (%) of S. aureus, E. faecalis and E. faecium isolated from blood Antimicrobial agents S. aureus E. faecalis E. faecium IP OP Total IP OP Total IP OP Total Ampicillin NT NT NT Ciprofloxacin Clindamycin Erythromycin Gentamicin Oxacillin Penicillin Cotrimoxazole Tetracycline Teicoplanin Vancomycin 57.0 (526) 55.2 (587) 68.7 (587) 64.2 (475) 73.8 (587) 96.9 (587) 15.6 (411) 47.8 (429) 0.0 (526) 0.0 (587) 22.0 (110) 22.5 (129) 37.6 (133) 29.7 (91) 33.8 (133) 90.2 (133) 12.0 (83) 24.0 (100) 0.0 (110) 0.0 (133) 50.6 (636) 49.3 (716) 62.9 (720) 58.7 (566) 66.4 (720) 95.7 (720) 15.0 (494) 43.3 (529) 0.0 (636) 0.0 (720) 1.4 (74) 29.9 (67) 0.0 (20) 15.0 (20) 1.1 (94) 26.4 (87) 83.4 (187) 86.8 (152) 68.2 (22) 61.9 (21) 81.8 (209) 83.8 (173) NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT 25.7 * (35) 33.3 * (9) 27.3 * (44) 58.0 * (88) 70.0 * (10) 59.2 * (98) NT NT NT NT NT NT 11.4 (35) 0.0 (14) 8.2 (49) 90.7 (86) 61.5 (13) 86.9 (99) NT NT NT NT NT NT 70.1 (54) 4.5 (67) 4.5 (67) 61.1 (18) 0.0 (18) 0.0 (18) 68.1 (72) 3.5 (85) 3.5 (85) 4.3 (163) 17.3 (173) 24.3 (173) 4.8 (21) 9.1 (22) 18.2 (22) 4.5 (184) 16.4 (195) 23.6 (195) Abbreviations: IP, inpatient; OP, outpatient; NT, not tested; ( *, high level aminoglycoside resistance. ), No. of isolates tested; - 18 -
Table 2. Antimicrobial resistance (%) of S. aureus, E. faecalis and E. faecium isolated from urine Antimicrobial agents S. aureus E. faecalis E. faecium IP OP Total IP OP Total IP OP Total Ampicillin NT NT NT Ciprofloxacin Clindamycin Erythromycin Gentamicin Oxacillin Penicillin Cotrimoxazole Tetracycline Teicoplanin Vancomycin 58.3 (417) 55.0 (427) 68.9 (427) 59.5 (365) 75.6 (439) 96.8 (439) 11.2 (304) 58.3 (367) 0.0 (417) 0.0 (439) 42.3 (142) 34.3 (134) 54.5 (134) 49.6 (119) 59.7 (149) 91.3 (149) 16.8 (143) 44.6 (121) 0.0 (142) 0.0 (149) 54.2 (559) 50.1 (561) 65.4 (561) 57.0 (484) 71.6 (588) 95.4 (588) 13.0 (447) 54.9 (488) 0.0 (559) 0.0 (588) 2.7 (1007) 33.7 (1007) 0.6 (659) 27.7 (659) 1.9 (1666) 31.3 (1666) 97.1 (1265) 95.4 (1200) 92.4 (236) 89.0 (236) 96.3 (1501) 94.4 (1436) NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT 58.4 * (197) 44.9 * (127) 53.1 * (324) 88.4 * (293) 64.2 * (53) 84.7 * (346) NT NT NT NT NT NT 19.5 (307) 8.9 (237) 14.9 (544) 97.6 (417) 94.3 (88) 97.0 (505) NT NT NT NT NT NT 87.2 (918) 0.3 (940) 0.4 (940) 80.6 (555) 0.2 (597) 0.0 (597) 84.7 (1473) 0.3 (1537) 0.3 (1537) 10.8 (1150) 17.3 (1117) 23.9 (1182) 14.4 (201) 5.8 (208) 9.6 (208) 11.3 (1351) 15.5 (1325) 21.8 (1390) Abbreviations: IP, inpatient; OP, outpatient; NT, not tested; ( *, high level aminoglycoside resistance. ), No. of isolates tested; - 19 -
S. aureus from inpatient 100 96.93 96.81 내성률 80 60 40 75.63 73.78 68.85 68.65 55.2 55.04 64.21 59.45 58.27 57.03 blood urine 20 15.57 11.18 0 penicillin oxacillin Erythromycin Clidnamycin Gentamicin Cotrimoxazole Ciprofloxacin S. aureus from outpatient 100 90.23 91.28 80 내성률 60 40 20 33.83 59.73 37.59 54.48 22.48 34.33 29.67 49.58 16.78 12.05 20 42.25 blood urine 0 penicillin oxacillin Erythromycin Clidnamycin Gentamicin Cotrimoxazole Ciprofloxacin - 20 -
E. faecalis 100 80 68.1 84.7 내성률 60 40 53.1 31.3 26.4 27.3 blood urine 20 14.9 8.2 0 Penicillin 1.1 1.9 Ampicillin Tetracycline Ciprofloxacin HL-gentamicin Teicoplanin 3.5 3.5 0.3 0.3 Vancomycin E. faecium 100 80 86.9 97 96.3 81.8 83.8 94.4 84.7 내성률 60 40 59.2 blood urine 20 0 Penicillin Ampicillin 11.3 4.5 Tetracycline Ciprofloxacin HL-gentamici 23.6 21.8 16.4 15.5 Teicoplanin Vancomycin - 21 -
2. E. coli와 K. pneumoniae (Table 3, 4) E. coli는혈액분리주들과소변분리주들사이에주요항균제들에대한내성률에있어서큰차이는없었으나, K. pneumoniae의경우는전반적으로소변분리주가혈액분리주보다다소간내성률이높은경향을보였다. S. aureus와 Enterococcus species에서와마찬가지로입원검체에서분리된균주들이외래검체 ( 응급실의뢰검체포함 ) 에서분리된것들보다여러항균제에대한내성률이높았으며, 이러한경향은 E. coli보다는 K. pneumoniae에서더욱뚜렷하였다. Aminoglycoside (amikacin, gentamicin, tobramycin) 에대한내성률은 E. coli가혈액과소변에서각각 2.6-22.0% 와 3.1-24.3%, K. pneumoniae는혈액 11.6-24.4%, 소변 19.23-41.5% 이었다. E. coli와 K. pneumoniae 공히 amikacin 내성률이 gentamicin과 tobramycin 등다른 aminoglycoside 계열항균제의내성률보다두드러지게낮았다. E. coli와 K. pneumoniae에서는 1980년대이후여러항균제에내성인균주가증가하였고, 특히 cephalosporin제를분해하는 extended-spectrum β-lactamase (ESBL) 생성균주가증가하여문제가되고있다. 본연구에서 E. coli는혈액검체의경우내성률이 ampicillin 60.9%, ciprofloxacin 30.0%, cotrimoxazole 32.1% 로비교적높았고, cephalothin 내성균주도 26.9% 로흔하였다. 제3세대 cephalosporin제인 cefotaxime과 ceftazidime, monobactam제인 aztreonam 내성률은혈액검체에서는 5.5-10.4% 이어서 ESBL 생성균주가드물지않은것으로추정되었다. K. pneumoniae의항균제내성률은혈액검체의경우내성률이 ciprofloxacin 20.1%, corimoxazole 23.8% 로 E. coli 보다낮았으나, cephalothin 의경우 43.7% 로전년도에비해 20% 이상내성률이상승하였다. Cefotaxime, ceftazidime 및 aztreonam 내성률은 15.9-27.2% 로높아서 ESBL 생성균주가 E. coli보다더흔한것으로추정할수있었다. ESBL 생성균주에의한감염증에치료제로사용할수있는 cefoxitin과 imipenem에대한내성률은혈액검체에서 E. coli는각각 4.0% 와 0.1% 이었고, K. pneumoniae의경우각각 20.2% 와 0% 이었다. 미국의 NNIS에의하면중환자실환자에서분리된 E. coli 와 K. pneumoniae 중 3세대 cephalosporin제에내성인균주의비율은각각 5.8% 와 20.6% 였다 (2003년자료 ). 미국의보고는중환자실환자들을대상으로하였지만 2003년의자료인점을고려할때본연구의내성률과큰차이는없다고생각되며미국의경우와같이앞으로계속내성률자료를축적하는것이필요하다고사료되었다. - 22 -
Table 3. Antimicrobial resistance (%) of E. coli and K. pneumoniae isolated from blood Antimicrobial agents E. coli K. pneumoniae IP OP Total IP OP Total Amikacin 3.0 (473) 2.2 (410) 2.6 (883) 12.7 (229) 9.8 (143) 11.6 (372) Ampicillin 65.9 (481) 54.9 (406) 60.9 (887) 99.6 (245) 97.7 (128) 98.9 (373) Ampicillin/Sulbactam 30.1 (376) 20.0 (310) 25.4 (686) 29.9 (167) 22.9 (83) 27.6 (250) Aztreonam 15.8 (514) 3.9 (415) 10.4 (929) 28.0 (250) 12.2 (139) 22.4 (389) Ceftazidime 6.1 (377) 5.0 (433) 5.5 (820) 38.5 (148) 12.8 (117) 27.2 (265) Cephalothin 27.5 (298) 26.3 (357) 26.9 (655) 56.3 (190) 13.8 (80) 43.7 (270) Ciprofloxacin 32.9 (504) 26.6 (433) 30.0 (937) 26.6 (244) 8.6 (140) 20.1 (384) Cefotetan 2.4 (168) 1.0 (307) 1.5 (475) 8.9 (101) 5.0 (101) 6.9 (202) Cefotaxime 11.2 (227) 7.6 (433) 9.1 (660) 22.7 (150) 7.0 (115) 15.9 (265) Cefepime 14.9 (483) 4.1 (369) 10.2 (852) 11.3 (230) 4.6 (132) 8.8 (362) Cefoxitin 5.0 (402) 2.3 (221) 4.0 (623) 24.1 (195) 8.1 (62) 20.2 (257) Gentamicin 24.9 (554) 18.8 (505) 22.0 (1059) 20.4 (289) 8.4 (166) 16.0 (455) Imipenem Piperacillin/Tazobactam Cotrimoxazole Tobramycin 0.3 (343) 3.3 (480) 34.8 (365) 20.4 (514) 0.0 (446) 1.4 (436) 29.6 (382) 10.1 (436) 0.1 (789) 2.4 (916) 32.1 (747) 15.7 (950) 0.0 (289) 10.9 (248) 28.5 (193) 30.7 (248) 0.0 (166) 7.5 (146) 15.1 (106) 13.7 (146) 0.0 (455) 9.6 (394) 23.8 (299) 24.4 (394) Abbreviations: IP, inpatient; OP, outpatient; NT, not tested; ( ), No. of isolates tested. - 23 -
Table 4. Antimicrobial resistance (%) of E. coli and K. pneumoniae isolated from urine Antimicrobial agents E. coli K. pneumoniae IP OP Total IP OP Total Amikacin 3.8 (2020) 2.4 (2226) 3.1 (4246) 22.3 (786) 13.6 (426) 19.2 (1212) Ampicillin 70.1 (2120) 71.0 (2197) 70.6 (4317) 98.3 (892) 99.0 (404) 98.5 (1296) Ampicillin/Sulbactam 28.7 (1392) 31.6 (1565) 30.2 (2957) 50.1 (603) 39.3 (33.1) 46.3 (934) Aztreonam 10.5 (2091) 3.9 (2159) 7.2 (4250) 45.8 (897) 19.0 (436) 37.1 (1333) Ceftazidime 10.8 (1293) 5.3 (2185) 7.4 (3478) 38.9 (653) 16.8 (322) 31.6 (975) Cephalothin 54.1 (1434) 37.0 (1353) 45.8 (2787) 63.7 (648) 32.7 (248) 55.1 (896) Ciprofloxacin 35.1 (2010) 29.1 (2081) 32.1 (4091) 47.4 (870) 26.7 (375) 41.0 (1245) Cefotetan 2.6 (742) 0.8 (1642) 1.3 (2384) 14.4 (305) 7.8 (294) 11.2 (599) Cefotaxime 11.1 (1346) 6.9 (2167) 8.5 (3513) 32.5 (474) 12.1 (320) 24.3 (794) Cefepime 9.8 (1803) 4.0 (2114) 6.6 (3917) 21.0 (730) 8.7 (416) 16.5 (1146) Cefoxitin 7.7 (1779) 6.5 (1502) 7.2 (3281) 35.6 (794) 27.7 (285) 33.6 (1079) Gentamicin 25.8 (2205) 23.1 (2657) 24.3 (4862) 39.1 (996) 24.7 (481) 34.4 (1477) Imipenem Piperacillin/Tazobactam Cotrimoxazole Tobramycin 0.0 (2354) 3.8 (2102) 41.7 (1712) 17.2 (2102) 0.0 (2568) 2.4 (2413) 39.8 (1977) 13.6 (2413) 0.0 (4922) 3.0 (4515) 40.7 (3689) 15.3 (4515) 0.5 (996) 20.7 (899) 48.4 (713) 47.7 (899) 0.0 (481) 12.7 (442) 31.9 (379) 29.0 (442) 0.3 (1477) 18.1 (1341) 42.7 (1092) 41.5 (1341) Abbreviations: IP, inpatient; OP, outpatient; NT, not tested; ( ), No. of isolates tested. - 24 -
3. P. aeruginosa (Table 5) P. aeruginosa는여러항균제에내성인것이특징이며임상검체에서흔히분리되는주요원내감염균중하나이다. 혈액분리주들과소변분리주들사이에내성률차이는 amikacin, gentamicin, tobramycin 및 ciprofloxacin에서뚜렷했는데, 소변분리주들에서월등히내성률이높았다. 2004년의연구에서도동일한양상의내성률차이가나타났고, 이의원인을내성률조사기간중하나의연구기관의입원환자들에서다약제내성 P. aeruginosa에의한요로감염의유행이있었기때문인것으로추정하였었다. 그러나, 해당연구기관에유행이없었던 2005년의경우에도혈액및소변분리주들사이에내성률차이는뚜렷했고, 전반적으로소변분리주들의내성률이높은경향을보였다. 입원환자의소변분리주에서 imipenem 내성률은전년도의 36.9% 에서현저히 21.0% 로감소하였고, 이는앞서언급한하나의연구기관에서생긴 2004년의요로감염유행때문인것으로추정되었다. 앞서기술되었던균종들에서와같이입원검체에서분리된균주들이외래검체 ( 응급실의뢰검체포함 ) 에서분리된것들보다여러항균제에대한내성률이현저하게높았다. P. aeruginosa의내성률은 piperacillin의경우혈액과소변각각 23.2% 와 37.3%, β-lactam과 β -lactamase 억제제의병합제인 piperacillin/tazobactam의경우혈액 18.9% 와소변 29.0% 이었다. Ceftazidime, cefepime, aztreonam에대한내성률은혈액의경우 16.2-22.2%, 소변의경우 21.2-27.3% 이었다. 최근에는 imipenem에도내성인균주가증가하고있음이보고된바있는데본연구에서 imipenem에대한내성률은혈액과소변에서각각 22.8%, 18.3% 로서다른그람음성간균 (E. coli, K. pneumoniae 등 ) 보다현저히높았고, 입원검체로부터분리된균주가외래검체의경우보다더욱높았다. 입원환자의소변분리주에서 imipenem 내성률은전년도의 36.9% 에서현저히 21.0% 로감소하였는데, 이는앞서언급한 1개연구기관에서생긴 2004년의요로감염유행때문인것으로추정되었다. - 25 -
Table 5. Antimicrobial resistance (%) of P. aeruginosa isolated from blood and from urine Antimicrobial agents blood urine IP OP Total IP OP Total Amikacin 18.0 (122) 2.1 (47) 13.6 (169) 34.3 (533) 19.9 (231) 30.0 (764) Aztreonam 27.3 (128) 7.0 (43) 22.2 (171) 28.3 (562) 24.7 (219) 27.3 (781) Ceftazidime 18.8 (128) 8.9 (45) 16.2 (173) 24.6 (562) 12.2 (213) 21.2 (775) Ciprofloxacin 21.7 (129) 17.0 (47) 20.5 (176) 45.0 (533) 29.9 (231) 40.5 (764) Cefepime 26.0 (123) 7.7 (39) 21.6 (162) 32.7 (465) 12.4 (193) 26.8 (658) Gentamicin 22.2 (117) 6.1 (49) 17.5 (166) 42.2 (604) 23.7 (249) 36.8 (853) Imipenem 25.9 (135) 14.3 (49) 22.8 (184) 21.0 (604) 11.7 (249) 18.3 (853) Piperacillin 30.0 (130) 4.3 (47) 23.2 (177) 44.6 (578) 18.8 (229) 37.3 (807) Piperacillin/Tazobactam 22.8 (123) 7.3 (41) 18.9 (164) 34.3 (536) 15.7 (217) 29.0 (753) Cotrimoxazole 93.5 (77) 86.7 (15) 92.4 (92) 96.1 (258) 96.2 (130) 96.1 (388) Tobramycin 19.5 (123) 2.3 (43) 15.1 (166) 33.4 (536) 20.3 (217) 29.6 (753) Abbreviations: IP, inpatient; OP, outpatient; ( ), No. of isolates tested. - 26 -
제 4 장 연구개발목표달성도및대외기여도 제 1 절연구개발목표달성도 본총괄및제 1세부과제에서계획하였던대로 2005년 3월부터 8월까지 6개월동안전국 10개대학병원환자의혈액및소변검체에서분리된주요병원성세균에대하여분리된균주수및항균제별내성양상과내성률을각연구기관별로조사하고, 총괄기관에서주요병원성세균의항균제감수성결과를분석완료하였다. 본연구에서원내감염균주와지역사회획득감염균주를구분하여분석하려는시도로각종내성자료를입원검체와외래검체로나누어취합분석하였는데, 외래검체라고하더라도대학병원의환자들을대상으로균주를수집한만큼외래와응급실환자들의타병원에서전원되었거나, 입원력이있을것으로추정되기때문에정확하게원내감염과지역사회획득감염을구분할수없다는것이한계점으로생각되었다. 또한 E. coli, Enterococcus species (E. faecalis와 E. faecium), S. aureus를계획대로수집, 취합하고, 수집된균주들을분배하여해당세부과제별로계획했던각균종별항균제내성기전및유전적상관성규명에대한연구를완료하였다. 이균주들은전국적으로수집되기는하였으나, 수집기간이비교적짧고대상균주의수가적어 ( 특히 Enterococcus species) 그대표성에다소간의문제가있을것으로생각되었다. 일반적으로임상검체에서분리되는균주들은대상군이일정하지않고항상변하며, 정확한독립변수를선정할수없기때문에통계적분석을시행하기는매우어렵다고알려져있다. Chi-squre test 등의방법으로비교를하는경우그의미가과평가되는경향이있어권장되지않으며, 항균제내성의추세를보는것이일반적인방법이다 (Bax et al, 2001; Prats et al, 2000). 제 2 절대외기여도 본연구는전국적규모의항균제내성조사연구로서, 전국 10개의료기관을대상으로하였다. 특히혈액및소변검체에서분리된주요병원성세균에대해항균제내성양상및내성률을조사하였으며, 이를통해전국적으로국내지역에따라또는원내감염균과지역사회감염균에따라균혈증및요로감염균의대체적인내성상황을파악할수있을것이다. 따라서이연구자료는가장중요하고흔한감염증인균혈증과요로감염환자치료를위한올바른경험적항균제사용지침 (empirical antibiotic therapy guideline), 내성세균의전파를막기위한감염관리대책, 내성기전규명을위한연구및강력한항균력을가진약제의국내개발등에중요한기초자료가될것으로판단된다. - 27 -
제 5 장 연구개발결과의활용성과및계획 제 1 절계량적성과 전문학술지 ( 편수 ) 학회발표 ( 초록 ) 특허 ( 건수 ) 국외국내국외국내국외국내게제투고중게재투고중출원중출원등록출원중출원등록 상품화 기타 (CD-ROM, 저서, 워크샾개최등 ) 제 2 절성과내용기술 본연구에서는전국적규모로균혈증및요로감염의주요병원성세균의항균제내성양상및내성률을파악할수있었다. 또한 E. coli, Enterococcus species (E. faecalis와 E. faecium), S. aureus 균주들을균혈증및요로감염환자에서분리수집하여, 이들을기초재료로하여각균종별항균제내성기전및유전적상관성규명에대한연구를수행하였다. 제 3 절활용계획 균혈증과요로감염증의원인균과항균제내성률연구결과는이들감염증치료에중요한기초자료로활용될수있다. 또한병원내항균제내성의규모및내성양상분석을근거로적절한경험적항균제선택지침의개발과국내의내성균발생억제및확산방지대책마련등에이용하고자한다. - 28 -
제 6 장 기타중요변경사항 특이사항없음. 제 7 장 참고문헌 1) Neu HC. The crisis in antibiotic resistance. Science 1992;257:1064-73 2) 강철인, 김동민, 이종윤, 박완범, 이기덕, 김홍빈등. 5년동안혈액에서배양된 Escherichia coli와 Klebsiella pneumoniae의항균제감수성 : Extended-spectrum β-lactamase 생성균주의영향. 감염과화학요법 2003;35(6):365-9 3) 김의종, 허미나, 한규섭, 박명희. 서울대학교병원환자혈액에서분리된 Staphylococcus aureus, E. coli, Klebsiella pneumoniae 및 Pseudomonas aeruginosa의항균제감수성. 대한화학요법학회지 1999;17(1):53-9 4) Kyungwon Lee, Hye Soo Lee, Sook-Jin Jang, Ae Ja Park, Myung Hee Lee, Won Keun Song et al. Antimicrobial resistance surveillance of bacteria in 1999 in Korea with a special reference to resistance of enterococci to vancomycin and gram-negative bacilli to third generation cephalosporin, imipenem, and fluoroquinolone. J Korean Med Sci 2001;16(3):262-70 5) 이경원, 정윤섭, 권오헌, 박홍석, 김준명. 임상검체에서분리된세균의항균제감수성 - 1988-1992년결과 -. 대한화학요법회지 1993;11:158-68 6) 정윤섭, 이경원, 서진태, 김의종, 배직현, 이규만등. 전국주요병원에서분리된그람음성간균의항균제감수성. 감염 1996;28:131-41 7) Lee K, Jang SJ, Lee HJ, Ryoo N, Kim M, Hong SG et al. Increasing prevalence of vancomycin-resistant Enterococcus faecium, expanded-spectrum cephalosporin-resistance Klebsiella pneumoniae, and imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in Korea: KONSAR Study in 2001. J Korean Med Sci 2004;19(1):8-14 8) Cheong HJ, Park CW, Eom JS, Ha KI, Shin JH, Kim CM et al. Clinical Features of VRE infection, microbiologic characteristics and genetic relatedness of VRE isolates from six university hospitals. Korean J Infect Dis 2002;34(5):285-92 9) Park JH, Lee SH, Jeong SH, Kim BN, Kim KB, Yoon JD et al. Characterization and prevalence of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates producing an extended-spectrum β-lactamase from Korean hospitals. Korean J Lab Med 2003;23(1):18-24 10) Smith TL, Jarvis WR. Antimicrobial resistance in Staphylococcus aureus. Microbes Infect 1999;1:795-805 11) Huycke MH, Sahm DF, Gilmore MS. Multiple-drug resistant enterococci: The nature of the problem and an agenda for the future. Emerg Infect Dis 1998;4(2):239-49 12) Nicolle LE. Resistant pathogens in urinary tract infections. J Am Geriatr Soc 2002;50:S230-S235 13) Mazzulli T. Resistance trends in urinary tract pathogens and impact on management. J Urol 2002;168:1720-2 14) A report from the NNIS system. National nosocomial infections surveillance (NNIS) system report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect - 29 -
Control 2004;32:470-85 15) Biedenbach DJ, Moet GJ, Jones RN. Occurrence and antimicrobial resistance pattern comparisons among bloodstream infection isolates from the SENTRY antimicrobial surveillance program(1997-2002). Diag Microbiol Infect Dis 2004;50:59-69 16) Bax R, Bywater R, Cornaglia G et al. Surveillance of antimicrobial resistance-what, how and whither? Clin Microbiol Infect 2001;7:316-25 17) Prats G, Mirelis B, Llovet T, Munoz C, Miro E, Navarro F. Antibiotic resistance trends in enteropathogenic bacteria isolated in 1985-1987 and 1995-1998 in Barcelona. Antimicrob Agents Chemother 2000;44:1140-5 - 30 -
제 2 세부연구과제 주요원인균의내성기전및 지역간균주의유전적상관성조사 : Escherichia coli 세부과제연구기관 : 연세대학교의과대학 세부과제책임자 : 용동은 - 31 -
목 차 제 1 장 서론 33 제 2 장 국내 외기술개발현황 35 제 3 장 연구개발수행내용및결과 36 제 4 장 연구개발목표달성도및대외기여도 42 제 5 장 연구개발결과의활용성과및계획 43 제 6 장 기타중요변경사항 44 제 7 장 참고문헌 44-32 -
제 1 장 서론 대장균 (Escherichia coli) 은원내및원외감염을흔히일으키는중요한그람음성간균이다. 그람음성간균의 expanded-spectrum β-lactamase제에대한내성기전중임상적으로중요한것은 extended-spectrum β-lactamase (ESBL) 생성, 변이성 AmpC β-lactamase의다량생성등이다 (3). 또한 fluoroquinolone제제에대한내성기전중 DNA gyrase, topoisomerase 변이, 유출이있다 (9). 최근임상검체에서 ESBL 혹은 AmpC β-lactamase 생성하는 E. coli와 fluoroquinolone 제제내성균주가증가함이보고되었다 (5-8). ESBL 생성균주는 aminoglycoside계, trimethoprim-sulfamethoxazole 등의다른계열의항균제에대하여동시에내성을보이는경우가흔하다 (1). 따라서 ESBL 생성균주에의한감염증은치료제의선택이어렵다. National Committee for Clinical Laboratory (NCCLS) 에서는 ESBL을생성하는 E. coli와 Klebsiella spp. 는 carbapenem을제외한 penicillin, cephalosporin, aztreonam 등의항균제에임상적내성인것으로간주하도록권고하고있다 (2). AmpC β-lactamase 생성균주는 cephamycin을가수분해하여 cefoxitin 등에감수성이저하된다 (3). 세브란스병원에서근래분리된 E. coli 중 cefoxitin 내성균주는 1994년 5% 에서1999년 20% 로점차증가하는경향을보였다. AmpC β-lactamase 생성균주는 cefepime, carbapenem을가수분해하지못한다. 그러나 AmpC β-lactamase 생성균주의선별및확인시험을위한방법은표준화되지않았다. ESBL 및 AmpC β-lactamase 생성세균의검출은치료항균제의선택에큰영향을미치기때문에매우중요하다. 즉, ESBL 생성세균은고가인 carbapenem계항균제의사용을증가시키고, 이는 carbapenem제에내성인세균을출현하게하는원인으로작용한다. 또한 AmpC β-lactamase 생성균주역시다제내성을보여서감염증의치료는어렵다. 따라서 ESBL 혹은 AmpC β-lactamase 생성세균에의한감염증치료지침과전파를억제하기위한대책이필요하다. 그러나이들내성세균을검출하는것은쉽지않다. 국내에서는흔히미국의 NCCLS 기준에따라서시험하고있다. 그러나국가간유행하는 ESBL 및 AmpC β-lactamase 유형이다르다. 검사실의업무량을고려한우리나라실정에맞은효과적인검출법이절실히필요하다고판단된다. Fluoroquinolone 제제는그람음성과양성균감염모두에널리사용되고있고, 폐렴구균등그람양성구균에대한항균력이강화된새로운제제들이사용되기시작하고있다. 한편 fluoroquinolone 제제에따라서교차내성이보고되고이들내성균의출현과확산을막기위하여는광범위한역학조사가반드시필요하다. 지금까지국내에서이루어진 E. coli의 ESBL, AmpC β-lactamase 생성현황에대한조사의대부분은소수병원분리주를대상으로시행한것이어서, 우리나라의전체적인현황을파악하기는매우어렵다. 또한임상적으로의미가큰병증의환자검체에서분리된 E. coli에서 ESBL 및 AmpC β-lactamase 생성균주의비율, 표현형및유전자형에대한연구는매우드문실정이다. 이에본연구에서는혈액및뇨검체에서분리된 E. coli에서의 ESBL 및 AmpC β-lactamase 생성균주및 fluoroquinolone 내성균주의분리율의국내현황을규명하려한다. 본연구자는전국 10개의료기관에서시행한혈액및뇨배양에서분리한균주를대상으로다음과같은목적으로연구를진행하고자한다. 1) 전국 10개의료기관환자의혈액및뇨검체에서분리수집한 E. coli의항균제감수성양상을조사한다. 2) ESBL 또는 AmpC β-lactamase 생성세균을검출하여그비율을지역별, 검체별, 병동별로조사한다. - 33 -
3) Fluoroquinolone 제제에대한항균제감수성과이들의임상상을분석하려한다. - 34 -
제 2 장 국내 외기술개발현황 E. coli는장내세균과 (family Enterobacteriaceae) 에속하는그람음성간균이며인체장내정상상재균이다. E. coli는원내및원외감염의흔한원인균이며, 요로감염, 패혈증, 창상감염등을유발한다. 그람음성간균치료에임상적효능이있는첫 penicillin계항균제인 ampicillin이소개된이후, β-lactam 항균제는이세균에의한감염증의치료에유용하게사용되었다. 그러나 ampicillin이사용된후곧 broad-spectrum β-lactamase (BSBL) 생성균주가발견되었고이들은 ampicillin에내성이었다. BSBL은 penicillin, 협범위 cephalosporin 또는 cefamandole 등을가수분해한다. TEM-1, TEM-2 및 SHV-1이그예이다. 제 3세대 cephalosporin계항균제는 BSBL 생성그람음성간균에도항균력을가지며, 1980년대초부터임상에서사용되었다. 이들항균제는 BSBL에안정하고, 그람음성간균의세포막을쉽게투과할수있어서장내세균에강한항균력을발휘한다. 그러나 1983년유럽에서 cefotaxime 내성 Klebsiella pneumoniae가보고된이후세계여러나라에서제 3세대 cephalosporin에내성인그람음성세균이보고되고있는데, plasmid 매개성 ESBL 및 AmpC β-lactamase는그중임상적으로가장중요한내성기전이다. ESBL 유전자를획득하는균주는 aminoglycoside계, trimethoprim-sulfamethoxazole 등의항균제에대하여동시에내성을보이는경우가흔하다. 따라서 ESBL 생성균주에의한감염증은치료제의선택폭이매우좁아진다. NCCLS에서는 ESBL을생성하는 E. coli와 Klebsiella spp. 는 carbapenem을제외한 penicillin, cephalosporin, aztreonam 등에임상적내성인것으로간주하도록권고하고있다. 또한 NCCLS는뇨검체분리그람음성간균에서 ESBL 선별및확인시험을각검사실실정에맞게시행하도록정하고있어각검사실간의시행여부가큰편차를보일것으로예상된다. ESBL은지역별로다양한분포를지닌다. 즉, 프랑스에는 TEM-3, 미국에는 TEM-10, TEM-12 및 TEM-26, 그리스에는 SHV-5가많은것으로알려졌다. 국내에는 SHV-12, SHV-2a와 TEM-52가많다는보고가있으나균주수와분리병원이제한되어있어서우리나라의실정을충분히반영한다고보기는어렵다. 또한우리나라검사실에적합한 ESBL 생성세균검출법에대한고안이필요하다고판단된다. AmpC β-lactamase 생성균주는 cephamycin을가수분해하여 cefoxitin 등에감수성이저하된다. 세브란스병원에서근래분리된 E. coli 중 cefoxitin 내성주는 1994년 5% 에서1999년 20% 로점차증가하는경향을보였다. AmpC β-lactamase 생성균주는 cefepime, carbapenem을가수분해하지못한다. 그러나 AmpC β-lactamase 생성균주의선별및확인시험의표준은정해지지않았다. ESBL 및 AmpC β-lactamase를생성하는균주의비율은해마다변화하고있으며, 그변화양상을파악하여야전파원인의규명을위한적절한대책을수립할수있다. Fluoroquinolone 제제는그람음성과양성세균감염증에모두널리사용되고있다. Fluoroquinolone 제제의표적은세균의 type II topoisomerase 즉, DNA gyrase (topoisomerase II) 와 topoisomerase IV이고, 이들에도달하려면우선세균의세포벽과세포막을통과하여세포질내에축적되어야한다. Fluoroquinolone 내성은세균에있던염색체의변이때문에일어난다. 이러한내성균주의분리율을규명하는것은효과적인약제사용에반드시필요하나국내분리주에서의연구는미비한실정이다. 이에본연구자는전국각지의병원을대상으로 ESBL 및 AmpC β-lactamase 생성 E. coli를대상으로그들의 β-lactam제내성현황과 fluoroquinolone 내성세균의분리율을함께조사함으로써감염증치료지침수립에기초가되는자료를제공하고자하였다. - 35 -
제 3 장 연구개발수행내용및결과 제 1 절연구내용 1. 연구대상 : 전국 10개기관환자의혈액및요에서분리된 E. coli를대상으로하였다. - 혈액분리주는입원및외래환자에서각각연속분리주 10주씩수집하였다. - 요분리주는입원및외래환자에서각각연속분리주 10주씩수집하였다. - 총혈액분리주 180주, 요검체분리주 180주수집을목표하였다. 2. 균주수집요건환자의무기록을검토하여다음과같은요건을충족시키는경우수집하였다. - 균혈증 : 임상적으로발열, 백혈구증다증, 오한등이 8시간이상나타나는감염의소견과함께 1번이상의혈액배양에서균이검출된경우 - 요로감염 : 발열, 빈뇨, 요급박, 배뇨곤란, 옆구리통증, 하복부및치골상부등의급성요로감염증상을호소하며, 소변검사상백혈구수가 5/HPF 이상이며, 요배양에서 10 5 CFU/mL 이상의집락이배양된경우 3. 자료수집가. 병원명, 병상규모, 환자연령, 병실및외래구분나. 분리균주의항균제감수성결과 : 디스크법또는 Kit법모두를포함 제 2 절연구방법 1. 항균제감수성시험및균주수집가. 항균제감수성시험 - 전국 10개기관으로부터 2005년 4월이후분리된 E. coli를대상으로 NCCLS 디스크확산법혹은액체배지희석법으로항균제감수성을시험하였다. 즉, 시험세균을 MacConkey 한천 (Difco, Detroit, MI., USA) 에계대배양하여 1개의독립된집락을백금침으로채취한후, Tryptic soy broth (TSB, Difco) 에접종하여 McFarland No. 0.5 탁도로맞춘다. 세균부유액을면봉으로 Mueller-Hinton 한천 (Difco) 에접종한후, 항균제디스크를놓는다. 세균이접종된배지는 35 항온기에 18시간배양하고, 각항균제디스크주위에생긴억제대의크기를측정한다. 항균제디스크로는 ampicillin, ampicillin-sulbactam, cephalothin, cefoxitin, cefotetan, cefpodoxime, cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone, aztreonam, imipenem, amikacin, gentamicin, tobramycin 혹은 ciprofloxacin 디스크 ( 이상 BBL, Cockeysville, MI., USA) 등을사용한다. 결과의정확성을위하여대조균주인 E. coli ATCC 25922의감수성을동시에시험하였다. 나. 균주수집 - 혈액검체와뇨검체에서분리된일련분리 E. coli 20주씩총 40주를전국 10개연구참여기관별로수집하였다. - 36 -
2. ESBL 연구가. ESBL 선별시험 : 각병원감수성결과중 cefotaxime, ceftazidime, aztreonam disk 억제대가각각 27 mm, 22 mm, 27 mm 이하인균주혹은항균제최소억제농도가모두 1 μg/ml 이하인균주를대상으로 ESBL 확인시험시행하였다. 나. ESBL 확인시험 : amoxicillin-clavulanate 와 cefotaxime, ceftazidime, aztreonam, cefepime disk를이용한 double-disk synergy test 시행하였다. 즉, 순배양된집락을백금침으로채취한후, TSB에접종하여 McFarland No. 0.5 탁도로맞추었다.. 세균부유액을면봉으로 Mueller-Hinton 한천에고르게접종한후, 배지의중앙에는 amoxicillin-clavulanic acid (20/10 μg, BBL), 그주위에는 30 μg의 cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone 및 aztreonam 디스크 ( 이상 BBL) 를놓았다. 중앙과주변디스크의가장자리간격은 1.5 cm가되게하였다. 세균이접종된배지는 35 항온기에 18시간배양후결과를판독하여, 두디스크사이에서상승효과에의한억제대의확장현상이관찰되면양성으로판정하였다. 다. ESBL 생성및비생성세균의병원별, 병동별, 검체별빈도를규명 3. AmpC β-lactamase 가. AmpC β-lactamase 선별시험 : 각병원감수성결과중에 cefoxitin disk의억제대가중간혹은내성인균주를대상으로확인시험을시행하였다. 나. AmpC β-lactamase 확인시험 : Modified Hodge test를시행하였다. -Modified Hodge test: E. coli ATCC 25922 균주 (MacFarland 0.5 탁도 ) 를접종한 Mueller-Hinton 한천배지에 cefoxitin disk를놓고시험세균을디스크에서 plate 가장자리로직선으로획선하였다. 35 배양기에서하룻밤배양후 E. coli ATCC 25922 균주의증식촉진정도를측정하였다. 4. Fluoroquinolone 제제항균제감수성결과분석 가. 전국 10개기관으로부터분리수집된 E. coli를대상으로 NCCLS 디스크확산법으로항균제감수성을시험하였다. 이들의임상적특징과항균제감수성양상을비교분석하였다. - 37 -
제 3 절연구결과 총수집균주는 337주이었다 ( 표 1). 계획대로전국 10개기관에서수집되었으며뇨검체분리 192주, 혈액분리 145주이었다. 기관별로는최소 27균주에서최대 40균주씩을수집하였다. 권역별로는서울지역이 113주로가장많았고영남지역수집균주가 98주이었으며, 호남, 강원, 충청, 경기지역에서각각 40-26주가수집되었다 ( 표 2). 2004년수집된 284 균주에비해증가하였다. 표 1. 기관별, 검체별, 의뢰병동별분리균주수 No. of isolates (2005) Hospital Urine Blood OPD IPD OPD IPD Total A 10 10 5 5 30 B 10 10 10 3 33 C 10 10 2 5 27 D 10 10 10 10 40 E 10 7 6 5 28 F 10 10 10 9 39 G 10 6 1 9 26 H 10 10 10 10 40 I 10 9 6 9 34 J 10 10 10 10 40 Sub total 100 92 70 75 Total 192 145 337 OPD, out-patient department; IPD, in-patient department. 표 2. 권역별, 검체별, 의뢰병동별분리균주수 No. of isolates (2005) 권역 Urine Blood Total OPD IPD OPD IPD 강원 10 10 10 3 33 경기 10 6 1 9 26 서울 30 29 26 28 113 영남 30 27 21 20 98 충청 10 10 2 5 27 호남 10 10 10 10 40 Sub total 100 92 70 75 Total 192 145 337-38 -
Double-disk synergy 시험양성으로 ESBL 생성균주의수와비율은지역에따라상이하여서서울지역이 13주 (11.5%) 로가장흔하였고영남지역이 9주 (9.2%) 이었으며강원지역이 1 (3.0%) 로가장낮았다 ( 표 3). 의뢰병동별로는 OPD 분리균주보다 IPD 분리균주의비율이뇨검체및혈액분리균주에서각각 12% 및 13.3% 로 6% 와 1.4% 에비하여흔함을알수있었다. 검체별로는혈액분리균주의 double-disk synergy 시험양성율 (7.6%) 이뇨검체분리주 (8.9%) 보다낮았다. 뇨에서의항균제농도가농축에의하여혈액보다는높게유지되는것이일반적이므로선택압력으로작용하였을것으로추측하였다. 2004년수집된균주중 DDST 양성을보였던 23주보다증가하였다. 강원 3.0%, 충청 3.7%, 호남 5.% 로낮았고, 서울 11.5%, 영남 9.2% 로높았으며, 의뢰병동별, 검체별로 2004년과상이하게 1.4%-13.3% 로다양하였다. 표 3. 권역별, 검체별, 의뢰병동별 double-disk synergy 시험양성균주 No. (%) of isolates with positive DDST (2005) 권역 Urine Blood OPD IPD OPD IPD Total 강원 1(10.0) 1 (3.0) 경기 1 (16.7) 1 (11.1) 2 (7.7) 서울 3 (10.0) 4(13.8) 6(21.4) 13 (11.5) 영남 2 (6.7) 3 (11.1) 1 (4.8) 3(15.0) 9 (9.2) 충청 1 (10.0) 1 (3.7) 호남 2(20.0) 2 (5.0) Total 6 (6.0) 11 (12.0) 1 (1.4) 10 (13.3) 28 (8.3) Modified Hodge 시험양성균주의수와비율은 1.8% 로낮았고서울, 경기및호남지역에서만양성균주가출현하여편중된양상을보였다 (data not shown). 검체별과의뢰병동별로는 IPD의뢰혈액분리균주에서만 6주가검출되었다. 현재추가확인을위한 AmpC β-lactamase multiplex PCR을시행중이다. 그중 cefoxitin 비감수성인 15주를대상으로시행한 modified Hodge 시험과 AmpC β-lactamase multiplex PCR 결과를보면표 4에서와같이 modified Hodge 양성균주 4주는 CIT, DHA 그리고 MOX type의 AmpC β-lactamase 유전자를가지고있어서모두일치하였다. 표 4. Modified Hodge test와 AmpC β-lactamase multiplex PCR 시험연관 Modified Hodge test with cefoxitin disk AmpC Multiplex PCR Positive Negative Negative - 11 CIT type 1 - DHA type 1 - MOX type 2 - - 39 -
기관별 fluoroquinolone (ciprofloxacin 혹은 levofloxacin) 비감수성균주의비율은 19%-43% ( 평균 32%) 이었다 ( 표5). 의뢰병동별로는 IPD 의뢰검체에서의 fluoroquinolone 비감수성균주의비율이 OPD 의뢰검체에서의비율보다높음을알수있었고, 검체별로는뇨검체분리균주에서 34% 로혈액분리주의 29% 보다약간높았다. 특히 2004년 20%-30% ( 평균 24%) 에비하여 2005년 21%-41% ( 평균 32%) 로현저히증가하였다. 표 5. 기관별, 검체별, 의뢰병동별 fluoroquinolone 내성균주 No. (%) of isolates with fluoroquinolone resistance (2005) Hospital Urine Blood OPD IPD OPD IPD Total A 4 (40) 4(40) 1(20) 3 (60) 12 (40) B 5 (50) 4(40) 9(27) C 4 (40) 1(10) 1 (20) 6(22) D 4(40) 2(20) 5 (50) 11 (28) E 4 (40) 3(43) 1(17) 4 (80) 12 (43) F 4 (40) 7(70) 3(30) 2 (22) 16 (41) G 4 (40) 1 (11) 5(19) H 3 (30) 4(40) 3 (30) 10 (25) I 3(30) 6(67) 1(17) 4 (44) 14 (41) J 1(10) 4(40) 3(30) 4 (40) 12 (30) Total 27 (27) 38 (41) 15 (21) 27 (36) 107 (32) ESBL 생성균주에서 fluoroquinolone의비감수성균주의비율이높음이알려져있다. 본연구에서도 ESBL 생성균주중 fluoroquinolone 비감수성균주의비율이 78.6% 로비생성균주에서의 27.5% 보다높음을알수있었다 ( 표 6). 또한 fluoroquinolone 비감수성균주에서 ESBL 생성균주의비율은 20.6% 로 fluoroquinolone 감수성균주에서의 2.6% 보다높았다. 표 6. Fluoroquinolone 내성과 ESBL 생성의연관성 No. (%) of isolates: ESBL Fluoroquinolone Nonsusceptible Susceptible Total Positive 22 (78.6) 6(21.4) 28 (100) Negative 85 (27.5) 224 (72.5) 309 (100) Total 107 (31.8) 230 (68.2) 337 (100) ESBL 생성균주는비생성균주에비하여다른항균제에대한내성율도높아서 piperacillin-tazobactam 11.5% vs. 0.3%, amikacin 11.5% vs. 3.4%, gentamicin 71.4% vs. 22.3%, tobramycin 73.1% vs. 10.6%, cotrimoxazole 69.6% vs. 29.5% 이었다. - 40 -
전체적으로 OPD 분리균주가 IPD 분리균주에비하여높은내성율을보였으나 outbreak에대한자료확보에대한제한으로원외및원내감염균을전적으로대표하기에는오차가있을것으로판단된다. 추후연구에서는배양의뢰된환자병력, 특히과거입원력과입원후 48시간경과에대한조사도포함할수있을것으로판단된다. 또한지역간균주의내성양성과유전적연관성규명을향후추가진행할필요가있을것으로사료된다. - 41 -
제 4 장 연구개발목표달성도및대외기여도 제 1 절연구개발목표달성도 2005년전국 10개기관의임상검체 ( 뇨, 혈액 ) 에서분리된 E. coli에서 ESBL 및 AmpC β -lactamase 생성균의검출을완료하였다. 특히 ESBL 생성세균의검체별, 의뢰병동별분포를규명하였다. 또한이들세균의 fluoroquinolone을포함한중요항균제감수성결과를분석하여 ESBL 생성과의연관성조사를완료하였다. 일부 cefoxitin 내성균주에서 multiplex PCR을시행하여 AmpC β-lactamase 생성선별시험인 modified Hodge 시험의유용성을평가하였다. 제 2 절대외기여도 이번연구를통하여병원내에서 ESBL 생성 E. coli가전국적으로계속하여분리되고있으며, 기관에따라생성빈도에많은차이가있음을알수있었다. 따라서, 이러한 ESBL 양성세균의유전자형및형별분석을추가로진행할필요가있으며, 이러한내성균의원내전파를막기위해서는조기검출및대책의수립이필요한것으로생각된다. 2005년분리된 ESBL 생성 E. coli의조사를통해몇개기관에서기관내 clonal spread가있음을시사하는소견이관찰되었다. 특히, 동일검체, 동일의뢰병동을대상으로 2004년분리수집된 E. coli 균주에서의 ESBL 생성균의비율과비교하였을때 OPD에서감소하는경향을볼수있었으나, IPD 분리균주에서는증가하였다. 이는원내 ESBL 생성세균의역학이급격히변하였음을시사하는소견이라판단된다. 근래의약분업을통한항균제처방의변화, 원내감염균총의변화와집단감염의발생등이그원인으로사료된다. - 42 -
제 5 장 연구개발결과의활용성과및계획 제 1 절계량적성과 2006 년국내외논문에게재를준비중에있음. 제 2 절성과내용기술 가. 전국 10개의료기관에서수집한혈액및뇨검체분리 E. coli를대상으로항균제감수성자료를분석하여, 전국규모의지역별, 병상규모별, 의뢰병실별내성상황을파악할수있었다. 나. 국내에서분리되는혈액및뇨검체분리 E. coli의지역별, 검체별, 병상규모별, 의뢰병실별 ESBL 생성균주의비율을파악할수있었다. 다. 국내에서분리되는혈액및뇨검체분리 E. coli의지역별, 검체별, 병상규모별, 의뢰병실별 AmpC β-lactamase 생성균주의비율을파악할수있었다. 라. 국내임상미생물검사실에 AmpC β-lactamase 검출법으로 modified Hodge 시험의유용성을평가진행중이다. 마. 국내에서분리되는혈액및요검체분리 E. coli의지역별, 검체별, 병상규모별, 의뢰병실별 fluoroquinolone 내성균주의비율을파악할수있고, ESBL 생성균과의관계를규명중이다. 제 3 절활용방안 가. 본연구의결과로얻어진혈액및뇨검체분리 E. coli의항균제감수성자료, ESBL 및 AmpC β-lactamase 생성균주및 fluoroquinolone 내성균주비율에대한자료는감염증치료지침과내성세균확산억제대책을마련하는데기초자료로유용한것으로사료된다. 나. 국내에서분리되는세균의내성기전파악은세균의감염역학을분석하는데도움이되는자료인것으로사료된다. 특히 2005년분리된 ESBL 생성 E. coli의조사에서 2004년연구와비교하여 OPD에서의비율은감소하였으나, IPD 분리균주에서는증가하였다. 이는원내 ESBL 생성세균의역학이급격히변하고있음을시사하는소견이라판단된다. 근래의약분업을통한항균제처방의변화, 원내감염균총의변화와집단감염의발생등이그원인으로사료되며계속적인조사가필요한것으로판단하였다. 다. 본연구를통해서우리나라에적합한 AmpC β-lactamase 생성균의검출법을제시할수있을것으로사료된다. - 43 -
제 6 장 기타중요변경사항 변동사항없음. 제 7 장 참고문헌 1. Du Bois SK, Marriott MS, Amyes SGB. TEM- and SHV-derived extended- spectrum β -lactamase: relationship between selection, structure and function. J Antimicrob Chemother 1995;35:7-22. 2 National Committee for Clinical laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility testing. Ninth informational supplement. Wayne:NCCLS, 1999;M100-S9. 3. Livermore DM. β-lactamase in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995;8:557-84. 4. Jacoby GA. Genetics of extended-spectrum beta-lactamases. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994;13(S 1):2-11. 5.. 이경원, 조성란, 이창숙, 정윤섭, 권오헌. Extended-spectrum β-lactamase 생성 Escherichia coli와 Klebsiella pneumoniae. 감염 1996;26:341-8. 6.. 이수연, 이선화, 배직현 : Klebsiella pneumoniae의 extended-spectrum β-lactamases 검출. 대한임상병리학회지 17:1076-1088, 1997. 7. 송원근, 이경원, 김선주, 정석훈, 장철훈, 신혜정등 : 전국 12개병원환자에서분리된 extended-spectrum β-lactamase 생성 Escherichia coli와 Klebsiella pneumoniae. 대한화학요법학회지 2000;18:401-10. 8. 류종하. Enterobacter, Citrobacter 및 Serratia 균종의최근 5년간분리추세와변이성 AmpC β -lactamase 생성균주의항균제에대한감수성. 석사학위논문, 연세대학교대학원 2001. 9. Lindgren PK, Karlsson A, Hughes D. Mutation rate and evolution of fluoroquinolone resistance in Escherichia coli isolates from patients with urinary tract infections. Antimicrob Agents Chemother 2003;47:3222-32. - 44 -
제 3 세부연구과제 주요원인균의내성기전및 지역간균주의유전적상관성조사 : Enterococcus species 세부과제연구기관 : 아주대학교의과대학 세부과제책임자 : 이위교 - 45 -
목 차 제 1 장 서론 47 제 2 장 국내 외기술개발현황 50 제 3 장 연구개발수행내용및결과 51 제 4 장 연구개발목표달성도및대외기여도 62 제 5 장 연구개발결과의활용성과및계획 63 제 6 장 기타중요변경사항 63 제 7 장 참고문헌 63-46 -
제 1 장 서론 제 1 절개괄 장구균 (Enterococcus) 은건강인의위장관과생식기의정상상재균으로서, 감염을야기하는경우가과거에는드물었으나, 근래원내감염을흔히일으키는중요한세균으로알려져있다. 이세균의병독성인자는알려져있지는않지만창상과요로감염등의경한감염뿐아니라균혈증, 심내막염, 수막염등의중증감염도일으키며, 미국에서는 4번째로흔한원내감염균으로보고되었다 [1-3]. 장구균은여러항균제에자연내성또는획득내성을갖는것이특징이다. 따라서장구균에의한폐혈증등의중증감염은 β-lactam과 aminoglycoside 제제의병합요법이권장되고, penicillin제제나 aminoglycoside제제에고도내성인균주에의한감염증치료에는 vancomycin이흔히사용되고있다. 그러나최근반코마이신내성장구균 (vancomycin-resistant enterococci, VRE) 에의한감염증이증가하고있어서심각한문제가되고있다 [4]. VRE는 1986년프랑스와영국에서처음보고되었고, 미국에서는 1988년에처음분리보고되었는데 1990년중반이후로 vancomycin 사용증가와함께그분리율이급격히증가하였다 [5-7]. 우리나라에서는 1992년처음보고되었는데, 최근 2-3년동안일부대학병원에서 VRE 분리율이급격히증가하고있다 [8-12]. VRE의증가가심각한이유는이세균이원내감염균으로서의확산이용이하고, 중증감염증시치료약제의선택이매우어려우며, 포도상구균등다른병독성이강한균종에내성유전자가전달될수있기때문이다. 따라서본연구에서는임상적으로문제가되는균혈증과요로감염에서분리된장구균을대상으로, 1) 균혈증과요로감염균주간의항균제내성양상의기전및차이규명, 2) 균혈증과요로감염균주의병독성인자의검출및차이규명, 3) pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) 를이용한균형형별분석에관하여연구를수행하였다. - 47 -
배경 : 균혈증및요로감염에서분리된장구균에대한항균제내성실태조사및유전적상관성조사의미비로국내전지역에퍼져있는장구균의전파및경로가규명되어있지않다. 방법 1: 유전적상관성조사 1 Pulsed-field gel Electrophoresis를이용한균형형별연구 방법2: 항균제내성기전및병독성인자규명 1 vancomycin을포함한항균제내성기전분석 2 병독성인자검출및차이규명연구 성과 : 국내장구균의유전적상관성에대한기본자료수집 성과 : 균혈증및요로분리주간의항균제내성양상과병독성인자차이규명 최종성과 : 국내전지역에서분리된균혈증및요로감염분리장구균에대한유전적상관성과내성유전자및병독성인자의차이를규명함으로써감염관리대책을수립한다. - 48 -
제 2 절연구과제의필요성 균혈증과요로감염은임상적으로주요한문제가되는감염임에불구하고, 현재국내에서는원인균별내성률조사와내성기전에관한연구가수행되지않고있고, 지역간전파에관한조사도이루어져있지않다. 특히장구균은요로감염에서는 2번째로흔한원인균이며, 균혈증에서도주요한원인균으로대두되고있는반면항균제에대한자연내성및획득내성을가지고있어감염시유용한치료제가많지않다. 더구나최근에는장구균에마지막치료약제로알려진반코마이신에도내성인 VRE의등장으로인하여대책마련이시급하게되었다. 미국질병통제센터는장구균감염에의한사망환자를분석한결과 vancomycin에감수성인장구균에의한사망률이 16.4% 인데반하여 VRE는 36.6% 로 2배이상의차이를보인다고보고하였고 [6], Edmond 등은 VRE로인한패혈증시사망률이 40% 라고발표하였다 [13]. 이러한결과들은모두치료약제가없고, 병원내에한번전파되기시작하면병원내에서쉽게유행되고근절이어렵기때문이다. 장구균감염관리의첫번째단계는전파양상과경로를파악하는것이다. 분리된장구균은유전자의구조분석을시행해야만전파양상이단일균주자체에의한 monoclonal outbreak인지아니면균주는다르더라도내성유전자만이 transposon을통해감수성인장구균으로이동됨이증명되었기때문에내성유전자의수평이동에의한것인지, 그렇지않으면전혀다른다양한균주들이새로이병원으로유입되는것인지그런것이면어느경로를통하는것인지를분석하여야지그경로를차단하는관리대책을수립할수있다. 장구균은장내상재균이고흔히정착균으로존재하므로, 감염증환자의임상검체에서분리된경우병원균인지정착균인지판단하는것은매우어렵다. 그러나현재까지장구균의병독성을평가할만한지표들에관한연구는거의없다. 현재까지보고된병독성인자중에서 enterococcal surface protein 혹은 extracellular surface protein (ESP) 은장구균의주요병독성인자로주목받고있다. 이인자는임상검체에서분리된 vanb 형 E. faecalis에서처음보고되었는데, 임상적으로유의한병독성이있는장구균에서흔히검출되고, 정상인변에서분리된장구균에서는드물게검출되는것으로보고되었다. 즉, 정상인변에서분리된 E. faecalis 중에서는 3% 만 ESP가검출된반면, 혈액배양에서분리된 E. faecalis 중에서는 41% 가검출되었다고하였다 [14-16]. 또한 ESP는 E. faecalis 외에 E. faecium에서도검출됨이보고되었다 [17]. 이두균종은임상검체에서분리되는장구균의대부분을차지하므로 ESP 검출은그실용성이높다고판단된다. 또한 ESP가요로감염에서균집락형성 (colonization) 과집락의존속 (persistence) 에크게기여한다고보고된바있다 [18]. 이에본연구자는 1) 전국각지역에서분리된장구균을대상으로분자생물학적연관성을분석함으로써전파경로를파악하여경로를차단하는관리대책을수립할수있고, 2) 균혈증과요로감염분리주를대상으로병독성의차이를분석함으로써임상검체에서분리된장구균의임상적유의성의판별지표로활용가능하고, 치료방침을결정하는데있어서중요한기준이될수있을것으로기대하였다. - 49 -
제 2 장국내외기술개발현황 제 1 절국내외정책현황및선행연구의문제점 균혈증및요로감염은임상적으로중요한감염증이나현재까지중요감염균에관한병원내에서의분포상황등만이보고되어있을뿐국내전지역에서분리된중요감염균에대한항균제내성양상에관한연구는전무하다. 특히지역간균주의유전적상관성에관한연구도보고된바없어국내감염균의전파양상도알수없는실정이다. 균혈증및요로감염에서중요한빈도를차지하고있는장구균은장내상재균이고흔히정착균으로존재하므로, 감염증환자의임상검체에서분리된경우병원균인지정착균인지판단하는것은매우어렵다. 그러나현재까지장구균의병독성을평가할만한지표들에관한연구는거의없다. 현재까지보고된병독성인자중에서 enterococcal surface protein 혹은 extracellular surface protein (ESP) 은장구균의주요병독성인자로주목받고있다. 이인자는임상검체에서분리된 vanb 형 E. faecalis에서처음보고되었는데, 임상적으로유의한병독성이있는장구균에서흔히검출되고, 정상인변에서분리된장구균에서는드물게검출되는것으로보고되었다 [14-18]. 이에본연구자는 1) 전국각지역에서분리된장구균을대상으로분자생물학적연관성을분석함으로써전파경로를파악하여경로를차단하는관리대책을수립할수있고, 2) 균혈증과요로감염분리주를대상으로병독성의차이를분석함으로써임상검체에서분리된장구균의임상적유의성의판별지표로활용가능하고, 치료방침을결정하는데있어서중요한기준이될것으로기대한다. - 50 -
제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절연구내용 국내전지역에서균혈증및요로감염에서분리된장구균의내성기전및유전적상관성을파악함으로써항균제내성양상, 감염경로및전파기전을알아내고국내에서급증하고있는장구균전파를차단하는대책수립의기본지표를마련하고자하였다. 1. 국내전지역병원의환자로부터분리된장구균의내성유전자검사를통해내성기전을파악한다. 2. 국내전지역병원의환자로부터분리된장구균의병독성인자를검출분석한다. 3. 분리된대상균주에대한균형분석을통해유전적상관성을파악한다. 4. 국내지역간장구균분리이동여부를내성기전파악및분자생물학적방법을이용하여추정한다. 5. 국내균혈증및요로감염에서분리된장구균의항균제내성양상및병독성인자에관한기초자료를마련하여감시체계를구축한다. 제 2 절연구방법 1 연구대상가. 연구대상 : 전국 8개기관환자의혈액및요에서분리된 E. faecalis 및 E. faecium 을대상으로하였다. - 혈액분리주는입원및외래환자에서각각연속분리주를수집하였다. - 요분리주는입원및외래환자에서각각연속분리주를수집하였다. 나. 균주수집요건환자의무기록을검토하여다음과같은요건을충족시키는경우수집하였다. - 균혈증 : 임상적으로발열, 백혈구증다증, 오한등이 8시간이상나타나는감염의소견과함께 1번이상의혈액배양에서균이검출된경우 - 요로감염 : 발열, 빈뇨, 요급박, 배뇨곤란, 옆구리통증, 하복부및치골상부등의급성요로감염증상을호소하며, 소변검사상백혈구수가 5/HPF 이상이며, 요배양에서 10 5 CFU/mL 이상의집락이배양된경우다. 자료수집 (1) 병원명, 병상규모, 환자연령, 병실및외래구분 (2) 분리균주의항균제감수성결과 : 디스크법또는 Kit법모두를포함 2. 항균제감수성검사 : 디스크확산법및한천희석법한천희석법으로 vancomycin, teicoplanin 및 ampicillin에대한최저발육저지농도 (Mininal Inhibitory Concentration, MIC) 를다음과같이측정하였다. 멸균증류수에항균제를녹여검사할농도의 10배농도의항균용액을만든후평판에항균용액 2mL와 48-50 로식힌 Mueller-Hinton agar 18mL를잘섞어굳힌다. Steers' inoculator를이용해균수가약 10 4 CFU가접종되도록한후접종액이배지에완전히흡수된후에 35 에서 16-20시간배양하였고 NCCLS의기준 [19] 에따라균주의 - 51 -
발육이억제되는최소농도를판독하였다. MIC에따라 vancomycin은 32μg /ml 이상을내성, 64μg /ml 이상을고도내성으로판독하였고, teicoplanin은 16μg /ml 이상을내성으로판독하였다. 3. 내성유전자검출 : Multiplex PCR 혈액한천배지에배양한 2-3개의 colony를 TSB broth 10mL에접종하여 24시간배양한후 Dynabeads DNA DIRECT kit(dynal, Oslo, Norway) 를이용하여 DNA를추출하고, 전반응액인동결건조액 PreMix-Top(Bioneer, Korea:Taq polymerase 1 unit, dntp 250μM, 10mM Tris(pH 9.0), 40mM KCl, 1.5mM MgCl 2 ) 이들어있는 0.5mL 시험관에대상균주 DNA 1μl와시발체 1.5μl씩을넣는다. GeneAmp PCR System 9600(Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT., USA) 을이용하여 PCR을시행 (94, 5분, 1 cycle / 94, 30초, 63, 1분, 30 cycle / 72, 5분, 1 cycle) 한후증폭산물을 10μl취해 2% agarose gel에 120V, 20분간전기영동하여 UV하에서관찰하였다. 4. 유전자균형분석 (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) 고형화시킨세균의 DNA는 SmaI (Gibco BRL, Gaithersbrug, Md., USA) 으로처리하였고 CHEF-DR II system (BioRad Lab., Hercules, CA., USA) 을이용하여 ramped pulse time을시작 1 초, 끝 20초로하고 6 V/cm의조건으로 24시간전기영동하였다. 분석은 Bio-Gene software (Vilber Lourmat, Marne la-valles, France) 를이용하여 UPGMA (unweighted pair-group method using arithmetic averages) 법으로군집분석하여유전적연관성을결정하였다. 5. 병독성인자혈액한천배지에배양한 2-3개의 colony를 TSB broth 10mL에접종하여 24시간배양한후 Dynabeads DNA DIRECT kit(dynal, Oslo, Norway) 를이용하여 DNA를추출하고, 전반응액인동결건조액 PreMix-Top(Bioneer, Korea:Taq polymerase 1 unit, dntp 250μM, 10mM Tris(pH 9.0), 40mM KCl, 1.5mM MgCl 2 ) 이들어있는 0.5mL 시험관에대상균주 DNA 1μl와시발체 1.5μl씩을넣는다. GeneAmp PCR System 9600(Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT., USA) 을이용하여 PCR을시행 (94, 5분, 1 cycle / 94, 30초, 63, 1분, 30 cycle / 72, 5분, 1 cycle) 한후증폭산물을 10μl취해 2% agarose gel에 120V, 20분간전기영동하여 UV하에서관찰하였다. - 52 -
제 3 절연구결과 1. 균주수집 : 전국 8개기관환자의혈액및요에서분리된 E. faecalis 및 E. faecium 227주를수집하였다. - 혈액분리주는입원및외래환자에서 78 분리주를수집하였다. - 요분리주는입원및외래환자에서 149 분리주를수집하였다. Table 1. Numbers of isolates from urine and blood specimen Department species No. of isolates Urine OPD E. faecalis 52 E. faecium 23 IPD E. faecalis 39 E. faecium 35 Blood OPD E. faecalis 6 E. faecium 16 IPD E. faecalis 16 E. faecium 40 2. 항균제내성율 Table 2. Frequency of antimicrobial resistance AMP CIP TET VAN TEI LNZ LEV SYN Urine OPD E. faecalis 1.9 58.8 85.7 2 0 0 28.2 97.9 E. faecium 4.5 94.7 15.7 15.7 10.5 0 94.7 5.3 IPD E. faecalis 7.7 60.5 87.5 2.4 0 0 47.9 83.7 E. faecium 100 100 14.2 30.3 20 0 85.7 0 Blood OPD E. faecalis 0 100 100 16.6 0 0 60 83.3 E. faecium 43.7 68.7 6.3 6.7 0 0 43.7 0 IPD E. faecalis 0 56.2 100 0 0 0 53.8 76.9 E. faecium 87.5 95.1 12.1 13.1 21.2 0 100 17.6-53 -
120 100 % 80 60 40 Urine OPD E. faecalis Urine IPD E. faecalis Blood OPD E. faecalis Blood IPD E. faecalis 20 0 AMP CIP TET VAN TEI LNZ LEV SYN Antibiotics Figure 1. Percentage of resistant E. faecalis to 8 commonly used antibiotics 120 100 Urine OPD E. faecium 80 Urine IPD E. faecium % 60 40 Blood OPD E. faecium Blood IPD E. faecium 20 0 AMP CIP TET VAN TEI Antibiotics LNZ LEV SYN Figure 2. Percentage of resistant E. faecium to 8 commonly used antibiotics - 54 -
3. 항균제내성균의유전적상관성 가. Quinolones-resistant enterococci A. B. C. D. E. Figure 3. PFGE pattern of quinolones-resistant enterococci (A-E) - 55 -
Figure 4. Dendrogram of quinolones-resistant enterococci - 56 -
나. Tetracycline-resistant enterococci Figure 5. PFGE pattern of tetracycline-resistant enterococci Figure 6. Dendrogram of tetracycline-resistant enterococci - 57 -
3) vancomycin-resistant enterococci Figure 7. PFGE pattern of vancomycin-resistant enterococci Figure 8. Dendrogram of vancomycin-resistant enterococci - 58 -
4) Q-D-resistant enterococci Figure 9. PFGE pattern of Quinupristin-Dalfopristin-resistant enterococci Figure 10. Dendrogram of Quinupristin-Dalfopristin-resistant enterococci - 59 -
4. 병독성인자양성율 Table 3. Frequency of genetic virulence markers among Enterococci strains isolated from urine and blood esp ACE gele efaa AS Urine OPD E. faecalis 58.8 43.9 58.1 95.8 12.2 E. faecium 70 7.14 29.6 0 0 IPD E. faecalis 69.4 35.2 35.2 89.6 16.6 E. faecium 57.1 0 0 0 3.1 Blood OPD E. faecalis 33.3 33.3 62.5 85.7 0 E. faecium 42.8 16.6 8.0 0 0 IPD E. faecalis 52.9 52.9 46.6 52.9 29.4 E. faecium 58.9 0 5.7 8.6 4.8-60 -
제 4 절연구결론 1. 항균제내성율가. E. faecalis - 외래에서분리된균주의항균제내성율이입원환자에서분리된균주보다낮았다. - 대부분의항균제에대하여혈액분리주의내성율이소변분리주보다높았다. - 2004년의경우반코마이신내성 E. faecalis는없었으나, 2005년에수집한균주에서는범주별로 2-6.7% 의빈도를보였다. - Synercid(Quinupristin-Dalfopristin) 의경우는구성적내성이므로분석에포함시키지않았다. 나. E. faecium - 외래에서분리된균주의항균제내성율이입원환자에서분리된균주보다낮았다. - 대부분의항균제에대하여혈액분리주와소변분리주의내성율차이가별로없었다. - 반코마이신내성장구균 (VRE) 의경우는외래에비하여입원의경우빈도가월등히높아 VRE 전파의대부분이병원내에서일어나고있음을알수있었다. - 입원환자의소변분리주중반코마이신내성 E. faecium (VREF) 이 30.3% 의높은빈도를보였으나, 이는 1개연구참여기관의소변분리주중 VREF 의빈도가 71% 인때문으로추정되며원내 outbreak 가있었을가능성을시사하였다. 다. 내성균의유전적상관성 - quinolones, tetracycline,vancomycin,quinuprstin-dalfopristin 내성균에대하여 PFGE 시행결과대부분의균주가유전적으로상관성을보이지않음으로써 epidemic strain에의한 outbreak이아님을알수있었다. - VRE의경우도각병원의균주가각각다른 PFGE pattern을보임으로써 epidemic strain에의한전파가아니라환자자신의상재균이내성유전자를획득한것임을알수있었다. - 초기연구계획에는내성균의유전적상관성을알아보기위해 multilocus sequence typing (MLST) 분석이포함되어있었으나, 국내에서분리되는 VRE는대부분이단일한 clonal complex-cc78-를나타내었다. Sequence type (ST) 은 ST78형이가장흔하였으며, 나머지도 ST78과 2개이하의 locus variant를가지는 CC78형을나타내어내성균의유전적상관성을알아보는데효용성이떨어진다고판단되었다 [20]. 2. 병독성인자가. esp - esp 인자는소변분리주의양성율이혈액분리주보다높았다. 이는소변분리주에서 biofilm 형성을위하여 esp 보유율이더높은것으로추정된다. - E. faecalis와 E. faecium의양성율차이는보이지않았다. 나. ACE, gele & AS - E. faecalis가 E. faecium에비하여높은양성율을보였다. 다. efaa - E. faecium은소변분리주에서는양성을보이지않았으나혈액분리주에서양성을나타내는균주가있어추후유전자분석예정이다. - 61 -
제 4 장연구개발목표달성도및대외기여도 1. 학문발전에의기대효과가. 내성기전개발나. 유전적상관성분석법의개발다. 병원내감염관리라. 내성세균의지역간이동경로파악 2. 국가경제에미치는효과가. 항생제내성세균의전파방지모델정립나. 항생제내성균에대한국가적병원감염관리사업에획기적인지표를마련 ---> 국내자체의장구균감시체계의토대마련다. 환자의재원기간을줄임으로써의료재정손실을줄임라. 병원의료질을향상시키고서비스의개선 3. 활용방안본연구의결과는병원감염관리차원에서국내균혈증및요로감염분리장구균에관한감시체계를위한기초자료로활용할수있게된다. 또한병독성인자에관한연구와병행하여내성기전을파악함으로써장구균에관한감염관리뿐만아니라다른그람구균특히황색포도상구균이장구균으로부터내성유전자를획득한다면같은기전으로인하여내성이발현될것이므로이의대비작업으로의역할을충분히할수있을것으로기대된다. - 62 -
제 5 장연구개발결과의활용성과및계획 제 6 장기타사항 제 7 장참고문헌 1. Moellering RC Jr. Emegence of Enterococcus as a significant pathogen. Clin Infect Dis 1992;14:1173-1178. 2. Emory TG, Gaynes RP. An overview of nosocomial infections, including the role of the microbiology laboratory. Clin Microbiol Rev 1993;6:428-442. 3. 정석훈, 김문정, 이경원, 정윤섭, 권오헌, 김준명, 김성규, 전세일 : 요와농검체에서의 vancomycin 내성장구균분리 2예. 감염 1996;28:373-377 4. Murray BE. The life and times of the Enterococcus. Clin Microbiol Rev 1990;1:46-65. 5. Leclercq R, Derlot E, Duval J, Courvalin P. Plasmid-mediated resistance to vancomycin and teicoplanin in Enterococcus faecium. N. Engl. J. Med. 319:157-161, 1988. 6. Uttley AHC, Collins CH, Naidoo J, George RC. Vancomycin-resistant enterococci. Lancet i, 57-58, 1988. 7. Ena J, Dick RW, Jones RN. The epidemiology of intravenous vancomycin usage in a university hospital. JAMA 269:598-600, 1993. 8. 박지원, 김양리, 신완식, 강문원, 한경자, 심상인. Vancomycin 내성 enterococci에대한감수성검사. 감염 1992;24:133-7. 9. 이위교. Vancomycin 내성장구균의분자생물학적진단. 대한임상미생물학회지. 1(1):33-36, 1998. 10. 이위교, 이선민, 곽연식. Vancomycin 내성장구균에대한 Vancomycin, penicillin 및 Gentamicin의병용효과. 대한화학요법학회지. 15(2):243-250, 1997. 11. 이위교, 정민권, 곽연식. Vancomycin 내성장구균의분리율, 항균제감수성및내성형에관한연구. 대한임상병리학회지. 18:51-56, 1998. 12. 김수정, 이남용, 송재훈, 김성민, 백경란, 최명식, 김의종, 이위교, 이경원, 배직현. 국내에서분리된 Vancomycin 내성장구균에대한분자역학적연구. 감염. 30:1-9, 1998. 13. Edmond MB, Ober JF, Dawson JD, Weinbaum DL, Wenzel RP. Vancomycin-resistant enterococcal bacteremia:natural history and attributable mortality. Clin Infect Dis 23:1234-1239, 1996. 14. Willems RJL, Top J, Van Den Braak N, et al. Host specificity of vancomycin-resistant Enterococcus faecium. J Infect Dis 2000; 182: 816-23. 15. Mundy LM, Sahm DF, Gilmore M. Relationships between enterococcal virulence and antimicrobial resistance. Clin Microbiol Rev 2000;13(4):513-22 - 63 -
16. Shankar V, Baghdayan AS, Huycke MM, Lindahl G, Gilmore MS. Infection-derived Enterococcus faecalis strains are enriched in esp, a gene encoding a novel surface protein. Infect Immun 1999; 67: 193-200. 17. Rob J L Willems, et.al. Variant esp gene as a marker of a distinct genetic lineage of vancomycin-resistant Enterococcus faecium spreading in hospitals. Lancet 2001; 357: 9259 18. Shankar N, Lockatell CV, Baghdayan AS, Drachenberg C, Gilmore MS, Johnson DE. Role of Enterococcus faecalis Surface Protein Esp in the Pathogenesis of Ascending Urinary Tract Infection. Infect Immun 2001;69(7):4366-72 19. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; eighth informational supplement; National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1998. 20. Ko KS, Baek JY, Lee JY, Oh WS, Peck KR, Lee NY, Lee WG, Lee K, Song JH. Molecular characterization of vancomycin-resistant Enterococcus faecium isolates from Korea. J Clin Microbiol 2005;43(5):2303-6 - 64 -
제 4 세부연구과제 Staphylococcus aureus 의내성기전및 지역간균주의유전적상관성조사 세부과제연구기관 : 울산대학교의과대학 세부과제책임자 : 김미나 - 65 -
목 차 제 1 장 서론 67 제 2 장 국내 외기술개발현황 68 제 3 장 연구개발수행내용및결과 69 제 4 장 연구개발목표달성도및대외기여도 75 제 5 장 연구개발결과의활용성과및계획 76 제 6 장 기타중요변경사항 77 제 7 장 참고문헌 78-66 -
제 1 장서론 제 1 절연구개발의목적 전국 8개의료기관에서 Staphylococcus aureus 에의한패혈증과요로감염을일으킨환자들에서분리된균주를모아서다음연구를실시한다. 1. 항균제감수성자료를모으고, methicillin resistant S. aureus (MRSA) 에효과적인 arbekacin, fusidic acid, linezolid, quinupristin/dalfopristin 등신약을포함하여감수성검사를실시한다. 이들신약에내성이발견되면내성기전과분자역학조사를한다. 2. 항균제감수성결과를원내감염과원외감염, 혈액과소변분리주로나누어해석한다. 3. 역학적검사를위해 PFGE, SCCmec 타이핑을실시하고, 수집한 S. aureus 균주들을원내감염과원외감염, 혈액과소변분리주, 지역별로역학적분석을한다. 제 2 절필요성및범위 S. aureus 는혈액배양에서분리되는균중 Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae 다음의빈도를보이는중요한원인균이며, 소변배양에서그람양성균으로서는 Enterococcus 다음으로흔하다. S. aureus 는병원감염과지역사회감염둘다를유발할수있는병원성이높은세균으로서 S. aureus 의항균제내성은항균제치료에큰어려움을초래한다. 대표적인내성균인 methicillin, oxacillin 등에내성을보이는 methicillin resistant S. aureus (MRSA) 는전국적으로대학병원급에서는 70-80% 에달한다. 최근에는지역사회획득성 S. aureus 중에도 MRSA 가존재하고심각한감염을일으킨예가보고되고있다. MRSA 경우대부분의항포도상구균약제에내성으로실질적으로 vancomycin. teicoplanin 등 glycopeptide 류만사용할수있게되는데, 과거 7-8년동안 glycopeptide 에 nonsusceptible, resistant 또는 tolerant 한균의출현으로 vancomycin 치료가실패하는경우가문제가되고있다. 최근 linezolid, quinupristin/dalfopristin 등신약이 glycopeptide 를대체할수있는항균제로등장하면서, 임상에사용한지는 2-3년에불과한데이미내성균이보고되고있는실정이다. 제 3 절연구방향 국내여러대학병원들의혈액과소변에서분리되는 S. aureus 의항균제감수성실태를모니터링하고, 새로운항균제내성균을발견하고, 분자역학적조사로병원간, 지역간전파가능성을규명하고자한다. - 67 -
제 2 장국내 외기술개발현황 세계적으로메티실린내성황색포도상구균과반코마이신비감수성황색포도상구균은치료에어려움때문에슈퍼박테리아란별명을얻을정도로관심의대상이되고있어서많은내성실태와기전연구가이루어지고있다. 특히미국에서 2002년, 2003년반코마이신내성장구균의내성유전자가황색포도상구균에전파되어반코마이신에완전내성인균주가출현한점과, 세계각지에서지역사회획득성메티실린내성황색포도상구균이심각한감염을일으킴으로써전세계적으로황색포도상구균에서항균제내성을검출하고조기에확산을막기위한노력이이루어지고있다. 이들내성균을목표로하는신약들이임상에이용되면서, 몇년이안됐지만, 이미내성균들이보고되고있어서신약개발또한내성균확산방지를위한노력이병행되어야함을알수있다. 이런상황에서개개의국가, 유럽, 아시아, 또는세계각국을묶는감시체계가구성되어있으며, 국내에서도반코마이신비감수성황색포도상구균에대해서임상미생물검사실을기반으로한국가적인감시체계가구축되어있다. 따라서국내에서전국적으로검사실이주축이되어황색포도상구균의내성을감시하는네트워크를구성하는것은국민보건을위해필수적인사업이며, 이번용역연구가지속적으로이루어지면이목표를효과적으로달성할수있을것이다. - 68 -
제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절연구수행체계 전국 8개병원에서 3개월에걸쳐혈액및소변배양에서분리된황색포도상구균의항균제감수성자료와균이분리된환자의임상적, 역학적자료를얻는다. 수집한균주로최소억제농도감수성검사와분자역학적인검사를실시한다. 임상적, 역학적자료에기초하여병원감염환자와지역사회감염환자로분류한다. 병원감염균주와지역사회감염환자, 배양검체별 ( 혈액배양과소변배양 ), 지역별, 검사기관특성별항균제내성의차이와항균제내성및역학적자료와비교한다. 제 2 절연구내용 1. 연구방법가. 연구대상 (1) 아래의전국 10개기관에서대학병원에서 2005년 4월부터 9월까지 3개월간혈액과소변배양에서분리된 S. aureus 균주를대상으로한다. ( 가 ) 혈액분리주는입원및외래환자에서각각 1명당 1균주의원칙하에연속분리주 5-10주씩수집한다. ( 나 ) 요분리주는입원및외래환자에서각각 1명당 1균주의원칙하에연속분리주 5-10주씩수집한다. ( 다 ) 총 200주정도를수집한다. 각기관은수집한균주를주관기관인서울대학교의과대학으로보내고, 주관기관에서본세부과제를실시하는연구자에게보낸다. (2) 균주수집요건환자의무기록을검토하여다음과같은요건을충족시키는경우수집한다. ( 가 ) 균혈증 : 임상적으로발열, 백혈구증다증, 오한등이 8시간이상나타나는감염의소견과함께 1번이상의혈액배양에서균이검출된경우 ( 나 ) 요로감염 : 발열, 빈뇨, 요급박, 배뇨곤란, 옆구리통증, 하복부및치골상부등의급성요로감염증상을호소하며, 소변검사상백혈구수가 5/HPF 이상이며, 요배양에서 10 5 CFU/mL 이상의집락이배양된경우 (3) 자료수집 ( 가 ) 병원명, 병상규모, 환자연령, 성별, 검체채취일, 병실및외래구분 ( 나 ) 수집한균주들의항균제감수성결과 : 검사방법과배지, 감수성결과나. 원내감염의정의입원한지 2일이지난환자에서원인균이분리된경우로정의한다. 외래와응급실에입원한지 2일이내환자에서균이분리된경우는비원내감염으로정의한다. 다. 검사방법 (1) 항균제감수성검사 : 최소억제농도법한천희석법으로최소억제농도 (minimal inhibitory concentration; MIC) 를결정한다. ( 가 ) Mueller-Hinton agar (MHA) 를사용하여항균제는두배연속희석법 (two-fold serial - 69 -
dilution method) 에따라희석하여평판배지를만든다. ( 나 ) 분리된균주를혈액한천배지에집락이잘분리되도록접종하여 16-18시간키운다. ( 다 ) 순수분리된집락 3-4개를따서 MH broth (MHB) 에풀어서 MacFarland 0.5의탁도로맞춘다. ( 라 ) ( 다 ) 의균액을자동접종기로 0.4 ul씩항균제를포함하지않은평판배지와포함한평판배지에접종한다. ( 마 ) 대기조건, 35 에서 16-18시간, oxacillin은 24시간배양한후육안으로관찰하여균이자라지않은항균제의가장낮은농도를최소억제농도로정의한다. - 정도관리는 S. aureus 29212 주를감수성표준균주로사용하여 NCCLS 기준에따라시행하여, 배지및항균제역가가적절함을확인한다. Table 1. S. aureus의항균제감수성표준표 (2005, NCCLS) MIC breakpoints ( μg / ml ) Antimicrobial agent Susceptible Intermediate Resistant Linezolid 4 Oxacillin 2 4 Quinupristindalfopristin 1 2 4 Rifampin 1 2 4 Fusidic acid* 1 2-4 8 Gentamicin 4 8 16 Arbekacin* 8 16 Vancomycin 4 8-16 32 * Eurpean criteria for Fusidic acid, Japanese criteria for Arbekacin (2) Vancomycin resistance screening test 4 ug/ml 의 vancomycin을포함한 brain heart infusion agar을제작하여 McFarland 0.5로탁도를맞춘균액 10 ul를접종한다. 집락이하나라도관찰되면확인검사를실시한다. (3) Pulsed field gel electrophoresis (4) SCCmec typing - multiplex PCR: meci, CIF2, KDP, DCS, RIF4, RIF5, IS431, pub110, pt181 (Oliviera et al., AAC 2002) - Multiplex PCR for ccr type (Ito et al., AAC 2001) - 70 -
제 3 절연구결과 1. 비원내획득성요로감염 (Non-hospital-acquired urinary tract infection; NU), 원내획득성요로감염 (Hospital-acquired urinary tract infection; HU), 비원내획득성균혈증 (Non-hospital-acquired blood stream infection; NB), 원내획득성균혈증 (Hospital-acquired blood stream infection; HB) 에서총 173균주의 S. aureus 를수집하였다. Table 1. Number of isolates according to the mode of acquisition and site of infection No. of isolates NU 29 HU 47 NB 34 HB 63 Total 173 2. 항균제감수성자료수집과감수성검사실시가. 항균제감수성결과는 Table 2에정리하였다. (1) 총 MRSA 는 101균주로 58.4% 였다. 일반적인임상균주전체통계에비해비율이낮다. NU, HU, NB, HB에서분리된균주들에서 MRSA 비율은 48.2%, 23.4%, 64.7%. 39.7% 로요로감염에서분리된균, 원내감염에서 MRSA 비율이높았다. 기존의보고에비해전체 MRSA 비율이낮게나온것은 4가지부류로나누어균주를수집하였기때문에무작위적으로임상균주를모은경우에비해지역사회감염균이더많았기때문일것이다. (Table 2) (2) MRSA, MSSA 모두에항균력을유지하고있는항균제는 teicoplanin(100%), vancomycin(100%), linezolid(100%), quinupristin/dalfopristin(100%), arbekacin(94.2%) 등이었다. 감수성률이 80% 이상인약제중 cotrimoxazole 은 MRSA 경우 19.0% 가내성인데비해, MSSA 경우 1.3% 만내성으로 MRSA에서내성률이높았다. 감수성률이 80% 미만인약제중에서는감수성률은 fusidic acid(69.3%), tetracycline(59.5%), ciprofloxacin(56.1%), clindamycin(57.2%), erythromycin(49.5%), gentamicin(47.0%), 순서였다. (Table 3) (3) Fusidic acid 는지역사회획득성감염균주들과원내감염균주들사이에감수성율에차이가없거나, 원내감염에서오히려약간감수성율이높았고, MRSA, MRSA 균주들중감수성균주가 75 균주 (74.2%), 47균주 (66.2%) 로 MSSA에서오히려내성이높은점은지역사회에 fusidic acid 내성균이확산되어있음을시사하였다.(Table 3) (4) MRSA는 cotrimoxazole, tetracycline, ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin, gentamicin에대해내성이동반되는경우가많아서다제내성을보이게된다.(table 3) (5) Erythromycin 과 clindamycin 내성은공조현상을보이는데 D-test 결과를고려하면, erythromycin 내성, clindamycin 감수성의경우 100% MLS Bi 에합당한결과를보임으로써 erythromycin 내성균은우선 clindamycin 에도내성으로간주해야할것이다.(Table 3) (6) 2004년에비해항균제내성양상은큰변화가없었고, vancomycin, teicoplanin, quinupristin/dalfopristin, linezolid에대해서는 100% 감수성을유지하였다. 2005년에 MRSA에서 - 71 -
gentamicin 감수성이증가했다. Table 2. Antimicrobial susceptibility of 177 S. aureus isolates against 15 antimicrobial agents % susceptibility Antimicrobials NU(n=29) HU(n=47) NB(n=34) HB(n=63) Total (n=173) Penicillin 10.3 0 5.9 3.2 4.0 Oxacillin 48.2 23.4 64.7 39.7 41.6 Erythromycin 37.9 29.7 67.6 46.0 49.5 Gentamicin 48.2 36.1 61.7 44.4 47.0 Ciprofloxacin 51.7 42.5 79.4 53.9 56.1 Clindamycin 55.2 44.6 79.4 66.7 57.2 Cotrimoxazole 93.1 85.1 91.1 85.7 87.3 Tetracycline 58.6 48.9 76.4 61.9 59.5 Arbekacin 96.6 91.4 91.1 96.8 94.2 Fusidic acid 68.9 72.3 58.8 66.6 68.2 Teicoplanin 100 100 100 100 100 Vancomycin 100 100 100 100 100 Linezolid 100 100 100 100 100 Q/D 100 100 100 100 100 Table 3. Antimicrobial susceptibility of MRSA and MSSA isolated in 2004 and 2005 % susceptibility 2004 2005 Antimicrobials MRSA (N=101) MSSA (N=72) MRSA (N=101) MSSA (N=72) Penicillin 0 9.7 0 9.7 Erythromycin 8.4 72.2 14.8 86.1 Clindamycin 30.0 95.6 30.7 95.8 Ciprofloxacin 17.5 96.0 25.7 97.2 Gentamicin 9.3 74.4 23.7 77.7 Cotrimoxazole 78.3 100.0 81.0 98.7 Tetracycline 32.6 92.1 37.6 91.6 Arbekacin 89.1 100.0 Fusidic acid 71.3 63.8 나. 반코마이신내성선별 V4 배지에서자란균주가 16개 (9.2%) 였고, V4 배지에자란집락을따서 Etest로반코마이신에 대한감수성검사를한결과 MIC가 1.5에서 4 ug/ml의분표를보였다. MIC 4 ug/ml인균주는 1-72 -
균주로 2005년까지의 CLSI 기준으로는감수성이지만, 2006년부터는 intermediate 범주에속하기때문에국내에서 vancomycin 에비감수성인 S. aureus 가 0.5% 의분리율을보였다. 다. MLS B 에의한내성기전 Erythromycin 내성, Clindamycin 감수성인 20균주에대해 Dtest 를실시한결과모두양성으로서 MLS Bi 에의한내성으로판단되었다. 3. 분자역학적분석 가. SCCmec 타이핑결과 SCCmec type 은 II, III, IV가 54 (53%), 20 (20%), 27균주 (26.7%) 로 I 이하나도없었고, II 가가장우세하였다. 비원내획득성감염에서분리된 27 균주중 II, III, IV가 48.2%, 18.5%, 33.3% 로전체분포에차이가없었다. IV 형은 nonmultiresistant 특성을보였다 (Table 5) IVa 형 25 균주로비원내획득 9 균주와원내 16균주를포함하여원내와비원내획득감염사이의분포는다른형과차이가없었다. 병원별 SCCmec type 분포에는차이가없었다 Table 4. Distribution of SCCmec type SCCmec type NU HU NB HB Total II 7 21 3 19 50 II (kdp -) 3 1 4 III 1 5 3 7 16 IIIa 2 1 3 IIIb 1 1 IV 1 1 2 IV (pub110+) 5 7 4 9 25 Total 16 36 11 38 101-73 -