Chapter 9 DNA Replication 1
9.1 General features of DNA replication DNA replication 은반보전적이다. Semiconservative Replication Conservative Replication Dispersive Replication 위의그림처럼 Watson 과 Crick 은 DNA 복제시두가닥이분리되며각가닥이새가닥의합성을위한주형으로작용하는 semiconservative 를생각. 그러나그당시에는 DNA 의변성이나가닥의분리가불가능할것으로생각함. 다른대안으로 conservative replication 과 Dispersive replication 을생각하게됨. 2
Semiconservative replication 을증명하는실험 Meselson 과 Stahl 의실험 1. culture E. coli in [ 15 N]NH 4 Cl-containing (heavy) medium 2. transfer bacteria to growth [ 14 N]NH 4 Clcontaining (light) medium 3. remove samples at different times and extract DNA 4. subject DNA to cesium chloride density gradient centrifugation 배양초기에추출된 E. coli DNA 는 15 N 을갖고있어 dense 한쪽에서 DNA 가검출되고 14 N 을갖고있는 light medium 으로옮긴후세대가거듭할수록덜 dense 한곳에서 DNA 가검출된다. 15 N 배지에서 14 N 배지로세포를이전한후 1 세대가되면한가닥은 15 N strand 이며다른한가닥은 14 N strand 이다. 3
DNA replication 은 bidirectional Unidirectional replication Bidirectional replication 1963 년 Cairns 는복제가 θ 구조인것을관찰함. 그러나복제방향이양방향인지단일방향인지는모름 1973 년 Gyurasits 와 Wake 는복제방향을알아내기위하여 [ 3 H]thymidine 이있는배지에서키움. 초기에는약한농도에서키우다가나중에는높은농도에서키움. Bidirectional replication; 양쪽끝이진하게나옴 Unidirectional replication; 한쪽끝이진하게나옴 Figure 9.6 4
Figure 9.7 위의사진처럼양쪽끝이진하게나와 Bidirectional replication 임이증명됨 Figure 9.08: Bidirectional replication. (θ 구조 ) 5
DNA replication is semidiscontinuous DNA 는두가닥으로되었으며각각의가닥이서로반대방향으로뻗은 antiparallel 이다. 그러나 DNA polymerase 는 5 에서 3 으로새로운 DNA 를합성함. Discontinuous model Semidiscontinuous model 1968 년 Okazaki 는 3 5 사슬이 discontinuous 할것이라는가설을제안함 Discontinuous model 은모든새로형성된 DNA 는조그만분절로존재하나 semidiscontinuous 는하나는긴분절이고다른가닥은조그만분절로존재. E.coli 를 [ 3 H]thymidine 하에서다양한시간에키우고 DNA 를추출한후 sucrose gradient centrifugation 을함. 실험결과 5 초배양후윈심분리 Tube 의윗부분에서방사선동위원소가감지됨. 이는 30 초까지증가. 약 1,000-2000bp 로간주. 두번째 fraction 은 10 초에서는거의감지않되지만 60 초에서뚜렷이나타남. 이는적은분절이큰분절로이어졌다고간주 6
The leading and lagging strands of semidiscontinuous replication Phage λdna 의복제를전자현미경으로보면짧은단일가닥지역이관찰되며 discontinuous 가닥의합성시작부위를나타냄. Leading strand ( 선도가닥 ) 와 lagging strand ( 지연가닥 ) 가있어선도가닥은 continuous Replication 을하며 lagging strand 는 discontinuous replication 한다. 이때생기는분절을 Okazaki fragment 라고한다. DNA 중합효소는새로운 DNA 가닥의합성을시작하는것이아니라이미존재하는 primer 의 3 끝에단지 deoxyribonucleotide 를첨가만하는역할을한다. 7
9.2 Bacterial DNA replication machinery E. coli 의복제는가장기본적이고연구가많이됨다음의세단계로나눈다. initiation assembly of the replication apparatus at a unique site elongation leading and lagging strand synthesis termination begins when the two replication forks meet half way around the chromosome 표 9.1 처럼 DNA 복제에필요한유전자들은돌연변이를이용한연구에서밝혀짐. Quick-stop mutants; 돌연변이체를제한온도로옮겼을때바로기능이멈춘경우. Slow-stop mutants; 돌연변이체를제한온도로옮겼을때그회의복제는계속되고새로운복제가안되는경우를의미. 8
9.3 Initiation stage in bacteria 1960 년대 Francois Jacob 와 Sydney Brenner 는 DNA 복제를설명하기위하여 replicon model 을주장함. Replicon; 플라스미드, 박테리아, 진핵세포염색체처럼독립적으로복제하는 DNA 분자. Initiator protein 이 replicator ( 복제가되는 DNA 분자내의특정서열 ) 에붙어서복제가시작 Replicator 내에복제가시작되는부위를 origin of replication (ori) 라고한다. E. coli initiator protein (DnaA) 은 4 개의 domain 으로됨. Domain I; oligomerization 과 DnaB protein (helicase) 를불러드린다. Domain II; DnaB 가일시적으로결합 Domain III; ATP 가결합하고 ATPase activity 를갖음 Domain IV; DNA 결합부위 Figure 9.14 9
The E. coli origin of replication oric Figure 9.15 E. coli oric 주변의유전자들. 화살표방향은전사방향을나타냄. 좌측그림은 oric 를분리하는실험을설명함. Plamid DNA 의원래 oric 를제거한후재조합방법을이용하여염색체의 oric 와항생제저항성을갖은것만선택함. 이러한연구를통하여 oric 에서꼭필요한서열이 245bp 정도라는것을밝힘 oric 내의중요 element를보면 ( 그림상단우측 ) DnaA box (R1-R5); 9bp (TTATNCACA) 로구성되었으며 DnaA단백질-ATP가강하게결합. I boxes (I1-I3); DnaA단백질-ATP가결합하며 R과 I에 DnaA 단백질이결합하면좌측에있는 3개의13mer (AT rich, 초록색 ) 지역이풀려이곳에 20-30 개의 DnaA 단백질이더결합한다. 이때단백질내의 oligamerization 지역이작용하여커다란 aggregate를만든다 10. 다음으로 SSB가결합하여풀어진지역을확장한다.
DNA 복제의 initiation 과정초기의 origin 인식과 DNA unwinding 은앞에서설명. Figure 9.18 다음단계는 DnaC 와 DnaA-ATP 의도움으로 DnaB (helicase) hexamer 가풀어진 AT-rich 지역에결합을한다. DnaB helicase 는 5 3 쪽으로이동하면서 65nucleotide 정도를풀어놓는다. 다음으로두개의 DnaG (primase) 가결합하여 RNA primer 를합성함. Initiation 의마지막단계로는 DnaA-ADP 를 DnaA box 에서제거하고 sliding clamp 와 DNA 중합효소 III 의첨가임. Initiation의조절 ; 1) DnaA 단백질은 ATPase 활성을갖고 helicase가결합하면활성을나타냄. 그산물이 DnaA-ADP는ADP가 ATP로전환되지않는한다시작용을못함. 2) oric 내에 methylation 부위가있어 parental strand와새로합성된 strand를구분하게함. Hemimethylated oric지역에 SeqA 단백질이결합하여새로운복제가일어나지못하게함 11
9.4 The stages of elongation DNA 복제는여러다른단백질이협동해서작용하는복잡한일이며아주빠른속도로새로운 DNA 사슬을합성한다. DNA polymerization III 는 holoenzyme 이며 DNA 를 5 3 으로합성한다. 그러나혼자작용하는것이아니라몇개의효소와협동적으로작용한다. DNA Polymerase III bacterial replication machinery DnaB helicase uses energy from ATP hydrolysis to unwind dsdna moves 5' 3' along the lagging template strand activates primase DNA gyrase and topoisomerase I act cooperatively to relieve the torsional strain created by unwinding the double helix Single-stranded binding protein coats the lagging strand template as helix is unwound by helicase 12
Primase (DnaG) catalyzes the formation of RNA primers for Okazaki fragment formation during lagging strand synthesis Ribonuclease H (RNase H) removes the RNA primers at the 5' end of Okazaki fragments DNA polymerase I extends the 3' end of the Okazaki fragment to the 5' end of the next fragment after primer removal DNA ligase joins adjacent Okazaki fragments DNA polymerase III DNA polymerase I 을최초로발견하였으며초기에는 polymerase I 이유일한중합효소라고생각함. 그러나 pola (DNA polymerase I) 유전자가돌연변이가일어나도 DNA 합성이계속되는것을보고 II 와 III 를발견함. DNA 중합효소 III 유전자는필수유전자임. Processivity; DNA 합성기간에해당중합효소가얼마나강하게그리고오래 DNA 주형에결합되어있는가를나타내는값. DNA 중합효소 III 은 holoenzyme 으로모든 subunit 가결합된상태에서강한 processivity value 를나타냄. 13
α subunit catalyzes 5' 3' chain growth and is essential for DNA synthesis ε subunit has 3' 5' exonuclease activity for proofreading cells with defective ε subunit have high mutation rates θ subunit may stimulate ε subunit but is not essential 14
The sliding clamp (β-dimer) Figure 9.22 Sliding clamp 는 β-dimer 혹은 β-clamp 로알려져있으며 dnan 유전자에의하여암호화되는두개의동일한 polypeptide 로구성. 이들이 head to head 로연결되며각각 3 개의 domain 으로구성됨. homodimer with semicircular subunits forms a ring with an inner diameter big enough to fit DNA double helix 직경이 3.5nm 이며 DNA 가들어가기에충분하다 sufficient space between ring and DNA for one or two water layers allows for sliding of clamp (ice skate 를타는원리 ) carboxyl ends of subunits associate with remainder of holoenzyme holoenzyme 의 processivity 를증가시킴 15
Clamp loader subassembly Clamp loader 는 5 -overhang 을갖는주형 DNA 에 sliding clamp 를 load 하기위하여 ATP 를이용한다. 중합효소 III 의일부분으로존재하며또한 free form 으로존재하기도한다. Free form 은 γ 3 δδ χψ 이고 holoenzyme 에존재할시 τ 2 γδδ χψ 로존재한다. γ 와 τ 는동일한 dnax 유전자에서만들어지나 τ 는전체길이를암호화한것이고 γ 는 c-terminal 의 ⅓ 이없다. C-terminal 은 core polymerase 와 DnaB helicase 와결합하는중요한부위이다. Clamp loader 를연구하기위하여실험실에서합성하여 γ 3 δδ 을만들었으며이를 mini clamp loader 라고명명함. 나머지 ψ,χ subunit 는 clamp load 에관계가없으며 Ψ subunit 는 clamp loader 의안정화에기여하고 χsubunit 는 SSB 에서 primase 를분리한다. 그림 ; ATP 가 clamp loader 에결합하면 loader 가 sliding clamp 에강하게결합한다. 이들복합체는 5 -overhang DNA 에강한친화력을갖는다. 16
Figure 9.25 Miniclamp 에서각각의역할을조사하고자각 subunit 를분리하여 ATP 의존재와비존재하에서실험을행함. 그결과방사선동위원소로 label 된 sliding clamp 를이중가닥 DNA 에 load 한후각각의 subunit 와배양을함. 그결과 δunit 가 ATP 가존재하거나안하거나 DNA 로부터 sliding clamp 를방출함. δunit 은 βdimer 의연결된면을여는 wrench 로작용 Mini clamp loader 의구조 17
Clamp loading γsubunit 는 ATP 에결합하여 ATP 를 hydrolyze 하는 motor 로작용. δ subunit 은 δsubunit 의반응을조절함 (a) ATP 가없을때 δ 은 δsubunit 과가까이위치하여작용을막음 (b) ATP 가존재하면 γsubunit 에결합하여형태적인변화를야기시켜 δ 가 βdimer (sliding clamp) 에결합하게하고이들은 5 -overhang 을갖는 DNA 에결합한다. (c) DNA 가 central cavity 로통과한것이확인되면 ATP 가 hydrolyze 된다. (d) δ unit 는 δ unit 근처로이동하며 β dimer 가닫힌다. clamp loader 가떨어져나오면 sliding clamp 만이 DNA 를싸고있으며중합효소 III 의다른 core 부위와반응을한다. Figure 9.26 18
Trombone model of replication 1980 년 Bruce Albert 가 trombone model 을주장함. 주형 DNA 의지연가닥은각각의 okazaki fragment 가생길때고리를만들며이에의해지연가닥과선도가닥이반대방향으로 DNA 를합성을해도두개의 core polymerase 가동시에작용을한다. Figure 9.27 Primase (DnaG) 가약 10-12base의 RNA primer를만듬. Primase와 DnaB helicase는서로관계를맺음. 이때 clamp loader의 τ subunit에의해 helicase의활성이증가함 χ subunit은 SSB와 primase를분리하여 primase를방출함. clamp loader가앞에배운기작으로 β clamp를 load함. 다음으로 clamp loader가떨어져나오면 β clamp가자유로이 core enzyme과 19 결합을함.
9.5 Termination stage in Bacteria Figure 9.28, 29 두개의 replication fork 는궁극적으로염색체의반대쪽에있는 termination region 에서만나복제가끝나고결국염색체가분리된다. termination sites (Ter sites) 가중요하며 11bp 의 conserved 된서열이며양방향으로존재한다. 한방향으로존재할때동일방향의복제과정은통과하나반대방향의복제는멈추게된다. E. coli 는 10 개의 Ter site 가있으며두집단으로모여있다. 그림 9. 28 처럼 TerC, TerB, TerF, TerG, TerJ 는시계방향으로움직이는복제를멈추게하고 TerA, TerD, TerE, TerI, TerH 는반대방향을멈추게함. 그림 9.29; Terminus utilization substance (Tus) 이라는단백질이 Ter 부위에결합. Tus 단백질은 Ter 부위에 monomer 로부착하나매우강하게결합하며이들복합체는 DNA 사슬을푸는 DnaB helicase 의작용을막음으로써 replication fork 의진행을막음 20
Topoisomerase IV 와 recombinase 가새로형성된낭염색체를분리시킨다. Topoisomerase IV 는 catenated (interlocking rings) 된것은분리시키지만복제기간에홀수의재조합이일어나공유결합으로연결되 dimer 를만든것은분리시키지못한다. 이처럼염색체가분리가안되면낭세포로분리되어서이동을하지못한다. 이경우에는 recombinase 가 termination 지역의 dif 라는특정부위를잘라서 dimer 를두개의염색체로분리한다. Figure 9.30 21
9.6 Eukaryotic DNA replication machinery 진핵세포의복제기작은원핵세포의복제기작과매우유사하나다른점도있다. 이곳에서는첫째 saccharomyces cerevisiae 의복제기작을배우고두번째로는 simian virus 40 (SV 40) 의기작을배우며또한약간다른진핵세포의복제체계를배울것이다. 9.7 Initiation stage in eukaryotes 그림 8.34에서보듯이 early region에서발현하는 T antigen이 DNA 복제에필요한 viral protein이며 early와 late 유전자지역사이에있는 ori에작용을한다. T antigen은 708 아미노산이며아래그림처럼 4개의구역으로나뉜다. Figure 9.31 origin binding domain (obd, 131-259 residue) 은 ori 를인식하고 T antigen 을 origin of replication 으로모으는역할을한다. helicase domain (265-626) 은 DNA 를푸는일을함. DnaJ (1-82)domain participates in remodeling protein complexes 그림 9. 32 에서보듯이 monomer 로존재하나작용시는 hexamer 로모여서작동한다. 22
SV 40 의 replication origin 은약 300bp 이나그중 64bp 가 core sequence 로 DNA 복제에필수적인부위이다. core sequence 는다시 3 개의지역으로나뉜다. early palindrome (EP), T antigen 결합부위를포함하는 27-bp 지역, 17-bp 의 AT-rich 지역이존재함. 두쌍의 T antigen 이 core sequence 내의 4 개의반복된서열에결합을한다. ATP 가존재할때각쌍의 T anitigen 분자는이중 hexamer 가결합하는전구체로작용을한다. T antigen hexamer 는중앙에커다란방 (<68Å wide) 과벽에구멍이있어가닥분리가일어날수있다. 우측그림은가닥분리가일어나는 looping model 임 초기의 replication bubble를완성하기위하여 replication protein A (RPA) 와 SSB 복합체가새로만들어진 single strand 지역에결합을한다. RPA는 single strand가다시결합하거나사슬내에이차구조를만드는것을막으며 T antigen과 interaction을한다. RPA와 T antigen은 DNA polymerase α-primase (Pol α) 를불러드린다. Pol α는각 subunit에서 primase와 DNA 중합효소의역할을한다. Primase가 RNA oligomer 23 를 8-10개를합성하면다음으로 DNA 중합효소 subunit가 DNA를합성한다.
Eukaryotic chromosomes have multiple origins of replication Figure 9.35 Long linear eukaryotic DNA 분자는여러부위에서 DNA 복제를시작한다. 전자현미경사진을증거로할수있다. 이들간의간격은약 10 300kb 정도이며양쪽으로복제를하면서나중에는이웃의 bubble 과만나게된다. ( 그림 9.35) 24
Yeast ARSs Figure 9.37 1980 년 Ronald Davis 는효모의 autonomously replicating sequence elements (ARS element) 를발견함. 그림 9. 37 에서 ARS element 를갖는 plasmid 는복제가독립적으로이루어지나 ARS 가없고 LEU 유전자만을갖는경우는효모의염색체내로 LEU 유전자가 integration 되어만살아남음. 효모는약 400 개의 ARS 를갖고있음. 반면에고등동물은수천개를갖음. 위그림은효모염색체 VI 의 ARS 를나타냄효모에 ARS 가여러개있는이유는박테리아보다복제진행속도가느리고염색체가크기때문이다. 25
효모에서 ARS1 과 ARS307 이많이연구되었다. ( 그림 9.39) ARS element 에는 11-bp element 5 -(A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/G)-3 가있으며이를 A-element 혹은 ARS consensus sequence (ACS) 라하며이주위에 A/T rich 서열이존재. A-element 뿐아니라주위의서열도 ARS 의기능에중요한역할을함. A- element 주위에뚜렷한기능이있는부위로 ARS1 은 B1, B2, B3 를갖고있고 ARS 307 은 B1, B2 를갖고있다. A-element 와 B1 에효모의 initiator protein 인 origin recognition complex (ORC) 가결합을한다. 효모중에서 S. pombe 는다른서열을갖고몇 mammalian 에서도다른서열을갖고있으며아직많은연구가되어야한다. Mapping origins using two-dimensional gels. Figure 9.40 26
Initiation complex at the origin 복제초기단계에 ARS 와어떤단백질들이작용하는가를조사함. Origin recognition complex (ORC) 는 heterohexamer 로 origin 에결합을하고 Cdc6 를불러드린다. Cdc6 는 Cdt1 과작용을하며 MCM complex 를불러드린다. Figure 9.41 ORC binds ARS elements recruits other proteins to complex Cdc6 cell division cycle protein helps recruit Cdt1 is degraded once initiation is complete Cdt1 recruits MCM to origin and to initiate S phase MCM ATP-dependent helicase to unwind DNA 27
9.8 Elongation stage in Eukaryotes 진핵세포의신장과정은매우유사하며이곳에서는일반적인것을배울예정임 28
진핵세포의복제에서선도가닥과지연가닥은서로협동적으로복제를진행하나이곳에서는편의상분리하여공부를한다. 선도가닥합성에있어서 Polα 가 initiator DNA 를합성하면두번째중합효소인 DNA 중합효소 δ (Pol δ) 가이어서 DNA 를합성한다. 포유류의 Pol δ 는 5 3 polymerase activity 와 3 5 exonuclease activity 를갖고있다. Pol δ 는 sliding clamp 에연결되어 DNA 에결합됨. 진핵세포의 sliding clamp 는 proliferating cell nuclear antigen (PCNA) 로알려졌으며박테리아와유사한 4 차구조이나 3 개의단위체로됨 ( 그림좌측하단 ) polymerase switching mechanism 사람의 PCNA sliding clamp E.coli 의 β sliding clamp 29
Lagging strand 의복제 1) Okazaki fragment synthesis; replication bubble 이자라면 Pol α 가지연가닥주형에결합하여 initiator DNA 를합성. 이것이 Pol δ 와교환되어다음 DNA 합성. 2) Okazaki fragment maturation; ( 그림 9.45) Pol ε; DNA replication 에관계하며 polymerase 와 exonuclease 의역할을모두갖는다. 필수적이나때로다른효소가대치하기도한다. 연구가더필요 그림 9.45; 지연가닥, 선도가닥의복제를요약 Figure 9.44 Figure 9.45 30
9.9 Telomeres and telomerase linear duplex 인진핵세포의염색체는 circular bacterial DNA 복제와다는문제점이있다. 진핵세포의염색체에는 telomere 라고하는 G 가많은 3 single overhang 이존재하기때문 telomere 의구조가밝혀지기전에는지연가닥합성이문제라고생각. 즉 okazaki fragment 의끝부분에존재하는 RNA primer 가제거되면 C-rich 가닥이짧아질것으로생각. 그러나 G- rich strand 가 3 overhang 이라서문제가안됨. 문제는선도가닥의 G 가짧아지는것이문제임 C-rich strand 는지연가닥합성에의하여조립. G-rich strand 는선도가닥합성에의하여조립. telomere 가짧아지면결국염색체가소실됨. telomerase 가이러한문제를해결함. Figure 9.46 31
Telomerase 의역할 Figure 9.48 Tetrahymena의 telomerase에서 159개의 nucleotide RNA subunit를분리하고내부에 5 -CAACCCAA-3 서열이있음을밝힘. 이서열은 telomeric repeat인 d(ttgggg) n 과상보적임. 다른생명체에서의 telomerase RNA의서열은각각다를지라도해당생명체의 telomeric DNA와는상보적임. 이는 RNA가 telomeric DNA 합성의주형으로작용한다는것을의미함. 그림 9.48에 telomerase의반응을설명. Telomerase는암과노화에중요한역할을함. 일반적인 somatic cell은몇번분열을하다가 senescence의상태로들어감. 그러나 germ-line cell이나 cancer는계속적으로분열 32. 이러한현상은 telomerase와밀접한연관이있다
9.10 DNA replication in the Archaea 처음에는 archaea 의복제가원핵세포와유사한점이있을것이라고생각하였지만실제연구결과로는진핵세포와더가까운점이많다. 그러나일반적인복제과정은원핵, 진핵세포에서와동일하다. 즉 semiconservative, bidirectional, semidiscontinuous 함 Initiation stage; Oric1/Cdc6 가 origin of replication 에결합하고이들이 MCM 을불러드린다. MCM helicase 는이중가닥을열고풀어헤친다. 이곳에 RPA (single stranded DNA binding protein) 가결합하고 Primase 가 RPA-DNA complex 에결합하여짧은 RNA primer 를합성함. 다음으로 DNA 중합효소가결합하여 DNA 를합성함. Figure 9.49 Elongation stage; 박테리아나진핵의신장과정과유사. 지연가닥과선도가닥이협동적으로복제를한다. sliding clamp 는진핵세포의 PCNA 와유사하며 DNA 중합효소와연결되어 processivity 를높인다. 두가지중합효소인 PolB 와 PolD 가존재하며어떤종은 PolB 가없다. 진핵세포의 Fen-1 과 Rnase H 해당하는효소가 okazaki fragment 의 5 끝의 RNA 를제거하고 DNA ligase 가 fragment 를연결한다. 33