대한진단검사의학회지 : 제 24 권제 5 호 2004 Korean J Lab Med 2004; 24: 327-33 진단유전학 실시간중합효소연쇄반응을이용한상대정량에서표준곡선의영향 이미경 김태형 1 중앙대학교의과대학진단검사의학교실, 비뇨기과학교실 1 Influence of Standard Curves on Relative Quantification using Real-time PCR Mi Kyung Lee, M.D. and Tae Hyoung Kim, M.D. 1 Departments of Laboratory Medicine and Urology 1, Chung-Ang University College of Medicine, Seoul, Korea Background : Although relative quantification by real-time PCR may be easier to perform than absolute quantification, there is a risk of errors associated with standard curve construction. The aim of this study was to evaluate the effects of standard curves on relative quantification using real-time PCR in Candida albicans. Methods : The reproducibility of real-time PCR-based standard curves for target genes and a reference gene generated from PCR amplicons (10-fold serial dilution, 10-4 to 10-9 ) was evaluated. In addition, the effects on standard curves were evaluated by running the same cdna samples. Results : The within-run variation (CV) by crossing point (Cp) was 0.12-1.05% for ERG11 and ACT1, whereas the between-run CV was 2.07-6.84% for ERG11, CDR1, MDR1 (target gene) and ACT1 (reference gene). The differences in PCR efficiency between targets and reference may be attributable to variations in relative quantification. Conclusions : To achieve reliable relative quantification of mrna in real-time PCR, a feasible guideline and standardization are of major importance. (Korean J Lab Med 2004; 24: 327-33) Key Words : Real-time PCR, Relative quantification, Standard curve 서 질병의연구에있어서질병의분자생물학적기전이해, 질병의진단, 신약개발을위한표적유전자연구및임상적치료효과를평가하는데필요한결정적인과정들중에서유전자발현 (Gene expression) 연구는매우중요한역할을담당하고있다 [1]. 유전자발현은최종산물인단백질이나중간생성물인 mrna를정량함으로평가할수있으나, 일부단백질과 mrna 표현사이에낮은상관관계를보인다는사실과 [2, 3] 단백질분석은인산화 (phosphorylation), 당화 (glycosylation) 및단백분해과정과같은접수 : 2004년 7월 5일접수번호 :KJLM1769 수정본접수 : 2004년 9월 20일교신저자 : 이미경우 100-272 서울시중구필동 2가 82-1 중앙의대부속필동병원진단검사의학과전화 :02-2260-2262, Fax:02-6263-6410 E-mail:cpworld@cau.ac.kr 론 해독후 (post-translation) 변형의영향도평가할수있다는점에서최종산물인단백질을측정하는것이바람직하다고알려져있다 [1]. 물론단백질과 mrna를동시에측정하는것이가장이상적이지만, 현재가능한단백질분석기술은일반적으로처리량이낮고기술적인개선이필요하며일반검사실에서쉽게적용할수없다는제한이있어, 일반검사실에서측정이가능하며다양하고정량적인정보를얻을수있는 mrna 측정에의한유전자표현연구가많이시도되고있다. 전사량을알기위한 mrna 측정에는일반적으로 Northern blotting과 in situ hybridization[4], RNase protection assay[5], cdna microarray[1] 및역전사중합효소연쇄반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) 등의 5가지방법이사용되고있다. 이중 RT-PCR은세포수가적은검체나유전자표현이낮은경우에도측정이가능하여가장예민하고다양하게적용할수있는방법으로평가되고있다 [6, 7]. 특히최근에 327
328 이미경 김태형 실시간 PCR (real-time PCR) 의도입으로기존 RT-PCR에서 PCR 후의복잡한검사과정을줄이고폐쇄관분석 (closed-tube system) 하에서실시간으로증폭산물을분석하게됨으로, 다른방법에비하여신속하고간편하면서정확하고재현성높은결과를내는것으로보고되고있다 [6, 8, 9]. Real-time PCR의기본원리는 DNA polymerase와형광공명에너지이동 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) 의원리에 [10] 의해 PCR의매주기마다실시간으로시행되는형광의검출과정량에있으며, PCR시매주기의진행상황을감시하여 exponential phase 범위내에서실시간으로증폭산물을측정하는방법이다. 이때중요한개념은 threshold cycle (C T ) 또는 crossing point (Cp) 라는수치로, 형광의양이기본값 (baseline level) 을넘어서감지될수있을정도로두드러지게증가하는시점의주기수이며, 이는초기주형량을정확하게반영하는것으로알려져있다 [11]. Real-time PCR에서증폭산물의양을측정하는방법에는절대정량 (absolute quantification) 과상대정량 (relative quantification) 이있다. 절대정량은농도를알고있는표준물질을사용하여표준곡선을만들고이를이용하여측정하고자하는대상유전자의농도를산출해내는방법으로대상유전자와표준물질의 PCR 효율이동일하다는가정하에서시행되며, 보다정확한정량을위해서대상유전자와농도를알고있는내부대조물질을동시에증폭시켜정량하게된다 [6]. 한편특정대상유전자표현의변화를확인하기위한 mrna 정량에는기준유전자 (reference gene) 와대상유전자를사용하여각각의표준곡선 (standard curve) 을만들고이를이용하여이들의증폭정도를농도로산출한후, PCR 간의변이를보상하기위하여기준유전자에대한대상유전자의비율 ( 대상유전자의농도 / 기준유전자의농도 ) 을계산하는상대정량이이용된다 [6, 9]. 상대정량이절대정량에비하여좀더쉽고경제적이며신뢰성있는방법으로생각되지만, 여전히표준곡선의조제와보관등에따른오류의위험을내포하고있다 [12]. Table 1. Primers and probes used in this study 이에본연구에서는유전자표현을위한상대정량에서대상유전자와기준유전자정량을위한표준곡선의영향을평가하기위하여, Candida albicans에서대상유전자로 ERG11, CDR1, MDR1 을, 기준유전자로 ACT1을사용하여각유전자정량을위한표 준곡선의농도별정밀도와효율을분석하고표준곡선이대상유전 자의상대정량에미치는영향을평가하여보고자하였다. 1. 대상 대상및방법 임상검체에서분리된 C. albicans와표준곡선제조를위하여 fluconazole에감수성인 C. albicans ATCC 32354 균주를사용하였으며, 균주는 -80 에보관하면서검사시35 에서 Sabouraud dextrose agar (SAB) 평판 (BBL, Cockeysville, MD, USA) 에계대배양하였다. 2. 방법 1) 표준곡선의평가표준곡선을위한주형 DNA는 35 의진탕배양상태로 SAB (Difco, Detroit, Michigan, USA) 액체배지에서하룻밤배양된 C. albicans ATCC 32354 균주로부터 QIAGEN Genomic-tip 20/G kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA) 를사용하여추출하였으며, 각유전자에대한시발체 (Table 1) 를사용하여 PCR로증폭하였다. 각각의증폭산물은 QIAquick PCR purification kit (QIAGEN) 로정제한후 DNA 농도를측정하였고, 보관과냉, 해 동에따른오차를줄이기위하여정제된 PCR 산물을 4 L 씩분 주하여 -80 에보관하다가 real-time PCR 시 10 배씩연속적으로 희석하여표준곡선을위한주형으로사용하였다. Primer/Probe GenBank assession no. Sequences (5-3 ) ERG11 Forward primer X13296 TGGAGACGTGATGCTG AGTATGTTGACCACCCATAA AATCTCTGCTACTTATATGAAAGAAATTAAACTGAG GAGAACGTGGTGATATTGATCCAAAT CDR1 Forward primer X77589 AAGAGAACCATTACCAGG AGGAATCGACGGATCAC CAAGACCAGCATCTCCATATACTGTAT ATTCTTTATGCAAGTGAGGTATGGTG MDR1 Forward primer X53823 GGAGTTTAGGTGCTGT CGGTGATGGCTCTCAA GCCAGTTGGAGATGGACT TTGGTTCATGTGTATCATTTCTGG ACT1 Forward primer X16377 CCAGCTTTCTACGTTTCC CTGTAACCACGTTCAGAC CGGTATTGTTTTGGATTCTGGTG TGTGTTTACTCACGTTGTTCC
실시간중합효소연쇄반응을이용한상대정량에서표준곡선의영향 329 표준곡선의정밀도평가를위하여정제된 PCR 산물을 10배씩연속적으로희석하여 (10-4 -10-9 ) 검사중 (within-run) 변이계수 (coefficient of variation, CV) 와검사간 (between-run) 변이계수를측정하였다. 검사중변이계수는한번의 real-time PCR동안각농도의연속희석한 ERG11과 ACT1 PCR 산물을각각 3개로나누어반복측정하였고, 검사간변이계수는 3개월동안 ERG11 과 ACT1 (20회), CDR1 또는 MDR1과 ACT1 ( 각각 10회씩 ) 에대한 real-time PCR 측정을통하여분석하였다. 표준곡선은 Light- Cycler (Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN, USA) 자체에서연속희석된초기주형농도의 log 값 (y축 ) 에대한 Cp값 (x축 ) 을표시하여그려지게되고, 이때기울기 (slope) 와 error값이주어지며기울기를이용하여 PCR의효율 (efficiency, E= 10-1/slope ) 을계산하였다 [9](Fig. 1). 2) RNA 추출 35 의진탕배양상태로 SAB (Difco) 액체배지에서하룻밤 배양된균주를새로운 SAB 액체배지에 1:100 으로희석하여 midlogarithmic phase (OD 600 =1-1.2) 가될때까지진탕배양한후, 원심분리하여세포를모으고멸균증류수로세척하였다. 총 RNA 는 RNAqueous TM -4PCR kit (Ambion, Austin, TX, USA) 를사용하여제조사에서제시한방법을일부변형하여추출하였다. 추출된 RNA 용액에남아있을 DNA 제거를위하여 DNase I (2 units/ L) 과완충액을가하여 37 에서 1시간동안반응시키고, DNase inactivation reagent를첨가하여실온에 2분간방치한후 13,000 rpm에서 1분간원심분리하고상층을새튜브로옮겨 Fluorescence (F2/F1) Cycle number 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Cycle Number 26 24 Linear Regression 22 Crossing Points Slope=3.517 20 Intercept=14.84 18 Error=0.0102 16 r=-1.00 14-3.5-3 -2.5-2 -1.5-1 -0.5 0 Log Concentration (pg/ L) Fig. 1. Amplification curve and regression curve (standard curve) for relative quantification. A regression curve is calculated with four values ranging from 10 10-4 to 10 10-7 ng/ L ACT1 PCR product and serves for the quantification of other samples. cdna 합성에사용하였다. 3) cdna 합성 cdna 합성을위한역전사는 1st Strand cdna Synthesis Kit for RT-PCR (Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN, USA) 을사용하여시행하였으며, 총 RNA 8 L와 10 reaction buffer (100 mm Tris, 500 mm KCl, ph 8.3) 4 L, 25 mm MgCl 2 8 L, dntp mix (datp, dctp, dttp, dgtp, 10 mm each) 4 L, random primer p (dn) 6 4 L, RNase inhibitor 2 L, AMV reverse transcriptase 1.6 L에 DEPC-처리멸균증류수를첨가하여총 40 L로만들었다. 역전사반응은 25 에서 10분, 50 에서 60분간반응시키고역전사효소의불활성화를위해 99 에서 5분간반응시켰다. 합성된 cdna는 QIAquick PCR purification kit (Qiagen) 를사용하여정제한후, 260 nm 와 280 nm에서흡광도를측정하여정제한 cdna의양과순도를확인하였다. 4) LightCycler를이용한정량적 real-time PCR Real-time LightCycler TM (Roche) PCR은 FastStart DNA Master Hybridization Probe PCR mix (Roche) 를사용하였다. PCR 반응액은 25 mm MgCl 2 2.4 L, 시발체각각 0.4 M, hybridization probe 각각 0.2 M, LightCycler DNA FastStart Hybridization mix 2 L에멸균증류수를가하여 18 L를만들어잘혼합한후유리 capillary로옮기고, cdna ( 정량을위한검체 ) 나연속희석한 PCR 산물 ( 표준곡선 ) 2 L를분주하였다. PCR 반응은 95 에서 10분간전변성시킨후 40에서 50 주기 (cycle) 로시행하였으며, 반응조건은 ERG11과 CDR1은 95 에서 10초, 62 에서 15초, 72 에서 10분으로하였으며, MDR1의경우결합반응 (annealing) 의온도를 54 로시행하였다. 각유전자 (ERG11, CDR1, MDR1, ACT1) 의농도는각각의표준곡선으로부터얻어지며, 이들유전자의상대정량치는기준유전자인 housekeeping 유전자 (ACT1) 에대한대상유전자 (ERG11, CDR 1, MDR1) 의비로산출하였다. 유전자표현의확인을위한모든검체의상대정량은동일한 cdna를사용하여각각 3회씩의독립된 real-time PCR로부터얻은결과의평균으로평가하였다. 5) Real-time PCR을이용한상대정량에서표준곡선의영향분석동일한 cdna를사용하여독립된 real-time PCR로부터얻은 3회의상대정량결과에서검사간변이계수가 10% 미만인검체 2개와 50% 이상인검체 3개를선택하여각각 2회의독립된 realtime PCR을추가로시행하였다. 유전자표현을위한상대정량에서표준곡선의영향을평가하기위하여각각의표준곡선효율과대상유전자와기준유전자간효율의차를분석하였다. 이때상대정량값을대상으로검사간변이계수가 50% 이상인검체는대 상유전자와기준유전자의표준곡선효율이모두제조사가제시하는최저효율인 1.75 이상이면서대상유전자와기준유전자간
330 이미경 김태형 효율의차가가장작은결과값을기준으로하여평가하였다. 결 1. 표준곡선의정밀도평가 과 표준곡선의 Cp 값을이용한 ERG11 과 ACT1 에대한검사중변 이계수는각각 0.12-0.84% 와 0.20-1.05% 였고, 평균표준편차 (SD) 는 0.09 주기였다 (Table 2). ERG11, CDR1, MDR1 및 ACT1에대한검사간변이계수는각각 2.07-4.9%, 3.25-3.81%, 2.12-4.17 %, 4.99-6.84% 였고, 평균표준편차는 0.97 주기였다. 각유전자에대한 PCR 효율은 1.80 (Range, 1.5-2.03), 1.78 (Range, 1.65-1.88), 1.85 (Range, 1.69-2.03), 1.82 (Range, 1.67-2.00) 를보여분석한유전자들간에는유의한차이를보이지않았다 (Table 3). 2. Real-time PCR 을이용한상대정량에서표준곡선의영향 상대정량에서검사간변이계수가 50% 이상인 3 개의검체중, Table 2. Within-run variation of LightCycler real-time PCR for standard curve 검체 1에서는표준곡선을위한대상유전자와기준유전자의효율이각각 1.88로같은효율을보인 4번째반응의결과값을기준으로분석하였으며, 검체 2에서는 5번째반응의결과값을, 그리고검체 3에서는 3번째반응의결과값을기준으로분석하였다 (Table 4). 기준이되는상대정량값에서 10% 이상의변이계수를보인 10 번의반응결과 ( 검체 1의 run 1, 2, 3, 검체 2의 run 1, 3, 4, 검체 3의 run 1, 2, 4, 5) 와검사간변이계수가 10% 미만인 10번의반응결과를비교하여보았다 (Table 5). 첫째, 기준유전자또는대상유전자표준곡선의효율이 1.75 미만이면서기준유전자와대상유전자표준곡선의효율차가 5% 미만인경우가반응결과의변이계수가 10% 이상에서 1예, 10% 미만에서 3예가관찰되었고, 둘째, 표준곡선의효율이모두 1.75 이상이면서표준곡선의효율차가 5% 이상인경우가변이계수가 10% 이상에서 1예, 10% 미만에서 2예있었으며, 셋째, 기준유전자또는대상유전자표준곡선의효율이 1.75 미만이면서표준곡선의효율차가 5% 이상인경우가변이계수가 10% 이상에서는 3예관찰되었으나, 10% 미만에서는없었다. 넷째, 기준유전자와대상유전자표준곡선의효율차 (CV) 는반응결과의변이계수가 10% 이상인경우 (mean± SD, 5.3±3.1; range, 2.7-13.4%) 가 10% 미만인경우 (mean± SD, 2.8±2.8; range, 0-8.6%) 에비해유의하게높았다 (P<0.05). Concentration (ng/ L) Cp (Mean±SD) CV (%) 고 찰 ERG11 DNA 8 10-4 16.30±0.02 0.12 (n=3) 8 10-5 20.60±0.08 0.38 8 10-6 22.91±0.05 0.20 8 10-7 26.22±0.22 0.84 ACT1 DNA 10 10-4 15.26±0.16 1.05 (n=3) 10 10-5 18.74±0.05 0.29 10 10-6 22.25±0.05 0.20 10 10-7 25.75±0.06 0.23 유전자발현의변화를보기위한 mrna 분석은인간유전체사업과 DNA microarray, real-time PCR 및 laser capture microdissection[13] 과같은새로운기술의발달로매우빠르게발전하고있다. 그러나유전자발현의분석은예민하고정확하며재현성있는특정 mrna 측정이필수적으로요구되며, 특히 RT-PCR 에의한정량은 mrna의작은변화까지검출할수있어유용한 Table 3. Between-run variation of LightCycler real-time PCR for standard curve Concentration (ng/ L) Cp (Mean±SD) CV (%) Efficiency (Mean±SD) ERG11 DNA 8 10-4 16.47±0.34 2.07 1.80±0.13 (n=20) 8 10-5 20.39±0.63 3.10 (Range, 1.50-2.03) 8 10-6 23.89±0.87 3.65 8 10-7 27.65±1.36 4.92 CDR1 DNA 7 10-6 25.56±0.85 3.31 1.78±0.07 (n=10) 7 10-7 28.87±1.10 3.81 (Range, 1.65-1.88) 7 10-8 32.66±1.15 3.52 7 10-9 36.23±1.18 3.25 MDR1 DNA 8 10-5 22.42±0.55 2.44 1.85±0.10 (n=10) 8 10-6 25.13±1.05 4.17 (Range, 1.69-2.03) 8 10-7 28.71±0.96 3.36 8 10-8 32.04±0.68 2.12 ACT1 DNA 10 10-4 15.93±1.09 6.84 1.82±0.07 (n=40) 10 10-5 19.50±1.12 5.76 (Range, 1.67-2.00) 10 10-6 23.13±1.21 5.76 10 10-7 26.67±1.33 4.99
실시간중합효소연쇄반응을이용한상대정량에서표준곡선의영향 331 Table 4. Relative quantification data (CV>50%) from five replicate real-time PCR runs in three samples* Sample Standard curve Target Reference Normalized expression Target Efficiency Reference Efficiency Sample 1 (ERG11) Run 1 6.034E-03 2.225E-03 2.7119 1.84 1.67 Run 2 1.725E-01 4.118E-02 4.1889 1.62 1.96 Run 3 1.819E-02 2.407E-03 7.5571 1.84 1.76 Run 4 4.489E-04 3.011E-03 3.5684 1.88 1.88 Run 5 3.778E-04 1.005E-04 3.7592 1.94 1.90 Sample 2 (CDR1) Run 1 1.788E-02 2.249E-03 7.9502 1.75 1.87 Run 2 9.619E-03 2.502E-03 3.8445 1.74 1.88 Run 3 1.519E-02 6.024E-03 2.5216 1.83 1.68 Run 4 8.991E-03 2.991E-03 3.0060 1.88 1.75 Run 5 3.041E-02 8.460E-03 3.5946 1.80 1.85 Sample 3 (MDR1) Run 1 1.674E-05 4.509E-02 0.3713 1.79 1.72 Run 2 3.289E-06 2.069E-03 1.5897 1.89 1.78 Run 3 9.163E-07 4.160E-04 2.2026 1.88 1.87 Run 4 2.003E-06 3.417E-03 0.5861 1.85 1.78 Run 5 5.089E-06 3.836E-03 1.3266 1.87 1.76 *Relative gene expression was expressed as a ratio of target gene (ERG11, CDR1, and MDR1) concentration to reference gene (ACT1) concentration. Relative quantification data was compared to an underlined data with suitable PCR efficiency. Table 5. Effect of the PCR efficiency of standard curve on relative quantification PCR efficiency of reference or target gene < 1.75 1.75 Difference in PCR efficiency Difference in PCR efficiency 5% <5% 5% <5% A (n=10) 3 1 1 5 B (n=10) 0 3 2 5 A: More than 10% of CV in relative quantification data; B: Less than 10% of CV in relative quantification data. 방법이지만재현성이낮은것이문제로알려져있어, 검체처리와 RNA 추출, 역전사반응그리고정량적 PCR 등각단계별엄격한정도관리가요구되고있다 [14]. 최근유전자발현의분석에도입되어신속하고간편하면서비교적정확하게재현성높은결과를내는것으로보고되고있는 [6, 8, 9] real-time PCR을이용한상대정량은, 기준유전자와대상유전자를사용하여각각의표준곡선을만들고이를이용하여이들의증폭정도를농도로산출한후, 기준유전자에대한대상유전자의비율을계산하여상대적인정량을하게된다. 이때기준유전자로는정확한정량을위하여 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), albumin, -actin, tubulins, cyclophilin, 18S-rRNA 또는 28S rrna와같은조절이되지않는유전자나세포의생존에필수적이어서모든유핵세포에존재하는 housekeeping 유전자를사용하고있다 [6, 9]. 본연구에서는 real-time PCR에서표준곡선의영향을평가하기위하여, 상대정량시결과에영향을줄수있는검체처리와 RNA 추출및역전사반응등의 PCR 이전과정과검사자에의한차이를없애고자동일검사자가동일 cdna를사용하여분석하였다. Cp값을이용한표준곡선의정밀도평가에서유전자 ERG11과 ACT1에대한검사중변이계수는대부분 1% 이하로매우낮은결과를보여기존의다른보고들과 [15-17] 유사하게나타났다. 그러나 ERG11, CDR1, MDR1 및 ACT1에대한검사간변이계수는 2.07-6.84% 로검사중변이계수에비하여높은변이를보이고있고 5% 이상의변이를보이는경우도있어, 표준곡선의검사간변이가결과의재현성에영향을줄수있을것으로사료되었다. 한편 PCR 효율은각반응에따라다양하고희석성분이나 GC 양과같은여러억제요소들로인해최대효율 ( 효율 =2) 을나타내기는어려우며 [14], 두개의동일한양의검체에서 PCR 효율이 5% 만차이가나도 PCR 26주기이후에증폭산물이 2배정도의차이를보일수있어 [18], PCR 효율의작은차이도증폭산물의양에큰영향을줄수있을것으로생각되고있다. 본연구에서는상대정량에서표준곡선의영향을평가하기위하여대상유전자와기준유전자각각의표준곡선효율과대상및기준유전자간효율의차를분석하여보았는데, 기준유전자또는대상유전자표준곡선의효율이낮고동시에표준곡선의효율차가 5% 이상인경우는상대정량값에영향을줄수있을것으로판단되었다. 그러나상대정량값에서 10% 이상의변이계수를보인 10 번의반응결과중 50% 에서는대상과기준유전자의표준곡선효
332 이미경 김태형 율이 1.75 이상이면서효율의차도 5% 미만으로나타나표준곡선이외에각반응의검사간결과에변동을줄수있는다른요인들의영향을시사하였다. 따라서동일검사자가동일 cdna를가지고실험을하였지만, 주형이되는 cdna의양이 2 L로매우소량이므로분주시발생할수있는주형량의변이, real-time PCR 기기인 LightCycler는장비내공기의온도를조절하여가열과냉각을반복하고있으므로각유리 capillary의온도가일정하지않았을가능성, DNA 오염등을고려해볼수있겠다. 최근유전자발현에관한연구가증가하면서 RT-PCR에의한 mrna 정량시검체처리와 RNA 추출, 역전사반응그리고정량적 PCR 등각단계에서발생할수있는변이를줄이기위하여각단계별반응을모니터할수있는정도관리물질이나소프트웨어등의개발및검사방법에관한연구들이많이보고되고있다 [8, 9, 15, 19-22]. 본연구에서도연구결과와연구과정의경험을통하여 mrna의상대정량시 real-time PCR 과정의변이를줄이기위한몇가지지침을제시하고자한다. 첫째, 동일검사자가검사를수행할경우검사중변이는매우낮으므로, 동일반응에서검체를중복검사하는것보다는검사간변이를줄이기위하여최소 3번이상의독립된반응에서얻은결과를분석하여변이가큰결과가있을경우한두번의반응을추가하여유사한값의평균을사용한다. 둘째, 기준유전자또는대상유전자표준곡선의효율이낮고동시에표준곡선의효율차가 5% 이상인경우는추가반응을시행하여확인한다. 셋째, RNA 추출과정에서완전히제거되지않은 DNA 에의한오염을확인하기위하여 real-time PCR 시음성대조로 NTC (No template control) 뿐아니라 RNA 대조도추가하여시행한다. 넷째, PCR 주기가증가할수록변이의폭도커질위험이있으므로반응조건을잘조절하여 PCR 주기를 40회이내로시행한다. 그러나타당하고적절한지침이라하더라도실험실에서모두적용하기에는여러가지어려움이있을것으로생각되므로, 각검사실에서실현가능한지침을만들어표준화하는것이중요하다고사료되었다. 요약배경 : Real-time PCR을이용한상대정량은절대정량에비하여좀더쉽고신뢰성있는방법으로생각되지만, 여전히표준곡선의조제와보관등에따른오류의위험을내포하고있다. 이에본연구에서는유전자표현을위한상대정량에서대상유전자와기준유전자정량을위한표준곡선의영향을평가하기위하여, Candida albicans의유전자정량시표준곡선의농도별정밀도와효율을분석하고표준곡선이대상유전자의상대정량에미치는영향을평가하여보고자하였다. 방법 : 표준곡선의정밀도는대상또는기준유전자에대한정제된 PCR 산물을 10배씩연속적으로희석하여 (10-4 -10-9 ) 검사중변이계수 (coefficient of variation, CV) 와검사간변이계수를 측정하여평가하였다. 표준곡선의영향을평가하기위하여동일한 cdna를사용하여독립된 real-time PCR로부터얻은상대정량결과에서 10% 이상의변이계수를보인 10번의반응결과와변이계수가 10% 미만인 10번의반응결과를비교하여보았다. 결과 : Crossing point (Cp) 값을이용한 ERG11과 ACT1에대한검사중변이계수는각각 0.12-1.05% 로대부분 1% 이하로매우낮은결과를보였고, ERG11, CDR1, MDR1 및 ACT1에대한검사간변이계수는 2.07-6.84% 로대부분 5% 이하의결과를보였지만, 검사중변이계수에비하여높은변이를보였다. 또한기준유전자또는대상유전자표준곡선의효율이낮고동시에표준곡선의효율차가 5% 이상인경우는상대정량값에영향을줄수있을것으로판단되었다. 결론 : mrna의상대정량시 real-time PCR 과정의변이를줄이기위하여각검사실에서실현가능한지침을만들어표준화하는것이중요하다고사료되었다. 참고문헌 1. Clarke PA, te Poele R, Wooster R, Workman P. Gene expression microarray analysis in cancer biology, pharmacology, and drug development: progress and potential. Biochem Pharmacol 2001; 62: 1311-36. 2. Anderson L and Seilhamer J. A comparison of selected mrna and protein abundances in human liver. Electrophoresis 1997; 18: 533-7. 3. Gygi SP, Rochon Y, Franza BR, Aebersold R. Correlation between protein and mrna abundance in yeast. Mol Cell Biol 1999; 19: 1720-30. 4. Parker RM and Barnes NM. mrna: detection by in situ and northern hybridization. Methods Mol Biol 1999; 106: 247-83. 5. Hod Y. A simplified ribonuclease protection assay. Biotechniques 1992; 13: 852-4. 6. Bustin SA. Absolute quantification of mrna using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol 2000; 25: 169-93. 7. Wang T and Brown MJ. mrna quantification by real time TaqMan polymerase chain reaction: validation and comparison with RNase protection. Anal Biochem 1999; 269: 198-201. 8. Bustin SA. Quantification of mrna using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol 2002; 29: 23-39. 9. Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 2001; 29: 2002-7. 10. Clegg RM. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol 1992; 211: 353-88. 11. Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis:
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