Week 1. The Post-genome Era 1. Post-genome era ( 후게놈시대 ) - Genome project 의완성으로생명체의 DNA 정보가모두밝혀진시대 - 인간을비롯한수많은 organism 들의 genome project 가완성되어 post-genome era 에접어들게됨 Genome ( 유전체 ): The entire collection of chromosome in each cell of an organism. The whole hereditary information encoded in DNA Genome = coding sequences (genes) + noncoding sequences (junk DNA: intergenic regions + repeated element) Gene( 유전자 ): Corresponding a DNA sequences to a single protein 2. Post-genome era 에서의생물학연구의초점 - Genome era 에서는 genome sequence 를밝히는데주력을했다면 post-genome era 에는그 genome 의역할을밝히는데연구의초점을둠 - Genome project 를통해얻어진방대한 DNA 정보를이용한생물학 - DNA 가발현되는단백질에대한연구 (Proteomics) - 유전자의발현및기능과단백질의 3 차구조를밝혀생명현상을이해하기위한 postgenome project - 방대한양의게놈정보관리및분석을위한생명정보학 (bioinformatics) 비중이커짐 1 Functional Genomics ( 기능성유전체학 ) 인간이가진유전자중약 30% 정도만이그기능이밝혀져있음. 기능성유전체학은 genome 들의기능과발현조절뿐만아니라실제로유전자가생체내에서어떻게이용되는지에대해연구하여해당 genome 을인간생활에유용하게이용하고유전적질병의원인을규명하는것을목표로함. 특히생물정보학의발달로특정역할을할것으로예상되는유전자들을분류하여다양한분석을행할수있게되었음. 한유전자의기능과조절작용을분석하기위해서는위의그림에나와있는 6 개의조절단계에대한연구가모두이루어져야하고이들은모두기능성유전체학의연구범위라할수있음. 건국대학교미생물공학과 1
Week 1. The Post-genome Era Central dogma The central dogma of molecular biology was first enunciated by Francis Crick in 1958 and re-stated in a Nature paper published in 1970 2 Comparative Genomics ( 비교유전체학 ) 개인간, 인종간, 생물간의유전자를비교분석하여그생체기능의차이를연구하는학문. 사람과침팬지등다른종들과의비교뿐만아니라사람과사람간의차이도그비교범주에들어가기때문에유전적질환이나약물연구에도이용될수있는분야라할수있음. 사람과타종간의유전자유사성연구는사람의단백질기능을밝히는데도중요한역할을함. 3 Structural Genomics ( 구조유전체학 ) 단백질의삼차원입체구조에바탕을둔생물학적기능과단백질간상호작용을규명하여생명현상을기술하고자하는접근방법. 먼저기능을전혀모르는단백질들의구조규명을하고, 이미기능이알려진유사분자들과의구조를비교하고목적하는단백질의기능을유추한뒤생화학적, 생물학적검증실험을통해분자의기능을분석하는것. 4 Proteomics ( 단백체학 ) 단백질수준에서의발현수치, 해독후의변형, 질병진행에대한통합된관점, 세포진행등에관여하는단백질의특성및기능을밝히는학문. Post-genome 시대의연구의흐름은유전자가단백질을만드는과정이어떻게조절이되고단백질이어떤기능을하고그활성이어떻게조절이되는지를밝히는방향이됨. 생명의기본정보를담고있는것은 DNA 이지만실제로생명현상을주관하는것은단백질이기때문. 5 Transcriptomics ( 전사체학 ) 생체내의특정세포의유전자발현정도를분석하는학문. 전사체는세포에서발현중인모든 RNA 를말하는것으로단백질발현정도는 mrna 의양을측정하여유추할수있음. 전사체학의주요기술중대표적인것으로는 DNA Chip 과 SAGE (serial analysis of gene expression technology) 를들수있음. 건국대학교미생물공학과 2
1. What is Genome Project? Week 2. Human Genome Project - 유기체의 genome 전체의서열을분석하여데이터베이스로만드는프로젝트 - 1980 년대에유전적질환을일으키는유전자가실제존재하는것임을알아내고, 유전정보가담겨있는 DNA 의서열을밝히려는계획이수립됨 - Human Genome Project 을포함하여여러 organism 에대한 genome project 가완성되거나진행중에있음 - Human Genome Project 의완성으로 post-genome 시대의도래 The HGP will be the ability to better diagnose, treat and prevent disease, and most of those benefits to humanity still lie ahead. With these immense data sets of sequence and variation now in hand, we are now empowered to pursue those goals in ways undreamed of a few years ago. - Francis Collins 2. The history of human genome project 1987 YAC(yeast artificial chromosome) vector 개발 (Science) 1987 400 개의 RFLP(restriction fragment length polymorphisms) 에기초한첫번째 human genetic map 완성 (Cell) 1988 美보건성 (NIH) 과에너지성 (DOE) 간의 Human Genome Project 공동연구합의. HGP 다국적팀의초대책임자로 James D. Watson 임명. 1991 NIH 의 J. Craig Venter 에의해 ESTs 를이용하여 expressed gene 을찾는방법발표 (Science) 1992 HGP 다국적팀의책임자로 James D. Watson 이물러나고 Francis Collins 가임명됨 1994 Human genome 의 genetic map 완성 (Science) 1995 December 15,000개의 marker를포함하는 human genome의 physical map 완성 (Science) 1996 Bermuda에서 The second international strategy meeting 개최. "Bermuda Principles" 라불리는 genome sequence data의공유원칙확인. 1998 Craig Venter에의해 Celera Genomics사설립. HGP 팀과는별도로 3년이내에 genome sequencing 완성을공표. 1999 NIH에서 project의완성을 2000년으로앞당김 1999 영국, 일본, 미국의 researcher 들에의해최초로인간의 22 번염색체해독완료 (Nature) 2000 독일과일본 researcher 들에의해 21 번염색체해독완료 (Nature) 2000 백악관에서유전자정보의무상공개방침발표 2001 HGP team 과 Celera 의유전자해독초안발표 (Nature, Science) 2003 Human genome project 완성. 99.99% 의정확도를가짐 건국대학교미생물공학과 3
Week 2. Human Genome Project Bermuda Principles ( 버뮤다원칙, 1996 년 ) HGP 다국적팀의과학자들이 정리된유전자데이터는 24 시간안에공개한다 는유전자정보사용안 에동의함 - Automatic release of sequence assemblies larger than 1 kb (preferably within 24 hours) - Immediate publication of finished annotated sequences - Aim to make the entire sequence freely available in the public domain for both research and development in order to maximise benefits to society 3. First publications of human genome sequencing Nature (Feb. 15, 2001) By Human Genome Project Science (Feb. 16, 2001) By Celera Genomics 요약 - The human genome contains 3 billion chemical nucleotide bases (A, C, T, and G) - The functions are unknown for more than 50% of discovered genes - The human genome sequence is almost (99.9%) exactly the same in all people - About 2% of the genome encodes instructions for the synthesis of proteins 건국대학교미생물공학과 4
Week 2. Human Genome Project - Repeat sequences that do not code for proteins make up at least 50% of the human genome - Repeat sequences are thought to have no direct functions, but they shed light on chromosome structure and dynamics. Over time, these repeats reshape the genome by rearranging it, thereby creating entirely new genes or modifying and reshuffling existing genes - The human genome has a much greater portion (50%) of repeat sequences than the mustard weed (11%), the worm (7%), and the fly (3%) - Over 40% of the predicted human proteins share similarity with fruitfly or worm proteins - Genes appear to be concentrated in random areas along the genome, with vast expanses of noncoding DNA between - Chromosome 1 (the largest human chromosome) has the most genes (2968), and the Y chromosome has the fewest (231) - Genes have been pinpointed and particular sequences in those genes associated with numerous diseases and disorders including breast cancer, muscle disease, deafness, and blindness - Scientists have identified about 3 million locations where single-base DNA differences occur in humans. This information promises to revolutionize the processes of finding DNA sequences associated with such common diseases as cardiovascular disease, diabetes, arthritis, and cancers 건국대학교미생물공학과 5
Week 2. Human Genome Project 4. Genome size 5. Strategies for sequencing the human genome 1 Hierarchical shotgun sequencing (Human Genome Project) BAC clone 을제작하고 contig mapping 과정이필요 Genomic DNA 의 repeat sequence 로인한 misassembly 의위험을줄일수있음 - 100kb~200kb 로 genomic DNA 절편을만들어 BAC clone 제작 (bacterial artificial chromosome vector carrying a 100kb~200kb DNA insert) - Chromosome walking 으로 contig map 제작 - 각각의 contig 를 shotgun sequencing - Assembly 건국대학교미생물공학과 6
Week 2. Human Genome Project 2 Whole-genome shotgun sequencing (Celera Genomics) 사이즈가작고 repetitive DNA 서열이적은 genome 의 sequencing 에적합한방법 Hierarchical sequencing 과는달리 BAC clone 제작이필요없으므로매우빠른방법으로 sequencing 이가능 - Genomic DNA 절편을만들어 vector 에 cloning - Sequencing 후 overlap region 을이용하여 assembly Repetitive DNA 서열이많을경우다음과같은 misassembly 문제가발생 Vector A vehicle for carrying foreign DNA into a host organism. Vector systems include plasmid, virus (lambda phage vector), cosmid, BAC, YAC Chromosome walking A technique that can be used to assemble a clone contig (Chapter 12) Contig The result of joining an overlapping collection of sequences or clones Tandem repeat A pattern of two or more nucleotides is repeated and the repetitions are directly adjacent to each other. For example would be ATTCATTCATTC. 건국대학교미생물공학과 7
Week 3. Bioinformatics Tools 1. What is bioinformatics? - The field of science in which biology, computer science, and information technology merge to form a single discipline - 생명체가지닌막대한양의정보를수집, 저장, 분석, 가공 - Human Genome Project 를통해대량의염기서열데이터가쏟아져나온것을계기로생물정보학이급속히발전 More information: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/about/primer/bioinformatics.html 2. Gateways to genome science resources - All Human Genome Project data and much related information are freely available on the web - Various tools are available to investigate genetic disorders, chromosomes, genome maps, genes, sequence data, genetic variants, and molecular structures - Major biological web databases to 1 Explore databases of genes associated with diseases Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/) Genome Database (GDB, http://www.gdb.org/) GeneCards (http://www.genecards.org/) 2 Find a gene s location on a chromosome map NCBI Map Viewer (http://www.ncbi.nih.gov/mapview/) GDB Mapview (http://www.gdb.org/gdb/mapviewhelp.html/) 3 View the DNA sequence of a gene or amino acid sequence of a protein NCBI Sequence Databases (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=nucleotide) SWISS-PROT and TrEMBL (http://expasy.org/sprot/) Protein Information Resource Protein Sequence Database (PIR-PSD, http://pir.georgetown.edu/pirwww/dbinfo/pir_psd.shtml) 4 Examine protein structures NCBI Structure Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/) Protein Data Bank (PDB, http://www.rcsb.org/pdb/) 건국대학교미생물공학과 8
Week 3. Bioinformatics Tools 3. Genoproteome research 를위한생물정보학적접근 - 유전단백체 functional analysis 의 in silico 접근 건국대학교미생물공학과 9
Week 3. Bioinformatics Tools 4. 주요생물정보데이터베이스구축기관 1 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) - 미국국립보건원산하의국립생물정보센터 - 유전자염기서열데이터를수집하고가공하여웹을통해무료로공개하고있음 (GenBank) 2 EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/) - 유럽분자생물학연구소산하 European Bioinformatics Institute - 스위스생물정보학협회와공동으로 Swiss-Prot 단백질데이터베이스를운영함 3 DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp/) - 일본국립유전학연구소의 DNA Data Bank of Japan - NCBI, EMBL 과함께염기서열데이터베이스협력체제를구성하고있음 5. 유전자염기서열및관련정보검색 - NCBI 홈페이지의검색창을통해알고자하는유전자의염기서열검색 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 검색하고자하는 database Key word ( 유전자명칭, 종명칭등 ) - 검색 key word 를포함하는염기서열리스트가출력됨 건국대학교미생물공학과 10
Week 3. Bioinformatics Tools - 염기서열정보가출력됨 유전자명칭 GenBank accession No. 유전자출처 염기서열길이 관련문헌정보 관련염기서열정보 유전자기능, 특징요약 Chromosome 상의유전자위치 Coding sequence 정보 Cellular component 에서단백질의위치 Gene function Cellular process 건국대학교미생물공학과 11
Week 3. Bioinformatics Tools Amino acid sequence mrna sequence - Gene databank 에서검색 -Gene structure 5 -UTR Exon Intron 3 -UTR - Related literature information Link to PubMed database (literature database) 건국대학교미생물공학과 12
Week 3. Bioinformatics Tools - Related cellular signaling pathways Link to KEGG pathway database - 유전자의 mrna 서열및아미노산서열정보 Link to nucleotide database Link to protein database 6. 단백질의도메인분석및구조, 특성예측 - Swiss-Prot (http://www.expasy.org/sprot/) 에서 PLCG1 이라는단백질검색 - 결과 건국대학교미생물공학과 13
Week 3. Bioinformatics Tools 건국대학교미생물공학과 14
Week 3. Bioinformatics Tools - PROSITE (http://www.expasy.org/prosite/) 에서단백질의 domain, protein interaction site, post-translational modification site 분석, 예측 단백질의아미노산서열또는 Swiss-Prot accession No. 입력 -Domain 분석 - Modification site 분석 건국대학교미생물공학과 15
Week 3. Bioinformatics Tools - ExPASy Proteomics tools (http://www.expasy.org/tools/) 을이용하여 protein identification and characterization, domain search, post-translational modification prediction, primary, secondary, tertiary structure analysis, phylogenetic analysis 등을행할수있음 Ex) ProtParam tool (http://www.expasy.org/tools/protparam.html): 단백질의 isoelectric point (pi), extinction coefficient, half-life 등을예측 ProtScale tool (http://www.expasy.org/tools/protscale.html): 단백질의 hydrophobicity, primary structure 등을예측 An example of hydrophobicity graph Domain 독립적이고특징적인삼차구조를가지는단백질의한부분으로큰단백질의경우보통여러개의 domain 을가지고있으며각각의 domain 은짧은 polypeptide chain 으로연결되어있음. Domain 은단백질의기능수행에중요한역할을함 (ex. calcium-binding domain of calmodulin). 7. 염기서열또는아미노산서열 alignment 를통한 database search - BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) - 결과 건국대학교미생물공학과 16
Week 3. Bioinformatics Tools 8. Sequence alignment - Nucleotide 또는 amino acid 서열을서로비교하여유사성을알아내는방법. 유전자또는단백질서열간의유사성분석을통해기능적, 구조적, 진화적연관성을알아낼수있음. - EMBL-EBI 의 ClustalW tool 을이용한 sequence alignment 방법 (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) - 결과 Sequence name 및 sequence 입력 두서열간의 similarity score 건국대학교미생물공학과 17
9. Analysis of restriction enzyme recognition site - Nucleotide sequence 내에존재하는제한효소자리파악 - NEBcutter tool (http://tools.neb.com/nebcutter2/) Week 3. Bioinformatics Tools Restriction enzyme Endonuclease that can cleave a DNA molecule at specific short sequences. Extensively used in recombinant DNA technology. 건국대학교미생물공학과 18
Week 4. Gene cloning and polymerase chain reaction 1. What is gene cloning? - PCR 과 gene cloning 에기초한 recombinant DNA technology 또는 genetic engineering 의발달은 genome sequencing 과유전자기능및조절기작의연구에새로운전환점을마련함 - The basic steps in a gene cloning experiment (1) Cloning 할유전자를포함한 DNA (insert) 를 circular DNA 인 vector 에 insertion 하여 recombinant DNA molecule 을제작 (2) Bacteria 등의 living cell (host) 에 recombinant vector 를도입시킴 (transformation) (3) Host cell 내에서 recombinant DNA 가복제됨 (4) Host cell 이분열 증식하면서 recombinant DNA 가 daughter cell 로전달되고복제가계속됨 (5) Solid medium 에서생성된각각의 colony (clone) 는 identical multiple copies of the recombinant DNA 를지니고있음 건국대학교미생물공학과 19
Week 4. Gene cloning and polymerase chain reaction 2. PCR (Polymerase Chain Reaction) - 중합효소연쇄반응 (PCR) 은 DNA 의특정부위를반복합성하여 in vitro 에서원하는 DNA 분자를증폭시키는방법 - 아주적은양의 DNA 를이용하여많은양의 DNA 합성이가능 - PCR 25 cycle 로 2 25 의 DNA 분자를얻을수있음 - PCR 방법을개발한공로로 1993 년노벨화학상 (Kary Mullis) 이주어진 revolutionized technique in molecular biology - 증폭하고자하는 DNA 분자양말단에상보적인한쌍의 oligonucleotide (primer) 가필요 - DNA amplification 에는고온에서도안정한 Thermus aquaticus 의 DNA polymerase I enzyme (Taq polymerase) 이이용됨 - Genome 으로부터유전자를효과적으로분리하여클로닝할수있음 건국대학교미생물공학과 20
Week 4. Gene cloning and polymerase chain reaction -PCR 과정 (1) PCR mixture 제조 (enzyme, primers, template DNA, dntp) (2) 94 에서 dsdna 를 detaturation (3) 온도를낮추어 primers 가 template 에 hybridization 되도록유도 (4) Taq polymerase 에의해새로운 strand 가합성됨 (5 3 방향 ) (5) Denaturation-hybridizationsynthesis 의 cycle 을반복 (25~30 회 ) -PCR 종료후 agarose gel electrophoresis 를통해 product 를확인할수있음 3. PCR in more detail - PCR 을수행하기전에고려해야할사항으로는 primers, 온도등이있음 1 Primers - Primers 는 PCR experiment 를성공적으로수행하기위한열쇠 - 증폭하고자할 template DNA 의 target region 양쪽말단서열과상보적이어야함 건국대학교미생물공학과 21
Week 4. Gene cloning and polymerase chain reaction - Primers 의길이가너무짧을경우 non-target site 에 hybridization 이되어원하지않는 PCR 산물이생성될수있음 - DNA 의 nucleotide 는 4 종류. 8-mer primers 의경우확률적으로 template DNA 의 4 8 =65,536bp 마다한개의 attachment site 가존재. 따라서 3,000,000kb 의 human genome 의경우 46,000 개의 attachment site 가존재. - 17-mer primers 의경우확률적으로 4 17 =17,179,869,184bp 마다한개의 attachment site 가존재. 따라서 human genome 으로부터특이적인 single PCR product 를얻을수있음. 2 Temperature - Each cycle of PCR 마다온도를 3 번변화시킴 Denaturation temp.: 보통 94 이며 dsdna 의 base pair 를분리하여 ssdna 를만듦 Hybridization or annealing temp.: Primers 가 template DNA 에붙을수있는온도 Extension temp.: DNA 합성이일어나는온도로보통 74 이며 Taq polymerase 의최적온도보다약간낮음. 건국대학교미생물공학과 22
Week 4. Gene cloning and polymerase chain reaction - DNA-DNA hybridization 은 temperature-dependent 하므로 annealing temperature 는매우중요함 - Annealing temp. 가너무높으면 hybridization 이일어나지않음 - Annealing temp. 가너무낮으면 mismatched hybridization 이일어남 Products of wrong size due to mismatched hybridization Product of wrong size No amplification Single desired product - 이상적인 annealing temp. 는 primers 와 template 가 hybridization 될수있으면서 mismatched hybridization 이일어나지않는온도로, melting temperature (T m ) 계산으로알수있음 - T m = (4ⅹ[G+C])+(2ⅹ[A+T]) [G+C] 는 primer 서열의 G and C nucleotide 수 [A+T] 는 primer 서열의 A and T nucleotide 수 - 각각의 primer 에대해 T m 을계산하고이보다 1~2 낮은온도가 annealing temperature -PCR 에이용되는두개 primer 의 T m 이동일해야함 건국대학교미생물공학과 23
Week 4. Gene cloning and polymerase chain reaction 4. PCR primer design - Mammalian cell 의 total genomic DNA 를가지고 PCR 할경우약 20nt 길이의 primer 가적당함 - Template DNA 의 repetitive DNA sequence 와 single nucleotide 가반복된부분을피해서 primer 를디자인해야함 - PCR primer design 시에고려해야할몇가지요인 길이 : 비특이적 hybridization 이일어나지않도록충분히길어야함 염기구성 : 각각의 primer 의 GC contents 는거의동일해야함 ( 약 50%) Secondary structure: Hairpin 구조가형성되지않도록해야함 3 end: 두 primer 의 3 말단에상보적염기서열을피해야함. 그렇지않으면 primer dimers 가생성. 건국대학교미생물공학과 24
- PCR 의 specificity 를높이기위한전략 Week 4. Gene cloning and polymerase chain reaction Nested PCR: 첫번째 PCR 로얻은산물을한번더내부의 primers 를사용하여 PCR 하는방법 Hot-start PCR: PCR 반응전 PCR mixture 를만들어놓으면상온에서 mismatched annealing 과 polymerization 이일어날가능성이있으므로 Taq polymerase 또는 dntp 등을첫번째 denaturation 이후에넣어주는방법 Touch-down PCR: 최초의 annealing temp. 를 T m 보다높게설정해주고 2 cycles 이지날때마다 1 씩낮춰주는방법. PCR 초기 cycle 에는매우특이적으로적은양의 primer 가 annealing 되어정확한산물이증폭되어지고, 이산물들이이후의낮은 annealing temp. 에서 primer 와 annealing 되어증폭됨. 건국대학교미생물공학과 25
Week 4. Gene cloning and polymerase chain reaction 5. Studying PCR products - PCR 산물을이용하여 gene cloning 및 DNA analysis 를수행할수있음 - 다음 3 가지테크닉이주로사용됨 Gel electrophoresis of PCR products Cloning of PCR products Sequencing of PCR products - Gel electrophoresis 는 agarose gel 상에서 DNA fragment 를사이즈별로분리한후 visible 하게확인하는방법 - Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis 는 PCR product 를 restriction endonuclease 로처리한후전기영동으로 DNA fragment 의 size 를비교하여분석하는방법. Genome map 제작, genetic disease 분석, forensic science 분야의 DNA profiling 등에이용됨. Lane #1: Restricted PCR product Lane #2: Unrestricted PCR product Lane #3: PCR product contains region of insertion - PCR 산물을쉽게 cloning 하기위해사용되는방법 TA cloning: 일부 Taq polymerase 의경우 DNA 합성시 strand 의 3 end 에 adenosine 을하나더붙이기때문에 T-tailed vector 에손쉽게 ligation 시킬수있음 - PCR 산물을 cloning 한후에 sequencing 을통해 PCR 산물의염기서열을확인할수있음 건국대학교미생물공학과 26
Week 4. Gene cloning and polymerase chain reaction 6. Problems with the error rate of Taq polymerase - PCR 을통해합성되는 DNA 가항상 template DNA 의정확한 copy 는아님 - Taq polymerase 의 lack of proofreading activity (3 5 exonuclease activity) 로인한 inserting an incorrect nucleotide into growing DNA strand - 평균적으로 PCR 시에 9,000 nucleotides 마다 1 개의 mistake 가일어남. 만약 PCR 30 cycle 일경우 300bp 마다 1 개의 mistake 확률. - Random position 에 error 를가지는 PCR 산물들을 cloning 하여 bacteria 에도입할경우각각의 colony 는동일한 error 를가지는 recombinant DNA 를지니게됨 - Magnesium as a cofactor for Taq polymerase activity Taq polymerase 활성을위해 Mg 2+ 이온이필요. Mg 2+ 농도는 polymerization rate 과 accuracy 에영향을미침. 건국대학교미생물공학과 27
Week 5. Cloning vectors and isolation of DNA 1. Vectors for gene cloning - Host cell 내로유전자를도입할수있는 vehicle 로서의역할 - Host cell 내에서독립적으로복제되어많은수의 copy 를만들수있음 (origin of replication 을가짐 ) - 대표적으로 plasmid 와 bacteriophage 가이용됨 1Plasmid vector - Circular molecule of DNA 로서 bacterial cell 내에서독립적으로존재함 - 하나의 plasmid vector 는여러유전자를지니며 host cell 의표현형에영향을줌 (ex. Antibiotic resistant gene used as a selectable marker) Selectable marker 외부유전자를 host cell 에도입후유전자가도입된 clone 과 artificial clone 을가려내기위해사용하는것. 대체로 cloning vector 의 antibiotic resistant gene 를이용함. Antibiotic 이포함된배지에서는외부유전자가도입된 colony 만이자랄수있으므로선택하여이용할수있음. - Episome: Host cell 의 chromosome 에 integration 될수있는 plasmid. 수많은 cell division 후에도안정적으로 host 내에존재할수있음. 건국대학교미생물공학과 28
Week 5. Cloning vectors and isolation of DNA - Plasmid vector 의사이즈는 cloning 의목적에따라 10.0kb~250kb 로다양함. - Copy number 는한 host cell 내에서존재하는 plasmid copy 수로 plasmid vector 마다고유함. Plasmid copy number 가높아야많은양의 recombinant DNA 를얻을수있으나유전자산물이 host cell 에 toxic 한경우에는 copy number 가낮은것이유리함. -Incompatibility: 한세포내에서다른종류의 plasmid 가공존할수없는경우 - Bacteria 간의 conjugation 으로 plasmid 가전달될수있음. - Plasmid classification F plasmid (fertility): Pilus 생성및 gene transfer 를조절하는 tra genes 만을가지고있어 conjugation 에의한 plasmid transfer 능력외에는다른특성이없음 R plasmid (resistance): Bacteria 가 antibacterial agent 에내성을갖도록하는유전자를지닌 plasmid. 이와같은 plasmid 는 bacterial infection 에큰문제를야기함. Col plasmid: E. coli 의 ColE1. 다른 bacteria 를죽이는 colicin 을 coding 함. Degradative plasmid: Pseudomonas putida 의 TOL 과같이대부분의생물이이용하지못하는 toluene 이나 salicyclic acid 와같은물질을대사에사용할수있게함 Virulence plasmid: Host bacterium 에병원성 (pathogenicity) 을부여함 건국대학교미생물공학과 29
- Plasmid vectors that fuse a gene with various tags Week 5. Cloning vectors and isolation of DNA Cloning 된 gene 과 c-myc gene 이 fusion 되어세포내에서 myc-tagged fusion protein 이만들어짐. Myc antibody 로 western blot 하여 fusion protein 을확인가능. 6XHistidine tag 은 nickel 이온과강한 affinity 를가지므로 fusion protein 을 nickel ion-charged bead 로분리할수있음 EGFP (enhanced green fluorescent protein) 와 fusion 되어만들어진단백질은형광현미경을통해세포내위치를확인할수있음 건국대학교미생물공학과 30
2 Bacteriophage -Host cell 에 infection 되어외부유전자도입이가능 -Lytic infection Week 5. Cloning vectors and isolation of DNA Adsorption and penetration Replication Maturation and release - Lysogenic infection 건국대학교미생물공학과 31
Week 5. Cloning vectors and isolation of DNA - Lysogenic infection 에서는 phage DNA 가 host bacteria 내에계속존재하며함께 division 함 - Lysogenic infection 되어 host chromosomal DNA 에삽입된 phage DNA 를 prophage 라함 - Prophage 를가지고있는 bacteria (lysogen) 은정상세포와구분이되지않으며, prophage 가 host chromosome 에서방출되면 lytic mode 로변함 - Gene cloning 에이용되는 lysogenic phage 에는 lambda (λ) phage 와 M13 phage 가대표적 - λ phage DNA 는양말단 cos sites 는 cohesive ends 이므로 linear form 에서 circular form 형성이가능하고따라서 bacteria 내부로도입이가능 - Bacteria 내부에서 circular form λ phage 는 rolling circle mechanism 에의해 catenane (λ phage DNA 가여러개결합된형태 ) 을복제하고이후 endonuclease 에의해 cos site 가잘리고 phage particle 이조립됨 건국대학교미생물공학과 32
Week 5. Cloning vectors and isolation of DNA 2. Preparation of total cell DNA - Gene cloning 의소스를얻기위함 - The basic steps in preparation of total cell DNA from bacteria 1 Growing and harvesting a bacterial culture - Bacterial culture 시에는 defined medium (ex. M9 medium) 또는 undefined medium (ex. LB medium) 등을이용. - LB (Luria-Bertani) medium 은미지성분이포함된 complex medium 으로서 tryptone, yeast extract, NaCl 로구성됨 - E. coli 를 37 의 LB medium 에서 150~250rpm 으로 shaking incubation 할경우, 일반적으로 20 분에한번씩 division 하며 2~3ⅹ10 9 cells/ml 까지증식함 - 증식정도는 600nm 에서 optical density 를특정하여알수있음. One OD unit 은약 0.8ⅹ10 9 cells/ml 에해당 - 배양후 centrifuge 하여 pellet 을작은 volume 으로 resuspension 하여 cell extract 를만듦 2 Cell extraction preparation - 세포내용물을꺼내기위해세포벽을제거해야함 - 물리적방법또는화학적방법으로 cell envelope 를 breaking 하며 bacteria 에는주로화학적방법이이용됨 - E. coli 에대한 chemical lysis 에는 lysozyme 과 EDTA 가이용됨 - Lysozyme 은 egg white 에존재하는 bacterial cell wall polymer 를분해하는효소 - EDTA (ethylenediamine tetraacetate) 는 chelating agent 로서 cell envelope 안정성에필요한 Mg 2+ 이온을제거하고또한 DNA 를분해하는효소의활성을억제함 건국대학교미생물공학과 33
Week 5. Cloning vectors and isolation of DNA - 주로 SDS (sodium dodecyl sulphate) 와같은 detergent 를사용, 세포막의 lipid molecule 을제거하여세포막 disruption 시킴 -Cell lysis 후 insoluble cell debris 를제거하고 DNA 를분리함 3 Purification of DNA from a cell extract - Bacterial cell extract 에는 DNA 뿐만아니라많은양의 protein 과 RNA 가존재 - 단백질을제거하기위해서는 phenol and chloroform mixture 를이용하거나 proteinase K 를이용 - RNA 를제거하기위해서는 ribonuclease 를이용 -DNA 를분리를위해 ion-exchange 등의 column chromatography 를이용할수있음 Phenol extraction: Cell extraction 과 phenol 을혼합하고원심분리하여단백질제거 건국대학교미생물공학과 34
Week 5. Cloning vectors and isolation of DNA 4 Concentration of DNA sample - DNA 를원하는농도로농축시키기위해 ethanol precipitation method 를이용 - Monovalent cation (Na + ) 와 ethanol 첨가하면 -20 이하의온도에서 DNA 가침전 -Na + 는 DNA 의 negative charge 를상쇄하고 ethanol 은 H 2 O 의 polarity 를감소시켜 DNA 의 solubility 를낮춤 - Glass rod 를이용해 DNA 를회수하거나원심분리한후원하는농도로 redissolve 할수있음 5 Measurement of DNA concentration - DNA 농도는 260nm 의 UV 파장으로측정 -A 260 =1.0 이면 dsdna 의농도는 50 μg /ml - A260/A280 ratio 는 pure DNA 가 1.8, protein 및 phenol 오염시 1.8 미만, RNA 오염시 1.8 이상 건국대학교미생물공학과 35
Week 5. Cloning vectors and isolation of DNA DNA purification by column chromatography Cell extract 를 anion-exchange resin 에통과시키면강한 negative charge 를지니는 DNA 분자가 resin 에결합하고다른물질은빠져나옴. Resin 에결합한 DNA 는물과같은극성용액으로 elution 하여회수. Guanidium thiocyanate 존재하에서 DNA 분자는 silica 에결합. Chemical structure of positively charged DEAE groups of QIAGEN Resin, and negatively charged groups of the DNA backbone which interact with the resin. 건국대학교미생물공학과 36
Week 5. Cloning vectors and isolation of DNA 3. Preparation of plasmid vector - Cloning 한유전자를지닌 plasmid vector 를 bacteria 로부터분리 - 많은양의 bacterial chromosomal DNA 로부터 plasmid DNA 만을분리해야함 - Plasmid DNA 와 bacterial chromosomal DNA 의 physical difference 에근거하여분리 size & conformation - Plasmid DNA 는매우작은 circular 형태. Bacterial DNA 는 size 가매우커서분리과정에서대부분부숴져 linear 한형태. 1 Separation on the basis of size - Sucrose 존재하에서 bacteria 에 lysozyme 과 EDTA 를처리하면세포벽이부분적으로파손된 sphaerplast 가형성 - Triton X-100 등의 non-ionic detergent 를처리하여 cell lysis (ionic detergents cause too much chromosomal breakage) - 원심분리하여 size 가작은 plasmid 가포함된 cleared lysate 를얻음 2 Separation on the basis of conformation - Plasmid 는 double-strand 가온전할경우 supercoiled (covalently closed-circular) 형태로세포내에서존재 - Nick 이있을경우 open-circular 형태 - Supercoiled plasmid 는분리과정에서 linear 형태로된 chromosomal DNA 로부터쉽게분리해낼수있음 건국대학교미생물공학과 37
- Alkaline denaturation method NaOH 를 cell extract 에첨가, ph 12~12.5 에서 non-supercoiled DNA 의 hydrogen bond 가파괴됨 Sodium acetate 를첨가, ph 가중성이되어 ssdna 가 reaggregation. 원심분리로 supercoiled DNA 만을분리 Week 5. Cloning vectors and isolation of DNA - Caesium chloride density gradient centrifugation CsCl 용액을 centrifuge 하여 gradient 를만들수있음 Cell extract 를넣어 protein, DNA, RNA 를크기에따라분리 EtBr (ethidium bromide) 는 dsdna 의 base pairs 사이에 intercalation 하는데, supercoiled DNA 는 free ends 가없으므로제한된양의 EtBr 만이 DNA 에결합할수있음 EtBr 을첨가하면 linear DNA 와 supercoiled DNA 간에 density 차이가생겨분리가능 EtBr 을 n-butanol 로제거 CsCl 을 dialysis tubing 으로제거 건국대학교미생물공학과 38
Week 6. Manipulation of DNA 1. DNA manipulative enzymes - DNA manipulative enzymes 는세포내에서 DNA replication, transcription, repair, recombination, breakdown 등에관여함 - 이러한 enzymes 를추출하여 gene cloning 및 genetic engineering 에사용함 1Nuclease - Cut, shorten or degrade nucleic acid molecules - Nucleotide 간의 phosphodiester bond 를끊음 Exonuclease removes nucleotides one at a time from the end of a DNA molecule Endonuclease is able to break internal phosphodiester bonds within a DNA molecule 건국대학교미생물공학과 39
Week 6. Manipulation of DNA - Exonuclease 인 Bal31 은 both strands 를 cleavage 함. E. coli exonuclease III 는 single strand (3 terminus) 에만작용. - S1 endonuclease 는 single strand 를 cleavage 하고, DNase I (deoxyribonuclease I) 은종류에따라 single strand 또는 double strand 에 non-specific 하게작용 - Restriction endonuclease 는 dsdna 의특정염기서열을인식하여작용 건국대학교미생물공학과 40
Week 6. Manipulation of DNA 2Ligase - Join nucleic acid molecule together - Repair of single-stranded breakage, join double-stranded DNA fragment 3 Polymerase - Synthesize a new strand of DNA complementary to an existing DNA or RNA molecule - Template 에 primer 로서역할을하는 double-stranded region 을필요로함 DNA polymerase I 은 5 3 exonuclease 활성을지님 Klenow fragment 는 DNA polymerase I 의 Exonuclease 활성부위를제거한것 Reverse transcriptase 는 RNA template 로부터상보적인 DNA strand 를합성함 건국대학교미생물공학과 41
Week 6. Manipulation of DNA - DNA labeling with various polymerases Nick translation Pancreatic DNase I 으로 nick 을만든후 E. coli DNA polymerase I 의 5 3 exonuclease activity 및 5 3 polymerase activity 를이용하여 DNA 를 labeling 함 Random primed labeling Random hexanucleotides 를 primer 로서 annealing 하고 Klenow fragment 에의한 polymerization 으로 DNA labeling 건국대학교미생물공학과 42
Week 6. Manipulation of DNA 4 DNA modifying enzymes - Modify DNA molecules by addition or removal of specific chemical groups Alkaline phosphatase From E. coli, calf intestinal tissue or arctic shrimp. Removal of phosphate groups at 5 terminus of DNA molecule. Polynucleotide kinase From E. coli infected with T4 phage. Adding phosphate groups onto 5 terminus. Terminal deoxynucleotidyl transferase From calf thymus tissue. Adding one or more deoxyribonucleotides onto 3 terminus of DNA molecule 건국대학교미생물공학과 43
Week 6. Manipulation of DNA 2. Restriction endonuclease - Gene cloning 을위해 circular 형태의 vector 를 restriction enzyme 처리로 linear 형태로만들고, insertion 할 DNA molecule 역시 restriction enzyme 으로양끝을 digestion 함 - 특정염기서열만을인식하여 cleavage 하므로 DNA 의다른부위에손상을주지않고원하는부위만을자를수있음 - Restriction enzyme 을 gene cloning 에이용하는 technique 의발견으로 W. Arber 등에게 Nobel Prize 가주어짐 (1978) 건국대학교미생물공학과 44
Week 6. Manipulation of DNA - Restriction endonuclease 는 bacteria 에 infection 된 phage DNA 를제거하는방어기작. Bacterial DNA 의 recognition sequence 는 methylation 되어서보호됨 - Restriction endonuclease 는 3 가지타입이있음 Type I and III 제한효소가특정염기서열을인식하나실제 cleavage site 는인식서열에서떨어진부위임 Type II 특정인식서열내부를 cleavage 하므로 genetic engineering 에사용됨. 많은제한효소들은 hexanucleotide sequence 를인식함. 인식하는 nucleotide sequence 길이는 4 개에서 8 개이상까지다양함. 대부분의인식서열은 DNA 서열이역방향으로동일하게반복된 palindrome 구조. 건국대학교미생물공학과 45
Week 6. Manipulation of DNA - 제한효소에의한 cleavage 후 dsdna 는 sticky end (cohesive end) 또는 blunt end 를지니게됨 - Blunt end 의경우 DNA 간의 ligation 효율이좋지않으므로 gene cloning 에는주로 sticky end 를이용함 - BamHI, BglII, Sau3A 와같이다른염기서열을인식하면서동일한 sticky end 를만드는제한효소들을이용해동일인식서열이없는 DNA molecule 을잘라붙일수있음 건국대학교미생물공학과 46
Week 6. Manipulation of DNA - DNA 에제한효소에대한 recognition sequence 가존재할확률은 4 개의 nucleotides 가동일하게존재한다고가정할때 (GC=50%), hexanucleotide 의경우 (ex. GAATTC) 4 6 =4096 nucleotides 마다한번임 - 제한효소의인식서열이길수록나타날인식서열이나타날확률이적어 genomic DNA cleavage 시 large fragment 를얻을수있음 - 실험적으로 DNA molecule 을 digestion 할경우제한효소의 maximal activity 를유지하는 condition 을만드는것이중요 (ionic strength, temperature, cofactor 등 ) - 반응후에는제한효소를 heat inactivation 시키고다음조작을위해 pure DNA 만을추출해야함 건국대학교미생물공학과 47
Week 6. Manipulation of DNA - Analyzing the result of cleavage by gel electrophoresis 제한효소에의해 cleavage 된 DNA fragment 의수와사이즈를확인하기위해전기영동을이용 DNA 의 negative charge 로인해 electric field 내에서 positive pole 쪽으로이동 DNA 의 molecular weight 이작을수록멀리이동함 0.5cm 두께의 0.5% agarose gel 의경우 1~30kb 의 DNA fragment 사이즈확인이가능 (large pores) 0.3mm 두께의 40% polyacrylamide gel 의경우 1~300bp 의 DNA fragment 사이즈확인이가능 (small pores) 전기영동후 gel 을 staining 하여 DNA 를 visible 하게확인 EtBr (ethidium bromide) 로 agarose 와 acrylamide gel 을 staining 하여 UV 로확인 EtBr 과 UV light 은강한 mutagen 이므로사용에유의 건국대학교미생물공학과 48
Week 6. Manipulation of DNA Autoradiography 로 32 P-labeled DNA 를 sensitive detection 할수있음 DNA molecule 의 radioactive labeling 은 nick translation, end filling labeling 또는 random primed labeling 등의방법을이용 건국대학교미생물공학과 49
Week 6. Manipulation of DNA - Restriction mapping Double digestion 으로잘린 DNA fragment 들의크기를확인하고 recognition sequence 의상대적인위치를알아냄 Full length DNA 의 restriction map 을알아내면원하는유전자를얻기위해어떤제한효소가필요한지알수있음 3. Ligation - Restriction enzyme 으로잘린 vector 와 insert DNA 를서로 ligation 하여 recombinant DNA molecule 을제작함 - T4 DNA ligase 를이용 (purified from E. coli infected with T4 phage) - Nucleotide 간의 phosphodiester bond 를형성 건국대학교미생물공학과 50
Week 6. Manipulation of DNA - Sticky-ended DNA molecule 의경우 base 간의상보적인결합이이루어지므로 ligation of blunt-ended molecule 보다 ligation 효율이높음 - Sticky end 를 DNA molecule 의양말단에도입하기위해제한효소인식서열을가진 linker 를 ligation 후제한효소처리. DNA 의 internal region 에제한효소인식부위가존재할경우이방법사용못함. 건국대학교미생물공학과 51
Week 6. Manipulation of DNA - Linker 를사용하지못할경우에는이미 sticky end 형태로합성된 adaptor 를 ligation 하여이용. Adaptor 간에서로 ligation 되는것을막기위해 sticky end 의 3 말단의 phosphate group 를제거함. Ligation 후 polynucleotide kinase 로다시 5 -phosphate group 생성. 건국대학교미생물공학과 52
Week 6. Manipulation of DNA - Terminal deoxynucleotidyl transferase 를이용한 homopolymer tailing 으로 vector 와 insert DNA 에 sticky end 를도입. Klenow fragment 로 vector 와 insert DNA tail 의 base 수를맞춰주고 ligase 로 repair 함. 건국대학교미생물공학과 53
Week 7. Gene transfer and clone identification 1. Transformation - The introduction of DNA molecule into living cells - Ligation 된소량의 recombinant DNA molecule 을 bacteria 내로도입하여많은양의 copy 를만들수있음 - Recombinant plasmid 가도입된 bacteria 로부터 recombinant protein 을생산, 정제하여이용할수있음 건국대학교미생물공학과 54
Week 7. Gene transfer and clone identification - Bacteria 로도입할 ligation mixture 에는 recombinant DNA molecule 뿐만아니라다음의것들이포함되어있음 Unligated vector molecule Unligated DNA fragment Self-ligated vector (vector molecule that have recircularized without new DNA being inserted) Recombinant DNA molecules carry the wrong inserted DNA fragment - Unligated molecule 의경우 bacteria 로도입되더라도 bacteria 내에서분해되고복제되기어려우므로문제가안됨 - Self-ligated vector molecule 또는 incorrect recombinant plasmid 의경우 bacteria 내에도입되어정상적으로복제되어문제 - Transformation 후에나타난각각의 single colony 중일부는 cloning 되지않은 plasmid 를지니고있음 - 원하는 recombinant plasmid 를지닌 bacteria 와 self-ligated plasmid 를지닌 bacteria 를가려낼수있어야함 건국대학교미생물공학과 55
Week 7. Gene transfer and clone identification - Bacillus 와 Streptococcus 속의경우 foreign DNA 를 uptake 하는것이용이하지만, 보통의 E. coli 는외부유전자를받아들이는능력이매우적음. 따라서인위적인 physical or chemical treatment 로 foreign DNA molecule 을받아들이는능력을만들어주어야하며이러한처리를거친 bacteria 를 competent 하다고말함. - Preparation of competent E. coli cells Chemically competent cell 0 에서 CaCl 2 과같은 divalent cation (Ca 2+ ) 을처리하면 E. coli membrane 외부에 plasmid 가붙게되고 42 의 heat shock 으로세포내부로 plasmid 가도입됨 Electrocompetent cell Electric shock 로 E. coli 세포에 hole 을만들어 plasmid 를도입시킴 - Cloning vector 는항생제를 detoxify 하는유전자를지니고있으므로항생제배지에서 transformed colony 만이나타나고 normal colony 는나타나지않음 (ex. amp R gene codes for β-lactamase) 건국대학교미생물공학과 56
Week 7. Gene transfer and clone identification 2. Identification of recombinants - pbr322 vector 의경우두개의 antibiotics resistance gene (amp R, tet R ) 을지니며 cloning site 가 tet R 내부에존재. Ampicillin 배지에서 transformed cell 을 selection 하고 tetracycline 배지에 replica plating 하여 insertion 여부를가려냄. tetr gene disrupted 건국대학교미생물공학과 57
Week 7. Gene transfer and clone identification - puc8 vector 의경우, lacz gene (coding for β-galactosidase) 내부에 cloning site 가 존재. Lactose 유사체인 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dgalactopyranoside) 과 IPTG (inducer of lacz, isopropylthiogalactosidase) 를배지에 넣어주면 β-galactosidase 에의해 X-gal 이분해되어 deep blue colored colony 를형성함. Recombinant vector 는 β-gal - 이므로 white colony 를생성하여 selection 이가능함 (Lac selection). 건국대학교미생물공학과 58
- LacZ gene 을이용한 blue/white screening 원리 Week 7. Gene transfer and clone identification Lactose 가 inhibitor 에결합하여 Lac Z gene 의발현 IPTG 에의해 inhibitor 가억제되어 Lac Z gene 이발현. E. coli chromosome 으로부터만들어진 ω-fragment 와 Lac Z gene 으로부터만들어진 α-fragment 가결합하여온전한 β-galactosidase 가형성됨. 건국대학교미생물공학과 59
Week 7. Gene transfer and clone identification 3. Introduction of phage DNA into bacteria - Phage vector 로 cloning 한 recombinant DNA molecule 을 bacteria 내로도입하기위해다음의방법을사용 1Transfection - Transformation 과동일한방법으로 heat shock 으로 E. coli 에 purified recombinant phage DNA 를도입시킴 2 In vitro packaging - λ cloning vector 등을직접 bacteria 로도입시키는것은어렵기때문에, head-andtail 구조의 λ virus 에 recombinant DNA 를 packing 하여 phage particle 을 bacteria 에감염시킴 - Single-strain system 또는 two-strain system 으로 in vitro packing 하여만든 phage particle 을 bacteria 에감염시켜 recombinant DNA 도입 Single-strain system 감염성 λ phage 를 E. coli SMR10 에도입시키면 packaging 에필요한단백질들이 bacteria 내에생산 축적되어 in vitro packaging 에이용됨. 사용되는 λ phage 는 cos site 가 mutation 되어있음. 따라서 λ DNA catenane 이 endonuclease 에의해잘려지지않아복제및조립되지않고 packaging 에필요한단백질만을생산함. Two-strain system Packaging 에필요한 protein E 를생산하지못하는 E. coli BHB2688 과 protein D 를생산하지못하는 E. coli BHB2690 에각각 λ phage 를감염시킴. 각각의 E. coli 내에서 packaging 에필요한단백질이없으므로 capsid 를형성하지못하고 packaging 에필요한단백질이축적됨. 두 E.coli 배양액 lysate 를섞어서 in vitro packaging 을함. 건국대학교미생물공학과 60
Week 7. Gene transfer and clone identification - Phage 에감염된 bacteria 를 agar plate 에도말하면 cell lysis 로인한 plaque 가형성됨 - Insertion inactivation of lacz gene 을통해 plaque 의 blue/white screening 이가능 건국대학교미생물공학과 61
1. Expression of foreign genes in E. coli Week 9. Production of protein from cloned gene - 유전적조작이편리하고빠른증식속도를가진 E. coli 를 host 로주로사용함 - E. coli 로부터재조합단백질을빠른시간내에대량으로생산하여 research material 이나 pharmaceutical product 로사용함 - E. coli 와같은 prokaryotic gene 은 intron 이없고그것을제거하는 processing step 이없으므로도입되는 recombinant gene 은 intron 이없는상태여야함 - Expression vector 는 E. coli 에서 foreign gene expression 을위해다음조건을갖춤 Promoter, transcription initiation site 의 upstream 에존재하는부위로 E. coli RNA polymerase 의 σ subunit 이인식하여결합하는부위. E. coli RNA polymerase 는 eukaryotic promoter 를인식할수없으므로 recombinant gene 의발현을위해서는 E. coli 가인지할수있는 promoter (ex. lac promoter) 를지닌 vector 에 cloning 필요 Terminator, stem-loop 구조를만들수있는 nucleotide sequence 로전사종료부위를나타냄 Gilbert box Promoter sequences Pribnow box (TATA box) Ribosomal binding site, ribosome 이결합하는 mrna 의한부분으로 initiation codon 의 upstream 에위치 건국대학교미생물공학과 62
Week 9. Production of protein from cloned gene 1 Promoter in expression vector - Promoter is a critical component of an expression vector - E. coli promoter 들의경우서로비슷한 consensus sequence 를지님 (ex. TTTACA, TTGACA) - Small variation in consensus sequence may have a major effect on transcription efficiency. It can be strong promoter or weak promoter. - Examples of promoters used in expression vector lac promoter, IPTG 에의해 induction 되어 downstream gene 을발현시킴 trp promoter, tryptophan 합성에관련된 gene 을발현시키는 promoter 로서 tryptophan 에의해 repression 되고 3-βindoleacrylic acid 에의해 induction 됨 tac promoter, lac 과 trp promoter 의 hybrid 로서 IPTG 에의해 induction 됨 λp L promoter, λ DNA 를발현시키는 promoter 로서 30 이상의온도에서 ci repressor 가 temperature-dependent inactivation 되며 induction 됨 T7 promoter, phage 의 T7 RNA polymerase coding gene 을지닌 E. coli 에서사용하며 T7 RNA polymerase gene 의 upstream 에 lac promoter 를도입하여 IPTG 에의해 induction 시킴 건국대학교미생물공학과 63
Week 9. Production of protein from cloned gene - Use of T7 and lac promoter in recombinant protein expression Expression vector 는 inserted gene 의 upstream 에 T7 promoter 와 lac operator sequence 를지님 (T7lac promoter) Recombinant protein 발현에사용되는 E. coli 는 λde3 lysogen 이며 chromosome 에 T7 RNA polymerase gene 을가지고있음. E. coli chromosome 상에서 lac promoter 에의해 T7 RNA polymerase 의발현이조절됨. lac repressor (binding to lac operator) 에의해 T7 RNA polymerase 의발현이억제되어있고배지에 IPTG 를첨가함으로써 induction 되어 E.coli RNA polymerase 에의하여 T7 RNA polymerase gene 이전사, 발현됨 T7 RNA polymerase 가 recombinant plasmid 의 T7 promoter 를인식하여결합, downstream gene 이발현됨 T7 RNA polymerase 의발현을 lac promoter 로조절하고 target gene 의발현을 T7 promoter 및 lac operator 를이용하여조절함으로써 very tight control of protein expression 가능 건국대학교미생물공학과 64
Week 9. Production of protein from cloned gene 2 Gene fusions - Foreign gene (especially eukaryotic gene) 을 E. coli 에서발현시킬경우, 만들어진단백질이 host cell 내에서불안정하여분해되거나또는 host cell 에 toxic 한경우가있음. 매우 hydrophobic 한단백질을생산할경우 incorrect folding 또는 hydrophobic interaction 으로인해세포질에서 inclusion body 축적, 정제시문제발생. - Bacterial peptide 를 target protein 앞에 fusion 시켜 host cell 에의해분해되는것을방지할수있음 - 세포질내에서의재조합단백질의 solubility 를증가시키기위해 NusA, GST (glutathione S- transferase), MBP (maltose-binding protein) 등을 target protein 의 N-termini 앞에 fusion 시킬수있음 - 단백질과 fusion 된 tag 에친화성을가지는물질을이용하여발현된재조합단백질을 cell extract 로부터정제하기위한 affinity chromatography 수행가능 GST-tagged protein has affinity to glutathione Sepharose bead coupled with glutathione that has high affinity to GST GST-tagged fusion protein Sepharose Bead GST Target Protein Protease (thrombin or factor Xa) Cleavage Site Glutathione 건국대학교미생물공학과 65
6X histidine-tagged protein has affinity to Ni-NTA Week 9. Production of protein from cloned gene Elution with imidazole or EDTA Histidine Ni 2+ -NTA (nitriloacetic acid) matrix 3 Problems with production of recombinant protein in E. coli - Due to sequence of foreign gene Foreign gene 이 intron 을포함하고있을때 다른 host 에서는정상이나 E. coli 에서 termination signal 로작용하는서열을포함할경우전사가조기종결됨 Codon bias 가다를경우. 모든 organism 의 genetic code 는동일하지만 eukaryote 와 prokaryote 의선호하는 codon 이다를수있음. - Due to limitation of E. coli E. coli 는 post-translational modification 을하지않으므로 eukaryotic protein 의경우 biological activity 에영향을받을수있음 재조합단백질의 incorrect folding 로인한활성결핍 건국대학교미생물공학과 66
Week 9. Production of protein from cloned gene 4 Recombinant protein production in eukaryotic cells - E. coli 를이용한재조합단백질생산의문제점을피하기위한시스템 - 재조합단백질의번역후 glycosylation 등의 modification 능력이 animal cell 과유사 -Yeast Saccharomyces cerevisiae, fungi Kluyveromyces lactis 등을 host 로이용 - S. cerevisiae 의경우 GAL promoter 의조절하에 foreign gene 을발현시킴. - GAL promoter 는 galactosidase 에의해 induction 됨. 다른 promoter 로는 PHO5 (regulated by phosphate level), CUP1 (induced by copper) 등이있음. An example of cloning vector for S. cerevisiae 5 Recombinant protein production in insect cells - Insect cells provide an alternative to mammalian cells to produce animal protein - Mammalian cell 과유사한단백질발현과높은수율의단백질생산이가능 - Insect 에흔하게감염되는 baculoviruse 의 genome 을이용한 cloning vector 사용 건국대학교미생물공학과 67
Week 10. Studying gene location and structure 1. Studying the location of a gene -Plasmid 와같은작은 DNA molecule 또는 chromosome 과같이큰 DNA molecule 에서의유전자위치를알아내는여러방법이있음 Southern hybridization Restriction enzyme 처리한 DNA fragment 를전기영동후 labeled probe 를 hybridization 하여 size 를확인하고 restriction mapping 을통해유전자의위치를알아내는방법. RNA molecule 의경우도마찬가지의방법으로실험할수있으며이는 Northern hybridization 이라함. DNA 를 agarose gel 로부터 nitrocellulose 또는 nylon membrane 로 transfer 하는방법 건국대학교미생물공학과 68
Week 10. Studying gene location and structure OFAGE (orthogonal field alternation gel electrophoresis) - 50kb 이상의큰 DNA molecule 의경우일반적인전기영동으로 migration 되지않음 - Eukaryotic chromosomal DNA 에서원하는유전자의위치를알아내기위해서는 OFAGE 등의방법을사용 - 두방향의 electric field 를번갈아가며걸어줌으로써큰 DNA molecule 의 migration 이가능 - 비슷한방법으로는 CHEF (contour clamped homogeneous electric field), FIGE (field inversion gel electrophoresis) 등이있으며이를통해 chromosome 을 gel 에서분리하여 gene library 구축을할수있음 건국대학교미생물공학과 69
Week 10. Studying gene location and structure Fluorescence in situ hybridization (FISH) -Higher eukaryotes 의 50,000kb 이상의 chromosome 의경우 OFAGE 로 DNA 를 migration 시킬수없음 - FISH 는 metaphase 의 chromosome 에 radioactive isotope- 또는 fluorescence-labeled probe 를직접 hybridization 하여 autoradiography 또는형광현미경을통해유전자의위치를확인하는방법 - Gene deletion, translocation 등으로인한유전적질환가능성을알아낼수있음 건국대학교미생물공학과 70
Week 10. Studying gene location and structure 2. DNA sequencing - DNA 의 nucleotides 배열을알아내는방법으로 chain termination method 와 chemical degradation method 가있음 1 The Sanger-Coulson method (chain termination method) - Single-strand recombinant DNA 의 vector 부위에상보적인 primer 를 annealing 하고 complementary strand 를합성함. 이때 dntp (radioactive isotope-labeled) 와함께 ddntp (dideoxynucleotide) 를첨가하여합성이더진행되지않도록함. ddntp 는 3 hydroxyl group 이없으므로다음에올 nucleotide 가결합하지못함. Chain termination 된 fragment 들을 polyacrylamide gel 에서전기영동하고 autoradiography 하여크기가작은밴드부터읽어나감. 건국대학교미생물공학과 71
Week 10. Studying gene location and structure - dntp (datp, dttp, dgtp, dctp) 와 ddatp 를일정비율로넣어주고 polymerase 에의한 complementary strand 합성을진행하면주형의 thymidine 자리에서합성이종결됨. 반응시정상적인 datp 가 ddatp 대신결합할수있으므로말단에 ddatp 가존재하는길이가다른여러 strand 가합성됨. - Automated sequencing 의경우각기다른 fluorescent dye 로 labeling 된 ddntp 를이용해 Sanger-Coulson method 법을수행. 4 가지 (A, T, G, C) 반응산물을하나의 lane 에전기영동하여이동하는 DNA fragment 가 laser beam 에의해 detection 됨. 건국대학교미생물공학과 72
Week 10. Studying gene location and structure 2 The Maxam-Gilbert method (chemical degradation method) -Sequencing 하고자하는 dsdna 의 5 말단을 labeling 한후 denaturation 하여전기영동하면두 single strand 의 purine 함량이다르므로 band 가서로분리됨 - Gel 상에서 single strand DNA 중하나를추출하고 nucleotide 간의결합을화학적으로끊어전기영동후 autoradiograph 를통해서열을읽음 - Methyl sulfate 는 DNA 의 purine (guanine, adenine) 을 methylation 함. Methylated purine 의 glycosidic bond (purine-ribose) 는매우불안정하여 DNA strand 의 purine 자리는 alkali 조건의고온에서 cleavage 됨. - DNA strand 의 adenine 자리는약산성의조건에서 cleavage 됨 - Pyrimidine (cytosine, thymine) 은 hydrazine (N 2 H 4 ) 에의해 cleavage - Cytosine 은 piperidine (C 5 H 11 N) 에의해 cleavage 건국대학교미생물공학과 73
1. Studying transcript - All genes have to be expressed in order to function - Transcription, translation 과정을거쳐유전자가발현 - Eukaryotes 의경우 transcript 에서 intron 을제거하는 processing 을거침 - 유전자의전사개시및종결부위와실제유전자산물이만들어지는부위를아는것이중요 - 많은 transcript analysis 에서유전자의 DNA 단편과 RNA transcript 간의 hybridization 을이용함 Week 11. Studying gene expression and function (1) 1 Electron microscopy of nucleic acid - 유전자를지니고있는 DNA strand 와그유전자의 RNA transcript 를 hybridization 시켰을때유전자의 intron 부위는 hybridization 되지않으므로전자현미경상에서고리를형성하여보임 - Intron 의위치와수를알아낼수있음 건국대학교미생물공학과 74
Week 11. Studying gene expression and function (1) 2 Analysis of DNA-RNA hybrids by nuclease treatment - DNA-RNA hybrid 를 S1 nuclease 처리 - S1 nuclease 는 single-strand 의 intron 부위만을 digestion 함 - Alkali 처리로 RNA strand 를제거하여 intron 이외의 DNA fragment 를얻어분석 3Nuclease S1 protection assay - 유전자의전사개시부위를알기위함 - 유전자의전사개시부위를포함하는 DNA 와 RNA transcript 를 hybridization 시키면전사개시부위앞의 5 -UTR 이 single-strand 로남음 - S1 nuclease 로 single-strand 부위를 digestion 하고 hybridization 된 DNA 의길이를확인. S1 nuclease 처리하지않은 DNA 의길이와비교하여전사개시부위의위치를알수있음. - Gel 로부터 single-strand DNA 를추출하여 Maxam- Gilbert method 로염기서열을알아낼수있음 건국대학교미생물공학과 75
Week 11. Studying gene expression and function (1) 4 Primer extension assay - Nuclease S1 protection assay 와같은목적으로이용될수있음 - RNA transcript 보다짧은 DNA fragment 를 RNA transcript 와 hybridization 시킨후 reverse transcription 으로 DNA 의 3 을 extension - Reverse transcription 한 DNA 와그렇지않은 DNA fragment 의사이즈를전기영동으로비교 - 이후 gel 로부터 single-strand DNA 를추출하여 Maxam-Gilbert method 로염기서열을알아낼수있음 Reverse transcription ( 역전사반응 ) Single-strand RNA 를 template 로하여 complementary DNA 를합성하는반응. HIV1, M-MLV, AMV 와같은 retrovirus 의역전사효소를이용함. 역전사반응으로얻은 single-strand cdna 를 PCR 하여 dsdna 를얻을수있으며 (RT-PCR) RT-PCR 을통해유전자의발현정도를알아내거나 gene cloning 에이용할수있음. 건국대학교미생물공학과 76
5 Rapid amplification of cdna ends (RACE) - Used to identify the 5 and 3 termini (especially unknown region of 5 UTR) of RNA transcript or obtain full length of cdna - 다양한기법의 RACE method 가존재함 Week 11. Studying gene expression and function (1) 역전사반응으로 RNA 의 5 termini 까지 cdna 합성 cdna 의 3 말단 (RNA 의 5 말단에상보적서열 ) 의서열을알지못함 cdna 의 3 말단에 poly-a tailing Poly-T primer 와 gene specific primer 를사용하여 PCR 수행 Nested PCR 후 PCR product 를 cloning 하여 sequencing 할수있음 건국대학교미생물공학과 77
Week 11. Studying gene expression and function (1) 2. Studying gene expression - 세포내의모든유전자가항상발현되는것은아님 - 유전자의발현수준은세포내에서엄격히조절되며필요할때만 switched on - 특정환경변화시세포내유전자발현변화를분석함으로써질병표지인자발굴 1 Northern hybridization - 전기영동한 RNA extract 를 nylon 또는 nitrocellulose membrane 에 blotting 하고확인하고자하는 RNA transcript 에상보적서열을가진 labeled-cdna probe 를 hybridization 하여 autoradiograph 등으로확인하는방법 - RNA transcript 의 size 및유전자의 expression level 을알아낼수있음 2 Tissue in situ hybridization - 얼린조직을 wax 로고정및 microtome 으로얇게자른후 (5μm thick) labeledantisense RNA probe 를 hybridization 시켜현미경을통해 gene expression pattern 을관찰하는방법. 조직대신 whole embryo 를이용하여발생과정에서의 gene expression 을확인가능. Tissue in situ hybridization using β-myosin heavy chain probe in the heart of 13 day embryonic mouse Tissue in situ hybridization using HoxB specific probe in the embryonic mouse 건국대학교미생물공학과 78
Week 11. Studying gene expression and function (1) 3 Whole genome expression screening using DNA chip - Glass wafer 에 cdna clones 또는 gene-specific oligonucleotides 가코팅된 DNA chip (microarray) 을이용하여 gene expression screening - Reverse transcription 으로세포에서추출한 RNA 를 cdna 로변환, fluorescent tag 으로 labeling 하고 DNA chip 에 hybridization - 한 organism 내의모든 gene 들의발현정도를동시에확인가능 - Possible applications below.. Inducible gene expression 세포가환경변화에어떻게반응하는지확인 (ex. exposure to specific hormone, signaling molecule, or irradiation) Tissue- and cell type-specific gene expression Developmental stage-specific gene expression Gene expression during differentiation Gene expression during tumorigenesis 82K DNA microarray containing 82,944 different probes Oligonucleotide microarray containing over 65,000 different probes for 1,641 unique genes 4 Serial analysis of gene expression (SAGE) - Method for multiplex gene expression screening which depends on very short tags located at specific sites within individual transcripts - 모든 gene 들의발현정도를동시에알아낼수있음 - 복잡하고값비싼장비를필요로하지않음 건국대학교미생물공학과 79
Week 11. Studying gene expression and function (1) - SAGE is based on two principle A short nucleotide sequence tag 은각각의 transcript 내의특정위치만을 uniquely identification 할수있어야함. 예를들어, sequence tag 의길이가 9bp 라면확률적으로 4 9 =262,144 개이하의각각다른 transcript 를인식하는데있어서충분한정보를가짐. Sequence tag 들의 concatenation 으로 transcripts 분석을연속적이고효율적으로시행할수있음. 각각다른 transcripts 의 tag 들을한 clone 내에서 covalently link 하고 sequencing 을수행. Poly (A)+ RNA 를세포로부터추출하고 biotinylated oligo (dt) primer 를이용하여 cdna 합성 Restriction nuclease (anchoring enzyme) 으로잘라 3 overhanging ends 를만들고 streptavidin bead 에결합시킴 (using affinity between biotin group and streptavidin) anchoring enzyme site 및 tagging enzyme ( 인식부위에서 20bp 떨어진곳을자름 ) site 를포함한 linker 에연결 Tagging enzyme 으로자르고 blunt-end ligation Anchoring enzyme 으로자르고 sequence tag 들의 concatenation. Linker A-, B-specific primer 를이용, PCR 로증폭후 anchoring enzyme 으로자름. 다른 sequence tag들을 ligation하여 plasmid vector에 cloning, sequencing하여 short sequence tag의개수로발현수준을확인건국대학교미생물공학과 80
Week 12. Studying gene expression and function (2) 3. Studying the regulation of gene expression - 유전자의 upstream region 에 regulatory protein 이결합하는 promoter region 및 control sequence 가존재하여유전자발현이조절됨 - Gene regulatory protein 의 DNA-binding site 는특정 DNA 서열을인식하여결합함 - DNA 에 regulatory protein 이결합하는지의여부를알아내는방법 1 Gel retardation of DNA-protein complex - Also known as electrophoretic mobility shift assay (EMSA) - Labeled-DNA fragment (genomic clone or synthetic oligonucleotide) 에단백질이결합하여전기영동 (PAGE) 시 mobility 를감소시키므로 free DNA fragment 와비교하여 DNA-protein 결합여부를알수있음 - 경우에따라 DNA 에결합하는단백질의 antibody 를함께결합시켜 supershifting assay 할수있음 - Suspected regulatory sequence 에 regulatory protein 이결합하는지여부를알아낼수있음 Oligonucleotide Nuclear extract Antibody (Anti-Oct-1) Competitor + + + + - + + + - - + - - - - + DNA-protein-antibody complex DNA-protein complex Free DNA 건국대학교미생물공학과 81
Week 12. Studying gene expression and function (2) 2 DNase I footprinting -Regulatory protein 이결합한 DNA 부위는 DNase I 에의해 cleavage 되지않는원리를이용 - Labeled-DNA 를 pancreatic DNase I 으로 partial digestion 하고전기영동하면 size-fractionation 되고단백질이결합한부위는 DNase I 으로부터보호되어 gel 상에서 gap (footprint) 을나타냄 건국대학교미생물공학과 82
Week 12. Studying gene expression and function (2) 3 Reporter gene assay (deletion analysis) - Regulatory sequence 의위치를정밀하게알아낼수있음 - Regulatory sequence 의일부를제거했을때유전자발현의차이가있는지관찰함 조절서열의 enhancer 부위를제거하면발현이감소함 조절서열의 silencer 부위를제거하면발현이증가함 - Regulatory sequence at upstream of a gene 및일부서열이제거된 regulatory sequence 뒤에 reporter gene 을융합시켜 reporter gene 의발현변화를확인 건국대학교미생물공학과 83
Week 12. Studying gene expression and function (2) - Luciferase 를 reporter gene 으로사용할경우, regulatory sequence 를 luciferase reporter vector 에 cloning. Recombinant plasmid 를세포에 transfection 한후 bioluminescence activity 를비교함. Regulatory sequence Reporter gene An example of luciferase reporter vector An example of deletion analysis by luciferase reporter assay 건국대학교미생물공학과 84
Week 12. Studying gene expression and function (2) 4 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) - Gene regulatory protein 이 DNA 에항상결합하는것은아니며세포외환경변화등에의한적절한신호를전달받았을때결합함 - ChIP 은세포가어떠한조건에주어졌을때 chromatin 의어떤부위에 regulatory protein 이결합하는지의여부를 in vivo 상에서알아보는방법 Formaldehyde 는세포막을통과하여핵내의 DNA-protein 을 covalently cross link 시킴 Cell lysis 후 sonication 으로 chromatin 을일정길이로 fragmentation 특정 regulatory protein 에대한항체로코팅된 bead 를이용해 DNA-protein complex 의 immunoprecipitation Reverse cross-linking (heating) 으로 DNA-protein dissociation Precipitation 된 DNA 를 PCR 로확인 Specific condition 과 normal condition 의세포내에서 regulatory protein 의 DNA 결합여부를비교 건국대학교미생물공학과 85
Week 13. Functional analysis of proteome 1. Introduction - The proteome is the entire collection of proteins in a cell - 동일한단백질이라도 post-translational modification 에의해 chemical group 이더해지면그기능이달라지게됨 (ex. phosphorylation) - 단백질의동정및단백질간의상호작용, modification 등의연구가필요 2. Identification of the proteome 1 Two-dimensional electrophoresis - Polyacrylamide gel electrophoresis 를통해세포나조직내의단백질들을 size 에의해분리후다시단백질고유의전하에따라분리 - 단백질의 molecular mass 와 isoelectric point 에의한분리 2MALDI-TOF - Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight - 분리된단백질샘플의동정이가능 - Protease 처리로 polypeptide 를자른후 pulse laser 를쏘아샘플을이온화시킴 - 이온화된샘플을일정한전위차로가속시켜 detector 까지비행 (flight) 시킴 - Ionization source 로부터 detector 까지의 time-of-flight 을측정, 이를통해 mass-to-charge ratio 를알수있음 - Mass-to-charge ratio 를이용해단백질의분자량및 peptide 의 amino acid composition 를알수있음 건국대학교미생물공학과 86