J Koren So Food Si Nutr 한국식품영양과학회지 43(7), 980~988(2014) http://dx.doi.org/10.3746/jkfn.2014.43.7.980 승마갈근탕과발효승마갈근탕에의한항산화, 항미생물및항세포독성효과 인재평 1 신정미 2 허선진 1 이시경 1 1 건국대학교생명자원식품공학과 2 원광대학교한의학전문대학원한약자원개발학과 Antioxidtive, Antimiroil nd Antiytotoxi Ativities of Seungmglgeuntng nd Fermented Seungmglgeuntng Je Pyung In 1, Jung Mi Shin 2, Sun Jin Hur 1, nd Si Kyung Lee 1 1 Dept. of Bioresoures nd Food Siene, Konkuk University 2 Dept. of Herl Resoures, Professionl Grdute Shool of Orientl Mediine, Wonkwng University ABSTRACT Seungmglgeuntng (SG) is rodly used in trditionl Orientl mediine espeilly in Kore, Chin, nd Jpn, for its mny phrmologil effets. This study ws rried out to investigte the ntioxidtive, ntimiroil, nd ntiytotoxi tivities of SG nd fermented seungmglgeuntng (). DPPH rdil svenging tivities of SG nd were 70% nd 74%, respetively, whih inresed slightly y fermenttion. Nitrite svenging tivities were strongly ltered t ph 1.2, (36.4% in SG nd 38.3% in ) y ddition of 200 μg/g. Superoxide dismutse-like tivities were from 21.5% to 23.3% t onentrtion of 0.4 mg/ml, nd the highest vlue were oserved in. Totl flvonoid ontents of SG nd were 47.1 nd 52.1 μg/l, respetively whih shows n inrese upon fermenttion. In the ntimiroil tivity test, MIC 50 vlues of SG nd were 800 μg/ml for Cndid lins nd 3,200 nd 1,600 μg/ml for Stphyloous epidermidis nd Stphyloous ureus, respetively. Antiteril effets were higher in ompred to SG. Antiytotoxi dmium toxiities rnged from 63.5% to 76.1% t 10 μg/ml of SG nd, nd the highest vlue ws oserved in. In the sensory evlution, olor, flvor, nd overll preferene vlues were higher in. Key words: seungmglgeuntng, fermented seungmglgeuntng, ntioxidtive, ntimiroil, ntiytotoxi tivity 서 현대에이르러서노화및다양한질병에서 free rdil과의관련성이대두되고있다 (1). Free rdil은생체막에존재하는불포화지방산을산화시켜생체막의유동성을저하시키고효소와 reeptor의활성을손상시키며막단백질에상해를입혀결국에는세포의불활성화를일으키는작용을통하여노화및각종질병발생에기여하는것으로알려져있다 (2). 따라서이러한 free rdil의발생을억제하고이들에의한산화작용으로부터생체를보호하고노화를예방할수있는항산화제의개발이매우중요하다. 현재까지한약재로검증되어사용중인생약추출물을항산화제물질로활용한경우가대부분을차지하고있다 (3). 천연물에서얻을수있는항산화성물질들은대부분 flvonoid 계통과 phenol계화합물로밝혀져있다 (4). 합성항산화제들중에서 BHT와 BHA 등은가격대비우수한항산화효과를갖고 Reeived 14 Ferury 2014; Aepted 17 Mrh 2014 Corresponding uthor: Si Kyung Lee, Dept. of Bioresoures nd Food Siene, Konkuk University, Seoul 143-701, Kore E-mil: lesikyung@konkuk..kr, Phone: +82-2-450-3759 론 있지만, 과잉섭취시다른질병을유발하는등안전성상의문제점들이일부보고된바있어 (5), 현재는사용량을규제하고있는실정이다. 이러한차원에서볼때앞으로천연물소재를이용한항산화효과검증을통한새로운물질개발분야의지속적인연구가필요할것으로생각된다. 갈근에는 gluoside 계열의 didzin, didzein, puerrin 등다량의 isoflvone 류및 flvone 류와 sophordiol, soyspogenol A B와 llntoin 등이함유되어있다 (6). 또한갈근의약리작용에대한연구도활발히진행되고있으며갈근은심혈관계에대한작용으로혈관평활근의이완에의한혈압저하작용, 혈소판응집억제작용, 길항작용및항부정맥작용등과알코올흡수억제작용 (7), 호르몬및대사기능에대한작용 (8), 항암작용 (9), 소화불량, 두통, 빈혈, 이질, 복통, 술독, 감기, 구토와부인들의하혈에쓰이고민간에서는위장약으로갈근을이용한다 (10). 감초 (Glyyrrhiz urlensis) 는콩과에속하는다년생본초로써단맛성분인 glyyrrhizin이 6~14% 함유되어있어맛이달고독이없으며따뜻한기운을가지고있어한약의구성재료로많이쓰이며기관지염이나결핵치료에효능이있다고알려져있고, 해독작용과기침을멈추게하는효능, 비위를튼튼하게
승마갈근탕의생리활성효과 981 하는효능이있는것으로알려져있다 (11). 감초의주성분은사포닌계통의 glyyrrhizin이며 liquiritigenin, liquiritin 등의 flvonoid도미량존재한다. Glyyrrhizin은항알레르기, 만성간염및 AIDS를포함한바이러스성질환에뛰어난효과가있는것으로증명되면서의약품의원료로이용되고있다 (12). 작약 (Peoni liflor) 은미나리아재비화인작약의뿌리를말린것, 또는찐것을말린것으로겉껍질을제거한것을백작약, 겉껍질을제거하고뜨거운물에데쳐서말린것을적작약이라고한다. 뿌리에는배당체인 peonuflrin이함유되어있고미량성분으로 enzoyl peoniflorin, oxypeoniflorin 등도함유되어높은항균효과를가지고있는것으로알려져있다 (13). 승마 (Cimiifug herleifoli Komrov, 升摩 ) 는명의별록 ( 名醫別錄 ) 의상품에수재되어있으며, 열해독 ( 熱解毒 ), 승거양기약 ( 升擧陽氣藥 ) 으로발진성열성질환, 발열, 두통, 치질, 화농성질환등의치료 (14,15) 및승마갈근탕 ( 升摩葛根湯 ), 을우탕 ( 乙宇湯 ) 등 (16) 의처방에배합되어사용되는중요한약물중의하나이다. 따라서본연구에서는콩과에속한다년생칡의뿌리를건조한갈근 (Puerire rdix, 葛根 ), 백작약 ( 白芍藥 ), 승마 ( 升麻 ), 감초 ( 甘草 ), 생강등을이용하여승마갈근탕 ( 升麻葛根湯 ) 액을 EM(effetive mroorgnisms) 복합균주로발효시킨발효승마갈근탕액을제조하여항산화효과와세포독성경감효과및병원성미생물에대한항균작용을조사하였다. 재료및방법실험재료실험에사용된승마갈근탕액의 5가지재료들 ( 갈근, 작약, 감초, 승마, 생강 ) 을각각서울 ( 경동시장 ) 한약재시장에서구입및제공받아실험에사용하였다. 본연구에사용된승마갈근탕각각의재료들은세절및 lender(hnil Eletri Co., Ltd., Seoul, Kore) 로분쇄 제조하여각각의시료로사용하였다. 승마갈근탕액제조본실험에사용한승마갈근탕액은화제국방 ( 和劑局方 ) 에기록된내용에준하였으며시료에사용된약재는경동시장에서구입하여정제수로세척하여사용하였다. 승마갈근탕액제조를위한재료는갈근 24 g, 작약, 감초, 승마, 생강을각각 12 g의조성비율로하여, 증류수를원료량 3배로가한후 85 C 의온도를유지하면서 4시간동안열수추출한시료에서추출잔사를 Whtmn No. 2(Whtmn Jpn K.K., Tokyo, Jpn) 로제거한추출원액을증류수로 100 ml 부피로맞추어실험에서사용한승마갈근탕액으로하였으며, 또한제조된승마갈근탕액을 dry oven(vision Sientifi Co., Dejeon, Kore) 을사용해서 85 C에서건조하여수분 20% 시료로제조하였다. 발효승마갈근탕액제조본실험에사용한발효승마갈근탕액은화제국방에기록된내용에준하였으며시료에사용된약재는경동시장에서구입하여정제수로세척하여사용하였다. 발효승마갈근탕액제조를위한재료는갈근 24 g, 작약, 감초, 승마, 생강을각각 12 g의조성비율로하여, 증류수를원료량의 1.5배로가한후 effetive mroorgnisms인유용미생물의균주를원료대비 10% 로접종한후진탕항온배양기 (300 rpm) 에서 32 C의온도를유지하면서 3일간발효시켰다. 발효가종료된발효승마갈근탕원액은 80 C에서 5분간가열하여발효미생물및효소를불활성화시킨후 Whtmn No. 2 여과지를사용하여발효추출잔사를제거한다음전체발효추출원액을 100 ml 부피로맞추어실험에서사용한발효승마갈근탕액으로하였다. 이때사용한 EM 복합균주는이엠생명과학연구원 (Djeon, Kore) 에서판매되는것을구입하여사용하였다. 사용된 EM 복합균주는 Ltoillus idophilus MG501, Ltoillus ltis MG530, Peilomyes jponius MG631, Billus ntto MG410, Rhizopus oryze MG680, Billus sutilis MG401, Billus polyfermentius MG440, Cordyeps militris MG611, Ltoillus sporogenes MG520, Leuonosto mesenteroides MG865, Leuonosto itreum MG210, Shromyes erevisie MG111, Ltoillus revis MG19 등이혼합되어진시판용균주를사용하였다. 또한제조된발효승마갈근탕액을 dry oven(vision sientifi Co.) 을사용해서 85 C에서건조하여수분 20% 시료로제조하였다. DPPH 라디칼소거능전자공여능은 Chen 등 (17) 의방법에따라 DPPH(1,1- diphenyl-2-pirylhydrzyl) 라디칼소거능으로측정하였다. 각각의시료 2 ml에 0.2 mm의 DPPH 1 ml를넣고교반한뒤 30분간정치반응시킨후 517 nm에서각각의흡광도를측정하였다. DPPH 라디칼소거능은시료첨가시험구와무첨가구시험구의흡광도감소율로나타내었다. DPPH 라디칼소거능 (%)= (1- 시료첨가군흡광도 ) 100 무첨가군흡광도 Superoxide dismutse(sod) 유사활성측정 Mrklund와 Mrklund의방법 (18) 에따라각농도별시료 (0.2 ml) 에 Tris-HCl uffer(50 mm tris[hydroxymethyl]-mino-methne ontining 10 mm EDTA, ph 8.5, 3 ml) 와 7.2 mm pyrogllol(0.2 ml) 을가하고 25 C 에서 10분간방치하였으며 1 N HCl(1 ml) 로반응을정지시킨후 420 nm에서흡광도를측정하였다. SOD 유사활성은다음식에의해나타내었다.
982 인재평 신정미 허선진 이시경 SOD 유사활성 (%)=(1- 시료첨가구흡광도 ) 100 무첨가구흡광도 아질산염소거능측정 아질산염소거능은 Kto 등 (19) 의방법에따라다음과같이측정하였다. 1 mm의 NNO 2 용액 1 ml에시료추출물 1 ml를첨가하고, 여기에 0.1 N HCl(pH 1.2) 과 0.1 M itrte uffer(ph 1.2, 3.0, 6.0) 를사용하여반응용액의부피를 10 ml로하였다. 이를 37 C에서 1시간동안반응시켜얻은반응액을 1 ml씩취하고여기에 2% eti id 5 ml와 Griess 시약 0.5 ml를가하여혼합시킨후실온에서 15분간방치한다음분광광도계 (Agilent 8453, Agilent Tehnology In., Snt Clr, CA, USA) 를사용하여 520 nm에서흡광도를측정하여아래와같이아질산염소거능을구하였다. 대조구는 Griess 시약대신증류수 0.5 ml를가하여상기와동일한방법으로측정하여추출물을첨가한경우와첨가하지않은경우의아질산염소거율을백분율 (%) 로나타냈으며, BHT 처리구와비교하였다. 아질산염소거능 (%)=(1- A-C ) 100 B A: NNO 2 용액에시료와 Griess를첨가한흡광도 B: NNO 2 용액에 Griess를첨가한흡광도 C: NNO 2 용액에시료와증류수를첨가한흡광도 총플라보노이드함량측정시료중총플라보노이드함량은 Zhishen 등 (20) 의분광분석법을이용하여측정하였다. 증류수 4 ml와시료 1 ml 를시험관에가하고 5분이경과한다음 5% NNO 2 0.3 ml 와 10% AlCl 3 0.3 ml를차례로가하였다. 대조군은시료대신증류수 1 ml를첨가하였다. 6분이경과한후에 1 M NOH 2 ml를가한후증류수를첨가하여 10 ml로맞춘다음 510 nm 파장에서흡광도를측정하였고, L당 tehin equivlent(ce) mg으로환산하여총플라보노이드함량을계산하였다. 균주및배양방법항균측정에사용한균주는 Streptoous mutns JC- 2, Stphyloous epidermidis ATCC 12228, Stphyloous ureus ATCC 29213와 Cndid lins KCTC 1940를사용하였다. 세균배양용배지로는 S. mutns, S. epidermidis와 S. ureus는 Brin Hert Infusion(BHI, BD Kore, Seoul, Kore) 를사용하였으며, C. lins는 Sourud dextrose( 증류수 1 L에 Bto peptone 10 g, Bto dextrose 40 g, BD Kore, Seoul, Kore) 를사용하였다. 항균효과측정항균효과를조사하기위한최소억제농도 (minimum inhiitory onentrtion, MIC) 를측정하는방법으로는액체배지희석법을이용하였으며, 96-mirowell plte(nunlon, Nlge Nun Interntionl, Roskilde, Denmrk) 에처리농도를최고 3,200 μg/ml에서최저농도 100 μg/ml까지 2배씩연속적으로희석하였다. 각균주는단일콜로니형태로액체배지에접종하였고, 37 C 항온배양기에서 18시간동안배양한균주 (10 5 CFU/mL) 를접종하여 37 C 항온배양기에서 24시간배양한후 ELISA(Spetr Mx 250, Moleulr Devies Kore, Seoul, Kore) 의흡수파장 630 nm 에서흡광도를측정하여배지의탁도를확인하였고, 순수배양액의흡광도값과같은결과를얻은것을 MIC로결정하여 MIC의수치가낮은시료를항균효과가높은것으로판정하였다. 세포배양승마갈근탕액의세포독성억제효과를측정하기위해서, 한국세포주은행 (Seoul, Kore) 에서분양받은 NIH3T3 섬유세포주는 RPMI 1640 배지에 10% het-intivted FBS, peniillin 100 units/ml와 streptomyin 100 μg/ml 를첨가하여사용하였으며, 세포배양은온도 37 C, 습도 95%, 5% CO 2 배양기 (Seouliniosiene Co., Sungnm City, Kore) 를사용하였다. 배양한 flsk의세포주를 0.25 % trypsin으로처리하여 Turk형혈구계산기를이용하였다. MTT 정량분석법 Mosmnn의방법 (21) 에의하여, NIH3T3 섬유모세포를각배양용기에 2 10 4 ells/ml의세포수를넣고 24시간배양후카드뮴 IC 50 농도의세포독성에대한승마갈근탕액의세포독성억제효과를측정하기위하여농도별 (0.01, 0.1, 1, 10 μg/ml) 로첨가한후 48시간동안배양한다음분석당일조제한 MTT 50 μg/ml가포함된세포배양액을배양용기당 1 ml씩넣고 3시간배양후배양액을버리고 DMSO를 2 ml/well씩넣어 5분간실온방치후 MTT formzn을용해한후흡광도는분광광도계 ELISA Reder (Multiskn Ex, Komioteh Co., Seoul, Kore) 로 MTT 의흡광도 (540 nm) 를측정하여대조군과비교조사하였다. IC 50 결정 IC 50 결정은배양중인 NIH3T3 섬유모세포를 96 well plte에 2 10 ells/well씩넣고 24시간배양한다음 0.01, 0.1, 1, 10 μg/ml 농도의승마갈근탕액을첨가하여 4시간배양한후 MTT 정량을하여이들각각에대한 50% 억제농도인 IC 50 을회귀직선식에의해서계산하였다. 폴리페놀성물질변화승마갈근탕액및발효탕액을 Whtmn syringe filter(sprtn 13 mm Syringe Filter, regenerted ellulose, 0.45 µm, Whtmn Jpn K.K.) 를사용하여전처리
승마갈근탕의생리활성효과 983 후 HPLC(Ultimte 3000, Dionex Kore, Seoul, Kore) 를이용하여분석하였다. 이때 flow는 0.8 ml/min, grdient는 uffer A(0.3% TFA), uffer B(etonitrile) 를사용하였다. 각각의 uffer를시간대별로유속량을조절하였으며, 분석에사용한칼럼은 Agilent SB C-18 olumn(4.6 150, 5 μm) 이었으며측정파장은 280 nm(190~700 nm DAD snning) 이었다. 관능검사승마갈근탕액과발효승마갈근탕액에대한소비자의관능검사는 25~50세로구성된 20명의패널을통하여각각의탕액상태로실시하였다. 평가항목은색, 냄새, 전체적인기호도를평가하였으며 5점척도법을이용하였다 (1점: 매우싫다, 3점 : 보통이다, 5점 : 매우좋다 ). 통계처리통계처리는각각의시료에대해 Student's t-test를사용하여 men±sd로계산하였으며 P-vlue를구하여유의성을검증하였다. 결과및고찰 DPPH 라디칼소거능갈근, 백작약, 승마, 감초, 생강등 5가지재료를이용하여제조한승마갈근탕액과발효승마갈근탕액에대한 free rdil 소거능을측정한결과는 Fig. 1과같다. 승마갈근탕액및발효승마갈근탕액에대한 DPPH 라디칼소거능은처리농도량 200 μg/ml에서각각 70.2 및 74.3% 로발효승마갈근탕액에서다소높은 DPPH 라디칼소거능을나타내었고, 비교구인 Vit. C의 DPPH 라디칼소거능은 91.9% 로나타났다. 이러한결과는발효승마갈근탕액제조에사용된원료들이발효과정에서 free rdil 소거능에효과가있는유효성분들에대한추출및전환이승마갈근탕액에비 해서높은것에기인하는것으로생각된다. Ch 등 (15) 은양성비교군으로사용한 BHT 0.05% 처리농도에서 92% 의 DPPH 라디칼소거능을보였으며, 0.05% 농도의참당귀뿌리추출물의 DPPH 라디칼소거능은 19% 로낮았으나, 참당귀뿌리를 A. oryze, A. kwhii 및 M. purpureus 균주로발효시킨발효당귀에서는 DPPH 라디칼소거능이각각 46, 49 및 56% 로모두발효에의해서라디칼소거능이높아졌다고하였다. Kim 등 (16) 은식물체추출물에서폴리페놀화합물및플라보노이드함량이높아지면서항산화활성이높은상관성을보였다고하였고, Lee 등 (22) 도발효시킨흑마늘을첨가한발효주가흑마늘을첨가하지않은발효주보다 DPPH 라디칼소거능이증가하였으며, 흑마늘첨가량이증가할수록 DPPH 라디칼소거능이향상되었다고하였다. 또한 Jeon 등 (23) 은홍국균을이용한마발효추출물에서의 DPPH 라디칼소거능이대조구에비해높은활성을보였다고하였으며, Prk 등 (24) 은홍삼및홍국발효홍삼추출물을비교한결과홍국발효홍삼추출물의 DPPH rdil 소거능이다소높았다고하여본실험의결과와일치하였다. Prk과 Kim(25) 은홍국쌀 (RYRG) 처리시배양시간에따라 DPPH 라디칼소거능이증가하였으나홍국균주에따라 DPPH 라디칼소거능의차이가있었다고하였으며, In(26) 은발효갈근황련황금탕의 DPPH 라디칼소거능이발효시키지않은갈근황련황금탕에비해높았다고하였다. 아질산염소거작용승마갈근탕액과발효승마갈근탕액의 ph 조건에따른아질산염소거작용을측정한결과는 Fig. 2와같다. 0.2 mg/ml 농도의승마갈근탕액과발효승마갈근탕액의아질산염소거능은 ph 1.2 조건에서각각 36.43 및 38.32% 로발효승마갈근탕액이승마갈근탕액보다다소높은아질산염소거능을보였으나, 비교구인 BHT(71.31%) 보다는낮은아질산염소거능을나타내었다. ph 3.0 조건에서도 25.34 및 27.23% 로발효승마갈근탕액에서다소높은아질산염 Eletron donting ility (%). 100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 SG Vit C 20 40 80 100 200 Conentrtion (μg/ml) Fig. 1. Eletron donting ility of seungmglgeuntng nd fermented seungmglgeuntng. SG, seungmglgenuntng;, fermented seungmglgeuntng; Vit. C, vitmin C. Eh r is the men±sd. Mens with different letters (-) in the sme onentrtion re signifintly different t P<0.05. Nitrite svenging ility (%). 80 70 60 50 40 30 20 10 0 SG BHT ph 1.2 ph 3.0 ph 6.0 Fig. 2. Nitrite svenging ility of seungmglgeuntng nd fermented seungmglgeuntng. SG, seungmglgeuntng;, fermented seungmglgeuntng, BHT: utylted hydroxyloluene. Eh r is the men±sd. Mens with different letters (,) in the sme ph re signifintly different t P<0.05.
984 인재평 신정미 허선진 이시경 소거능을나타내었다. 또한 ph 6.0 조건에서는전체적으로 7.41% 와 9.12% 로가장낮은아질산염소거능을나타냈다. 이상의실험에서승마갈근탕액의아질산염소거능은 ph가낮을수록 (ph 1.2> ph 3.0> ph 6.0) 아질산염소거능이우수하다는 Be 등 (27) 의연구결과와아질산염소거능이인체의위액 ph 조건과비슷한 ph 1.2에서가장높았다고보고한 Lim 등 (28) 의결과와도일치하였다. Jung 등 (29) 은머핀제조시상황버섯침지발아현미첨가구에서아질산염소거능에미치는영향을 ph 별, 농도별로분석한결과상황버섯침지발아현미첨가구가대조구머핀보다높은경향을보였으나시료간의유의적인차이는크지않았다고하였다. SOD 유사활성승마갈근탕액과발효승마갈근탕액에대한 superoxide (O - 2 ) 산화억제작용활성을확인하기위해서 superoxide와반응하여갈변물질을나타내는 pyrogllol 자동산화반응을측정하여 SOD 유사활성을조사한결과는 Fig. 3과같다. 승마갈근탕액과발효승마갈근탕액의 SOD 유사활성은첨가농도 0.2 mg/ml에서는유의적차이가없었으나, 0.4 mg/ ml 농도에서는각각 21.45±0.36%, 23.34±0.42% 로유의적으로 (P<0.05) 차이를보였다. In 등 (26) 은발효갈근황련황금탕액의 SOD 유사활성이갈근황련황금탕액보다높았다고하였으며, Jung 등 (29) 도상황버섯침지발아현미를첨가한머핀과대조구머핀에대한 SOD 유사활성을비교조사한결과상황버섯침지발아현미첨가머핀에서 SOD 유사활성이높게나타났다고보고하였다. Lee 등 (30) 은녹차를홍국으로발효시녹차추출물에서의 SOD 유사활성이높았다고하였으나발효기간이증가함에따라 SOD 유사활성이감소하였다고하였는데이는발효과정에서카테킨및생리활성물질이산화과정에서손상을받는것으로보고하였다. Hwng 등 (31) 은미생물발효영지버섯추출물과영지버섯추출물간의 SOD 유사활성을비교한결과발효영지버섯추출물에서의 SOD 유사활성이높았다고하여, 본실험의 결과와같이발효처리시 SOD 유사활성이다소증가하는것으로나타났다. 총플라보노이드함량승마갈근탕액 (SG) 과발효승마갈근탕액 () 에함유된총플라보노이드함량을측정한결과는 Fig. 4와같다. 총플라보노이드함량은각각 47.14±0.38 mg/g(sg), 52.11± 0.74 mg/g() 으로, 발효승마갈근탕액에서총플라보노이드함량이유의적으로높게나타났다 (P<0.05). Shin과 Yoo(32) 는금은화추출물과금은화추출물발효물에서의총플라보노이드함량을비교한결과금은화추출물에서 20.93±1.8 mg/g이었으나, 추출물발효물의총플라보노이드함량은 38.17±3.18 mg/g으로발효전에비해 82.3% 증가하였다고보고하였다. 그러나 Hn과 Lee(33) 는소청룡탕과유산균으로발효시킨소청룡탕의약리효능비교연구에서발효전후의총플라보노이드함량의변화가없었다고하여복합한약재추출물에서의미생물발효에의한생리활성물질의변화가없다고하였다. Prk과 Kim(25) 은 red yest rie 추출물의발효기간이증가함에따라이에함유된총페놀함량및총플라보노이드함량이증가하였다고보고하였는데, 이는발효과정에서기질의내부성분이용출이용이한페놀화합물로전환된것으로추정된다고하였다. 본실험의결과도승마갈근탕의주요원료인갈근, 승마, 작약, 감초, 생강에포함되어있는이소플라본과플라보노이드성분들이발효과정에서각각의원료들이분해되어주요성분들의추출이용이하게변화되어결과적으로생리활성물질함량및항산화능이증가된것으로생각된다. 승마갈근탕에대한항균효과승마갈근탕액과발효승마갈근탕액의항균효과를조사하기위하여 Streptoous mutns JC-2, Stphyloous epidermidis ATCC 12228, Stphyloous ureus ATCC 29213와 Cndid lins KCTC 1940 균주를이 Superoxide dismutse like Ativity (%). 25 20 15 10 5 0 SG 0.2 0.4 Conentrtion (mg/ml) Fig. 3. Superoxide dismutse like tivity of seungmglgeuntng nd fermented seungmglgeuntng. SG, seungmglgeuntng;, fermented seungmglgeuntng. Eh r is the men±sd. Signifintly different from SG t P<0.05. Totl Flvonoids (mg/g). 54 52 50 48 46 44 42 SG Fig. 4. Totl flvonoid ontents of the seungmglgeuntng nd fermented seungmglgeuntng. SG, seungmglgeuntng;, fermented seungmglgeuntng. Eh r is the men±sd. Signifintly different from SG t P<0.05.
승마갈근탕의생리활성효과 985 Tle 1. Miniml inhiitory onentrtions (MIC) of seungmglgeuntng nd fermented seungmglgeuntng Smples SG 1) MIC 50 (μg/ml) S. mutns S. epidermidis S. ureus C. lins 1,600 1,600 3,200 1,600 3,200 1,600 800 800 1) SG: seungmglgeuntng, : fermented seungmglgeuntng. 용하여최소저해농도 (MIC) 수준에서의항균효과를확인한결과는 Tle 1과같다. 표에서보는바와같이 C. lins 에대한승마갈근탕액과발효승마갈근탕액의항균효과는 MIC 50 이 800 μg/ml였으나, S. mutns, S. epidermidis, S. ureus에대한 MIC 50 은 1,600~3,200 μg/ml로진균인 C. lins에대한 MIC 50 이낮게나타나항진균효과가세균에대한항균효과보다높았다. 이러한결과는발효승마갈근탕액을사용하는경우칸디다증을완화시키는데효과가있을것으로기대된다. 또한승마갈근탕의 S. epidermidis 와 S. ureus에대한항균효과는최소억제농도 (MIC 50) 가 3,200 μg/ml였으나발효승마갈근탕에의한두균주에대한최소억제농도는 1,600 μg/ml로발효승마갈근탕에의한항균효과가높게나타나, 한방에서승마갈근탕의주요효과로지목하는피부병에처방한다는결과와도일치하여발효승마갈근탕액에서의피부질환완화효과가기대된다. 이상의실험에서발효승마갈근탕에의한세균에대한항균효과가승마갈근탕에의한항균효과보다높았다. 이러한결과는발효처리시승마갈근탕에서항균효과를갖는물질이발효과정에서원료에서의용출량이증가되어승마갈근탕보다높은항균활성이나타난것으로생각된다. Kim 등 (34) 은포도가공부산물의발효전후의항균효과를비교한결과대조구에서는항균활성이보이지않았으나 L. sei 로발효처리한포도박발효물에서는 5 mg/dis의농도에서 B. ereus, B. sutillis, S. ureus, E. oli, E. loe, S. enteri, P. eruginos 세균에대한항균활성을나타내었다고하였다. Brown과 Wfight(35) 는중국의한약재의항균효과에대한연구가최근진행되고있으며, 위장질환의치료에오랫동안사용되어왔던 essentil oil과같은많은향신료와식물약제성분들이 ntihelioter 효과가있다고하였다. Cho 등 (36) 도 H. pylori 액체배지에균주를분주하고제균된각 her 추출물을주입한후배양하여균수를측정한결과, 검토된 26종의 her 추출물에서항균효과가확인되었으며그중가든세이지가 63.42%, 예루살렘세이지 44.56%, 크리핑로즈마리 51.36%, 로즈마리 78.23%, 체리세이지 66.05%, 오레가노 72.19% 및화이트페퍼가 47.24% 로높은 H. pylori 생육저해활성을보였다고하였다. Cell vility (%). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 d Control 20 25 30 35 40 45 50 e Conentrtion (μm) Fig. 5. Determintion of ell viility ginst vrious dmium onentrtions on NIH3T3 firolsts. Eh r is the men±sd. Mens with different letters (-h) ove the rs re signifintly different t P<0.05. 카드뮴독성에대한승마갈근탕액과발효승마갈근탕액의세포보호효과카드뮴농도에따른카드뮴독성에대한섬유소세포 50% 생존율을조사한결과는 Fig. 5와같다. 카드뮴의농도를 NIH3T3 섬유모세포에농도별로적용한후세포생존율을확인할수있는 MTT 정량분석법으로흡광도를측정한결과, 카드뮴의처리농도에따라 NIH3T3 섬유모세포의세포생존율이감소함을확인하였으며그림에서와같이섬유소세포생존에따른흡광도값의감소는카드뮴처리농도에의존적으로나타났다. 카드뮴처리농도가증가함에따라섬유모세포의생존율이감소하였는데카드뮴농도가 35~ 40 μm 사이에서 IC 50 이나타남을확인하였다. NIHT3 섬유모세포에여러농도의카드뮴을투여하면서, 세포독성을조사하여얻은 MTT 50 량 (IC 50=40.0 μm) 을바탕으로본실험에서승마갈근탕액과발효승마갈근탕액에대한섬유모세포보호효과를측정한결과는 Fig. 6과같다. 승마갈근탕액과발효승마갈근탕액에다양한농도별로카드뮴을처리한후 MTT 흡광도를측정한값은승마갈근탕액과발효승마갈 MTT (% of Control). 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 SG 0.01 0.1 1 10 Conentrtion (μg/ml) Fig. 6. The MTT sorne of seungmglgeuntng nd fermented seungmglgeuntng on NIH3T3 firolsts treted with dmium. SG, seungmglgeuntng;, fermented seungmglgeuntng. Eh r is the men±sd. Signifintly different from SG t P<0.05. f g h
986 인재평 신정미 허선진 이시경 근탕액에서의 MTT 흡광도값은처리농도가감소함에따라세포보호효과가감소함을확인하였다. 승마갈근탕액과발효승마갈근탕액의농도를 0.01, 0.1, 1, 10 μg/ml에서조사한결과승마갈근탕액과발효승마갈근탕액의모든처리농도범위에서통계적으로유의성 (P<0.05) 있게카드뮴독성에대한 NIH3T3 섬유모세포의보호효과를확인하였으며, 승마갈근탕액을 10.0 μg/ml 농도에서처리시카드뮴독성에대한 NIH3T3 섬유모세포보호효과는 63.46% 이었으며, 발효승마갈근탕액의카드뮴독성에대한 NIH3T3 섬유모세포의보호효과는 76.12% 로높게나타났다. 이상의실험에서발효승마갈근탕액이카드뮴독성에대한세포보호효과가승마갈근탕액보다높았다. 이러한결과는승마갈근탕액에함유된생리활성물질들이승마갈근탕액보다발효승마갈근탕액에서좀더용출이용이해졌으며, 또한카드뮴과의결합이가능한화합물들이추출되어이러한생리활성물질들이카드뮴독성으로부터 NIH3T3 섬유모세포보호효과를증가시킨것으로생각된다. Lee 등 (37) 은카드뮴을농도별로섬유모세포 NIH3T3에처리시어성초추출물처리농도에따라 MTT 측정값은감소하는경향을보였으며, MTT 50 은 33.04 μm로보고하였다. 또한어성초추출물을섬유모세포에처리시세포수및세포재생효과가증가하였다고하였다. Hn 등 (38) 도포공령추출물을섬유모세포 NIH3T3에대해서카드뮴을농도별로처리시모든포공령처리농도에서카드뮴에대한섬유모세포보호효과를확인하였으며 10-2 mg/ml 농도에서높은세포보호효과가있다고하였다. 폴리페놀성물질변화승마갈근탕및발효승마갈근탕에서의다양한폴리페놀성물질들중주요성분의함량을 HPLC를이용하여분석한결과는 Tle 2와같다. 승마갈근탕액과발효승마갈근탕액에공통적으로함유된 isoflvone 성분인 didzin과 didzein 성분이검출되었으며, 발효승마갈근탕액의경우 didzein 성분함량이승마갈근탕액에비해약 5배정도증가하는경향을보여발효처리탕액에서의물질용출및전환율이증가함을확인하였다. 승마갈근탕과발효승마갈근탕에함유된주요폴리페놀성물질의 HPLC hromtogrm은 Fig. 7과같다. Wlsh와 Fill(39) 는 puerrin과 didzin의경우장내미생물에의해발효과정을거치는동안 didzein 으로전환된후 β-gluosidse에의해서활성형태인 dihydrodidzein 및 equol로다시전환되어환원될수있다고하였다. Chien 등 (40) 은 isoflvone 함량변화와배당체의활성은두유발효에사용되는유산균의종류에따라다양하게나타나며 Streptoous thermophilus의경우다른유산균에비해서 glyones 형태의 didzein 함량이발효가진행될수록증가함을보였으며이때 β-gluosidse의활성이높을수록함량이증가한다고보고하였으며, 이러한결과는본실험에서 didzein 함량이발효승마갈근탕액에서증가한결과와도일치하였다. 관능검사승마갈근탕액과발효승마갈근탕액의관능검사를통해색상, 향기, 전체적인기호도를조사한결과는 Tle 3과 Tle 2. Comprtive nlysis of polyphenoli ompounds in seungmglgeuntng nd fermented seungmglgeuntng Smples SG 1) Contents (μg/l) Cffei id Didzin Feruli id Didzein Bererin Bilein 2) 1,559 1,643 1) SG: seungmglgeuntng, : fermented seungmglgeuntng. 2) : not deteted. 12 63 Fig. 7. HPLC hromtogrm for the determintion of polyphenol in seungmglgeuntng nd fermented seungmglgeuntng. A: hromtogrm of seungmglgeuntng. B: hromtogrm of fermented seungmglgeuntng.
승마갈근탕의생리활성효과 987 Tle 3. Sensory evlution of seungmglgeuntng nd fermented seungmglgeuntng Smples SG 1) Chrteristis Color Flvor Totl eptility 2.7±0.5 2.8±0.4 2.7±0.6 3.4±0.5 3.3±0.5 3.3±0.5 1) SG: seungmglgeuntng, : fermented seungmglgeuntng. Signifintly different from SG t P<0.05. 같다. 전체적인기호도는발효승마갈근탕액 (3.4) 이발효시키지않은승마갈근탕액 (2.7) 에비해높았으며이는 P<0.05 수준에서유의적차이가있었다. 또한발효갈근탕액의색상을더선호하였으며, 향기선호도도발효승마갈근탕액에서높았다. 탕액의색상은발효처리시에기존의열수추출방식에서나타나는어두운갈색및특유의한약냄새가아닌밝은갈색 ( 사진생략 ) 과한약특유의냄새가적게나타난결과로생각된다. 이러한결과는승마갈근탕액이미생물에의해발효과정을거치면서미생물의생육과이들이생성하는효소에의한유효성분의변화로인하여색상과향기에대한선호도를향상시킴에따라전체적인관능적품질특성이향상된것에기인하는것으로생각된다. 탕액의관능검사에대한연구결과가없어비교하기는어려우나이상의관능검사결과승마갈근탕액보다는발효승마갈근탕액을선호하는것을알수있었다. 이는미생물발효에의해향과색상및기호도가개선되었으며이로인해발효탕액을섭취하기에용이한것에기인하는것으로생각된다. 요 승마갈근탕액 (SG) 과발효승마갈근탕액 () 에의한항산화, 항균및세포독성에대한효과를조사한결과는다음과같다. SG와 의항산화효과를 DPPH법을이용하여측정한결과 200 μg/ml에서 70.2%, 74.3% 로 가높았다. SG와 에의한아질산염소거능은 ph 1.2, 3.0, 6.0 조건에서발효승마갈근탕액의아질산염소거능이높았으며, ph 가낮을수록아질산염소거능은높았다. SG와 의 SOD 유사활성은발효승마갈근탕액에서증가하였다. SG와 의총플라보노이드함량은각각 47.14 mg/g, 52.11 mg/g 으로발효처리시총플라보노이드함량이증가하였다. SG 와 의항균효과를조사한결과효모형진균인 C. lins에대한최소억제농도 (MIC 50) 가 800 μg/ml로낮게나타나항진균효과가 S. mutns, S. epidermidis와 S. ureus(mic 50, 1,600~3,200) 에대한항균효과보다높았다. SG의 S. epdermidis와 S. ureus에대한항균효과는 MIC 50 이 3,200 μg/ml였으나, 에의한 MIC 50 은 1,600 μg/ml였다. SG와 의카드뮴에대한섬유소세포보호효과는각각 10.0 μg/ml 처리농도에서 64.36% 및 76.12% 로 의세포보호효과가높게나타났다. 의폴리페놀성물질변화는발효처리시활성화된 didzein 함량이 63 약 μg/l로 SG에비해약 5배증가하였다. 승마갈근탕액을발효처리시에탕액의색상이나향기에대한선호도및전체적인기호도가증가하였다. REFERENCES 1. Moon YG, Lee KJ, Heo MS. 2007. Chrteristis of itrus y-produt ferment using Billus sutilis s strter extrts. Kor J Miroiol Biotehnol 35: 142-149. 2. Kim KY, Chung DO, Chung HJ. 1997. Chemil omposition nd ntimiroil tivities of Houttuyni ordt Thun. Koren J Food Si Tehnol 29: 400-406. 3. Young HT, Choi HJ, Bek SH. 2008. Inhiitory effets of lehinone A from Sophor fivesens Ait. ginst dmium indued ytotoxiity. Koren J Orientl Physiol Pthol 22: 1163-1167. 4. Prk SY, Bek JM, Bek SH. 2010. Cytoprotetive effet of glgeuntng extrt on dmium indued ytotoxiity. Ykhk Hoeji 54: 151-156. 5. Kng JG, Kng HJ, Seo JH, Kim SO, Choi JH, Cho DY, Prk CG, Lee HY. 2009. Effets of fermented turmeri (Curum long) y Billus ntto supplementtion on liver funtion nd serum lipid prmeters in mie. J Koren So Food Si Nutr 38: 430-435. 6. Hn SH, Shin MK, Kim YW. 1999. Effets of Kore Lyium hinense Miller, Shizndr hinensis Billon, Puerri thunergin Benth, Euommi ulmoides Oliv te everge on the removl of hevy metl. J Est Asin Dietry Life 9: 363-369. 7. Compton DL, Kenr JA, Lszlo JA, Felker FC. 2007. Strh-enpsulted, soy-sed, ultrviolet-soring omposites with feruloylted monyl- nd diylglyerol lipids. Ind Crop Prod 25: 17-23. 8. Prtt DE, Bir PM. 1979. Soure of ntioxidnt tivity of soyens nd soy produts. J Food Si 44: 1720-1722. 9. Choe SY, Yng KH. 1982. Toxiologil studies of ntioxidnts, utylted hydroxytoluene (BHT) nd utylted hydroxynisole (BHA). Koren J Food Si Tehnol 14: 283-288. 10. MKersie BD, Murnghn J, Jones KS, Bowley SR. 2000. Iron-superoxide dismutse expression in trnsgeni lflf inreses winter survivl without detetle inrese in photosyntheti oxidtive stress tolerne. Plnt Physiol 122: 1427-1437. 11. Donnelly JK, MLelln KM, Wlker JL, Roinson DS. 1989. Superoxide dismutse in foods. Food Chem 33: 243-270. 12. Cho SY, Lee SH, Choi JY, Shin EM, Kng SS, Jeong JS, Jeong CS. 2007. Antigstriti effet of renoxolone disodium from Glyyrrhize rdix. J Toxiol Pu Helth 23: 165-172. 13. Choo MK, Prk EK, Yoon HK, Kim DH. 2003. Antithromoti nd ntillergi tivities of didzein, metolite of puerrin nd didzin produed y humn intestinl miroflor. Biol Phrm Bull 25: 1328-1332. 14. Wng X, Wu J, Chi H, Umegki K, Ymd K, Ishimi Y. 2003. Puerrie rdix prevents one loss in ovrietomized mie. J Bone Miner Met 21: 268-275. 15. Ch JY, Kim HW, Heo JS, Ahn HY, Eom KE, Heo SJ, Cho YS. 2010. Ingredients nlysis nd iologil tivity of fermented Angeli gigs Nki y mold. J Life Si 20: 1385-1393. 16. Kim EY, Bik IH, Kim JH, Kim SR, Rhyu MR. 2004.
988 인재평 신정미 허선진 이시경 Sreening of the ntioxidnt tivity of some mediinl plnts. Koren J Food Si Tehnol 36: 333-338. 17. Chen YC, Sugiym Y, Ae N, Kuruto-Niw R, Nozw R, Hirot A. 2005. DPPH rdil-svenging ompounds from dou-hi, soyen fermented food. Biosi Biotehnol Biohem 69: 999-1006. 18. Mrklund S, Mrklund G. 1974. Involvement of superoxide nion rdil in the utoxidtion of pyrogllol nd onvenient ssy for superoxide dismutse. Eur J Biohem 47: 469-474. 19. Kto H, Lee IE, Chuyen NV, Kim SB, Hyse F. 1987. Inhiition of nitrosmine formtion y nondilyzle melnoidines. Agri Biol Chem 51: 1333-1338. 20. Zhishen J, Mengheng T, Jinming W. 1999. The determintion of flvonoid ontents in mulerry nd their svenging effets on superoxide rdils. Food Chem 64: 555-559. 21. Mosmnn T. 1983. Rpid olorimetri ssys for ellulr growth nd survivl: pplition to prolifertion nd ytotoxiity ssys. J Immunol Methods 65: 55-63. 22. Lee HH, Kim IJ, Kng ST, Kim YH, Lee JO, Ryu CH. 2010. Development of lk grli ykju nd its ntioxidnt tivity. Koren J Food Si Tehnol 42: 69-74. 23. Jeon CP, Lee JB, Choi CS, Kwon GS. 2011. Biologil tivities of ethnol extrts from Monsus-fermented Chinese ym. J Life Si 8: 1142-1148. 24. Prk JC, Ch JY, Lee CH, Doh ES, Kng IH, Cho YS. 2009. Biologil tivities nd hemil hrteristis of Monus-fermented Koren red ginseng. J Life Si 11: 1553-1561. 25. Prk HJ, Kim IS. 2011. Antioxidnt tivities nd ntiner effets of red yest rie grown in the medium ontining grli. Food Si Biotehnol 20: 297-302. 26. In JP. 2013. Antioxidtive, ntiteril nd ytotoxiity tivity of glgeuntng, seungmglgeuntng nd glgeunhwngeunhwngkeumtng nd their fermented tng. PhD Disserttion. Konkuk University, Seoul, Kore. 27. Be YI, Jeong CH, Shim KH. 2002. Nitrite-svenging nd ntimutgeni effet of vrious solvent extrt from different prts of loqut (Eriootry jponi, Lindl.). Koren J Food Preserv 9: 92-96. 28. Lim JA, Lee ES, Bek SH. 2008. Antioxidtive tivity nd nitrite svenging ility of ethnol extt from Nelumo nuifer leves. Koren J Orientl Physiol Pthol 22: 654-659. 29. Jung KI, Cho EK, Choi YJ. 2011. Food qulity of muffin with germinted rown rie soked in myelil ulture roth of Phellinus linteus. J Koren So Food Si Nutr 40: 875-884. 30. Lee YK, Lee SI, Kim JS, Yng SH, Lee IA, Kim SD, Suh JW. 2012. Antioxidnt tivity of green te fermented with Monsus pilosus. J Appl Biol Chem 55: 19-25. 31. Hwng YY, Chong MS, Kim HJ, Lee KN. 2007. Studies on the polyshride of Gnoderm luidium extrt y miroorgnism fermenttion. Koren J Orientl Physiol Pthol 21: 1506-1512. 32. Shin JH, Yoo SK. 2012. Antioxidnt properties in miroil fermenttion produts of Lonier jponi Thun. extrt. J Est Asin So Diet Life 22: 95-102. 33. Hn JH, Lee SY. 2011. Compring medil effiy of soheongyong-tng with lti id teri fermented soheongyong-tng. Koren J Orientl Physiol Pthol 25: 246-256. 34. Kim KH, Yun YS, Chun SY, Yook HS. 2012. Antioxidnt nd ntiteril tivities of grpe pome fermented y vrious miroorgnisms. J Koren So Food Si Nutr 41: 1049-1056. 35. Brown ED, Wfight GD. 2005. New trgets nd sreening pprohes in ntimiroil drug disovery. Chem Rev 105: 759-774. 36. Cho YJ, Chun SS, Yoon SJ, Kim JH, Kim TW, Choi UK. 2005. Sreening of the ntimiroil tivity ginst Helioter pylori from her plnts. J Koren So Appl Biol Chem 48: 161-165. 37. Lee JH, You IS, Kim JS, Lee KN, Chung WY, Hn DS, Bek SH. 2000. The inhiitory effets of Houttuyni ordt Thun ginst dmium indued ytotoxiity (Ⅱ). Ykkk Hoeji 44: 432-439. 38. Hn DS, Lee KN, Lee JS, Bek SH. 1998. The inhiitory effets of Trxi Her ginst dmium indued ytotoxiity. Ykhk Hoeji 42: 307-311. 39. Wlsh KR, Fill ML. 2009. Trnsport nd metolism of equol y Co-2 humn intestinl ells. J Agri Food Chem 57: 8297-8302. 40. Chien HL, Hung HY, Chou CC. 2006. Trnsformtion of isoflvone phytoestrogens during the fermenttion of soymilk with lti id teri nd ifidoteri. Food Miroiol 23: 772-778.