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1 The Journal of Korean Oriental Medical Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology 2012;25(1): 삼황세제가미방외용이 NC/Nga 마우스의아토피피부염에대한효과 황충연 1) 박민철 1) 홍석훈 1) 주현아 1) 조현우 2) 정수영 2) 조정희 2) 1) 원광대학교한의과대학안이비인후피부과학교실 2) 전라남도한방산업진흥원 The External Use Effects of Samwhangsejegami Extract on Atopic dermatitis of NC/Nga mice Chung-Yeon Hwang Min-Cheol Park Seok-Hoon Hong Hyun-A Joo Hyun-Woo Cho Soo-Young Jung Jeong-Hee Cho Objectives : In this study, Samhwangsaejaegami extract was tested to prove its anti-atopic dermatitis effect on NC/Nga mice. Methods : In order to evaluate the external use effects of Samhwangsaejae extract on anti-atopic dermatitis, the expression of filaggrin, serine palmitoyltransferase(spt), and COX-2 were analyzed. In vivo study, clinical skin severity score, IgE, IL-4, IL-5 and IL-6 level were analyzed through NC/Nga atopic mice model after 12 weeks external treatment. Results : In vitro study results showed the reduction in the expression of filaggrin, SPT, and COX-2. In vivo study results demonstrated the significant reduction in clinical skin severity score, IgE, IL-4, IL-5, IL-6 expression level. Conclusions : These results showed Samhwangsaejaegami extract can be a promising candidate for anti-atopic dermatitis treatment. Key words : Samhwangsaejaegami extract(shsjge), filaggrin, serine palmitoyltransferase(spt), COX-2, IgE Ⅰ. 서론 교신저자 : 황충연, 원광대학교부속광주한방병원안이비인후피부과학교실 (Tel : , hwangida@wonkwang.ac.kr) 접수 2012/1/6 수정 2012/2/8 채택 2012/2/15 아토피피부염은주로영유아기에시작하는가려움을동반하는만성재발성습진질환으로연령에따라특징적인병변의분포와양상을보인다. 22

2 황충연외 6 인 : 삼황세제가미방외용이 NC/Nga 마우스의아토피피부염에대한효과 아토피피부염의임상양상은매우다양하며특이한검사소견이없어임상양상을종합한한국인아토피피부염진단기준에따라진단한다 1). 아토피피부염은전세계적으로증가추세에있는데최근우리나라에서도알레르기질환의급증과함께증가하고있으며대개유소아기에발병하나청소년, 성인에서도발병율이증가하며중증화되는경향을보이고있다 2). 아토피피부염은비정상적인피부혈관반응이나면역학적반응을동반하고홍반, 부종, 심한소양증, 삼출, 부스럼딱지와인설을특징으로하는염증성피부질환이다 3,4). 韓醫學에서는아토피피부염을奶癬, 胎癬, 胎斂瘡등으로표현하였는데隨代巢 5) 는 諸病源候論. 小兒雜病諸候. 癬候 에서小兒의面部에癬皮가甲錯되고乾燥하게되는것을乳癬이라하여嬰兒濕疹과유사한것으로보았다. 淸代吳 6) 는 醫宗金鑑. 外科心法要訣. 嬰兒部 에서아토피피부염에대해胎斂瘡이라하고그중嬰兒頭面이나눈썹끝에나타나는것을奶癬이라하였는데瘙痒과鱗屑이있고형태는奶疥와도같다하였다. 이는모두胎中風熱이원인이라하였으며증상에따라피부가마른풀과같은모양이면乾斂, 栗粒狀으로매우가렵고누런진물이온몸에두루있으면濕斂이라하였다 7-10). 아토피피부염의한의학적원인으로는風熱, 血熱, 血虛, 脾胃運化機能失調에의한胎火濕熱, 風濕熱의侵入등을들수있으며, 이외에도기온의변화, 음식물, 불규칙한수유습관, 의복마찰, 寒冷의변화등의자극이관여된다. 주로임신중에五辛炙煿를섭취함으로써아기에게열이전해져생후에風熱邪氣를감수하여발생하거나혹은稟性不耐하여脾胃不和하니濕熱이內生하여발생한다고하였다. 또한이외에도消化不良, 食物過敏, 衣服摩擦등의자극에의해서도발생된다고보았다 11). 아토피에대한한의학적연구로尹 12) 은아토피피부염환자의한의학적인임상분류에대한연구를보고하였다. 단일한약재에대한실험적연구로는金 13) 은桑葉이, 韓 14) 은牛蒡子가, 金 15) 은紫草가아토피피부염에미치는영향을보고하였으며, 처방에대한연구로는朴 16) 은連翹散, 朴 17) 은柴胡淸肝湯을시료로면역조절작용을통한항아토피효과를규명하였다. 삼황세제는대황, 황백, 황금, 고삼으로구성되어있으며淸熱, 止痒, 收澁, 일체급성피부병및癤病, 紅腫, 焮痒, 出水者등에외용적으로활용하는경험방으로중의외과학 18) 등에소개되고있다. 저자는삼황세제에금은화, 연교, 마치현을가미하여항아토피효과를규명하기위하여 in vitro 실험으로항염증, 피부장벽강화효과를보았고, NC/Nga mice를이용한 in vivo 실험에서피부손상도및면역학적인자를측정하여유의성있는결과를얻었기에보고하는바이다. Ⅱ. 재료및방법 1. 재료 (1) 동물웅성 ( 雄性 ) 6주령의 30 g 내외의 NC/Nga atopic mice를중앙실험동물에서공급받아실험당일까지고형사료와물을공급하고실온 22±2, 상대습도 50~65%, 조도 200 lux(8시점등, 20시소등 ) 를계속유지하면서 2주일간실험실환경에적응시킨후실험에사용하였다. (2) 약물본실험에사용한삼황세제가미추출물 (SHSJGE) 은전라남도한방산업진흥원에서추출및동결건조한것을공급받아사용하였다. 처방내용과구성은다음과같다 (Table 1). 23

3 Table 1. Prescription of SHSJGE Herbal Name 대황황금황백고삼금은화연교마치현 (3) 시약및기기 Scientific Name Rhei Radix et Rhizoma Scutellariae Radix Phellodendri Cortex Scophorae Flavescentis Radix Lonicerae Flos Forsythiae Fructus Portulaca olerscea Dose (g) Total Amount 시약본실험에사용된시약으로 dietyl pyrocarbonate (DEPC), NH 4 Cl, KHCO 3, Na 2 EDTA, complete adjuvant, chloroform, collagenase IV, RPMI- 1640, isopropanol, 적혈구용혈액 (ACK lysis solution), ethidium bromide(etbr), Dulbecco's phosphate buffered saline(d-pbs), Dulbecco's minimum essential medium(dmem), formaldehyde, magnesium chloride(mgcl 2 ), agarose 는 Sigma 사 (U.S.A.) 제품을, 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS) 은 Gibco BRL사 (U.S.A.) 제품을, RNase inhibitor, Taq polymerase, random primer, dntp, Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase 는 promega 사 (U.S.A.) 제품을, IL-4, 5, 6, IFN-r의 ELISA kit는 BD(U.S.A.) 사제품을, IgE, IgM, IgG1의 ELISA kit는고마바이오텍 (Korea) 제품을, RNAzolB는 invitrogen 사 (Carlsbad, CA, U.S.A.) 제품을사용하였고, 그외사용된시약은 Duksan(korea) 에서구입하여사용하였다. 2 기기 CO₂incubator, deep-freezer(sanyo Co., Japan), vortex, plate shaker, Clean bench, ELISA reader(bio TEK, U.S.A.), autoclave, water bath, boiling water extracter, ice-maker(vision scientific Co., Korea), micro pipet(gilson, France), Gene Amp PCR system 2400(perkin Elmer, U.S.A.) 를사용하였다. 2. 방법 (1) 삼황세제가미방의추출및농축열수추출은삼황세제가미방각원료 g씩 840 g을정칭하여 5배인 4.2L의증류수로 3시간동안추출한후추출액을다른용기에따라두고다시 3.5L의증류수를가한후 3시간동안추출한후여과하여 1차따라둔추출액과합쳐농축시킨후동결건조하여 150 g의시료를수득하여실험에사용하였다 ( 수득률 18%). 알코올추출은삼황세제가미방각원료 g씩을정칭하여 5L의에탄올 (EtOH) 을이용하여 3시간동안 70 C로 2회반복하여추출한후여과하여농축한후동결건조시켜 85 g 시료를수득하여사용하였다 ( 수득률 10.5%). (2) 세포주배양실험에사용한각질형성세포주 (Human kerationocyte HaCaT cell line) 는 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum(fbs), 1% penicilinstreptomycin(gibco Co., U.S.A.) 을첨가하여 3 7, 5% CO₂ 조건하에서배양하여사용함. 세포를 75 mm plate에약 80% 의 confluency에도달할때까지배양하였다. (3) 삼황세제가미추출물 cell 처리방법시료처리전에배지를제거한후 PBS 로세척하여배지내 serum 성분을제거한다음 FBS를첨가하지않은 DMEM 배지를넣어주었다. 시료는열수추출물과 EtOH 추출물이며시료를각각 DW로 1% 의추출물 stock을만들어최종농도 24

4 황충연외 6 인 : 삼황세제가미방외용이 NC/Nga 마우스의아토피피부염에대한효과 가 0.01, 0.05, 0.1, 0.5% 가되도록처리하여 CO 2 배양기에 24시간배양하였다. 대조군은상기와동일한배지에서시험물질을첨가하지않은상태로배양한것을이용하였다. (4) 세포생존능력시험 (Cell viability test) 세포생존능력시험은 cell counting assay를이용하여진행하였다. 삼황세제가미추출물시료를처리하여 24시간배양후처리된배지와시약을제거하였다. 200 μl의 TE(Trypsin-EDTA) buffer 를처리한후 incubator에서 2-3분동안방치하였다. 1.8 ml의 PBS를첨가한후세포를 plate에서떨어뜨린후 10 μl의 Trypan blue와 10 μl의세포액을잘섞은후실온에서 3-4분동안반응시켰다. Hemacytometer에 cover glass를올려놓은후 hemacytometer와 cover glass사이의틈에반응물을 10 μl취하여주입한후현미경을이용하여염색되지않은세포와염색된세포를 counting 하였다. (5) Filaggrin 과 SPT (serine palmitoyltransferase) 발현분석우선 Filaggrin의발현을평가하기위하여상기의방법으로배양및시험한세포로부터트리졸 (Trizol, invitrogen CO., USA) 을이용하여 total RNA를추출한다음, one step RNA PCR kit(amv)(takara Bio Inc., Otsu, Japan) 에서제공되는방법에준하여 reverse transcriptase polymerase chain reaction(rt-pcr) 분석을시행하였다. PCR amplification은 GeneAmp R PCR System 2700(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 을이용하여 94 에서 30초동안 denaturation을시킨후, 60 에서 30초동안 annealing을하고, 72 에서 75초동안 extension 이되도록하였다. 이때 amplification products는 filaggrin과 β -액틴(actin) 이각기약 400bp와 300bp 이다. 이때, 프라이머 (primer) 로는 filaggrindp 대한프라이머 (Bioneer Corp., Daejeon, Korea, 5'-GGTAGATAGATCTGGACACTCAGGG-3') 를사용하였으며, internal control으로는 β -액틴을이용하여발현량을비교하였다. 또한 SPT의발현을분석하기위하여 SPT의 mrna level은 Dorfman과 Lichtenstein의방법에따라 RT-PCR 로분석하였다. 상기의방법으로배양및시험한세포로부터트리졸을이용하여 total RNA를추출하고, First strand cdna synthesis kit (Fermentas, Hanover, MD, USA) 에서제공되는방법에준하여 cdna를합성하였다. RT PCR은 1 μl template, 10 μl PCR master mix(qiagen, Valencia, CA, USA), 1 μl β -actin과 7 μl증류수로총부피를 20 μl로한 PCR mix로 PCR을수행하였다. 그때의조건은 denature(95, 15초 ), annealing, extension(60, 60초 ) 으로 45cycle을수행하였으며 mrna의양은 comparative CT method를이용하여각각의 template의변이에기인하는증폭양을 normalization하였고, 또한 house keeping gene인 β -actin을각유전자의기준으로정하여정량을유도해내었고, 대조시료에서의각유전자를 calibrator로정하여정량을하였다. (6) 삼황세제가미추출물도포및염증유발아토피피부염은 1-chloro 2,4-dinitrobenzene (DNCB) 을이용하여유발하였다. 먼저 NC/Nga mice의등부위를깨끗이제모한후피부의미세상처가치유되도록 24시간방치하였다. 실험 4일전 1% DNCB용액 (acetone:olive oil=3:1) 200 μl를등부위에도포하고실험시작일부터종료일까지 12주간일주일에 2번 0.2% DNCB용액 150 μl를등부위에도포하여염증을유발하였다. NC/Nga mice 실험군은삼황세제추출물각각 25

1%, 3%, 5% 농도로군을나누었으며 NC/Nga mice 실험군각각은삼황세제열수추출물을 12주간매일오전 9시, 오후 5시에등부위를충분히적실정도로도포하였다. NC/Nga mice 대조군은생리식염수를추출물과같은용량, 용법으로도포하였다. (7) 피부손상도측정 NC/Nga mice의피부염은아토피성피부염에서일반적으로사용되는임상적육안평가법을이용하였다.

5 1%, 3%, 5% 농도로군을나누었으며 NC/Nga mice 실험군각각은삼황세제열수추출물을 12주간매일오전 9시, 오후 5시에등부위를충분히적실정도로도포하였다. NC/Nga mice 대조군은생리식염수를추출물과같은용량, 용법으로도포하였다. (7) 피부손상도측정 NC/Nga mice의피부염은아토피성피부염에서일반적으로사용되는임상적육안평가법을이용하였다. 육안평가결과는다음의 5가지항목을각각평가한점수의총합으로나타내었으며평가항목은홍반 (erythema), 가려움과건조피부 (Pruritus & Dry Skin), 부종과혈종 (Edema & Excoriation), 미란 (Erosion), 그리고태선화 (Lichenification) 로나누어졌다. 이각각의항목은없음 (0), 약함 (1), 중증도 (2), 심함 (3) 으로나누어서채점하였다. Ⅲ. 결과및고찰 1. 삼황세제가미추출물의 In vitro 검사 (1) 세포생존능력 (Cell Viability) 분석삼황세제가미추출물이세포에미치는영향을알아보기위하여두가지추출물을농도를다르게처리하여세포의생존능력을확인하였다. H 2 O와 EtOH을이용하여추출한추출물을 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5% 를처리하였을때세포생존능력을분석한결과, Fig. 1과같이 H 2 O로추출한추출물은농도가증가하여도세포가사멸되지않고잘살아있는것을확인하였다. 가장높은농도인 0.5% 인경우에만약 10% 정도생존력이감소하는것을확인하였다. (8) 혈청내 IgE 정량화혈청내 IgE 량은 2주, 3주, 5주, 8주, 12주에생쥐의눈에서 capillary tube를이용하여약 100 μl의혈액을채혈한후원심분리기로혈청을분리하여 IgE 량을 ELISA kit로측정하였다. (9) 혈청내 IL-4, 5, 6 정량화 SHSJGE 도포 12주후 NC/Nga 생쥐를 ethyl ether로마취한후심장천자법으로혈액을채혈하여혈청을분리한후혈청중 IL-4, 5, 6량을 ELISA kit로정량하였다. 3. 통계처리 통계학적유의성검정은 one-way ANOVA (Analysis of Variance) 방법을사용하였으며, 유의수준 p<0.01 의범위내에서그결과들은평균에대한표준편차로나타내었습니다. Fig. 1. Effect of Samwhangsejegami extracts on cell viability [(a) H 2O extract,(b) EtOH extract] 26

황충연외 6 인 : 삼황세제가미방외용이 NC/Nga 마우스의아토피피부염에대한효과 EtOH을이용한삼황세제가미추출물의경우에는추출물의농도가증가할수록세포의생존력이조금씩감소하는경향을보였으며, 가장높은농도인 0.5% 에서는약 20% 정도생존력이감소하였으나세포의성장에많은영향을주지않음을확인하였다 (Fig. 1).

6 황충연외 6 인 : 삼황세제가미방외용이 NC/Nga 마우스의아토피피부염에대한효과 EtOH을이용한삼황세제가미추출물의경우에는추출물의농도가증가할수록세포의생존력이조금씩감소하는경향을보였으며, 가장높은농도인 0.5% 에서는약 20% 정도생존력이감소하였으나세포의성장에많은영향을주지않음을확인하였다 (Fig. 1). (2) 추출물이피부장벽조절인자에미치는영향 삼황세제가미추출물이피부장벽기능조절인자에미치는영향을알아보기위해서 filaggrin과 SPT의발현량을 reverse transcriptase PCR로분석하였다. Fig. 2에서알수있는바와같이, H 2 O를이용한추출물을 0.01, 0.05, 0.1, 0.5% 로처리하였을때에농도의존적으로 filaggrin의발현양이증가되는것을확인할수있었으며이로부터 H 2 O를이용한추출물은 % 의비교적낮은농도로처리하였을때에도효능을나타내었으며농도가높아질수록많이증가함을확인할수있었다. 또한 SPT의발현양역시농도의존적으로증가하는것을확인하였고이또한 0.5% 로의높은농도에서발현양이가장높은것을확인하였다. H 2 O 추출물뿐만아니라 EtOH 추출물을 0.01, 0.05, 0.1, 0.5% 로처리하였을때역시농도의존적으로 filaggrin과 SPT의발현양이증가하는것을확인할수있었으며 EtOH 추출물의경우에는 H 2 O 추출물에비하여 cell viability가약 10% 정도떨어지긴하지만, 추출물로인한피부장벽조절인자의발현양상에는좋은영향을미치는것을확인할수있었다 (Fig. 2). (3) 피부항염증반응인자에미치는영향삼황세제가미추출물이피부항염증반응인자에미치는영향을알아보기위해서 COX-2의발현과 COX-2의 transcription factor중의하나인 AP-1의발현을 western blotting으로분석하였다. Fig. 2. Effect of extracts on skin barrier factor expression [(a) H 2O extract,(b) EtOH extract] Fig. 3. Effect of extracts on infla mmation factors expression [(a) H 2O extract,(b) EtOH extract] Fig. 3에서알수있는바와같이, H 2 O 추출물을 0.01, 0.05, 0.1, 0.5% 로처리하였을때에농도의존적으로 COX-2의발현이약간감소함을확인하였고, AP-1 역시농도가증가함에따라그발현양이감소하는것을확인하였다. 또한 EtOH 추출물의경우에도 0.01, 0.05, 0.1, 0.5% 로처리하였을때에농도의존적으로 COX-2의발현이감소하는것을확인하였고 H 2 O 추출물의경우에비해더많이감소하는것을확인하였으며, AP-1도농도가증가함에따라확연히감소하는것을확인할 27

7 수있었다. 이와같은결과로삼황세제가미추출물은피부장벽조절인자인 filaggrin과 SPT의양을증가시켜줌으로써피부의수분유지기능을유지시켜주는기능을강화함과동시에추출물이피부항염증반응인자를증가시켜피부의염증을유발을억제할수있음을알수있었다 (Fig. 3). 2. 삼황세제가미추출물의 in vivo 동물실험을통한항아토피효능검증 (1) 피부손상도에미치는영향염증유발된 NC/Nga mice는모든군에서 1주부터피부발진이나타났으며 2주에피부발진이선명하게보였다. Fig. 4와같이처리군에서는 3주이후로추출물도포에의해피부발진이조금씩회복되어감을파악할수있었다. 5주이후로제모를하여자세한피부발진들을확인시외견상대조군에비해추출물도포군에서상당히많이완화됨을확인할수있었고특히삼황세제추출물의 농도가높아짐에따라피부발진회복력은더욱뛰어났다. Fig. 5와같이피부손상정도지표 (Clinical skin severity score) 역시대조군 9.8 보다추출물처리군 (1%, 3%, 5%) 모두 5.1, 4.5, 4.1로감소함을볼수있었다. 8주및 12주에는대조군의피부손상정도가더욱심해지는반면 (8주 12.2, 12주 13.5) 추출물은거의피부발진및손상정도가정상으로회복 (12주; 1% 3.2, 3% 2.4, 5% 1.4) 되어추출물의아토피유발에의한피부손상에효과가우수함을확인할수있었다. Fig. 5. Clinical skin severity of dermatitis in NC/Nga mice. 삼황세제농도 아토피유발 5 weeks 8 weeks 12 weeks 1% 3% 5% Fig. 4. Clinical skin features of dermatitis in NC/Nga atopy dermatitis model mice. 28

황충연외 6 인 : 삼황세제가미방외용이 NC/Nga 마우스의아토피피부염에대한효과 (2) 혈청중 IgE 발현에미치는영향혈청중 IgE 생성량은아토피유발대조군은 DNCB 투여후, 0주와 2주에서 3.90±0.80, 365.00±4.54 ng/ ml로측정되었으며, 추출물처리군은 1% 에서각각 5.2±0.42, 375.60±15.

8 황충연외 6 인 : 삼황세제가미방외용이 NC/Nga 마우스의아토피피부염에대한효과 (2) 혈청중 IgE 발현에미치는영향혈청중 IgE 생성량은아토피유발대조군은 DNCB 투여후, 0주와 2주에서 3.90±0.80, ±4.54 ng/ ml로측정되었으며, 추출물처리군은 1% 에서각각 5.2±0.42, ±15.20 ng/ ml, 3% 에서각각 4.5±0.54, ±12.10 ng/ ml, 5% 에서각각 5.9±0.64, ±11.40 ng/ ml로측정되었다. DNCB 투여후, 3주에서는대조군은각각 ±11.50, 추출물처리군 1% 에서는 ± ng/ ml로나타났고, 3% 에서는 ±18.10 ng/ ml로나타났고, 5% 에서는 ±13.80 ng/ ml로나타나 3주후부터추출물처리군에서 IgE가유의성있게감소하기시작함을알수있었으며 8 주와 12주추출물처리군 1% 에서는 ± ng/ ml, 3% 에서는 ±11.35, 5% 에서는 85.00±9.15 로측정되어모두대조군에비하여유의성있게 (p<0.01) 감소했다추출물처리군은농도의존적으로 IgE가유의성있게감소함을알수있었다 (Fig. 6). (3) 혈청중 IL-4, IL-5, IL-6 발현에미치는영향 IL-4 수준은최종 12주령에서아토피유발대조군은 60.55±4.12 pg/ ml, 추출물처리군은 1% 에서 45.35±2.798 pg/ ml, 3% 에서 33.32±3.51 pg/ ml, 5% 에서는 23.41±3.11 pg/ ml로나타나대조군에 Total IL-4 level(pg/ml) Control 1% 3% 5% Fig. 7. Serum IL-4 level after treatment of dermatitis in NC/Nga mice. Total IL-5 level(pg/ml) Control 1 % 3 % 5 % Fig. 8. Serum IL-5 level after treatment of dermatitis in NC/Nga mice Total IL-6 level(pg/ml) Fig. 6. Serum IgE level in NC/Nga atopy dermatitis model mice 0 Control 1 % 3 % 5 % Fig. 9. Serum IL-6 level after treatment of dermatitis in NC/Nga mice. 29

9 비하여유의성있는 (p<0.01) 감소를나타내었으며추출물의농도가증가할수록 IL-4 감소량은증가하였다 (Fig. 7). IL-5 수준은최종 12주령에서아토피유발대조군은 ±4.12 pg/ ml, 추출물처리군은 1% 에서 ±2.25 pg/ ml, 3% 에서 ±3.11 pg/ ml, 5% 에서는 ±3.11 pg/ ml로나타나 IL-4 수준과마찬가지로대조군에비하여유의성있는 (p<0.01) 감소를나타내었으며추출물의농도가증가할수록 IL-4 감소량역시증가하였다 (Fig. 8). IL-6 수준또한 IL-4와 IL-5와유사한경향을보였는데최종 12주령에서아토피유발대조군은 ±2.15 pg/ ml, 추출물처리군은 1% 에서 ±3.21 pg/ ml, 3% 에서 ±4.14 pg/ ml, 5% 에서는 ±2.56 pg/ ml로나타나아토피유발대조군에비해삼황세제가미추출물처리군에서급격한감소를보였다 (Fig. 9). 실험동물인 NC/Nga 생쥐는일반적인환경에서사람의아토피피부염과매우유사한증상인가려움, 심한피부염증, 血腫, 체중감소를나타내는실험동물모델로 air-uncontroled 상황 (conventional NC/Nga mice) 에서 12주이후혈청중 IgE 수준이정상의 100배까지기록되고아토피성피부염의피부장해가동반된다 19). 아토피피부염은 IgE 와연관된면역기전에의해발생되는데, B 세포로부터 IgE의생성을유도하는 IL-4 20), IgE의생성을촉진하는 IL-5 21), IgE의생성을증폭시키는 IL-6 22) 등과같은면역인자와깊은관련이있다. 아토피피부염환자들의 80% 이상에서혈청 IgE 의수치가증가되어있으며 20-23), 이수치는대체적으로아토피피부염의임상적중증도와비례하는것으로알려져있다. 본연구는삼황세제가미추출물을이용한아토피유발모델인 NC/Nga mice 에대해아토피유발억제능을검증한것으로, 삼황세제가미추출물을아토피유발후부터매일 2회분무를 12주간실 시하였다. 실험결과아토피유발대조군에비하여삼황세제가미추출물도포군에서현저한피부손상정도지표 (Clinical skin severity score) 감소를나타냈다. 삼황세제가미추출물을분무한 NC/Nga mice 의혈액에서 IgE 수치는아토피유발대조군에비하여유의성있게 (p<0.01) 감소를나타내었고, 혈중 IL-4, IL-5, IL-6 수치역시삼황세제가미추출물도포군에서모두아토피유발대조군에비하여유의성있는 (p<0.01) 감소를나타냄으로써, 삼황세제가미추출물이 B 세포분화에수반되는 IgE, IL-6 발현과 Th2에서분비되는 IL-4, IL-5 발현을억제함을확인하였다. 결과적으로삼황세제가미추출물이 Th2 세포를억제함으로써 IL-4과 IL-5 등의염증관련싸이토카인생성을억제하고이로인해 IgE 생성역시억제됨으로써동물실험에서나타난바와같은유의성있는결과가도출된것으로사료된다. Ⅳ. 결론삼황세제가미추출물의항아토피효능을검증하기위하여 HaCaT cell에서 in vitro 실험과 NC/Nga mice에서 in vivo 실험을한결과다음과같은결론을얻었다. 1. 열수추출물은농도가증가하여도세포가사멸되지않고잘살아있으나가장높은농도인 0.5% 인경우에만약 10% 정도생존력이감소하였다. EtOH 추출물은추출물의농도가증가할수록세포의생존력이조금씩감소하는경향을보였으며, 가장높은농도인 0.5% 에서는약 20% 정도생존력이감소하였다. 2. 삼황세제가미추출물농도의존적으로 filaggrin과 SPT의발현량이증가되어삼황 30

10 황충연외 6 인 : 삼황세제가미방외용이 NC/Nga 마우스의아토피피부염에대한효과 세제가미추출물로인한피부장벽조절인자의발현양상에는좋은영향을미치는것을확인하였다. 3. COX-2의발현과 COX-2의 transcription factor중하나인 AP-1의발현이추출물농도의존적으로발현량이감소하였다. 4. 삼황세제가미추출물도포군에서피부손상정도지표 (Clinical skin severity score) 아토피유발대조군에비하여유의성있는감소를보였다 5. 혈중 IgE, IL-4, IL-5, IL-6 수치모두아토피유발대조군에비하여유의성있는감소를확인하여삼황세제추출물이 Th2 세포를억제함으로써 IL-4과 IL-5 등의염증관련싸이토카인생성을억제하고이로인해 IgE 생성역시억제함으로서항아토피효과를나타냄을확인하였다. 감사의글본연구는 년보건복지부의연구비지원에의해수행되었음. 참고문헌 1. 대한피부과학회. 교과서편찬위원회편저. 제5판피부과학. 서울 : 여문각. 2008: 손정민, 김희택, 홍승욱. 제천지역소재초등학교학생들의아토피피부염에대한설문조사연구. 한방안이비인후피부과학회지. 2009; 22(2): 피부과학원색도감편찬위원회편. 피부과학원색도감. 서울 : 도서출판정담. 1999: 김정원. 아토피피부염. 대한한의사협회지. 1996;39(7): 巢元方編著. 巢氏諸病源候論. 大星文化社. 1992: 吳謙. 醫宗金鑑 ( 下 ). 北京 : 人民衛生出版社. 1982: 葛洪. 肘後備急方 ( 四庫全書 ). 大星文化社. 1995: 478-9, 孫思邈. 備急千金要方. 大星文化社. 1989: 襲廷賢. 增補萬病回春 ( 下卷 ). 台北 : 大中國圖書公司. 1967: 洪元植. 中國醫學史. 서울 : 東洋醫學硏究院. 1984: 박민철, 김진만, 홍철희. 아토피피부염의동 서의학적문헌고찰. 대한안이비인후피부과학회지. 2002;15(1): 윤화정, 고우신. 아토피피부염환자의韓醫學的인臨床類型分類에대한연구. 대한한의학회지. 2001;22(2): 김기훈, 이진용, 김덕곤. 桑葉이아토피피부염에미치는영향. 경희의대논문집. 2004;20(1): 한규철, 이진용, 김덕곤. 牛蒡子가아토피피부염에미치는영향. 대한한방소아과학회지. 2004; 18(2): 김시혜, 정혁상, 조백건, 이진용, 김덕곤. 자초가아토피피부염에미치는영향. 대한한방소아과학회지. 2004;18(1): 김윤희, 박지수, 강탁림. 연교산이아토피동물모델에미치는영향. 동의생리학회지. 2006; 20(1): 박민철, 최인화. 시호청간산투여가아토피피부염을유발한동물모델의각질층기능회복에미치는영향. 대한한의학회지. 2004;25(3): 고백강. 중의외과학. 북경 : 인민위생출판사. 1987: Masahiro Matsumoyo, Chisei Ra, Keiko 31

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α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를