Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 27: 161166 (2012) 연구논문 막걸리에서분리한젖산세균인 Lactobacillus casei HK9 의특성및항균활성 백현, 최문섭, 오계헌 * Characterization and Antibacterial Activity of Lactobacillus casei HK9 Isolated from Korean Rice Wine, Makgeolli Hyun Baek, MoonSeup Choi, and KyeHeon Oh* 접수 : 2012 년 5 월 31 일 / 게재승인 : 2012 년 6 월 27 일 2012 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: 1) The purpose of this work was to examine the antibacterial activity derived from a lactic acid bacterium isolated from korean rice wine, called makgeolli. Various physiological and biochemical properties of this strain were characterized. Both the BIOLOG system and phylogenetic analysis using 16S rrna sequencing were utilized for identification, and the strain was designated as Lactobacillus casei HK9, and registered in GenBank as [JQ951606]. Growth rate, production of organic acids (e.g., lactic acid and acetic acid), and ph changes during growth were monitored. The maximum concentrations of lactic acid and acetic acid were approximately 576 mm and 199 mm, respectively, and ph was changed from 7.00 to 3.74 after 72 h of incubation. HPLC was used to confirm the production of lactic acid and acetic acid. Significant antimicrobial activity of the concentrated supernatant was demonstrated against various foodpoison causing bacteria (e.g., Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, methicillinresistant Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis). Ethanol tolerance of L. casei HK9 showed up to 12% of ethanol within the culture. Keywords: Lactic acid bacteria, Lactobacillus casei HK9, 순천향대학교생명시스템학과 Department of Life Science and Biotechnology, Soonchunhyang University, Asan, ChungNam 336745, Republic of Korea Tel: 82415301353, Fax: 82415301350 email: kyeheon@sch.ac.kr Makgeolli, Korean rice wine 1. 서론 막걸리는찹쌀, 보리쌀, 밀가루등에누룩과물을섞어발효시키는우리나라전통주로써, 최근몸에좋다는연구결과가밝혀지고있어서, 막걸리의소비가증가추세로이어지고있다. 지난 2010 년막걸리출고량은 2009 년보다 58.1% 증가하였고, 막걸리수출량은 19,407 kl 로 2009 년보다 178.1% 가증가하였으며, 와인의수입이막걸리의보급증가로인해감소하고있다고보고하였다 [1]. 젖산균은사람의장내균종을개선시켜숙주에게유익한효과를주는미생물또는혼합배양물을의미하는프로바이오틱 (probiotics) 의대표적미생물이다 [2]. 젖산균은그람양성의비운동성, 비포자형성, 발효성대사에의해젖산을생성하는세균으로 [3], 야채나과일의발효를통해서식품의풍미를향상시키며, 사람의소화관과생식기등에서방어시스템을가지는것으로보고된바있다 [47]. 젖산균은암예방 [8,9], 면역시스템활성화 [10] 등의다양한기능성이있는것으로알려져있다. 항균능력도뛰어난것으로알려져있는데, 젖산균을이용하여식중독원인세균을사멸시키는것으로나타났다 [5]. 특히 Lactobacillus 종은다양한세균에대한항균활성연구가이루어지고있으며, 항균활성인자로서유기산, 과산화수소, 박테리오신등이알려져있다 [11,12]. 최근에막걸리를포함하는곡주 ( 穀酒 ) 가항산화 [13] 와항노화 [14] 의기능이있다고보고된바있다. 본연구에서는시판되는막걸리로부터 Lactobacillus casei
162 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 27: 161166 (2012) HK9 을농화배양기법을통해분리하여, 여러가지형태학적및생화학적특성을조사하였으며, 분리세균을이용하여식중독을일으킬수있는여러가지병원균들에대한항균활성을조사하였다. 2. 재료및방법 2.1. 균주확보와배양조건본연구에서사용된젖산세균은충남아산시신창면주변상점에서제조판매되는 S 양조장의쌀막걸리 ( 조성 : 백미 56%, 밀가루 20%, 전분당 24%) 를구입하여농화배양기법으로분리하였다. 막걸리시료를 1 ml 취해생리식염수가담긴튜브에넣고 10 6 으로희석한후, 100 μl 를 0.002% BPB (bromophenol blue) 가첨가된 MRS (Difco, USA) 고체평판배지에도말하고, 37 배양기에서혐기적조건으로 48 시간배양하였다. 균주의생육과정에서노란색을띠는균주를선별하여 MRS 고체평판배지에평판도말법을통한순수배양으로 HK9 을분리하였다. 2.2. 분리세균의형태학적관찰및생화학적특성조사분리세균 HK9 을 MRS 고체평판배지에도말하여단일집락의형태를확인하고, 그람염색을실시하여형태학적특성을관찰하였으며, 여러가지생화학적특성을조사하였다 [2]. 분리세균의동정은 GP2 Microplate Identification System (BIOLOG, Hayward, USA) 를이용하여동정하였다. 분리세균을 BUG 고체평판배지에도말한후, 37 에서 24 시간동안배양하였다. 배양된세균현탁액을 Biolog Turbidimeter (BIOLOG, Hayward, USA) 를이용하여 20% 까지맞추고 GP2 MicroPlate 의 96 개의 well 에각각 150 μl 씩분주하였고, 30 에서 48 시간동안배양하였다. 배양된 MicroPlate 의결과는 MicroLog database software 를통해확인하였다. 2.3. 16S rrna 염기서열의계통수분석분리세균 HK9 의유전학적계통수 (phylogenetic tree) 를작성하기위하여 16S rrna sequencing 을실시하였다. HK9 균주를이용하여 genomic DNA 를추출하였고, 16S rrna 유전자를증폭하기위하여 8F (5'AGAGTTTGATCCTG GCTCAG3') 와 1492R (5'TACGGTTACCTTGTTACG ACTT3') primer 를사용하였으며, PCR 을통하여증폭하였다. Genomic DNA 를주형으로하여 PCR Mastermix (GenDEPOT, USA) 를이용하여 PCR 을수행하였다. PCR 수행조건은 denaturation (94, 30 초 ), annealing (60, 30 초 ), elongation (72, 30 초 ) 단계를 30 회반복한후, 72 에서 10 분간유지하였다. PCR 에의하여증폭된 DNA 단편을전기영동한후, agarose gel extraction kit (Intron, Korea) 를이용하여회수한후, PCR 결과물을염기서열분석업체인솔젠트 (Solgent Co., Daejeon, Korea) 에의뢰하여부분적인염기서열을결정하였다. 결정된염기서열은 NCBI 의 BLAST 분석프로그램을사용하여상동성을비교하였으며, 계통유전학적계통수는 Bio Edit (Ibis Biosciences, Carlsbad, CA, USA), Clustal X (Conway Institute, UCD, Ireland), Mega4 (The Biodesign Institute, Arizona State University, AZ, USA) 등의프로그램을이용하여작성하였다. 2.4. 세균의생장에따른 ph 의변화와유기산분석 MRS 액체배지는 ph 7.0 으로조절한후, 분리세균인 HK9 를접종하고, 37 에서배양시키면서, 세균의생장에따른 ph 의변화와배양기간중에생산되는유기산의변화를 8 시간간격으로 72 시간까지측정하였다. 세균의생장은 8 시간마다 MRS 고체평판배지에배양액의 10 6 희석액을 100 μl 씩평판도말하여 37 에서 48 시간동안배양한후, 연속희석법에의한집락수를계수하여생장곡선을작성하였다. ph 변화는 8 시간마다 10 ml 씩채취하고균체를제거한후, ph meter 를이용하여측정하였다. 분리세균에의해생산되는유기산을분석하기위해 HPLC 를사용하였다. 분석에사용된 HPLC system 은 UV/VIS151 detector 와 321 pump 가부착된 Gilson 사 HPLC 를사용하였으며, Supelco 사의 Supelcogel C610H 컬럼 (300 mm 7.8 mm, 입자크기 9 μm) 을사용하였다. HPLC 작동조건은 flow rate 0.5 ml/min, UV 파장은 210 nm 로맞추어사용하였다. Mobile phase 는 0.1% phosphoric acid 를 0.45 μm membrane filter 에여과하고, 초음파세정기를이용하여용액내의기포를제거한후사용하였다. 유기산은분석용표준품과배양액으로부터채취한시료를대상으로분석하였다. 표준품은젖산 (lactic acid) 과아세트산 (acetic acid) 을각각 1:1 의비율로혼합하여만들었으며, 배양액은생성된유기산을정량하기위하여채취한시료를 13,000 g 에서 30 분간원심분리한후, 0.45 μm syringe filter 로여과하였고, Hamilton syringe 를사용하여 HPLC injector 내에 20 μl 를주입하였다. HPLC chromatogram 은 Unipoint TM (Gilson, Inc., USA) 에의해제공된프로그램에의해작성되었다. 2.5. 세균의농축배양상등액제조분리세균 HK9 의항균활성을확인하기위하여 MRS 액체배지에접종하여 37 에서 48 시간동안배양한후, 4,000 g 에서 20 분간원심분리하여균체를제거하고, 상등액을 0.5 N NaOH 를사용하여 ph 를 7.0 으로조절한대조군과 ph 를조절하지않은실험군을준비한후, 멸균된 0.2 μm syringe filter 를이용하여여과한후, 동결건조기를이용하여건조한후 20 배로농축하였다. 2.6. 농축배양상등액의항균활성조사농축된배양상등액의항균활성은평판확산검정법 (plate diffusion assay) 을통하여확인하였다. 대상세균으로는식중독감염의원인균으로보고된그람양성세균인 Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, methicillinresistant Staphylococcus aureus, 그람음성세균인 Escherichia coli, Salmonella enteritidis 를이용하였다. 대상세균들을액체영양배지 (nutrient broth) 에각각접종하여 37 진탕배양기에 24 시간배양시킨후, 고체영양배지 (nutrient agar) 에멸균된면봉으로도말하고, 여기에 paper
막걸리에서분리한젖산세균인 Lactobacillus casei HK9 의특성및항균활성 163 disc 를올려놓은뒤, 두종류의농축배양상등액 20 μl 를흡수시키고, 37 배양기에서 24 시간배양시켜 paper disc 주변에생성된투명대의크기로항균활성을측정하였다. 2.7. 알코올농도별생존력확인분리세균의알코올농도에따른생존력을확인하기위하여, 각각다른농도의알코올이포함된 MRS 액체배지에균을배양한후, 배양액을 10 6 로희석하여 100 μl 를 MRS 평판배지에도말하였고, 37 배양기에서 48 시간배양시켜균주의생존력을확인하였다. 3. 결과및고찰 3.1. 세균의분리및특성시중에서판매하는막걸리로부터항균활성물질을생성하는세균들을농화배양기법을통하여분리하였다. 0.002% BPB 가첨가된 MRS 고체평판배지에서생장중, 유기산을형성하여노란색집락을형성하는균주를선별하여, 총 3 회에걸친순수계대배양으로 HK9 을분리하였다. 분리세균은그람염색을통하여형태학적분석을실시하였으며, 현미경으로관찰한결과그람양성의간상형세균으로관찰되었다. Table 1 에서보여주는바와같이, 인돌 (indole) 형성여부에서는음성으로나타났으며, glucose 를이용하지못하였고, methyl red 시험은음성, VogesProskauer 시험에서는양성반응을나타내었다. 녹말과젤라틴분해여부시험에서는음성을나타내었으며, catalase 시험에서는음성, oxidase 시험에서는양성을나타내었다. Klingler iron agar 배지에서나타난 disulfhydase 에의한 H 2S 의형성은양성으로확인되었으며, Simmon s citrate 이용여부와 litmus milk 시험에서펩톤화 (peptonization) 는음성으로확인되었다. Table 1. Morphological and physiological characteristics of the isolate, L. casei HK9 Morphological characteristics Cell shape Gram stain Physiological characteristics Indole production Glucose Methyl red VogesProskauer Starch hydrolysis Gelatin hydrolysis Catalase Oxidase Simmon s citrate H 2S (KIA) Litmus milk (peptonization) : Positive reaction, : Negative reaction. Rod Positive 3.2. 세균의동정및 16S rrna 염기서열의계통수분석분리세균 HK9 균주의동정을위해, 각종탄소원이용 여부를 BIOLOG 분석시스템을이용하여조사하였고, MicroLog database software 를이용하여분석한결과, HK9 는 Lactobacillus casei 로동정되었으며, Lactobacillus casei HK9 으로명명하였다. BIOLOG 분석시스템을사용하여얻어진생화학적특성은 Table 2 에나타내었다. Table 2. Biochemical characteristics of the isolate, L. casei HK9 using the BIOLOG analysis system Biochemical tests Water αcyclodextrin βcyclodextrin Dextrin Glycogen Inulin Mannan Tween 40 Tween 80 NacethylDglucosamine NacethylDmannosamine Amygdain Larabinose Darabitol Arbutin Cellobiose Dfructose Lfucose Dgalactose Dgalacturonic acid Gentiobiose Dgluconic acid αdglucose minositol αdlactose Lactulose Maltose Maltotriose Dmannitol Dmannose Dmelezitose Dmelibiose αmethyl Dgalactoside βmethyl Dgalactoside 3methylglucose αmethyl Dglucoside βmethyl Dglucoside αmethyl Dmannoside Palatinose Dpsicose Draffinose Lrhamnose Dribose Dsalicin Sedoheptulosan Dsorbitol Stachyose Sucrose Dtagatose Dtrehalose Turanose Xylitol Dxylose Acetic acid αhydroxy butyric acid βhydroxy butyric acid γhydroxy butyric acid βhydroxy phenyl acetic acid αketo glutaric acid αketo valeric acid Lactamide Dlactic acid methylester Llactic acid Dmalic acid Lmalic acid Methyl pyruvate Monomethyl succinate Propionic acid Pyruvic acid Succinamic acid Succinic acid NacetylLglutamic acid Alaninamide Dalanine Lalanine Lalanylglycine Lasparagine Lglutamic acid GlycylLglutamic acid Lpyroglutamic acid Lserine Putrescine 2,3butanediol Glycerol Adenosine 2deoxy adenosine Inosine Thymidine Uridine Adenosine5'monophosphate Thymidine5'monophosphate Uridine5'monophosphate Fructose6phosphate Glucose1phosphate Glucose6phosphate DLαglycerolphosphate
164 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 27: 161166 (2012) Lactobacillus casei HK9 의유전학적계통수 (phylogenetic tree) 를작성하기위하여, PCR 을통해 16S rrna 유전자를증폭하고, 부분적인염기서열을결정하였다. 결정된염기서열을 NCBI 의 BLAST 분석프로그램을사용하여상동성을비교한결과, L. casei 와 97% 의유전적상동성을보였다. 염기서열은 GenBank 에 [JQ951606] 로등록하였으며, Lactobacillus 종에속하는다른균주들과의계통유전학적계통수를작성하였다 (Fig. 1). Lactobacillus plantarum YK9 는 72 시간이내에 588.7 mm 젖산과 255.5 mm 아세트산을생성하였다고보고하였다 [5]. 이들결과는인체또는주변에존재하는젖산균의분리장소와균주의종류에따라다양한화합물이생산되며, Fig. 2 에서보여주는바와같이, HK9 배양은주요대사산물로서젖산과아세트산을생산하는데, 이들유기산은 ph 를하락시켜병원성세균의항균활성에영향을미친다는것을제시한다. Fig. 1. Phylogenetic relationship between L. casei HK9 ( ) and its related strains based on 16S rrna gene sequence analysis. 3.3. 세균의생장에따른 ph 의변화와유기산분석분리세균 HK9 균주를 ph 7.0 으로조절된 MRS 액체배지에접종하고세균의생장과 ph 변화를 8 시간간격으로측정하였다 (Fig. 2). 배양시간동안배양액의 ph 는지속적으로감소하였으며, 40 시간이후생장이느려짐에따라 ph 의변화도감소하여, 최종 ph 는 3.74 로확인되었다. 분리세균에의해생산되는유기산을분석하기위해 HPLC 를사용하여분석한결과, 젖산과아세트산이혼합된표준품과비교하여배양액에서채취한시료에서도 14.41 min 과 16.26 min 에서동일한피크 (peaks) 가확인되었다. 따라서이두개의피크는유기산인 lactic acid 와 acetic acid 로확인되었으며, 분리세균 HK9 의배양시간경과에따른유기산인젖산과아세트산의생성량은 24 시간에서 370 mm 과 120 mm, 48 시간에 526 mm 과 155 mm, 그리고 72 시간에서 576 mm 과 199 mm 로각각정량되었다 (Fig. 3). ph 감소와비교하였을때, 이들유기산은배양액의 ph 를낮추는데직접적인영향을미치는것으로확인되었다. 많은연구에서젖산세균은발효기간중유기산 (organic acids), diacetyl, 과산화수소, bacteriocin 등과같은다양한화합물을생산하는것으로알려져있다 [15,16]. 신생아태변에서분리한 Lactococcus lactis HK9 에서배양기간중에 495.6 mm 젖산과 104.3 mm 아세트산을생성하였고 [6], 새우양식장에서분리된 Lactobacillus sp. JK8 은 192 mm 젖산과 43.6 mm 아세트산을생성하였으며 [17], 김치에서분리된 Fig. 2. Growth of L. casei HK9 culture, measured as viable cell count ( ) and compared with the parallel formation of lactic acid ( ), acetic acid ( ), and ph changes ( ). Fig. 3. HPLC chromatograms of a mixture of authentic standards containing lactic acid and acetic acid (a), and of culture samples of L. casei HK9 at the beginning (b) and after 24 h (c), 48 h (d), and 72 h of incubation (e); peak 1, lactic acid; peak 2, acetic acid. 3.4. 농축배양상등액의항균활성조사분리세균 HK9 의항균활성시험은 plate diffusion assay 방법 [18] 을이용하여농축배양상등액을그람양성세균인 B. cereus, L. monocytogenes, S. aureus, MRSA, 그람음성세균인 E. coli, S. enteritidis 등 6 가지식중독감염원인세균에노출시키고 24 시간동안배양한후, paper disc 주변에형성되는투명대를통하여항균활성을확인하였다 (Fig. 4). HK9 에서생성되는항균물질을비교하기위해서 ph 를조절하였으며, 그결과 ph 를 7.0 으로조절한배양상등액에서는
막걸리에서분리한젖산세균인 Lactobacillus casei HK9 의특성및항균활성 165 투명대가형성되지않았지만, 조절하지않은배양상등액에서는 6 가지균주모두에게서투명대가형성되었고, 이결과는분리세균 HK9 항균활성물질이유기산으로써, 식중독원인세균들의생장저해에탁월한효과를나타내는것으로확인되었다. 본연구에서분리세균 HK9 의배양액은접종이되어배양기간이경과함에따라 7.0 이었던초기 ph 가급속히감소되었으며, 배양 72 시간에는 3.74 로유지되었는데, 이는배양액중에젖산과아세트산의유기산들이생성되었기때문이다. 배양액의 ph 를 7.0 으로조절하면, 배양액이중성으로되어항균활성이사라지게되는데 ( 자료미제시 ), 이는 HK9 가가지는항균활성요인이유기산들이라는것을의미한다. HK9 에서얻어진결과는새우양식장에서분리한젖산세균 Lactobacillus sp. JK8 과유사한결과를보여주었다 [17]. 보고된바있다 [20]. 이러한결과는 HK6 가지금까지알려진알코올내성젖산균들과비교하여높은알코올내성을갖는젖산균으로조사되었는데, 이는막걸리와같은발효주를제조에서존재하는젖산균이가지는대표적인특성으로알려져있다. 막걸리는우리의전통발효주로서많은사람들의애호를받지만, 저장성이매우짧아제조후유통기간이내라할지라도신맛이생겨서술의변질우려와함께기호주로서외면을받을소지가있다. 본연구를통해서, 막걸리의신맛은젖산균의다양한식중독원인균들에대한항균활성으로음용시건강에문제가되지않는다는것을생각할수있으며, 추후막걸리고유의맛과함께젖산균의기능성을고려한새로운알코올성음료개발에대한가능성을제시하고있다. Fig. 4. Antibacterial activity of 20fold concentrated culture supernatants from L. casei HK9. Paper discs soaked with the supernatants were placed onto lawn plates of B. cereus (a), E. coli (b), S. enteritidis (c), S. aureus (d), MRSA (e), L. monocytogenes (f). All strains grew on nutrient agar plates. 젖산균의항균활성은여러논문을통해보고된바있는데, 김치, 우유, 술등의발효식품, 수서환경, 또는사람의내장과생식기등에서분리된다양한젖산균은식품의맛과풍미를증진시키거나, 환경이나생물체에서의방어기작에중요한역할을한다 [47,17,19]. 본연구를통해서막걸리에서분리된 Lactobacillus casei HK9 는발효기간에경과함에따라알코올맛에부가하여젖산균으로부터젖산이나아세트산생성에따른맛의변화가다소진행이된다하더라도다양한식중독원인세균들에대한항균능력으로젖산균이가지는기능성을가지는것으로사료된다. 3.5. 알코올농도별생존력확인분리세균 HK9 의알코올농도별생존력을확인하기위해, 6~14% 의알코올을포함하는 MRS 액체배지에 HK9 를배양한후, MRS 고체배지에평판도말하여집락수를계수하였다. 알코올의농도증가에따라형성된집락의수는점차감소하였으며, 14% 알코올이포함된배지에서는집락을관찰되지않았다. 막걸리에서분리한 Lactobacillus plantarum ST4 는 10% 이상의알코올농도에서는생존하지않는다는것이 Fig. 5. Survival tests of L. casei HK9 cells in the different concentrations of alcohol (%). Data shown represent the mean ± SD based on triplicate studies. 4. 결론 본연구는막걸리에서분리한젖산균인 Lactobacillus casei HK9 의다양한생리적특성과항균활성을조사하기위해실시하였다. 이균주를 MRS 배지에서분리하여, BIOLOG 시스템과 16S rrna 염기서열을이용한계통유전학적분석으로동정하여, Lactobacillus casei HK9 으로명명하고, GenBank 에 [JQ951606] 로등록하였다. 배양기간중생장률, 유기산생산 ( 예, 젖산과아세트산 ), ph 변화를조사하였다. 배양기간중에젖산과아세트산의생산량이증가하는것을확인하였고, 젖산과아세트산의최대농도는약 576 mm 과 199 mm 였으며, ph 는배양 72 시간경과후 7.00 에서 3.74 로변화하였다. 젖산과아세트산의생산은 HPLC 로확인하였다. 농축된 L. casei HK9 의배양상등액은식중독원인세균들 ( 예, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, methicillinresistant Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis) 에대하여현저한항균활성이있음을보여주었다. L. casei HK9 은 12% 알코올에도생장할수있는것으로확인되었다.
166 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 27: 161166 (2012) 감사 본연구는순천향대학교학술연구비의일부지원으로수행하였음. References 1. 온기운 (2011) 주류칼럼 2011 년경제전망과주류산업. 주류산업 31: 1421. 2. Chun, J. W, C. W Ma, and K. H. Oh. (2005) Physiological characterization of Lactobacillus sp. JK8 isolated from shrimp aquaculture pond. Kor. J. Microbiol. 41: 1823. 3. Ringo, E. and F. J. Gatosoupe (1998) Lactic acid bacteria in fish: a review. Aquaculture 160: 177203. 4. Balcázar, J. L., D. Vendrell, I. de Blas, I. RuizZarzuela, J. L. Múzquiz, O. Gironés (2008) Characterization of probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from intestinal microbiota of fish. Aquaculture, 278: 188191. 5. Song, Y. J., S. H. Park, J. Y. You, Y. S. Cho, and K. H. Oh (2009) Antibacterial activity against foodpoisoning causing bacteria and characterization of Lactobacillus plantarum YK9 isolated from kimchi. KSBB J. 24: 273278. 6. Baek, H., H. R. Ahn, Y. S. Cho, and K. H. Oh (2010) Antibacterial effects of Lactococcus lactis HK9 isolated from feces of a new born infant. Kor. J. Microbiol. 46: 127133. 7. Ahn, H. R., J. S. So, and K. H. Oh (2011) Characterization and antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from vaginas of women of childbearing age. Kor. J. Microbiol. 47: 308315. 8. Hirayama, K. and J. Rafter (2000) The role of probiotic bacteria in cancer prevention. Microbes Infect. 2: 681686. 9. Wollowski, I., G. Rechkemmer, and B. L. PoolZobel (2001) Protective role of probiotics and prebiotics in colon cancer. Am. J. Clin. Nutr. 73: 451455. 10. Herich, R. and M. levkut (2002) Lactic acid bacteria, probiotics and immune system. Vet. Med. 47: 169180. 11. Aly, S., A. T. Cheik, H. N. Imael, and S. T. Alfred (2004) Antimicrobial activities of lactic acid bacteria strains isolated from burkina faso fermentated milk. J. Nutri. 3: 174179. 12. Yang, B. G., J, G. Lee, and M. S. Heo (2003) Antibacterial activity of Lactobacillus sakei BK19 against fish pathogenic bacteria. Kor. J. Microbial. 39: 5661. 13. Jeong, J. W., P. W. Nam, S. J. Lee, and K. G. Lee (2011) Antioxidant activities of Korean rice wine concentrates. J. Agric. Food Chem. 59: 70397044. 14. Seo, M. Y., S. Y. Chung, W. K. Choi, S. H. Park, M. J. Seo, J. K. Park, J. W. Kim, and C. S. Park (2009) Antiaging effect of rice wine in cultured human fibroblasts and keratinocytes. J. Biosci. Bioeng. 107: 266271. 15. Verschuere, L., G. Rombaut, P. Sorgeloos, and W. Verstraete (2000) Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 655671. 16. Farzanfar, A. (2006) The use of probiotics in shrimp aquaculture. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 48: 149158. 17. Ma, C. W., Y. S. Cho, and K. H. Oh (2009) Removal of pathogenic bacteria and nitrogens by Lactobacillus spp. JK8 and JK11. Aquaculture 287: 266270. 18. Schillinger, U. and F. K. Lucke (1989) Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat. Appl. Environ. Microbiol. 55: 19011906. 19. Maragkoudakis, P. A., K. C. Mountzouris, D. Psyrras, S. Cremonesem, J. Fischer, M. D. Cantor, and E. Tsakalidou (2009) Functional properties of novel protective lactic acid bacteria and application in raw chicken meat against Listeria monocytogenes and Salmonella enteritidis. Int. J. Food Microbiol. 130: 219226. 20. Lee, S. G., K. W. Lee, T. H. Park, J. Y. Park, N. S. Han, and J. H. Kim (2012) Proteomic analysis of proteins increased or reduced by ethanol of Lactobacillus plantarum ST4 isolated from makgeolli, traditional korean rice wine. J. Microbiol. Biotechnol. 22: 516525.