43-4(08) fm

KOREAN J. FOOD SCI. TECHNOL. Vol. 43, 4, pp. 446~452 (2011) The Korean Society of Food Science and Technology 김치에서항균활성유산균의분리및동정 김수영 1 김종두 1 손지수 1 이시경 2 박갑주 3 박명수 * 안양과학대학호텔조리과, 1 건국대학교생명과학과, 2 건국대학교응용생명과학부, 3 건국대학교기초과학연구소 Biochemical and Molecular Identification of Antibacterial Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi Soo Young Kim 1, Jong Doo Kim 1, Ji Soo Son 1, Si Kyung Lee 2, Kab Joo Park 3, and Myeong Soo Park* Department of Hotel Culinary Arts, Anyang Science University 1 Department of Biological Sciences, Konkuk University 2 Department of Applied Biology and Chemistry, Konkuk University 3 Research Institute for Basic Sciences, Konkuk University Abstract Total 480 lactic acid-producing bacteria were isolated from five kinds of kimchi, and their antibacterial was tested against Salmonella enterica serovar Typhimurium, Bacillus subtilis, and Pseudomonas aeruginosa using an agar diffusion assay. Among them, 340 isolates showed a halo on MRS agar against one or more indicator strains, which were identified using multiplex, an API 50CHL kit, and a sequence analysis. As a result, 169 Lactobacillus plantarum, 20 Lactobacillus fermentum, two Lactobacillus paracasei ssp. paracasei, two Lactobacillus sp., and 15 Pediococcus sp. were identified. This may be the first report on the isolation of antibacterial Lactobacillus fermentum from kimchi. Keywords: antibacterial, kimchi, lactic acid bacteria, identification 서 유산균은자연계에광범위하게분포하며, 전통적으로다양한발효식품에이용되어왔고, 일반적으로안전하다고인식되는미생물 (GRAS, generally recognized as safe) 로서 (1), Bergey s Manual(2) 에서는그람양성구균과그람양성간균에서다루고있다. 유산균은 G+C 50 mol% 이하의그람양성, non-spore-forming 의구균, 간균, 혹은구간균이다. 많은유산균은프로바이오틱스 (probiotics) 로서소화흡수를돕고장내부패를억제하고, 설사변비의치료효과, 장내유해균의억제, 비타민의생성, 혈중콜레스테롤저하능, 항암효과, 인체의면역능력증강등다양한기능성이보고되고있다 (3). 한예로 Lactobacillus strain 의경우 immunoglobulin 의생산자극 (4), 대식세포에 interferon 유도 (5), 신체부분적산성화 (6), hypocholesteroleaemic 효과 (7), mutagenic 물질과의반응 (8), 항균물질인박테리오신의생성 (9), 그리고 Salmonella enterica serovar Typhimurium 과 Neisseria gonorrhaea 와같은병원성세균의흡착저해등의기능이밝혀진바있으며, 이와같이유산균의숙주에대하여이로운작용을하는 probiotics 로서의기능이밝혀져한때영양적측면에서가치없는식품으로오인받 *Corresponding author: Myeong Soo Park, Department of Hotel Culinary Arts, Anyang Science University, Anyang, Gyeonggi 430-749, Korea Tel: 82-31-441-1347 Fax : 82-31-441-1347 E-mail: mspark@ianyang.ac.kr Received April 7, 2011; revised June 1, 2011; accepted June 6, 2011 론 았던발효식품들은오늘날에이르러서는가장과학적인식품으로인정받고있다. 식품에서유산균은발효식품의맛과발효산물의특징을결정하고, 유기산및박테리오신등의항균활성물질을생성하여식품의저장성에기여한다. 박테리오신은다양한그람양성균에서생산되는항균활성단백질또는펩타이드이며, 유산균에서유래한박테리오신의경우식품산업에서천연보존제 (natural preservative) 로이용할수있는응용성과항생제를대체할수있는물질로서관심을끌고있다. Klaenhammer(9) 는유산균이생산하는박테리오신을분자및생리학적특성에따라다음과같이분류하였다. Class I bacteriocin(lantibiotics) 은 post-translational modification 결과 lanthionine 같은특이한아미노산을포함한다. Class II 는 lanthionine 을함유하지않는박테리오신으로분자량이작고 (<13 kda), 작은분자량으로인하여 3 차구조를형성하지않으므로비교적열에안정하며, 일반적으로 20 개정도의소수성아미노산으로이루어진 transmembrane helix 를가지는것을특징으로한다. Class III 는분자량이크고 (>30 kda) 열에불안정한항균활성단백질이다. Lactococcus lactis 가생산하는 nisin 의경우 Class I 에속하며비교적넓은 antimicrobial spectrum 을가지고대부분의그람양성균의증식을억제한다. Nisin 은열에안정하고낮은 ph 에서도활성을나타내며천연식품보존제로사용되고있다. 또한대부분의박테리오신의활성이약산성에서강하고염기성환경에서불안정한것으로알려져있어산을생성하는 Lactobacillus 속의배양액으로부터박테리오신의생산여부를알아보기위해광범위하게적용할수있는실험적방법의확립에어려움이있다 (10). 최근에는박테리오신은식품보존제로서뿐아니라유산균종의개량을위한발현벡터시스템의선발유전자로이용되기도한 446

김치에서항균활성유산균의분리및동정 447 다 (11). 본연구에서는항균활성이우수한유산균주를탐색하고이를식품용유전자발현시스템용마커로서개발하기위한기초연구로서, 김치로부터항균활성을나타내는유산균을분리 선발하고이들균주를생화학적 유전학적방법으로동정하였다. 재료및방법 배지및시약 Lactobacillus속미생물의분리를위하여 Lactobacillus selection media(lbs-media, Difco, St. Louis, MO, USA) 와 MRS media (Difco) 에 acetic acid(shinyo Pure Chemical Co., Ltd. Osaka, Japan) 를첨가하여사용하였고계대배양에는 MRS media(difco) 를사용하였다. 혐기배양을위하여 AnaeroGen TM gas pack(oxoid Inc., Cambridge, UK) 를사용하였다. 균주의보존을위하여균배양액에 glycerol(shinyo) 이 15%(v/v) 가되도록조성하여 70 o C Deep Freezer(Ilshin lab Inc., Seoul, Korea) 에보관하며사용하였다. 분리한균주의생화학적특성검사를위해서는 Gram stain sets(difco), hydrogen peroxide(sigma Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), oxidase reagent(biomérieux Inc., Marcy l'etoile, France), API 50CHL kit(biomérieux) 를사용하였다. 균주의분리전통적인방법으로일반가정집에서만든 5 종류의김치를수집하여 mixer 로균질화한후 180 ml 의 LBS 및 MRS 배지에 10%(w/v) 로접종한후 37 o C 에서 48 시간배양하여증균하였다. 증균액을 0.85% 멸균생리식염수를이용하여 10 6-10 7 까지희석한액 100 µl 를 0.1%(w/v) CaCO 3 를함유하는 MRS 고체배지에도말한후 AnaeroGen TM gas pack(oxoid Inc.) 을사용하여혐기적인조건에서 37 o C 로 3 일간배양한후산생성에의해투명환을형성한콜로니중 48 개씩을 MRS 고체배지에도말하여순수분리하였다. 분리한균주는 MRS 액체배지에서배양한후 15% glycerol 로조성하여 70 o C 에서보관하며동정과박테리오신활성시험에사용하였다. 본연구에사용된분리균주및표준균주는 Table 1 에표시하였다. 균주의염색및생화학적특성검사분리균주는 MRS 액체배지에서 37 o C 로 24 시간배양한후그람염색 (12) 을통하여그람양성균주를판별하고, 분리균주의크기와형태를광학현미경으로관찰하였다. 분리한균주의생화학적특성은 Cowan 과 Steel(13) 그리고 MacFaddin(14) 의방법에따라균주의특성을조사한후 Bergey s Manual of Systematic Bacteriology(2) 에준하여분류및동정하였다. Catalase test 는배양평판에 3% hydrogen peroxide(h 2 O 2 ) 를첨가한후 O 2 발생유무를관찰하였고, oxidase test 는콜로니를 비금속성막대를사용하여 filter paper 에묻힌후 Oxidase reagent(biomérieux) 를한방울떨어뜨려변색여부를관찰하였다. 항균활성검사항균활성검색을위하여 blank disc 를이용한 agar diffusion assay 를수행하였다. 24 well 배양접시에멸균된 MRS 액체배지를 2mL 씩분주하여분리균주를접균하고혐기조건에서 48-72 시간배양하였으며, 배양액 1.5 ml 를취하여멸균된 eppendorf tube 에옮긴후원심분리 (12,000 rpm, 4 o C, 5 분 ) 한후상층액 1mL 를조심스럽게취하여박테리오신조추출액으로하여 20 o C 에보관하고, 1 회해동하여냉장보관하며 agar diffusion assay 를수행하였다. 균배양액의상등액은 3 N NaOH 를사용하여 ph 6.5-7.0 으로조정한후상등액에 ammonium sulfate 를첨가하여 70% 가되도록하였다. 항균활성은멸균된 agar 배지를적당히식힌후예비실험을통해결정된희석비율을사용하여 indicator 균주배양액을최종 1 10 6 CFU/mL 이상, 1 10 7 CFU/mL 이하가되게접종한다음페트리디쉬에 10 ml 씩분주하여굳힌후건조를위하여 37 o C 에서 4 시간배양하였다. 건조된 indicator plate 에 blank disc 를떨어뜨린후 20 µl 의박테리오신조추출액을점적하고 37 o C 에서 12 시간배양후투명환의형성여부를판단하여항균활성을갖는균주를선발하였다. 균주의동정최초분리한 480균주의신속한동정을위하여 (15) 을수행하였다. 주형으로사용할 genomic DNA는 Puregene TM DNA Isolation kit(gentra Systems, Minneapolis, MN, USA) 을사용하여준비하였다. 분리균주의그룹을나누기위한 multiplex -G에서는 10X reaction buffer(with MgCl 2 ) 2.5 µl, 1µL의 dntps(2.5mm each), 10 pmol/µl로희석한 primer Ldel-7, LU-5, LU-3', LU-1', 를 1µL씩을넣고, 최종 25 µl의반응용액에 0.25U의 HanTaq XL polymerase(genenmed Inc., Seoul, Korea) 를포함하게조성하였으며, PTC-100 Peltier Thermal Cycler(MJ Research Inc. Waltham, MA, USA) 를사용하여 반응을수행하였다. 은 95 o C에서 5분간반응후에 95 o C에서 20초, 55 o C에서 2분의반응을총 35회수행한후 72 o C에서 5 분간최종신장하였다. -G의결과에따라 multiplex 를수행하였다. -IV는 primer로 Lsal-1, Lreu- 1, Lpla-3, Lfer-3, Lsal-2, Lreu-4, Lpla-2, Lfer-4를 10 pmol로희석하여각 1µL씩을사용하였으며, 나머지성분은 multiplex - G와동일하게조성한후 95 o C에서 5분간반응한후에 95 o C에서 20초, 58 o C에서 2분의반응을총 35회수행한후 72 o C에서 5분간최종신장한후 2% 아가로즈겔전기영동으로확인하였다. -G와 multiplex -IV에의한증폭산물을형성하지않은균주중간균 9종을선별하여 API 50CHL kit을사용하여당분해능, arginine과 esculin 분해능을배지의색변화로관 Table 1. Bacterial strains used in this study. s Relevant characteristics Source or reference Isolates L101-L548 240 Isolates from 5 kinds of kimchi by LBS enrichment This study Isolates M101-M548 240 Isolates from 5 kinds of kimchi by MRS enrichment This study B. subtilis KCTC 3716 Indicator strain for antibacterial KCTC 1) P. aeruginosa KCTC 2651 Indicator strain for antibacterial KCTC S. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 and ATCC 12023 Indicator strain for antibacterial ATCC 2) 1) KCTC: Korean Collection for Type Culture 2) ATCC: American Type Culture Collection

448 한국식품과학회지제 43 권제 4 호 (2011) Table 2. primers used in this study Target Primers Nucleotide sequences (5' 3') Usage Group I Group II Group III Group IV Lb. salivarius Lb. reuteri Lb. plantarum Lb. fermentum Ldel-7 LU-5 LU-1' LU-3' Lsal-1 Lsal-2 Lreu-1 Lreu-4 Lpla-3 Lpla-2 Lfer-3 Lfer-4 27F 920R 350F 920R 27F 1492R 350F 1492R ACAGATGGATGGAGAGCAGA CTAGCGGGTGCGACTTTGTT ATTGTAGAGCGACCGAGAAG AAACCGAGAACACCGCGTT AATCGCTAAACTCATAACCT CACTCTCTTTGGCTAATCTT CAGACAATCTTTGATTGTTTAG GCTTGTTGGTTTGGGCTCTTC ATTCATAGTCTAGTTGGAGGT CCTGAACTGAGAGAATTTGA ACTAACTTGACTGATCTACGA TTCACTGCTCAAGTAATCATC AGAGTTTGATCCTGGCTCAG GTCAATTCCTTTGAGTTT TACGGGAGGCAGCAG GTCAATTCCTTTGAGTTT AGAGTTTGATCCTGGCTCAG GGTTACCTTGTTACGACTT TACGGGAGGCAGCAG GGTTACCTTGTTACGACTT Amplicon size (bp) Reference -G 450 15 -G 300 15 -G 400 15 -G 350 15 -IV 411 15 -IV 303 15 -IV 248 15 -IV 192 15 Identification 893 16 Identification 570 16 Identification 1465 16 Identification 1142 16 찰하여 apiweb program(http://apiweb.biomerieux.com, Biomerieux) 을이용하여동정하였다. -G 와 multiplex -IV 에의한증폭산물을형성하지않은균주중구균 18 종을선별하여 서열을분석하여동정하였다. 염기서열결정용으로 27F, 350F, 920R, 1492R primer 를사용하였으며, 각각의결과를보정하여 BLASTN progarm(http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) 을사용하여해당균주를동정하였다. 에사용된 primer 는 Table 2 에표시하였다. 결과및고찰 김치유산균분리및항균활성균주선발 5 종류의김치로부터산생성, 그람양성, catalase 음성, oxidase 음성을기준으로 480 종의균주를분리한후재료및방법에의하여이들중 426 균주에대한박테리오신조추출액을제조하여항균활성실험에사용하였다. S. enterica serovar Typhimurium, P. aeruginosa, B. subtilis 을항균활성에대한지표균주로사용하여시험한결과 340 균주가한가지이상의균주에대하여항균활성을나타내었다. 이중 S. enterica serovar Typhimurium 균주에대해서만항균활성을갖는것은 L420 이었으며, P. aeruginosa 에대해서만항균활성을갖는것이 35 균주, B. subtilis 에대해서만항균활성을나타내는균주가 71 균주이었으며, S. enterica serovar Typhimurium 과 P. aeruginosa 에대하여항균활성을나타낸것은 3 균주, P. aeruginosa 와 B. subtilis 두균주에대한항균활성을나 타내는것은 165 균주, S. enterica serovar Typhimurium 과 B. subtilis 에대해서항균활성을나타낸것은 6 균주이고, 59 균주가 S. enterica serovar Typhimurium, P. aeruginosa, B. subtilis 세균주모두에대하여항균활성을나타내었다 (Table 3). 을이용한균주의동정 Song 등 (15) 의 Lactobacillus 속의신속한동정법을이용하여 1 차선발한 340 균주에대하여 multiplex-g 을수행한결과 204 균주에서 group IV(Lb. salivarius ssp. salivarius, Lb. salivarius ssp. salicinius, Lb. reuteri, Lb. fermentum, Lb. plantarum) 에해당하는 증폭산물 (350bp) 을형성하였으며, 이들에대하여 multiplex- 을수행하여 162 균주를 Lb. plantarum, 20 균주를 Lb. fermentum 으로확인하였다 (Table 3). API 50CHL Kit을이용한균주의동정 -G와 multiplex -IV에의한증폭산물을형성하지않은균주중간균 9종 (L328, L331, L521, L538, L543, M305, M307, M311, M317) 에대하여 API 50CHL Kit을이용한실험결과를웹프로그램 (http://apiweb.biomerieux.com/) 을이용하여, 표준균종에대한상대적근접성을나타내는 %ID, 각균종에대하여전형적인생화학특성에대한근접성을나타내는 T-index 를이용하여동정결과 L328(%ID=99.9%, T-index 0.58), L331 (99.9%, 0.69), L521(99.9%, 0.59), L538(99.9%, 0.35), L543 (99.9%, 0.44), M305(94.3%, 0.25), M317(99.7%, 0.38) 를나타내어각각 Lb. plantarum으로동정하였다. M307균주는 %ID의합

김치에서항균활성유산균의분리및동정 449 Table 3. Biochemical and bactericidal characteristics of isolates from kimchi and identification of several strains by, 16S rdna sequencing and multiplex G IV Sa 1) Ps 2) Ba 3) G Sa Ps Ba L101 - P. acidilactici - 4) ND 5) 0 10 0 M327 - - IV P 0 12 12 L147 - P. acidilactici - ND 0 10 0 M328 - - IV P 0 11.5 12 L204 - - IV P 6) 0 11 0 M329 - - IV P 0 11.5 12 L210 - P. pentosaceus - ND 0 11 0 M330 - - IV P 0 11 12 L246 - Lb. plantarum - ND X 8) 11 0 M331 - - IV P 0 12 13 L301 - - IV F 7) 0 8 0 M332 - - IV P 0 12 12 L302 - - IV F 0 9 0 M334 - - IV P 0 11 9 L315 - - IV F 0 10 0 M340 - - IV P 0 12 12 M311 Lb. paracasei or plantarum - IV ND 0 10 0 M341 - - IV P 0 11 11 M312 - - IV P 0 11 0 M342 - - IV P 0 11.5 11 L409 - - IV P 0 8.5 0 M343 - - IV P 0 12.5 12 L416 - - IV P 0 9 0 M345 - - IV P 0 11.5 12 L421 - - IV P 0 8 0 M46 - - IV P 0 11 12 L422 - - IV P 0 11 0 L410 - - IV P 0 8.5 7 L432 - - IV P 0 8 0 L423 - - IV P 0 9 9 L443 - - IV P 0 9 0 L425 - - IV P 0 9 8 L444 - - IV P 0 10 0 L426 - - IV P 0 9 8 L445 - - IV P 0 10 0 L436 - - IV P 0 9 8 L446 - - IV P 0 11 0 L438 - - IV P 0 11 11 L447 - - IV P 0 9 X L442 - - IV P 0 9 8 M401 - - IV P 0 9 0 M441 - - IV P 0 10.5 9 M421 - - IV P 0 8 0 M443 - - IV P 0 12 11 M440 - - IV P 0 11 0 M444 - - IV P 0 10 9 L515 - - IV F 0 9.5 0 M446 - - IV P 0 11 11 L546 - - IV F 0 7 0 M447 - - IV P 0 11 11 L547 - - IV F 0 9 0 L506 - - IV P 0 12 12 M532 - - IV F 0 7 0 L507 - - IV P 0 11.5 12 M533 - - IV F 0 8 0 L516 - - IV F 0 8 7 M540 - - IV F 0 7 0 L520 - - IV P 0 12 11 L145 - P. acidilactici - ND 0 0 10 L521 Lb. plantarum - - ND 0 12 11 M120 - P. pentosaceus - ND 0 0 12 L522 - - IV P 0 11 11 L319 - - IV F 0 0 9 L523 - - IV P 0 7 11 L329 - - IV P 0 X 12 L524 - - IV P 0 10 12 L348 - - IV P 0 0 11 L533 - - IV P 0 13 11 L402 - - IV P 0 0 8 L539 - - IV P 0 12 12 L404 - - IV P 0 0 7 L540 - - IV P 0 12 10 L412 - - IV P 0 0 10 L528 - Lb. plantarum - P 0 11 12 L413 - - IV P 0 0 8 L542 - - IV P 0 13 12 L418 - - IV P 0 0 11 L543 Lb. plantarum - - P 0 12 12 L420 - - IV P 9 0 0 L545 - - - P 0 12 11 L430 - - IV P 0 0 8 L548 - - IV P 0 12.5 11 M448 - - IV P 0 0 9 M109 - P. pentosaceus - ND 8 0 11 L505 - - IV F 0 0 8 M111 - P. acidilactici - ND 7 0 12 L525 - - IV F 0 0 8 L307 - - IV P 8 X 9 L527 - - IV F 0 0 8 L411 - - IV P 9 0 10 M505 - - IV F 0 0 8 M417 - - IV P 11 0 9 M529 - - IV F 0 0 8 M428 - - IV P 10 0 10 M530 - - IV F 0 0 7 L202 - - IV P 8 13 12 M536 - - IV F 0 0 7 L203 - - IV P 8 12.5 11 M545 - - IV F 0 0 7 L224 - - IV P 8 13 11 M546 - - IV F 0 0 7 L313 - - IV P 8 10 12 L245 - P. pentosaceus - ND 8 11 0 L314 - - IV P 9 10 9 L415 - - IV P 10 9 0 L321 - - IV P 8 12 12

450 한국식품과학회지제 43 권제 4 호 (2011) Table 3. Contined G Sa 1) Ps 2) Ba 3) G IV Sa Ps Ba M432 - - IV P 11 11 0 L322 - - IV P 9 13 12 L115 - P. acidilactici - ND 0 9 11 L328 Lb. plantarum - IV - 10 11 13 L146 - P. acidilactici - ND 0 10 10 L330 - - IV P 8 10 12 L206 - - IV P 0 13 13 L331 Lb. plantarum - IV - 10 11 12 L209 - - IV P 0 11 8 L332 - - IV P 9 10 12 L211 - - IV P 0 12 11 M301 - - IV P 8 10 9 L213 - - IV P 0 10 11 M302 - - IV P 8 8 10 L214 - - IV P 0 10 12 M336 - - IV P 10 12 11 L216 - - IV P 0 9 9 M337 - P. pentosaceus - ND 9 11 11 L222 - - IV P 0 11 11 M338 - - IV P 9 12 12 L238 - P. pentosaceus - ND 0 14 10 M339 - - IV P 9 12.5 13 M223 - P. acidilactici - ND 0 13 8 L414 - - IV P 9 9 8 L303 - - IV P 0 12 13 L424 - - IV P 9 9 10 L304 - - IV P 0 12 12 L448 - - IV P 11 11 9 L305 - - IV P 0 13 12 M403 - - IV P 9 10.5 8 L306 - - IV P 0 13 11 M404 - - IV P 9 11 11 L308 - - IV P 0 11 9 M408 - - IV P 11 11 9 L310 - - IV P 0 12.5 11 M409 - - IV P 11 11 13 L316 - - IV P 0 11 9 M412 - - IV P 9 11 8 L317 - - IV P 0 10 11 M413 - - IV P 9 12 8 L318 - - IV P 0 9 9 M414 - - IV P 10 11 8 L311 - - IV P 0 11 8 M415 - - IV P 12 11 11 L323 - - IV P 0 11 8 M416 - - IV P 9 11 13 L324 - - IV P 0 10 8 M418 - - IV P 9 9 12 L325 - - IV P 0 9 12 M425 - - IV P 9 10.5 7 L326 - - IV P 0 9.5 12 M426 - - IV P 10 11 11 L333 - - IV P 0 12 11 M427 - - IV P 10 11.5 12 L335 - - IV P 0 10.5 11 M429 - - IV P 12 12 12 L336 - - IV P 0 11 13 M430 - - IV P 12 12 8 L337 - - IV P 0 11 13 M431 - - IV P 12 12 8 L338 - - IV P 0 12 13 M434 - - IV P 11 13 12 L340 - - IV P 0 12 11 M435 - - IV P 11 12 12 L341 - - IV P 0 9 12 M436 - - IV P 10 11 12 L342 - - IV P 0 10 11 M437 - P. pentosaceus IV - 11 9 10 L343 - - IV P 0 12 12 M438 - - IV P 12 11 11 L344 - - IV P 0 12 12 L502 - Lb. plantarum IV P 10 10 12 L345 - - IV P 0 10 12 L504 - - IV P 11 10.5 12 L346 - - IV P 0 8 12 L508 - - IV P 10 11.5 11 L347 - - IV P 0 9 13 L509 - - IV P 11 12 13 M303 - - IV P 0 10 10 L510 - - IV P 9 12 12 M304 - - IV P 0 10 11 L512 - - IV P 12 11 11 M305 Lb. plantarum - IV - 0 12 12 L514 - - IV P 10 13 11 M307 Lb. paracasei or plantarum - IV - 0 12 12 L526 - - IV P 11 11.5 12 M309 - - IV P 0 12 12 L529 - - IV P 12 11 11 M310 - - IV P 0 11 11 L530 - - IV P 9 11 11 M313 - - IV P 0 12 12 L531 - - IV P 10 12 11 M314 - - IV P 0 13 12 L534 - - IV P 9 13 12 M317 Lb. plantarum - IV - 0 8 11 L535 - - IV P 9 13 12 M320 - - IV P 0 11 11 L536 - - IV P 10 12.5 12 M323 - - IV P 0 11 12 L537 - - IV P 10 12 12 M325 - - IV P 0 12.5 12 L538 Lb. plantarum - - P 10 12 12 M326 - - IV P 0 12 11 L541 - - - P 9 13 11 1) Salmonella enterica serovar Thyphimurium, 2) Pseudomonas aureuginosa, 3) Bacillus subtilis, 4) No detectable multiplex -G product, 5) No detectable multiplex -IV product, 6) Lactobacillus plantarum, 7) Lb. fermentum, 8) Not tested.

김치에서항균활성유산균의분리및동정 451 86.1%, T index 평균 0.25 를보여 Lactobacillus 속으로동정하였다. M311 균주는 Lb. paracasei ssp. paracasei 에대하여 %ID= 71.9%, T index 평균 0.16 를보였다. sequencing을이용한균주의동정 에서증폭산물을형성하지않은구균혹은구간균 17종을선택하여 를 27F, 1492R primer를사용하여 로증폭한후 27F, 350F, 920R, 1492R primer를사용하여염기서열중일부를결정하였다. 이들 primer 중특히 1492R primer가가장좋은결과를보였으며 920R primer를사용한경우대부분의균주가반응을나타내지않았는데, 이는 920R primer의부착부위인 의보존서열에 primer 부착이저해될정도의변이가있을가능성을나타낸다. 이렇게얻어진부분적인 염기서열을 BLASTN program으로데이터베이스와비교한결과 L210, L238, L245, M109, M120, M337, M437의 7균주가 P. pentosaceus와 99% 이상의상동성을나타냈으며, L101, L115, L145, L146, L147, M111, M223은 P. acidilactici와 99% 이상의상동성을나타냈고, L246, L502와 L528은 Lb. plantarum 과 99% 이상의상동성을보였다. 김치에는 30종이상의유산균종이보고되고있다. 그중에서 Lb. plantarum, Lb. brevis, Ent. faecalis, Leu. mesenteroides, P. pentosaseus 등이우점종으로알려지고있다. 기존의연구를통하여김치에서박테리오신을생산하는 Ent. faecium, P. pentosaseus, P. acidilactici, Leu. mesenteroides, Leu, paramesenteroides, Lc. lactis, Lb. brevis 등에대해보고가된바있다 (17). 그러나 Lb. fermentum에서박테리오신에대한연구는매우미비한편이다. Yan과 Lee(18) 는 Lb. fementum에서항균활성범위가매우좁은박테리오신을부분정제하고 fermenticin B로명명하였다. 또한 Wells 등 (19) 은소의위에서 Streptococcus bovis에대한항균활성을가지는 Lb. fermentum을분리하여보고하였다. Fazeli 등 (20) 은이란의전통빵의제조에사용되는 sourdough에서곰팡이의성장을억제하여유통기한을연장할수있는 Lb. fermentum을분리하여보고하였다. 최근의연구에의하면 Lb. fermentum은구강에서충치균을억제하는것으로나타났으며 (21), 훈제연어에서분리된 Lb. fermentum의경우 Listeria monocytogenes에대한항균활성과함께장상피세포에대한우수한부착능을보였다 (22). 본연구에서분리된 Lb. fermentum 균주들은 P. aeruginosa 혹은 B. subtilis에만활성을나타내었다 (Table 3). Lb. fermentum의경우, Lb. acidophilus와함께인체장내에서 probiotics로서의활성이보고되고있어 (23) 본연구를통해분리한균주들의효율적인활용을위해서는보다광범위한균주에대한활성검사와이들이생산하는박테리오신의특성규명에대한추가적인연구가진행되어야할것이다. 요 항균활성을나타내는야생형유산균을분리 동정하기위하여김치에서 480 종의유산균을분리하였으며, S. enterica serovar Typhimurium, P. aeruginosa, B. subtilis 에대한항균활성을 agar diffusion 법을사용하여검사하였다. 이들중항균활성을나타내는균주 340 종에대하여 multiplex 과 API 50CHL Kit 을이용한생화학적특성검사및 sequencing 을통해 Lb. plantarum 169 균주, Lb. fermentum 20 균주, Lb. paracasei spp. paracasei 2 균주, Lactobacillus 속 2 균주와 Pediococcus 속 15 균주를동정하였다. 이들균주중 Lb. fermentum 의경우는프로바이 약 오틱스로서의활성이보고되고있는균으로추가적인연구가필요하다고사료된다. 감사의글 이논문은 2010 년도건국대학교학술진흥연구비및농촌진흥청차세대바이오그린 21 사업 ( 과제번호 :PJ008005) 지원에의한논문임 문 1. Sandine WE, Muralidhara KS, Elliker PR, England DC. Lactic acid bacteria in food and health: A review with special reference to enteropathogenic Escherichia coli as well as certain enteric diseases and their treatment with antibiotics and lactobacilli. J. Milk Food Technol. 35: 691-702 (1972) 2. Sneath PHA, Mair NS, Sharpe ME, Holt JG. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol. 2, Williams and Wilkins, Baltimore, MD, USA. pp. 1209-1234 (1986) 3. Gilliland SE. Health and nutritional benefits from lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 7: 175-188 (1990) 4. Isolauri E, Joensuu J, Suomalainen H, Luomala M, Vesikari T. Improved immunogenicity of oral D x RRV reassortant rotavirus vaccine by Lactabacillus casei GG. Vaccine 13: 310-312 (1995) 5. Kitazawa H, Matsumura K, Itoh T, Yamaguch T. Interferon induction in murine peritoneal macrophage by stimulation with Lactobacillas acidophilus. Microbiol. Immunol. 36: 311-315 (1992) 6. Zheng HY, Alcorn TM, Cohen MS. Effects of H 2 O 2 -producing lactobacilli on Neisseria gonorrhoeae growth and catalase. J. Infect. Dis. 170: 1209-1215 (1994) 7. Fernandes CF, Shahani KM, Amer MA. Therapeutic role of dietary lactobacilli and lactobacillic fermented dairy products. FEMS Microbiol. Lett. 46: 343-356 (1987) 8. Orrhage K, Sillerstrm E, Gustafsson JA, Nord CE, Rafter J. Binding of mutagenic heterocyclic amines by intestinal and lactic acid bacteria. Mutat. Res. 311: 239-248 (1994) 9. Klaenhammer TR. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 12: 39-85 (1993) 10. Kim SH. Screening and characterization of bacteriocin from Lactococcus sp. HY449. Korean J. Dairy Sci. Technol. 12: 1-10 (1995) 11. Mierau I, Kleerebezem M. 10 years of the nisin-controlled gene expression system (NICE) in Lactococcus lactis. Appl. Microbiol. Biot. 68: 705-717 (2005) 12. Gerhardt P, Murray RGE, Wood WA, Krieg NR. Methods for general and molecular bacteriology, American Society for Microbiology, Washington DC, USA. pp. 31-32 (1994) 13. Cowan ST, Steel KJ. Manual for the identification of medical bacteria. 2 nd ed. Cambridge University Press, Cambridge, UK. pp. 147-161 (1974) 14. MacFaddin JF. Biochemical tests for identification of medical bacteria. 2 nd ed. Williams and Wilkins. Baltimore, MD, USA. pp. 345-370 (1980) 15. Song Y, Kato N, Liu C, Matsumaya Y, Kato H, Watanabe K. Rapid identification of 11 human intestinal Lactobacillus species by multiple assays using group-and species-specific primers derived from 16S-23S rrna intergenic spacer region and its flanking 23S rrna. FEMS Microbiol. Lett. 187: 167-173 (2000) 16. Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ. 16S ribosomal DNA amplication for phylogenetic study. J. Bacteriol. 173: 697-703 (1991) 17. Kwon DY, Koo MS, Ryoo CR, Kang CH, Min KH, Kim WJ. Bacteriocin produced by Pediococcus sp. in kimchi and its characteristics. J. Microbiol. Biotechn. 12: 96-105 (2002) 18. Yan TR, Lee CS. Characterization of a partially purified bacteriocin, Fermenticin B, from Lactobacillus fermentum. Biotechnol. Lett. 19: 741-744 (1997) 19. Wells JE. Krause DO, Callaway TR, Russell JB. A bacteriocinmediated antagonism by ruminal lactobacilli against Streptococcus 헌

452 한국식품과학회지제 43 권제 4 호 (2011) bovis. FEMS Microbiol. Ecol. 22: 237-243 (1997) 20. Fazeli MR, Shahveri AR, Sedaghat B, Jamalifar H, Samadi N. Sourdough-isolated Lactobacillus fermentum as a potent antimould preservative of a traditional Iranian bread. Eur. Food Res. Technol. 218: 554-556 (2004) 21. Botina SG, Chervinets IuV, Klimina KM, Koroban NV, Chervinets VM, Gavrilova OA, Lebedev DV, Mironov AIu. Genetic identification of antagonistically active lactobacillus strains isolated from the oral cavity of healthy individuals. Klin. Lab. Diagn. 11: 43-46 (2010) 22. Todorov SD, Furtado DN, Saad SM, Tome E, Franco BD. Potential beneficial properties of bacteriocin-producing lactic acid bacteria isolated from smoked salmon. J. Appl. Microbiol. 110: 971-986 (2011) 23. Pascual LM, Daniele MB, Giordano W, Pájaro MC, Barberis IL. Purification and partial characterization of novel bacteriocin L23 produced by Lactobacillus fermentum L23. Curr. Microbiol. 56: 397-402 (2008)