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발간등록번호 11-1543000-000770-01

제출문 농림축산식품부장관귀하 이보고서를 전통발효식품 ( 무발효제 ) 의품질개선을위한미생물첨가제개발및보급시스템 구축 과제의보고서로제출합니다. 2015 년 01 월 26 일 주관연구기관명 : 세계김치연구소 주관연구책임자 : 김태운 세부연구책임자 : 박해웅 협동연구기관명 : 경기대학교 협동연구책임자 : 이종훈 연 구 원 : 이종희 연 구 원 : 최학종 연 구 원 : 장자영 연 구 원 : 김현주 연 구 원 : 오영준 연 구 원 : 박선영 연 구 원 : 김유진 연 구 원 : 박성희 연 구 원 : 김재환 연 구 원 : 이상일 연 구 원 : 강미란 연 구 원 : 곽현정 연 구 원 : 김경희 연 구 원 : 신홍철 연 구 원 : 이만복 연 구 원 : 윤형석 연 구 원 : 윤다혜 연 구 원 : 김혜림 연 구 원 : 정광식 연 구 원 : 한설화 - 1 -

요약문 Ⅰ. 제목 전통발효식품의개선을위한미생물첨가제개발및보급시스템구축 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 다양한자연미생물에의하여제조되는김치의발효속도조절및위생학적안전성향상을위하여품목별특성에맞는맞춤형미생물첨가제를개발하고미생물첨가제를효율적으로중소규모전통발효식품제조업체에공급하기위한맞춤형미생물첨가제의보급시스템구축하고자함 발효속도조절용미생물첨가제 - 김치 : 품질유지기한 2배연장 ( 현행 30일 60일로 2배연장, 냉장조건 ) - 고염젓갈 : 숙성기간 2배단축 (1년 6개월로 2배단축 ) 저염화제품의위생학적안전성향상을위한미생물첨가제 - 저염김치 : 일반김치대비대장균군 50% 이상저감화 - 저염양념젓갈 : 기존제품대비위생지표미생물및식중독균 50% 이상저감화 미생물첨가제보급시스템구축 - 중소규모전통발효식품제조업체를지원하기위한맞춤형미생물 (artificial microflora) 첨가제의보급시스템기반구축 Ⅲ. 연구개발내용및범위 전통발효식품 ( 무발효제 ) 품질개선을위한우수미생물자원확보 - 김치, 젓갈류로부터발효속도조절및위생지표미생물제어우수미생물확보 - 발효단계별미생물군집분석을통한발효기작규명및품질특성변화분석 전통발효식품제조용맞춤형복합미생물첨가제개발 - 미생물첨가제제조및우수미생물조합에의한최적배합비확립 개발미생물첨가제를이용한발효속도조절기술개발 - 미생물첨가제를이용한김치의품질유지기한연장 - 미생물첨가제를이용한고염젓갈속성발효기술개발 개발미생물첨가제를이용한위생학적안전성향상기술개발 - 미생물첨가제를이용한저염김치의대장균군제어기술개발 - 미생물첨가제를이용한저염양념젓갈의위생지표미생물및식중독균제어기술개발 - 2 -

개발미생물첨가제를이용한전통발효식품의최적발효공정개발 - 계절별원 부재료미생물분포조사및초기균수저감화기술개발 - 미생물첨가제제형별활성화기술및첨가량, 첨가방법개발 우수미생물및미생물첨가제의효율적관리및보급시스템구축 - 관련미생물의수집, 보존및관리시스템구축 - 미생물첨가제제제화기술및포장기술개발 - 맞춤형미생물첨가제제조를위한기본매뉴얼제작 - 관련미생물첨가제의보급시스템개발및구축 - 미생물첨가제사용관리지침 ( 안 ) 및미생물첨가제품질인증제도마련 ( 제품효능검증 ) Ⅳ. 연구개발결과 1. 김치의품질개선을위한우수미생물자원확보 발효후기단계의김치에서분리한균주중배양액의 ph가낮은균주들인 Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus sakei을김치산패지시균으로선정하였음 이들균주에대한생육억제능이우수한 Lactococcus. lactis WK11, Lactobacillus brevis WK12를항균활성우수균주로선발하였음 2. 김치용미생물첨가제개발 Lc. lactis를 MRS broth에배양한후원심분리하여균체를농축하고균액과동량의 2% alginate를첨가하여최종적으로 1% alginate 용액을제조하였음. 이러한유산균과 alginate 1% 혼합용액을 2.0 mm의비드로코팅하여 10% 콩가루수용액과함께 48시간동안동결건조하여미생물첨가제를제조하였음 3. 미생물첨가제를이용한김치발효속도조절기술개발 Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액을첨가하여처리한김치군은대조군에비해적숙기가 2배이상연장되었음 Bead 형태로제조한미생물첨가제도생균을배양하여첨가했을때와유사한효과를나타내어 Lc. lactis를제제화하여이를김치에적용하여도대조군과비교하여품질유지기한이연장된김치를제조할수있을것으로사료되었음 양념을 65 에서 30분열처리하거나젖산을첨가시또는병행할경우, 연장효과가조금향상되었음 4. 저염김치의위생학적안전성향상기술개발 종균첨가김치의대장균군균수변화를살펴본결과담금당일에는대조군과유사한균수를나타내었지만김치발효가진행됨에따라종균을첨가한실험군에서대조군보다그감속속도가빠른것으로나타났음 - 3 -

5. 개발미생물첨가제를이용한전통발효식품의최적발효공정개발 시판용소독수 ( 차아염소산나트륨액 100ppm) 와저온살균처리후원부재료의미생물균수변화를살펴본결과소독수의경우 2분이상처리시저감효과가있었으며 5분처리시초기균수가더욱저감되었음. 양념의경우 65 에서 30분간처리시저감효과가있는것으로나타났음 초기종균접종량을 Lc. lactis 1 10 3 CFU/g, 1 10 5 CFU/g, 1 10 7 CFU/g으로각각달리하여접종한결과 1 10 7 CFU/g으로접종한김치에서품질유지기한연장효과가있었음. 또한종균첨가시기에따른차이를알아본결과추가적인숙성과정없이김치를담글때양념에종균과함께배양액을잘섞어김치를제조하는것이효율적이었음 6. 젓갈발효의우점종도출 멸치젓갈의우점종 : 멸치젓갈로부터분리한 315 균주의동정결과, Virgibacillus halodenitrificans를포함하는내염성 Bacillus 근연종이우점하는것으로확인 새우젓갈의우점종 : 새우젓갈로부터분리한 295 균주의동정결과, Staphyococcus equorum을포함하는 coagulase-negative staphylococci가우점하는것으로확인 오징어젓갈의우점종 : 오징어젓갈로부터분리한 121 균주의동정결과, 내염성 Bacillus 속이가장우점하고, coagulase-negative staphylococci가우점하는것으로밝혀짐 7. 식중독균 ( 황색포도당구균, 장염비브리오균 ) 생육저해활성보유오징어젓갈용종균확보 6% NaCl 농도에서황색포도당구균및장염비브리오균의생육저해가가능한오징어젓갈발효용종균후보 6균주확보 : Bacillus pumilus ANR7, Bacillus pumilus RM010, Bacillus siamensis RM502, Bacillus tequilensis AM5R3, Bacillus tequilensis MA504, Bacillus tequilensis MS503 8. 안전한젓갈발효용종균도출 본연구에서우점종으로도출된 Staphylococcus equorum 균주들의안전성평가수행 - 본연구에서확보한 185 S. equorum 균주중, ampicillin 내성을나타낸균주를제외한 126 균주를대상으로항생물질내성평가, 혈청분해 (hemolysis) 확인, 혈청분해관련유전자존재확인, biofilm 형성확인, enterotoxin 생성유전자존재확인 - 39 S. equorum 균주가위해성이없는것으로평가됨 안전성이검증된 S. equorum 39 균주들을대상으로한기능성평가 : biogenic amines 생성평가, protease, lipase, nitrate reductase 활성평가 안전성과기능성이확보된젓갈발효용종균후보 S. equorum 5 균주확보 (C4X11, C6037, KS1035, KS1039. KS2036) - 4 -

선발된균주들은 20% 이상의 NaCl 이첨가된배지에서생장이가능하여젓갈용종균으로서 의안전성과기능성을모두확보한것으로평가됨 9. 젓갈발효용종균의첨가법개발 새우를이용한종균첨가용배지를개발하고그효용성을확인 동결건조에의한종균의사멸률및회복률을확인하여종균보급법으로써의적용성확인 10. 젓갈용미생물첨가제의효과분석 135일간의새우젓갈숙성과정중의 bacteria 군집천이분석을통하여종균후보균주 S. equorum이숙성과정중에서의우점화를규명하였기에젓갈용종균으로의유효성을검증함 확보한종균후보균주들이 25% NaCl이첨가된액체배지에서사멸하지않고증식함을확인하여젓갈발효용종균으로써의효용성규명 젓갈유래 bacteria 분석용최적배지도출 : 기존의연구에서사용된실험실용배지대비 marine agar의유용성규명 11. 식품첨가용미생물의안전성평가법의확립 유산균과같은식품용미생물은최근까지안전성에대한의문없이기능성에근거하여식품용으로사용되었으나, 최근에식품용미생물에대한위해성이제기되면서안전성평가의필요성이증가하고있음 본연구과제에서의 S. equorum 균주의안전성및기능성평가결과, 이들균주의안전성및기능성관련특성이균주특이적으로나타남을확인하였기에식품용미생물에대한안전성평가의필요성이확인되었음. 본연구에서확립된안전성평가기준은향후식품용미생물의안전성평가에필요한기초자료로활용될수있음 12. 미생물첨가제제제화를위한배지조성개발 절임배추착즙액을기본배지성분으로활용하여탄소원, 질소원, 미량성분을조절 Box-Behnken experimental design을통하여질소원들을스크리닝하여반응표면실험법을실시함 미량성분들의결핍이유산균의성장에미치는정도를측정하여필수성분을선발 질소원으로는 peptone 4%(w/v) 첨가를최적배합으로결정함 - 5 -

13. 미생물첨가제의제제기술개발 김치미생물생존율이보장된단기형 ( 액상형, 냉동형 ) 및장기형 ( 건조형 ) 제제기술개발 미생물첨가제제형별저장기간에따른생존율검정 14. 미생물활성및생존율향상을위한보호제선정 식품첨가등급의소재를사용하여첨가제의생존율을높일수있는동결보호제선발함 Weissella cibaria SW1-1, Lactobacillus plantarum A-1, Lb. sakei 2-12 24, Leuconostoc citreum 3526 균주를 soy powder를사용한처리구에서생존율을조사한결과 90% 이상의생존율나타내어본연구의동결보호제로선정함 동결보호제로 10% soy powder를사용시, Lb. brevis A101 균주의경우 92.7% Lc. lactis CHJ10 균주의경우 94.7% 의높은생존율을나타냄 15. 미생물첨가제대량배양기술개발 식품첨가등급의주요영양원탐색 _ 실험균주의균체량생성에유리한주요영양원으로포도당및효모추출물선정 _MRS 배지대비경제성확보 배양중산도와미생물생육특성에관한상관관계구명 16. 모의유통조건을통한미생물첨가제활성유지조건확립 유통조건에따른활성변화분석 유산균제제를 20 에서 28일보관한경우의생존율이가장우수함 실온에서유산균제제를보관할경우생존율은급격히감소하여 0~19.1% 의생존율을나타냄 알지네이트 1% 를사용한비드와동결보호제로써 10% soy powder의혼합은저장기간중생존율을향상시키는것을확인함 17. 온라인과오프라인을통한보급시스템기반구축 ( 안 ) 및사용매뉴얼 ( 안 ) 작성 미생물첨가제보급시스템기반구축및사용매뉴얼작성 - 6 -

Ⅴ. 연구성과및성과활용계획 논문게재 : 5 건 - 고염에서생장하는젓갈유래 Bacteria의분리및고염에서의생육특성, 한국미생물생명공학회지, 39(3) (2011) - Lactobacillus sakei 생육저해활성보유 Leuconostoc mesenteroides가생산하는 Bacteriocin의특성, 한국미생물생명공학회지, 39(4) (2011) - 오징어젓갈 Bacteria 군집분석및식중독균생육저해 Bacillus 균주선발, 한국미생물생명공학회지, 41(4) (2013) - 김치의저장성향상을위한항균활성우수유산균선발, 한국식품영양과학회지, 43(2) (2014) - 유산균생존율향상을위한식품첨가물등급의동결보호제탐색. 한국식품과학회지, 46(5) (2014) 논문게재예정 : 2 건 - Extending the shelf life of kimchi with Lactococcus lactis strain as a starter culture. Food Sci. Biotechnol. (2015) - Starter cultures for kimchi fermentation, J. Microbiol. Biotechnol. (2015) 학술발표 : 14건 - Isolation of antibacterial and mannitol producing lactic acid bacteria from kimchi, 한국미생물생명공학회국제학술대회및정기학술대회, 2012.06.27. - Selection of lactic acid bacteria with antibacterial activity for the extension of kimchi shelf-life, 한국식품과학회정기학술대회, 2013.08.28. - Distribution of the lactic acid bacteria in kimchi according to different isolation temperature using 16S rrna gene sequencing analysis, 2013 International Meeting of FKMS, 2013.07.16 - Effect of the Rigidity and Size of Alginate Beads on Survival of Freeze-dried Pediococcus pentosaceus. 한국생물공학회국제학술대회 (2013. 10. 16-18) - Screeening of Cryoprotectants to Increase Survivability of Lactic Acid Bacteria during Freeze Drying Process. 한국식품과학회국제심포지엄및정기학술대회 (2013. 8. 28-30) - Effect of the Rigidity and Size of Alginate Beads on Survivial of Freeze-dried Lactobacillus plantarum. 한국미생물ㆍ생명공학회국제학술대회 (2013. 7. 3-5) - Improved Freeze-protecting Effect of Alginate Encapsulation on Survival Rate of - 7 -

Wissella kimchii during Freeze Drying. 한국미생물ㆍ생명공학회국제학술대회 (2013. 7. 3-5) - Effect of the Rigidity and Size of Alginate Beads on viability of freeze-dried Lactic acid bacteria during storage. 한국미생물ㆍ생명공학회국제학술대회 (2014. 6. 25-27) - Synergitic Effect of Alginate and Soy Powder on the Viability of Lactic Acid after Freeze-Drying. 한국식품과학회국제심포지엄및정기학술대회 (2014. 8. 25-27) - - Bacterial Community Migration during the Ripening of Saeu-jeotgal, a Traditional Korean High-Salt-Fermented Seafood. 2012년한국미생물 생명공학회국제학술대회및정기학술대회 - Effects of the Acid-tolerant and Lactobacillus sakei-inhibiting Starter Candidates on Kimchi Fermentation. 2012년한국미생물 생명공학회국제학술대회및정기학술대회 - Antibiotic Susceptibility of Coagulase-negative Staphylococci Isolated from Korean High-salt-fermented Seafood, Jeotgal. 2013년한국미생물 생명공학회국제학술대회및정기학술대회 - Genetic Diversity of Staphylococcus equorum Isolates from Saeu-jeotgal Evaluated by Multilocus Sequence Typing. 2013년한국미생물 생명공학회국제학술대회 특허출원 : 5건 - 마늘파쇄물및유산균이포집되어있는알지네이트비드를포함하는, 생존율이증진된식품발효용미생물첨가제조성물및이의제조방법 ( 출원번호 : 10-2013-0087969) - 동결보호제로서찹쌀풀을이용하는생존율이증진된식품발효용미생물첨가제조성물및이의제조방법 ( 출원번호 : 10-2013-0087981) - 동결보호제로서콩가루를이용하는생존율이증진된식품발효용미생물첨가제조성물및이의제조방법 ( 출원번호 : 10-2013-0087978) - 폐절임배추를이용한미생물배양용식용배지의생산방법 ( 출원번호 : 10-2013-0087974) - 내염성및단백질분해활성을갖는균주및이의용도 ( 출원번호 : 10-2014-0143924) 유전자원등록 : 10건 ( 김치유산균 16S rdna 염기서열 10건등록 ) - Pediococcus pentosaceus strain A-2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (GeneBank accession No. JX397933) - Pediococcus pentosaceus strain A-3 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (GeneBank accession No. JX397934) - Pediococcus inopinatus strain 4-4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (GeneBank accession No. JX397935) - Pediococcus inopinatus strain 4-6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence - 8 -

(GeneBank accession No. JX397936) - Pediococcus inopinatus strain 4-33 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (GeneBank accession No. JX397937) - Lactobacillus sakei strain Wikim SH003 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (GeneBank accession No. JX402124) - Weissella sp. Wikim SH004 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (GeneBank accession No. JX402125) - Weissella sp. Wikim SH005 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (GeneBank accession No. JX402126) - Leuconostoc mesenteroides strain Wikim SH006 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (GeneBank accession No. JX402127) - Leuconostoc mesenteroides strain Wikim SH007 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (GeneBank accession No. JX402128) 성과활용계획 - 김치용미생물첨가제를제품화하고기술이전실시 - 김치종균에대한이해및특성관련교육실시 - 미생물첨가제보급시스템구축으로미생물첨가제산업의활성화및우수균주의경제적활용성증대 - 맞춤형미생물첨가제를중소규모의전통발효식품산업체에제공함으로써전통발효식품산업활성화에기여하도록추진함 - 도출된연구결과를바탕으로논문투고및특허출원계획 - 9 -

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1. 2 3. - 11 -

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목 차 제 1 장연구개발과제의개요 18 제 1 절연구개발의목적 18 제 2 절연구개발의필요성 18 제 3 절연구개발범위 23 제 2 장국내외기술개발현황 24 제 3 장연구개발수행내용및결과 33 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 189 제 5 장연구개발성과및성과활용계획 195 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 199 제 7 장참고문헌 202-17 -

제 1 절연구개발의목적 다양한자연미생물에의하여제조되는김치의발효속도조절및위생학적안전성향상을위하여품목별특성에맞는맞춤형미생물첨가제를개발하고미생물첨가제를효율적으로중소규모전통발효식품제조업체에공급하기위한맞춤형미생물첨가제의보급시스템구축하고자함 제 2 절연구개발의필요성 국내외농림수산업관련환경이시장개방확대, 무한경쟁가속화등의영향으로급속히바뀜에따라기술경쟁력을갖춘농림수산식품산업육성의필요성이증가하고있으나, 농림어업 GDP는국가전체 GDP에서차지하는부분이계속적으로감소하고있으며 OECD 회원국중최하위수준에있음. 이러한문제점의해결을위해서농림수산식품산업의일대도약이필요한시점임 최근전통발효식품이웰빙식품으로급부상하고건강기능식품으로각광받고있으나국내전통발효식품과관련되어실용화된미생물자원은매우부족한실정이고산업적으로필요한품목별특성에따른발효속도조절기술, 저염화에따른유해세균제어기술등미생물응용기술은매우미흡한실정임 유럽이나일본등의선진국에서는발효제품에이용할미생물첨가제개발이활발히이 루어지고있으나국내전통발효식품산업체의경우대부분영세하여독자적으로미생물 첨가제를연구 개발하는회사는일부대기업을제외하고거의없는실정임 특히발효제 ( 메주, 누룩등 ) 를사용하지않는전통발효식품 ( 김치, 젓갈류등 ) 의품질고급 및위생성향상을위해서는중소규모의전통식품제조업체가저렴하게이용할수있는 맞춤형미생물첨가제의개발및국가적인보급시스템구축이절실히필요함 김치는절인배추나무, 오이등의주원료에각종양념을혼합하여일정기간발효, 숙성 시킨채소발효식품으로서독특한맛을내는한국의중요한전통식품으로우리의식생활 에서가장큰비중을차지하는부식임 - 18 -

김치는배추와마늘과같은원 부재료와제조과정중의여러가지미생물원으로부터주 발효균인유산균과기타일반세균, 효모, 곰팡이그리고대장균군까지유래되어단계적으 로발효가진행되는 microecosystem 으로알려져있음 대장균군의경우발효가진행될수록감소되어발효된김치에서는문제가되지않으나일부국가의경우초기대장균군균수를제한하고있어수출에어려움이있음. 또한최근저염김치의등장으로인한김치의위생적인문제가발생할소지가있어이를해결하기위한방안이필요함 김치의경우배추품종, 절임방법, 양념혼합, 숙성방법및미생물발효패턴등품질균일화를위해서는많은변수가조절되어야함. 이중에서제조공정관리부분은현재까지축적된산업화노하우와연구데이터로인하여산업현장에서어느정도품질관리가가능하지만미생물발효패턴조절기술은아직산업현장에서현실화된것이미비한실정임 김치의상품화에있어품질균일화및저장성연장이대표적인문제로대두되고있으나 이를해결할수있는방안이아직실용화되지못하고있는실정임 김치와유사한염지및야채발효식품인일본의쯔게모노 ( 漬物 ), 서양의 sauerkraut와 pickles 등은일찍부터많은연구가진행되어발효기작이거의밝혀져있으며, 따라서발효의인위적조절이가능한단계에이르렀으나김치는아직자연발효수준에머물러있음 따라서김치발효기작의정확한규명을통한우수균주선발과미생물첨가제를이용한 김치의발효조절및위생학적안전성을확보하는것은김치의품질및저장성향상, 위 생성향상에있어매우중요한의미를갖고있음 국내김치시장의시장규모는약 2조 4천억원, 1,204천톤으로 (2013년) 상품김치시장비율이금액면에서 1조 2,295억원으로 50.9% 차지 ( 가정제조 : 1조 1,876억원, 49.1%). 생산량에서는 506천톤으로 42% 를차지 ( 가정제조 : 698천톤, 58%) 하는것으로나타났으며그수요가더욱더증대될것으로예상됨 김치 Codex 규격채택 (2001 년 ), 세계 5 대건강식품선정 (2006 년 ) 등김치종주국의위상과 는달리식생활의서구화, 외식기회확대등으로 1 인당김치소비량이감소되고있으며, 저가의중국산김치수입급증으로김치산업이대내외적으로도전과시련을맞고있음 발효식품은건강식품이라는인식이전세계적으로확산되면서향후인구증가와더불어 시장규모가지속확대될전망이어서김치의우수한기능성을홍보하여내수촉진을도 - 19 -

모하고해외시장경쟁력강화에대비할필요가있음 지구온난화와환경오염심화로농산물생산성저하및미생물자원고갈이예상됨에따 라김치의미생물자원보존유지필요성이증대되고있음 따라서김치의세계화및김치종주국의수호를위해서김치발효미생물에대한연구가 주도적으로이루어져야할것임 김치미생물첨가제사용량은점점사용량이증가될것으로예상됨. 고가의미생물첨가 제를사용할수없는중소규모의김치제조업체에본연구과제에서개발된첨가제를저 렴하게공급함으로서김치산업을활성화시킬수있을것으로사료됨 김치수출량은 2005년 30,000톤을상회하던것이기생충알파동으로급감한후차츰증가세를보여 2009년 28,500톤으로회복. 수출국은다변화 ( 00:27 개국 05:35 11:60) 되고있으나여전히일본에편중 ( 13 : 74%) 되어있음. 수출액은 ( 09:89,386 천불 11:104,577 천불 13:89,277). 따라서우수종균첨가로품질이향상된다양한김치를산업적으로대량생산할수있게 되면내수시장뿐만아니라국제적으로김치수출을촉진시킬수있게되어경제 산업 적측면에서매우큰의의가있다하겠음 젓갈은어패류의근육, 내장또는생식소등에 10~20% 의식염을첨가하여부패변질을억제하면서일정기간숙성발효시킨전통수산가공식품으로, 장류, 침채류와더불어우리나라3대발효식품중하나임. 원료로부터유래된자가소화효소및미생물의효소작용에의해숙성과정중단백질이분해되어특유의풍미와조직감이형성되고, 유리아미노산및정미성분이풍부하여단백질공급원으로써뿐만아니라김치의부원료나조미료로써한국인의식생활에서빼놓을수없는주요한자리를차지하고있음 현재국내에서조사된젓갈류는침장원및원료의종류, 제조방법등에따라 160종의젓갈과식해가알려져있지만, 산업화가이루어진것은 30여종이며대부분은지역특산물로가내수공업수준에서제조되고있고, 원료의수급사정으로명맥만유지하는것도있다. 1980년대부터는오양수산, 한성기업, 하선정종합식품등이젓갈의대중화및산업화에앞장서고있지만, 영세한제조업체가다수를차지하고있음 젓갈산업이 1980 년대이후, 빠르게성장하고있음에도불구하고제조및유통은다른발 효식품에비해취약한상태에있음. 그이유는 1) 고염식품이라는점에서과거에비해 기호도및선호도가떨어지고있으며, 2) 발효숙성기간이길며, 규격생산이어렵다. 또한 - 20 -

3) 상품수명이짧고, 4) 위생적품질관리가어려우며, 5) 수송및취급이용이하지못하기 때문임 이러한문제점의해결을위해서는 1) 젓갈품질의표준화및품질평가방법의확립, 2) 유통기한연장기술의개발, 3) 소비자가선호하는새로운제품의출시, 4) 젓갈위해요소의규명및제거등을목표로한젓갈제조기술의과학화및현대화가이루어져야하며, 이를위한기초연구가선행되어야함 국민의건강에대한관심이증가함에따라전통식품에대한관심이높아지고있고, 정부의전통식품의과학화및상품화에대한관심이높아지면서젓갈연구에대한관심도높아지고있지만, 김치나장류, 주류등의전통발효식품의연구에비해양적, 질적인면에서뒤떨어져있다. 한국과학기술정보원 (KISTI) 을이용하여검색한김치관련논문및특허는각각 989건및 4,767건으로젓갈관련의논문 212건및특허 287건을크게앞선것으로집계되어젓갈연구의후진성을보여주고있음 신성장동력의하나로식품산업이거론됨에따라한식의세계화에많은관심이집중되고있음. 그일원으로김치의세계화에는많은연구가투자되고있으나젓갈의세계화는미진한실정이다. 전통발효식품의세계화를위해서는반드시젓갈의세계화또한동반하여추진되어야함 국가과학기술종합정보서비스 (NTIS) 에서검색한바에따르면, 지금까지진행된젓갈관련국가과제는 18건으로집계됨. 이들중디자인기술개발을제외한젓갈제조기술의과학화및현대화와직접적으로관련있는기초및산업화연구는 8건정도에불과함. 한편김치관련국가과제는 79건이시행되어, 젓갈연구의낙후성을단적으로제시하고있음. 또한연구성과면에서도젓갈연구를통하여사업화된예는찾아보기힘듬 젓갈류산업의육성을위한연구개발은저염화및속성발효법개발을중심으로기초및 응용연구가진행되었지만, 속성발효와관련해서는산업적성과를거둔예를찾아보기힘 듬 젓갈을제조한후, 상품화까지의시간이 1년이상소요되는멸치젓과새우젓과같은고염젓갈의속성발효에의한생산기간단축은젓갈생산비용의감소로연결되어젓갈산업의활성화에기여할수있기때문에젓갈의속성발효를위한연구가기존에다수진행되었지만, 대부분단백질분해효소의첨가에의존하였고, 젓갈발효에관여하는내염성단백질분해미생물을첨가한시도는없었음 - 21 -

특히젓갈발효관련미생물연구의경우숙성기작의대한해석과발효에관여하는주발효균또는우점종이정확하게도출되지못했음. 이러한이유는침채류및장류에비해젓갈에존재하는미생물의종류가방대하고, 젓갈발효에관여하는미생물의전체상을이해하기위한체계적인미생물다양성파악보다는선택배지를이용한신규미생물의탐색이나유용미생물분리의방향으로젓갈연구가단편적으로진행되었기때문으로사료됨 속성발효에의한경제적효과가매우큼에도불구하고속성발효가산업적성공을거두지못한점은계속적으로효소를첨가해야하고, 초고압설비와같은추가적인설비가필요한방향으로진행되어영세한젓갈생산자들에경제적효과가전달되지못하였기때문으로분석됨. 따라서고염에서단백질분해효소를생산하는미생물첨가제를저가에공급하여속성발효에적용한다면기존의연구에서달성하지못했던산업적성공을거둘수있을것으로사료됨 국민의건강에대한관심이높아지면서젓갈의저염화를위한다수의연구가진행되었고, 양념젓갈을중심으로저염화는상당한성과를거두었음. 그러나저염화의결과, 저염제품 의발효관련미생물상이바뀌게되어미생물학적안전성에대한문제점이대두되었음 젓갈의저염화로초래된위해미생물의오염을평가한연구가 2000년이후에다수가진행되었음. 유통중인다수의젓갈류를대상으로위생지표미생물및식중독균을검출한결과, 멸치젓과새우젓과같은고염이함유된젓갈의경우식품위해균에의한문제점이발생할가능성은거의없는것으로나타났음. 그러나오징어젓, 명란젓, 창란젓과같은저염양념젓갈로부터는식품위해미생물이검출되는것으로나타났고, 대장균군 (coliforms), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 장염비브리오균을포함하는 Vibrio spp. 에의한오염가능성이있는것으로나타났음 젓갈의저염화가계속적으로추진되고있는현시점에서식품위해미생물에의한문제점 발생의가능성이제기되고있기때문에저염양념젓갈의위생지표미생물및식중독균의 제어는시급히해결되어야함 - 22 -

제 3 절연구개발의범위 전통발효식품 ( 무발효제 ) 품질개선을위한우수미생물자원확보 - 김치, 젓갈류로부터발효속도조절및위생지표미생물제어우수미생물확보 - 발효단계별미생물군집분석을통한발효기작규명및품질특성변화분석 전통발효식품제조용맞춤형복합미생물첨가제개발 - 미생물첨가제제조및우수미생물조합에의한최적배합비확립 개발미생물첨가제를이용한발효속도조절기술개발 - 미생물첨가제를이용한김치의품질유지기한연장 - 미생물첨가제를이용한고염젓갈속성발효기술개발 개발미생물첨가제를이용한위생학적안전성향상기술개발 - 미생물첨가제를이용한저염김치의대장균군제어기술개발 - 미생물첨가제를이용한저염양념젓갈의위생지표미생물및식중독균제어기술개발 개발미생물첨가제를이용한전통발효식품의최적발효공정개발 - 계절별원 부재료미생물분포조사및초기균수저감화기술개발 - 미생물첨가제제형별활성화기술및첨가량, 첨가방법개발 우수미생물및미생물첨가제의효율적관리및보급시스템구축 - 관련미생물의수집, 보존및관리시스템구축 - 미생물첨가제제제화기술및포장기술개발 - 맞춤형미생물첨가제제조를위한기본매뉴얼제작 - 관련미생물첨가제의보급시스템개발및구축 - 미생물첨가제사용관리지침 ( 안 ) 및미생물첨가제품질인증제도마련 ( 제품효능검증 ) - 23 -

종균김치국내업체현황 - 품질균일화를위한종균첨가김치는일부기업을중심으로생산되고있음 - 유제품은종균및맞춤형발효단계이나김치는대부분자연발효단계수준으로종균첨가김치는일부업체에서만생산하고있음 - 1998년 : 베지퀸에서최초시도하여제품출시 (Leuconostoc citreum IH-22) - 2000년대초반 : 한울바이오김치 (Leuconostoc kimchii), 종가집김치 (Leuconostoc DRC 0211 함유 ) - 2000년대후반 : CJ 하선정김치, 동원양반김치, 풀무원등에서유산균첨가김치출시 - 24 -

표 1. 종균을첨가하여판매중인국내상품김치예시 - 25 -

기존논문의경우김치의저장기간연장과품질향상을위해 bacteriocin을생성하는균주나 dextransucrase, mannitol 등을생성하고저온적응성이우수한균주를사용하여종균김치를제조하여여러가지이화학적특성및점유율분석을통해서종균의김치적용가능성을제시함 시장에유통되고있는대부분의김치제품이자연미생물 community 를그대로이용한상 품으로서발효조절이어렵거나품질이균일하지않는등여러가지문제점을가지고있음 유럽이나미국등의선진국에서는발효제품에이용할종균개발이활발히이루어지고 있으나국내김치산업체의경우독자적으로종균을연구 개발하는회사는극소수에불 과함 현재종균을사용또는사용을위한연구단계인김치산업체로서는대상 ( 주 ) 의종가집김치, CJ( 주 ) 의하선정김치, 동원양반김치, 풀무원김치등이있으며이들업체는독자적으로개발한균또는종균회사로부터균을공급받아종균김치를제조하고있으며많은중소업체에서종균김치의필요성을절감하고있음 젓갈발효관련미생물연구및젓갈의발효에따른품질변화등, 젓갈의과학화및산업화 와관련된연구가진행되고있지만, 양과질적인면에서김치와장류에비해명맥을이어 가는수준으로분석됨 젓갈연구의기반은 1960년대와 1970년대에거쳐이루어졌으며주로소재별발효, 숙성기작규명을위한미생물상변화연구 [ 이, 1969; 이와최, 1974], 정미성분및향기성분분석 [ 이와성, 1977; 성, 1978], 그리고숙성과정에관한효소학적연구 [ 서, 1973] 등의젓갈에대한과학적접근이시도되었음 1980년부터는전통식품의상품화와산업화가본격적으로추진됨에따라, 식염의과잉섭취를방지하면서도저장성과풍미에손색이없는저식염젓갈의제조 [ 차등, 1983; 차와이, 1985a, 1985b], 젓갈의대량생산을위한속성발효 [ 차등, 1988, 1990; 차와이, 1989, 1990] 등의산업화를염두에둔기존젓갈의문제점해결을위한실용연구가시작되었음 1990 년대중반부터는기존에진행되었던정미성분의규명, 속성발효, 저염젓갈의제조, 미 생물학적및효소학적연구 [ 차등, 1988] 외에도소비자를의식한품질개선및안전과 - 26 -

관련된연구가진행되었음. 그예로는젓갈품질평가방법의표준화를위한미생물연구 [ 허, 1996], 젓갈의안전성확보 [ 함과진, 2002; 김등, 2006; 하등, 2007], 품질유지기한의연장 [ 이등, 2000; 조등, 2002], 젓갈의안전성확보를위한 HACCP 제도의도입 [Park et al., 2002b] 등의연구를들수있음 2000년대에들어서면서젓갈의산업화와관련된연구외에도유용물질탐색, 항암활성보유유용미생물분리 [ 박등, 2004], lacticin [ 백등, 2003], lipopeptide [ 윤등, 2005] 등의박테리오신생산미생물분리를비롯하여신규자원의활용과관련된다수의유용미생물이분리가보고되었음. 또한젓갈을대상으로한신규미생물발굴이집중적으로진행되어, 형태및생리적특성에의존한고전적동정법으로진행된젓갈미생물연구에서보고되지않았던신규미생물 Bacillus jeotgali [Yoon et al., 2001] 외약 20여종이신규등록되었음 젓갈을제조한후, 상품화까지의시간이 1년이상소요되기때문에속성발효젓갈의제조를위한다수가이미기존의연구에서진행되었지만, 대부분단백질분해효소의첨가에의존하였고, 젓갈발효에관여하는내염성단백질분해미생물을첨가한시도는없었음 [ 차등, 1988, 1990; 차와이, 1989, 1990]. 국민의건강에대한관심이높아지면서젓갈의저염화를위한다수의연구가진행되었고, 양념젓갈을중심으로저염화는상당한성과를거두었음. 그러나저염화의결과제품의젓 갈발효관련미생물상이바뀌게되어미생물학적안전성에대한문제점이대두되었음 젓갈의저염화로초래된위해미생물의오염을평가한연구가 2000년이후에다수가진행되었음 [ 김등, 2006; 오등, 2004; 이등, 2008; 하등, 2007; 함등 2002]. 유통중인다수의젓갈류를대상으로위생지표미생물및식중독균을검출한결과, 멸치젓과새우젓과같은고염이함유된젓갈의경우식품위해균에의한문제점이발생할가능성을거의없는것으로나타났음. 그러나오징어젓, 명란젓, 창란젓과같은저염양념젓갈로부터는식품위해미생물이검출되는것으로나타났고, 대장균군 (coliforms), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 장염비브리오균을포함하는 Vibrio spp. 에의한오염가능성이있는것으로나타났음 2010 년을기점으로전통발효식품을대상으로한 metagenome 분석이활발하게진행되면 서김치, 장류에이어젓갈의 bacteria 군집에대한 metagenome 분석결과가보고되어 - 27 -

젓갈에존재하는미생물상이규명되었음 [Jung et al., 2013a, 2013b, 2014; Lee et al., 2014a, 2014b]. Pyrosequencing 을이용한젓갈의미생물 metagenome 군집분석결과는본 연구에서배양법을통하여분석한결과와크게다르지않은것으로나타났음 김치및장류대비시장규모가작은관계로젓갈에대한연구는전반적으로빠르게진전되지는않지만, 최근의미생물상에대한연구를통하여젓갈발효관련미생물에대한지식은많이진보하였고, 본연구를통하여품질균일화및속성발효를위한종균이도출된상태임. 그러나도출된젓갈발효용종균이기존의식품발효에서많이사용되었던미생물과는다르기때문에식품용도로의사용을위한미생물안전성평가가큰숙제로대두되었음 젓갈산업의진흥을위한많은지원이필요함에도불구하고연구비투자가늘어나지않고있어젓갈산업에서의문제점해결은진전되지못하고있음. 젓갈발효관련미생물상에대한지식이어느정도확보된만큼이를바탕으로산업적문제점해결을위한추가연구의진행이필요한시점에도달했음 - 28 -

해외현황분석 세계김치생산현황 - 총 146개업체로중국이 40개업체로가장많으며, 미국이 32개업체로두번째로많음. 한국식김치생산업체가존재하지않는국가도 3개국 ( 영국, 네덜란드, 칠레 ) 이있음 - 주요생산품목은생산품목중가장높은비중을차지한것은포기김치로서 83.33%(35개소 ) 였고, 맛김치가 50.0%(21개소 ) 로두번째로높았으며, 깍두기 47.62%(20개소 ), 총각김치 33.33%(14개소 ), 열무김치 28.57%(12개소 ) 순임 표 주요생산품목 복수응답 - 29 -

일본김치시장현황및유통현황 - 김치생산량의최고치를달성했던 2002 년이후 2003 년의일본김치생산량은전년도보다 1.71% 감소함. 2005 년에는갑작스런수입산김치의기생충사건으로인하여일본김치시장은큰타격을입었으나, 일본김치제조업체에게자국산김치점유율을증가시킬수있는기회로작용함 - 일본에서김치를생산하고있는대표적인일본산김치제조업체로는도카이쓰케모노 ( 東海漬物 ), 빈고쓰케모노 ( 備後漬物 ), 나카가와식품, 마르코시, 아키모토식품, 피클스등이있음 - 2002년한일월드컵으로인한한식에대한관심이증가로인해김치판매액은대폭증가하였으나, 2003년에는주춤하여 2006년에급격히감소함 - 2007년부터는김치시장이회복되는기미를보여계속적으로성장하고있는것으로보이며, 후지경제에서는 2012년에 2001년도의시장규모를회복할것으로추정함 중국김치시장현황및유통현황 - 중국현지에서생산되는한국식전통포장김치브랜드는약 20개이상이며, 5개업체가시장의약 70% 를점유하고있음 - 중국내유통되는포장김치중 70% 는현지인이소비하고, 약 30% 는교민시장에서소비하는것으로추정 - 한국산 : 생산업체 중국총대리상 소매매장 ( 대형유통업체, 한인마트등 ) - 현지생산품 : 생산업체 소매매장 ( 대형유통업체, 한인마트등 ) - 중국주요지역 ( 상하이, 베이징, 칭다오등서부해안지역 ) 전역에서판매되는김치브랜드는종가집 ( 북경공장 ), 경복궁 ( 칭다오공장 ) 등이며, 각지역별로현지에서생산하여지역에서만판매되는김치업체는약 20여개업체이상이되는것으로파악됨 베트남김치시장현황및유통현황 - 한국문화에대한우호적인환경과함께절임식품에대한친밀도로인해현지김치업체의성장률이높은상황임 - 한국김치시장은매년 50% 수준의급성장을기록하고있으며, 베트남내한인을대상으로하는한인슈퍼에는 OngKim 김치외에한국산수입김치인 종가집, 소규모현지브랜드, 자가제조김치등이혼재되어판매되고있음 독일김치시장현황및유통현황 - 독일푸랑크푸르트내의 10개정도의한국식품점들이김치를생산하고있으나, 대부분영세한제조시설을갖추고있음 - 현재현지생산김치는브레멘 (Bremen, Germany) 의 KoreaKimchi 업체 ( 한국인대상 ) 와하 - 30 -

나우 (Hanau, Germany) 의김치제조업체 ( 동남아식품가게대상 ) 가존재함 - 한국산수입김치는운송기간이 28 35일정도소요되어김치의신선도문제가발생될가능성이높음 - GABHI GmbH 를통해항공으로수입후, 독일루프트한자에납품함 ( 원스톱, 원나잇시스템구축, 특별시장으로한달운송료 2천만원이상소요 ) 프랑스김치시장현황및유통현황 - 파리내에존재하는한인마트에서모두자체제조된김치를판매하고있으며, 정부허가를받은김치공장은이조김치가유일함. 이조김치의자체브랜드미보유로인해판로를찾지못해직접소비자에게판매하는방법을취하고있음 - 판매되고있는한국산수입김치 ( 종가집 ) 의경우, 맛김치 200g 제품이 1.80유로로판매되고있으며, 한인마트에서자체생산중인김치제품의경우 250g에 4.5유로에판매되고있음 - 한국에서수입된김치제품의경우, 유통기간의문제로신선한상태의공급이불가능하여현지한인마트에서신선한김치를제공하는차별화전략으로 2배이상의높은가격을받고있음 젓갈은우리나라고유의전통발효식품이기때문에외국에서연구된예는찾아보기힘듬. 그러나곡물을주식으로하는동남아시아와일본에서젓갈과유사한수산발효식품이제조되고있어, fish sauce, fermented fish product 관련다수의논문이보고되었고, 그수준은국내보다우위에있음 젓갈과마찬가지로 fish sauce의제조에있어서도속성발효에의한경제적효과가직접적으로나타날수있기때문에태국의연구자들을중심으로효소와미생물을이용한속성발효가시도되었음 [Yongsawatdigul et al. 2007]. 국내보다연구의수준이높은것으로평가됨 속성발효와직접적인관련이있는논문은 1건에불과하지만, 속성발효의달성에도달하기까지진행한효소및미생물에대한기초연구가태국및일본에서보고되었음 [Fukami et al., 2004; Hiraga et al., 2005; Sinsuwan et al., 2007; Siringan et al., 2005]. 또한태국의젓갈류 plaa-som에대한외국연구자들의연구결과 [Paludan-Müllera et al., 2002] 도보고되고있어태국젓갈에대한국제적연구가진행되고있는것으로추정됨 종균을첨가한속성발효가어느정도성공을거두고있지만, 종균을첨가하여위해미생 물을제어한결과는보고되지않았음. 미생물첨가제의첨가를통한저염젓갈의식품위 - 31 -

해미생물제어에성공한다면세계적으로저명한학술지에게재가능할것으로사료됨 태국과일본의속성발효및품질균일화관련의연구수준은우리나라에비해서다소높게평가되지만, 최근들어 metagenome 분석을통한젓갈미생물균총분석과같은수준높은연구가해외저명학술지에발표되면서고염발효식품미생물의연구수준은우리나라가앞선것으로평가됨 [Guan et al., 2011; Jung et al., 2013a, 2013b, 2014; Lee et al., 2014a, 2014b]. - 32 -

제 1 절항균활성우수균주의선발 1. 실험방법 가. 유산균분리일반가정과마트에서시판되고있는적숙기김치를구입하여젖산 (lactic acid) 생성능이과다하지않고항균활성이우수한균주를분리하고자거즈를이용하여김치국물에있는고형분을제거한후, 희석하여 MRS배지에 0.2% BPB 지시약 1% 를넣어제조한 MRS-BPB 배지에도말하여 30 에서 48시간동안혐기적으로배양한다음 colony를분리하였다. 나. 박테리오신생산균주선발상기에서분리한균주를 spot-on-the-lawn법을이용하여박테리오신생산여부를확인하였다. 사용한감수성균주로는과숙김치에서분리한김치의산패를유도하는 Lb. plantarum 20-10, Lb. plantarum A-1, Pediococcus pentosaceus A-2, P. pentosaceus A-5, Lb. plantarum A-6, P. pentosaceus B-11, Lb. sakei CK0153, Lb. sakei CK0154를이용하여각각의선택배지 (agar 0.7% w/v) 에접종한뒤중층후저해환을생성하는단일집락을박테리오신생산균주로선발하였다. 다. 선발된균주동정선발된균주는 MRS broth에배양후 genomic DNA extraction kit(intron Biotechnology, Korea) 를사용하여 DNA를추출하였다. 추출된 DNA는 1% agarose gel을이용하여확인하였으며, 16S rrna gene을증폭하기위하여추출된 genomic DNA를 template로하여 2 7 F ( 5 - A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G - 3, f o r w a r d ), 1 4 9 2 R (5 -GGCTACCTTGTTACGACTT-3, reverse) primer를이용하여 PCR을진행하였다. PCR 조건은 denaturation 95 1min, annealing 45 1min, extension 72 1min 30sec로 30 cycle을수행하였다. 얻어진 PCR product는 sequencing을위해 purification Kit(iNtRON - 33 -

Biotechnology, Korea) 를이용하여정제하였다. DNA 염기서열은 ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Perkin Elmer, U.S.A.) 를사용하여염기서열을결정하였으며, National Center for Biotechnology Information(NCBI) 의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) 를이용하여분리균주를동정하였다. 라. 항균활성측정박테리오신항균활성측정은 agar-well diffusion assay 방법을사용하여김치과숙지시균주에대해서분리균주들의생육저해활성을확인하였다. 지시균주들과 Lactococcus lactis, Lactobacillus brevis를 MRS broth에접종한후 30 에서 18시간동안전배양한후 100mL MRS 액체배지에전배양액 1% 접종하여 30 에서 18시간동안 2차배양하였다. 분리균주의항균활성을측정하기위해 MRS 고체배지에지시균배양액 100 μl를 0.7%(v/v) soft agar 에접종하여중층후구멍을뚫었다. 분리균주배양액을 0.45μm membrane filter(sartorius, Frankfurt, Germany) 로제균한뒤균액을 100μL 씩가하였다. 30 에서 2일간배양하여생육저지환의생성을확인하였다. 항균활성의정도는배양후생성된 clear zone의크기를측정하여나타내었다. 마. 분리균주의내산성확인상기에서분리된유산균을 lactic acid로 ph 3.0, 3.5, 4.0으로조정한 MRS broth 3ml에접종한후, 30 에서 48시간동안배양하면서생육유무를관찰, 상기 ph 범위에서내산성정도를측정하였다. 바. 분리균주의내염성확인상기에서분리된유산균을 NaCl 1%, 3%, 5% 를첨가한 MRS broth 3ml에접종한후, 3 0 에서 48시간동안배양하면서생육유무를관찰, 상기 1%, 3%, 5% 의염범위에서내염성정도를측정하였다. 사. 분리균주의산생성능확인항균활성을측정한후김치과숙지시균주에대하여항균스펙트럼이넓고강한항균활성을보인균주를 MRS broth 3ml에각각접종하여 30 에서 24시간동안배양하면서산생성능을관찰하였다. - 34 -

2. 실험결과및고찰 가. 박테리오신생산균주선발및동정준비한균주를선택배지에접종한뒤 spot-on-the-lawn법을이용하여박테리오신생산여부를확인하였다. 저해환을생성하는집락을박테리오신생산균주로선발하여, 선발된균주를형태적생리적생화학적실험을한결과, 그람양성균주이며간균과구균형태를갖고있음을확인할수있었다. 분리한유산균의 16S rdna의염기서열을분석하였고그결과, 두균주가 Lactococcus lactis와 Lactobacillus brevis 염기서열과 99.9% 동일하여 Lactococcus lactis와 Lactobacillus brevis로각각동정이되었다. 나. 분리균주의항균활성항균활성측정은 agar-well diffusion assay 방법을사용하여김치과숙관련지시균주에대해서분리균주들의생육저해활성을확인하였다. 30 에서 2일간배양하여생육저지환의생성을확인하였다. 항균활성의정도는배양후생성된 clear zone의크기를측정하였다. 표와 Fig. 1-1에나타낸바와같이특히 Lb. plantarum A-1, P. pentosaceus A-2, Lb. sakei 0154에대하여강력한항균활성을나타내었다. Table 1-1. 분리균주항균활성측정 +, 12mm; ++, 12mm 19.3mm Fig 1-1. agar-well diffusion assay 을이용한항균활성측정. A : Lc. lactis B : Lb. brevis (1) Lb. plantarum A-1, (2) P. pentosaceus A-2, (3) Lb. sakei 0154-35 -

다. 분리된균주의내산성확인김치가제일맛있다고평가되는적숙기의 ph는 4.2 4.5로, 내산성에강한균주를선발하여실제김치에적용해야만종균으로서의기능이계속유지될수있다. ph 3.0, 3.5, 4.0 으로조정한 MRS broth 3 ml에 30 에서 48시간동안배양하면서생육유무를관찰한결과 Lc. lactis균주는 ph 3.5에서 70% 와 ph 4에서 102% 의생존율을보였고 Lb. brevis 균주는 ph 3에서 71% 와 ph 3.5에서 91%, ph 4에서 95% 의생존율을보였다. 이들두균주는종균으로의활용가능성을보였다. Viable cell number (log cfu/ml) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Control ph3.0 ph3.5 ph4.0 0 A B Fig. 1-2. 분리한유산균의내산성확인 A : Lc. lactis B : Lb. brevis 라. 분리된균주의내염성확인우리나라일반김치의염도는 2 3% 내외이다. 그러나지역적특성으로인해보다높은염도의김치도일부만들어지고있다. 분리된균주가실제김치에적용이가능한지를알아보고자내염성을측정하였다. NaCl 1%, 3%, 5% 를첨가한 MRS broth 3ml에분리균주를접종하여 30 에서 48시간동안배양하면서생육유무를관찰한결과분리균주모두 5% 까지잘생육하였다. 특히염농도 3% 에서두균주모두 108%, 103% 의생존율을보이며종균으로의활용가능성을나타내었다. 종균후보균주로선발된 Lc. lactis와 Lb. brevis 두균주의형태학적및생화학적분석결과를 Table 1-2 에나타내었다. - 36 -

10 Viable cell number (log cfu/ml) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Control 1% NaCl 3% NaCl 5% NaCl 0 A B Fig. 1-3. 분리한유산균의내염성확인 A : Lc. lactis B : Lb. brevis Table 1-2. 분리균주형태학적및생화학적분석결과 마. 분리균주의산생성능확인 Lc. lactis 와 Lb. brevis가강력한항균활성을보인김치과숙관련지시균인 Lb. plantarum A-1, P.pentosaceus A-2, Lb.sakei 0154를 MRS broth에배양하면서산생성능을관찰하였다. 항균활성이뛰어난균주 Lc. lactis 와 Lb. brevis는김치과숙지시균보다산생 - 37 -

성능이적은것으로나타나김치에첨가하더라도김치의 ph 를저하시키지않을것으로예 상되었다. Table 1-3. 분리균주산생성능확인 제 2 절초기접종균수에따른미생물첨가제첨가량설정 1. 실험방법 가. 김치첨가용배양액제조 Lc. lactis 를 MRS broth 5 ml에접종하여 30 에서 24 시간동안 1 차전배양을하였다. 상기 1 차전배양액을 MRS 에 0.5%(v/v) 접종하여 30 에서 18 시간동안 2 차배양하였다. 나. 김치제조절임배추와절임양념을구매하였으며, 대조군시료, 절임양념을 65 에서 30분동안열처리한시료, 절임양념을 65 에서 30분동안열처리한후, Lc. lactis 1 10 3 CFU/g와김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액을첨가한시료, 절임양념을 65 에서 30분동안열처리한후, Lc. lactis 1 10 5 CFU/g와김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액을첨가한시료, 절임양념을 6 5 에서 30분동안열처리한후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액을첨가한시료를준비하였으며, 담근종균김치는 PE 재질의플라스틱통에담아포장하여 8 에저장하면서실험을수행하였다. 다. 이화학분석제조한 4군의실험군김치와대조군김치를대상으로산도와 ph를측정하였다. ph 및산도를측정하기위하여각김치 300 g을분쇄후거즈로여과하여김치액을제조하였다. 분쇄한김치 100g을 ph 미터 (Thermo Orion 720A., USA) 를이용하여 ph를측정하였다. 산도는분쇄후거른김치액 20 ml를 0.1N NaOH을사용하여 ph 8.3이되도록중화적정한후, 소비된 NaOH량을젖산함량 (%) 으로환산하여나타내었다. - 38 -

라. 균수측정제조한실험군김치와대조군김치를대상으로총균, 유산균을측정하고자분쇄한 25 g의김치를스토마커처리를한후순차적으로희석하고희석액을필름배지에도말하여총균은 30 에서 48시간동안호기배양, 유산균은혐기배양한후계수하였다. 2. 실험결과 가. ph 및산도의변화김치를제조하여 8±0.5 저장고에저장하면서이들의 ph와산도의경시적인변화를관찰하였다 (Table 1-1, 1-2). 담금당일의 ph는거의유사하게나타났으며, 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치군들의 ph가첨가한균수에비례하여낮아지는경향을보였다. 숙성 7일차에는절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치군들의 ph가적숙기상태의 ph의범위를유지하였으나, 대조군과절임양념을 65 에서 30분열처리한김치의경우이미적숙기상태의 ph 보다낮게나타났다. 숙성 14일차에는절임양념을 65 에서 30 분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치군에서만적숙기상태의 ph를유지하고있었다. 산도또한 ph와동일한경향을나타내었다. 담금당일은동일한산도를나타냈으며, 숙성이진행됨에따라대조군과절임양념을 65 에서 30분열처리김치군의경우산도가빠르게높아지는경향을보였으며, 숙성 14일차에는절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치군에서의산도가가장낮은경향을보였다. 따라서본실험을통해서미생물첨가량을달리한김치를제조함에따라적정한균수접종량을결정하고자하였는데, Lc. lactis를 1 10 7 CFU/g 첨가한군의결과가발효지연에가장효과가있는것으로사료되어본실험군의조건을최종농도로선정하였다. - 39 -

Table 1-1. 미생물첨가량을달리한김치의 ph 변화 Control: 대조군, B: 절임양념을 65 에서 30분열처리한김치, 3: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 3 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, 5: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 5 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, 7: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치. Table 1-2. 미생물첨가량을달리한김치의산도변화 Control: 대조군, B: 절임양념을 65 에서 30분열처리한김치, 3: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 3 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, 5: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 5 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, 7: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치. 나. 총균및유산균수의변화대조군김치와실험처리한 4군의총균수와유산균수의변화를살펴본결과는다음의 Table 1-3, Table 1-4와같다. 총균수의경우, 담금당일에는대조군에비해절임양념을 6 5 에서 30분열처리한군의총균수가높게나타났으며, Lc. lactis를접종량을달리하여처리한군들의총균수가접종량에비례하여높게나타났다. 숙성됨에따라서도대조군에비해실험처리군의총균수가높게나타났으나, Lc. lactis를접종량을달리하여처리한군들의총균수는현저한차이를보이진않았다. 유산균수의변화를살펴본결과, 담금당일에대조군에비해절임양념을 65 에서 30분열처리한군의유산균수가다소높은경향을보였으며, Lc. lactis를접종량을달리하여처리한군들의유산균수가접종량에비례하여높게나타났다. 숙성됨에따라서도대조군에비해실험처리군의유산균수가높게나타났으나, Lc. lactis를접종량을달리하여처리한군들의유산균수의차이는보이지않았다. - 40 -

Table 1-3. 미생물첨가량을달리한김치의총균수변화 Control: 대조군, B: 절임양념을 65 에서 30분열처리한김치, 3: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 3 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, 5: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 5 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, 7: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치. Table 1-4. 미생물첨가량을달리한김치의유산균수변화 Control: 대조군, B: 절임양념을 65 에서 30분열처리한김치, 3: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 3 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, 5: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 5 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, 7: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치. 3. 고찰 미생물첨가제첨가량의영향분석을통해적정한균수접종량을결정하고자하였다. Lc. lactis의접종량을달리첨가하여제조한김치를 8±0.5 저장고에저장하면서이들의 ph, 산도, 총균수와유산균수의변화를관찰하였다. 담금당일의총균수와유산균수를확인한결과, Lc. lactis를접종량을달리하여처리한군들의총균수와유산균수가접종량에비례하여높게나타났다. 숙성됨에따라실험처리군의총균수및유산균수가높게나타났으며, 접종량에따른차이는보이지않았다. 또한숙성됨에따라 ( 숙성 14일차 ), 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 107 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치군에서만적숙기상태의 ph를유지하고있었으며, 산도가가장낮게나타났다. 따라서본실험을통해서미생물첨가량을달리한김치를제조함에따라적정한균수접종량을결정함에있어발효지연에가장효과적인 Lc. lactis를 1 107 CFU/g 첨가한군의조건을선정하였다. - 41 -

제 3 절 Lactococcus lactis 를이용한품질유지기한연장기술개발 1. 실험방법 가. 김치첨가용배양액제조 Lc. lactis 를 MRS broth 5 ml에접종하여 30 에서 24 시간동안 1 차전배양을하였다. 상기 1 차전배양액을 MRS 에 0.5%(v/v) 접종하여 30 에서 18 시간동안 2 차배양하였다. 나. 김치제조절임배추와절임양념을구매하였으며, 대조군시료, 절임양념을 65 에서 30분동안열처리한시료, 김치중량의 0.02% 의젖산을첨가한시료, 절임양념을 65 에서 30분동안열처리한후, 김치중량의 0.02% 의젖산을첨가한시료, 분리한우수종균 Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액을첨가한시료, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량의 2% 의 lactose, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액을첨가한시료, 절임양념을 65 에서 30분동안열처리한후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액을첨가한시료, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량의 0.02% 의젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액을첨가한시료, 절임양념을 65 에서 30분동안열처리한후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량의 0.02% 의젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액을첨가한시료를준비하였으며, 담근종균김치는 PE 재질의플라스틱통에담아포장하여 8 저장하면서실험을수행하였다. 다. 이화학분석제조한 8군의실험군김치와대조군김치를대상으로산도와 ph를측정하였다. ph 및산도를측정하기위하여각김치 300 g을분쇄후거즈로여과하여김치액을제조하였다. 분쇄한김치 100g을 ph 미터 (Thermo Orion 720A., USA) 를이용하여 ph를측정하였다. 산도는분쇄후거른김치액 20 ml를 0.1N NaOH을사용하여 ph 8.3이되도록중화적정한후, 소비된 NaOH량을젖산함량 (%) 으로환산하여나타내었다. - 42 -

라. 균수측정제조한 8군의실험군김치와대조군김치를대상으로총균, 유산균을측정하고자분쇄한 25g의김치를스토마커를이용하여 10배희석한후, 희석한액을순차적으로희석한후필름배지에 30 에서 48시간동안총균은호기배양, 유산균은혐기배양하여계수하였다. 마. genomic DNA 추출및 PCR 증폭미생물분리에사용한현탁액을원심분리 (13,000 g, 10 min) 하여균체를취하고멸균된생리식염수에균체를 2회세척한후, DNA Prep kit (Quiagen, Valecia, CA, USA) 를사용하여 DNA를추출하였다. 추출된 DNA의 16S rrna gene 증폭을위하여 GC clamp가부착된 338F(5 -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 ) 와 518R(5 -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ) primer를이용하였다. PCR 반응시 Takara Perfect Premix () 10 μl에 DNA template (20 µg/ ml ) 1μl, forward와 reverse primer (1.0 µm) 를각각 1 μl씩넣고나머지는증류수를첨가하여총부피가 20 μl가되도록제조하였다. PCR 증폭은 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany) 으로수행하였다. PCR 반응은 95 에서 5분 (initail denaturation), 94 에서 45초 (denaturation), 52 에서 45초 (annealing), 72 에서 1분 (extension) 을 30 cycles 실시하였고, 72 에서 5분간최종 extension을실시하였다. 바. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) 분석 PCR을이용하여증폭된 DNA는 Bio-Rad DCode TM Universal Mutation Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) 을이용하여 8% (w/v) polyacrylamide gel (urea 와 foramide의첨가량을달리한 30-60% 의 gradient gel) 을만든다음, loading 하여 60V, 60 에서 16시간전기영동하였다. 전기영동이끝난후 EtBr로염색하고 UV-transilluminator을이용하여 DNA band를확인하였다. 사. 관능검사종균첨가김치의기호도를평가하기위하여저장기간연장효과를나타내었던 Lc.lactis 10 7 CFU/g 에 Lc.lactis의배양액을 10% 첨가해주었던그룹을선발하여발효적숙기 (ph 4.2~4.3) 의관능검사를수행하였다. 관능검사패널은세계김치연구소관능검사요원 10명을대상으로양념냄새, 젓갈냄새, 이취, 군덕내, 짠맛, 매운맛, 쓴맛, 감칠맛, 단맛, 신맛, 이미, 붉은정도, 전체기호도, 항목에대해서 7점척도법으로수행하였다. - 43 -

2. 실험결과 가. ph 및산도의변화김치를제조하여 8±0.5 저장고에저장하면서이들의 ph와산도의경시적인변화를관찰하였다. Table 1-1에서보듯이제조한날부터그룹간의 ph차가크게나타났으며, 특히나김치중량의 0.02% 의젖산을첨가한군모두에서대조군에비해 ph가현격히낮아지는것을확인할수있었다. 숙성 14일만에대조군은 ph가 4.15로낮아졌고, 절임양념을 65 에서 30분열처리한김치군또한 4.24로낮아졌으나, 나머지처리군에서는적숙기 ph 인 4.3 보다높은수치를나타냈다. 숙성 49일까지도 Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치군, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 2% 의 lactose, 김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치군, 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치군, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치군, 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치군의 ph는 4.29에서 4.44 범위로적숙기김치 ph인 4.3 보다높은경향을보였다. 이들처리군의발효가지연됨을알수있었고, 이중 Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치군, 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치군의경우, 실험종료일인 56일간의발효에도적숙기상태를유지함을확인할수있었다. 또한 Table 1-2를통해산도의변화를살펴보면, ph와유사한경향을보였다. 특히나, 김치를제조한당일의산도를살펴보면, 김치중량의 0.02% 의젖산을첨가한군모두에서대조군에비해 ph 결과와유사한결과로산도가높아지는것을확인하였다. 숙성 35일까지도절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치군, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치군, 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치군의산도는 0.77에서 0.87 범위로적숙기김치의산도인 0.7~0.9 범위내에있는경향을경향을보였다. 이들처리군의발효가지연됨을알수있었고, 이중 Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치군, 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치군의경우, 실험종료일인 56일간의발효에도적숙기상태의산도를유지함을확인할수있었다. - 44 -

Table 1-1. 종균을첨가하여담근김치의 ph 변화 Control: 대조군, B: 절임양념을 65 에서 30 분열처리한김치, LA: 김치중량의 0.02% 젖산첨가김치, B+LA: 절임 양념을 65 에서 30 분열처리및김치중량 0.02% 젖산첨가김치, Lc. lactis : Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + lac: Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 2% 의 lactose, 김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + B: 절임양념을 65 에서 30 분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김 치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + LA: Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 0.02% 젖산, 김치 중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + B + LA: 절임양념을 65 에서 30 분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치. Table 1-2. 종균을첨가하여담근김치의산도변화 Control: 대조군, B: 절임양념을 65 에서 30 분열처리한김치, LA: 김치중량의 0.02% 젖산첨가김치, B+LA: 절임 양념을 65 에서 30 분열처리및김치중량 0.02% 젖산첨가김치, Lc. lactis : Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + lac: Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 2% 의 lactose, 김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + B: 절임양념을 65 에서 30 분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김 치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + LA: Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 0.02% 젖산, 김치 중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + B + LA: 절임양념을 65 에서 30 분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치. 나. 총균및유산균수의변화대조군김치와실험처리한 8군의총균수와유산균수의변화를살펴본결과총균수의경우, 담금당일에는대조군에비해 Lc. lactis를첨가한김치군의총균수가현저하게높음을알수있었다. 하지만 Lc. lactis와함께젖산이첨가한김치군의경우대조군과유사한균 - 45 -

수를나타내었다. 이를통해젖산의첨가로인해균의일부가저해또는사멸됨을예측할수있었다. 숙성이진행됨에따른총균수의변화를관찰한결과, 절임양념을 65 에서 30 분열처리한군의경우총균수가대조군에비해높게나타나는경향을보였으며, 젖산을첨가한군의경우대조군에비해낮게나타는경향을통해열처리와젖산의첨가가균의성장에영향을미침을확인할수있었다. 이는실험이종료되는 56일동안의숙성기간동안동일한경향을보였으며, Lc. lactis만첨가한군과대조군을비교한결과, Lc. lactis 첨가군의경우총균수가지속적으로높게나타났으며, 이를통해첨가해준균이김치내에지속적으로잘유지되고있음을예측할수있었다. 유산균수의변화를살펴본결과 (Table 1-4), 총균수와유사한경향을보였다. 담금당일의유산균수비교결과, 대조군에비해 Lc. lactis를첨가한김치군의유산균수가현저하게높게나타났으며, 젖산을첨가한김치군의경우대조군과유사하거나현저하게낮은유산균수를나타내었다. 이를통해총균수의저해또는사멸경향이유산균수의저해또는사멸을통한저감임을예측할수있었다. 숙성이진행됨에따른유산균수의변화를관찰한결과, 총균수의변화와동일한경향으로, 절임양념을 65 에서 30분열처리한군의경우유산균수가대조군에비해높게나타나는경향을보였으며, 젖산을첨가한군의경우대조군에비해낮게나타는경향을통해열처리와젖산의첨가가유산균의성장에도영향을미침을확인할수있었다. 이는실험이종료되는 56일동안의숙성기간동안동일한경향을보였으며, Lc. lactis만첨가한군과대조군을비교한결과, Lc. lactis 첨가군의경우유산균수가지속적으로높게나타났다. Table 1-3. 종균을첨가하여담근김치의총균수변화 Control: 대조군, B: 절임양념을 65 에서 30 분열처리한김치, LA: 김치중량의 0.02% 젖산첨가김치, B+LA: 절임 양념을 65 에서 30 분열처리및김치중량 0.02% 젖산첨가김치, Lc. lactis : Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + lac: Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 2% 의 lactose, 김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + B: 절임양념을 65 에서 30 분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김 치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + LA: Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 0.02% 젖산, 김치 중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + B + LA: 절임양념을 65 에서 30 분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치. - 46 -

Table 1-4. 종균을첨가하여담근김치의유산균수변화 Control: 대조군, B: 절임양념을 65 에서 30 분열처리한김치, LA: 김치중량의 0.02% 젖산첨가김치, B+LA: 절임 양념을 65 에서 30 분열처리및김치중량 0.02% 젖산첨가김치, Lc. lactis : Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + lac: Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 2% 의 lactose, 김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + B: 절임양념을 65 에서 30 분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김 치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + LA: Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 0.02% 젖산, 김치 중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + B + LA: 절임양념을 65 에서 30 분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g 와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치. 다. DGGE법에의한미생물군집분석대조군김치와실험처리한 8군의미생물군집을분석하여 DGGE법을통해그양상을확인하였으며, 그결과는 Fig. 1-1., Fig. 1-2., Table 1-5와같다. DGGE 분석을통해첨가한 Lc. lactis가우점하고있음을확인하였고, 4주, 8주의결과를통해서도첨가한균이발효기간이지속됨에도계속해서유지되고있을뿐만아니라우점균으로존재하고있음도확인할수있었다. 또한김치발효시초기의우점하는균으로알려진 Leuconostoc mesenteroides와 Weisella sp. 이 Lc. lactis 첨가군에서발현되지않음을확인할수있었다. 따라서 Lc. lactis를첨가함에따라 Leuconostoc mesenteroides와 Weisella sp. 의발현을억제함에따른효과를보이고있다는것을유추할수있다. Fig. 1-2에 thetayc calculator를통해분석한결과를 phylogenetic tree로나타냈으며, Lc. lactis를첨가한군간의유의성의높게나타났으며, 젖산을첨가한군간의유의성또한높게나타났다. 이는 8주의발효기간동안에서동일한양상을나타냄을확인할수있었다. - 47 -

Fig. 1-1. DGGE법에의한미생물군집분석 Control: 대조군, B: 절임양념을 65 에서 30분열처리한김치, LA: 김치중량의 0.02% 젖산첨가김치, B+LA: 절임양념을 65 에서 30분열처리및김치중량 0.02% 젖산첨가김치, Lc. lactis : Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + lac: Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 2% 의 lactose, 김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + B: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + LA: Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + B + LA: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치. Table 1-5. DGGE 법에의한미생물분석 Band Closet relatives Accession No. % Sequence similanty a Leuconostoc mesenteroides KF673539.1 99 b Lactobacillus sakei JN851763.1 92 c Lactococcus lactis GU427920.1 98 d Leuconostoc gelidum KF577567.1 96 e Weissella sp. KF999720.1 99-48 -

Fig. 1-2. Phylogenetic tree (A) 0주, (B) 8주, Control: 대조군, B: 절임양념을 65 에서 30분열처리한김치, LA: 김치중량의 0.02% 젖산첨가김치, B+LA: 절임양념을 65 에서 30분열처리및김치중량 0.02% 젖산첨가김치, Lc. lactis : Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + lac: Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 2% 의 lactose, 김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + B: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + LA: Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치, Lc. lactic + B + LA: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 0.02% 젖산, 김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치. 라. 관능평가대조군김치와저장기간이연장된 Lc. lactis 및배양액을첨가한김치의기호도를평가하기위하여세계김치연구소관능검사요원 10명을대상으로양념냄새, 젓갈냄새, 이취, 군덕내, 짠맛, 매운맛, 쓴맛, 감칠맛, 단맛, 신맛, 이미, 붉은정도, 전체기호도항목에대해 7점척도법으로관능검사를수행한결과종균첨가김치가대체적으로우수한평가를받았다. - 49 -

Fig. 1-3. 관능평가 Control: 대조군, Lc. lactis : Lc. lactis 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액첨가김치 - 50 -

제 4 절미생물첨가제제형별에따른효과분석 1. 실험방법 가. 김치첨가배양액제조 Lc. lactis를 MRS broth 5ml에접종하여 30 에서 24시간동안 1차전배양을하였다. 상기 1차전배양액을 MRS 및배추즙에 1.0%(v/v) 접종하여 30 에서 18시간동안배양하였다. 실험에사용한배추즙은배추를블랜더로분쇄, 착즙후재제염을사용하여식염 2% (v/v), 포도당 1.0%(w/v) 를첨가한후, 멸균하여배양액으로이용하였다. 나. Alginate beads 제조위에서설명한바와마찬가지로 Lc. lactis를 MRS broth에배양한후 8000rpm에서 10분동안원심분리하여균체를농축하고균액과동량의 2% alginate를첨가하여최종적으로 1% alginate 용액을제조하였다. 이러한유산균과 alginate 1% 혼합용액을 2.0 mm의비드로코팅하여 10% 콩가루수용액과함께 48시간동안동결건조후 sodium citrate에비드를용해시켜 8000rpm, 10분동안원심분리를통해상등액을제거하고균체를 1x10 7 CFU/g으로균체배양액과함께김치에첨가하였다. 다. 김치제조절임배추와절임양념 ( 배합비 : 무 31.6%, 고춧가루 15.8%, 다시물 7.4%, 멸치액젓 7.5%, 새우젓 6.3%, 마늘 5.4%, 찹쌀죽 4.7%, 양파 3.2%, 대파 3.2%, 멸치젓 3.3%, 건고추 2.8%, 배 2.2%, 쪽파 1.6%, 생강 1.6%, 설탕 1.6%, 갓 0.9%, 황석어젓 0.9%) 을구매하였으며, 대조구, Lc. lactis를 MRS broth에접종하여 1 10 7 CFU/g과김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액을첨가한그룹, Lc. lactis를배추즙에접종하여 1 10 7 CFU/g과김치중량 10% 의 Lc. lactis 배양액을첨가한그룹, Lc. lactis를 MRS broth에접종하여 alginate beads로코팅하여동결건조후 1 10 7 CFU/g과김치중량 10% 의배양액을첨가한그룹으로구성하였다. 담근종균김치는 PE 재질의플라스틱통에담아포장하여 8 에서저장하면서실험을수행하였다. 라. 이화학분석제조한 3그룹의실험군김치와대조군김치를대상으로산도와 ph를측정하였다. ph 및산도를측정하기위하여각김치 300 g을분쇄후거즈로여과하여김치액을제조하였다. 분쇄한김치 100g을 ph 미터 (Thermo Orion 720A., USA) 를이용하여 ph를측정 였다. 산도는분쇄후거른김치액 20 ml를 0.1N NaOH을사용하여 ph 8.3이되도록중 - 51 -

화적정한후, 소비된 NaOH 량을젖산함량 (%) 으로환산하여나타내었다. 마. 유산균분리및대장균군계수김치로부터종균첨가방법에따른총균, 유산균및대장균군분석을수행하고자 300g의김치시료를취한후살균된 blender에곱게갈아 25g을 225ml의멸균식염수와함께스토마커백에넣고 3분동안균질화시켰다. 순차적으로희석한뒤, 총균은 3M사의 petrifilm 제품 aerobic count plate에 1ml씩분주하여 30 에서 48시간동안배양하여계수하였다. 유산균은희석액을다시 2X MRS broth에 1:1로희석하여 3M사의 petrifilm 제품 aerobic count plate에 1ml씩분주하여 30 에서 48시간동안혐기적으로배양한다음계수하였다. 대장균군또한 3M사의 petrifilm 제품 petrifilm coliform count plate를이용하여 1ml씩떨어뜨려 30 에서 48시간동안배양한뒤계수하였다 바. 미생물첨가시기를달리한김치양념제조절임양념 ( 배합비 : 무 31.6%, 고춧가루 15.8%, 다시물 7.4%, 멸치액젓 7.5%, 새우젓 6.3%, 마늘 5.4%, 찹쌀죽 4.7%, 양파 3.2%, 대파 3.2%, 멸치젓 3.3%, 건고추 2.8%, 배 2.2%, 쪽파 1.6%, 생강 1.6%, 설탕 1.6%, 갓 0.9%, 황석어젓 0.9%) 을구매하여무처리대조군, Lc. lactis를 MRS broth 5ml에접종하여 30 에서 24시간동안 1차전배양시키고, 상기 1차전배양액을 MRS 에접종하여 1x10 5 CFU/g을절임양념에처리하여 24시간숙성시킨그룹으로구성하였다. 2. 실험결과 가. Lc. lactis의첨가방법을달리한김치의 ph 및산도의변화김치를제조하여 8 저장고에저장하면서이들의 ph와산도의경시적인변화를관찰하였다. Table 1-1에서보듯이대조군김치와배추즙에서배양한 Lc. lactis 첨가김치에서숙성 14일만에적숙기의 ph인 ph 4.3 이하에도달하였고, Lc. lactis를 MRS 배양액에배양한김치와비드로제조하여첨가한김치군은대조군김치보다발효진행을늦춰, 적숙기기간 - 52 -

을연장시키는경향을보였다. 산도역시숙성 14 일째 ph 와동일한경향을보여, Lc. lactis 를 MRS 배양액에배양한김치와비드로제조하여첨가한김치군의산도의경우대조군에 비해천천히증가함을확인하였다. 나. Lc. lactis의첨가방법을달리한김치균수의변화 Lc. lactis를첨가방법을달리하여첨가한김치와대조군김치의총균과유산균수의변화를살펴본결과담금당일에는종균 Lc. lactis를첨가한김치와대조군사이에현저한차이가있음을알수있었으나, 대장균군을측정한결과에서는군간의차이를보이지않았다. 다. Lc. lactis 의첨가시기를달리한김치균수의변화 Lc. lactis 의첨가시기를달리한절임양념의균수변화를확인하고자한결과균을첨가한 후 24 시간동안숙성시킨후에도대조군과비슷한수준으로유지되는것을확인하였다. Table 1-1. 미생물첨가방법에따른 ph 변화 ( 평균치 ) ( 단위 : CFU/g) Control: 대조군, MRS: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, MRS broth에배양한 Lc. lactis를 1 10 7 CFU/g와김 치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, chinese cabbage juice: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, 배추즙에 배양한 Lc. lactis를 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치. Table 1-2. 미생물첨가방법에따른산도변화 ( 평균치 ) ( 단위 : %) Control: 대조군, MRS: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, MRS broth에배양한 Lc. lactis를 1 10 7 CFU/g와김 치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, chinese cabbage juice: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, 배추즙에 배양한 Lc. lactis를 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치. - 53 -

Table 1-3. 미생물첨가방법을달리한김치의총균수변화 ( 단위 : CFU/g) Control: 대조군, MRS: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, MRS broth에배양한 Lc. lactis를 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, chinese cabbage juice: 절임양념을 65 에서 30분 열처리후, 배추즙에배양한 Lc. lactis를 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치. Table 1-4. 미생물첨가방법을달리한김치의유산균수변화 ( 단위 : CFU/g) Control: 대조군, MRS: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, MRS broth에배양한 Lc. lactis를 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, chinese cabbage juice: 절임양념을 65 에서 30분 열처리후, 배추즙에배양한 Lc. lactis를 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치. Table 1-5. 미생물첨가방법을달리한김치의대장균군수변화 ( 단위 : CFU/g) Control: 대조군, MRS: 절임양념을 65 에서 30분열처리후, MRS broth에배양한 Lc. lactis를 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치, chinese cabbage juice: 절임양념을 65 에서 30분 열처리후, 배추즙에배양한 Lc. lactis를 1 10 7 CFU/g와김치중량 10% Lc. lactis 배양액첨가김치. Table 1-6. 미생물첨가시기를달리한절임양념의총균수 ( 단위 : CFU/g) Control: 대조군, Lc. lactis: 절임양념에 Lc. lactis를 1 10 5 CFU/g 첨가김치 - 54 -

Table 1-7. 미생물첨가시기를달리한절임양념의유산균수 ( 단위 : CFU/g) Control: 대조군, Lc. lactis: 절임양념에 Lc. lactis 를 1 10 5 CFU/g 첨가김치 Table 1-8. 미생물첨가시기를달리한절임양념의대장균군수 ( 단위 : CFU/g) Control: 대조군, Lc. lactis: 절임양념에 Lc. lactis 를 1 10 5 CFU/g 첨가김치 3. 고찰 미생물첨가제의첨가시기와첨가방법에따른김치의발효양상을비교하고자하였다. Lc. lactis를첨가방법을달리하여제조한김치를 8±0.5 저장고에저장하면서이들의 ph, 산도, 총균수와유산균수, 대장균군의변화를관찰하였다. 담금당일의총균수와유산균수를확인한결과, 총균수와유산균수는대조군에비해큰차이를보였고대장균군은비슷한수준으로측정되었다. 7일째숙성됨에따라실험처리군의총균수및유산균수가높게나타났으며, 균첨가방법에따른차이는보이지않았다. Lc. lactis와김치중량의 10% 배양액을함께첨가하여잘섞어준후김치를담근김치그룹들에서는적숙기상태의 ph를대조군대비오랜기간동안유지하고있었으며, 산도가가장낮게나타났다. 본실험을통해서미생물첨가방법을달리한김치를제조함에따라미생물활성의차이가나타나는지확인하고자하였지만모두비슷한수준으로발효지연효과를나타내었다. 따라서 Lc. lactis를제제화하여이를김치에적용하여도대조군과비교하여품질유지기한이연장된김치를제조할수있을것으로사료되었다. 또한미생물첨가시기에따른미생물변화로미루어보았을때추가적인숙성과정없이김치를담글때절임양념에종균과함께배양액을잘섞어김치를제조하는것이효과적으로적용시킬수있는방법으로사료되었다. - 55 -

제 5 절미생물첨가제를이용한저염김치대장균군제어기술개발 통상적으로김치제조시김치의주재료인야채를소금에절여서야채의조직을연하게하여김치의식감을향상시키고양념의침투를용이하게하며보존성을높여왔다. 이로인해김치에는보통 2.5 3% 내외의식염이함유되어있어다량섭취시염분으로인해여러가지순환기질환의발병우려가있으며, 뇌혈관질환, 허혈성심질환, 신장질환등을가진 40 70세환자들은김치를선호하나, 염분때문에김치의섭취를제한해야하는어려움이있었다. 최근에건강에대한관심이높아지면서염도가높은김치에대한저염화에관한연구가활발히이루어지고있다. 하지만저염김치의등장으로인한김치의위생적인문제가발생할소지가있다. 대장균군의경우발효가진행될수록감소되어발효된김치에서는문제가되지않으나일부국가의경우초기대장균군균수를제한하고있어수출에어려움이있다. 따라서본연구에서는종균첨가에따른저염김치대장균군감소효과를알아보았다. 1. 실험방법 가. 김치첨가배양액제조 Lc. lactis 와 Lb. brevis를 MRS broth 5ml에접종하여 30 에서 24시간동안 1차전배양을하였다. 상기 1차전배양을배추즙에 1.0%(v/v) 접종하여 30 에서 18시간동안배양하였다. 실험에사용한배추즙은배추를블랜더로분쇄, 착즙후재제염을사용하여식염 2%(v/v), 포도당 1.0%(w/v) 를첨가한후, 멸균하여배양액으로이용하였다. 나. 김치제조염도 2% 이상김치와염도 1.4% 이하저염김치제조를위하여원료배추를잘다듬은후천일염으로제조한 10%(w/v) 와 8%(w/v) 의소금용액에서 8 10시간실내온도에서절임하고흐르는물에 3회세척하여 3 4시간탈수하였다. 배합비는탈수된절임배추 100g에대하여파 1.241g, 마늘 0.6g, 생강 0.16g, 고춧가루 0.92g, 물 0.215g으로하였고제조된김치의염도는약 2.0% 와 1.4% 를나타내었다. 분리한우수종균 Lc. lactis와 Lb. brevis는김치전체중량에대하여배양액을 2.0%(w/v) 첨가하였다. 담은종균김치는나일론 +PE용포장지에담아포장하였다. 다. 유산균분리및대장균군계수 적숙기김치로부터염도 2% 김치와염도 1.4% 저염김치간의미생물군집비교분석및 대장균군분석을수행하고자거즈를이용하여김치국물에있는고형분을제거하고순차적 - 56 -

으로희석한뒤, 유산균은 MRS Agar에 0.2% BPB 지시약 1% 를넣어제조한 MRS-BPB 배지에도말하여 30 에서 48시간동안혐기적으로배양한다음 colony를분리하였다. 대장균군은 3M사의 petrifilm 제품 petrifilm coliform count plate를이용하여 1ml씩떨어뜨려 37 에서 24시간동안배양한뒤계수하였다. 2. 실험결과및고찰 가. 일반김치와저염김치간의미생물군집비교분석염도 2.0% 김치와염도 1.4% 저염김치간의미생물군집을비교분석해본결과염도 2% 김치에서는 Leu. mesenteroides가 70% 로우점하고있었으며 W. cibaria는 20%, Leu. pseudomesenteroides가 10% 를차지하고있었다. 반면 1.4% 저염김치에서는 Leu. mesenteroides가 84.22%, Leu. lactis가 5.26%. Leu. pseudomesenteroides 5.26%, Leu. garlicum이 5.26% 로우점하는것으로나타나염도차이에따라미생물분포가차이가있음을알수있었으며이는김치발효특성에어느정도영향을미칠것으로예상되었다. 염도 2% 김치 염도 1.4% 김치 Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Weissella cibaria Leuconostoc pseudomesenteroides Leuconostoc lactis Leuconostoc pseudomesentero Leuconostoc garlicum Fig. 1. 염도에따른미생물군집분포 염도 1.4% 김치와염도 2.0% 김치비교 - 57 -

나. 미생물첨가에의한대장균군변화분석대장균의경우발효가진행될수록감소되어발효된김치에서는문제가되지않으나일부국가의경우초기대장균군균수를제한하고있어수출에어려움이있다. 또한최근에는저염김치의등장으로위생적인문제가발생할소지를내포하고있다. 종균첨가김치의대장균군균수변화를살펴본결과담금당일에는대조군과유사한균수를나타내었지만김치발효가진행됨에따라종균을첨가한실험군에서대조군보다그감속속도가훨씬빠른것으로나타났다. 이는첨가한미생물들이생산해내는 bacteriocin 등의항균물질이이들대장균군을제어하는것으로사료되며이들항균물질의특성및기작에대해서는향후실험을진행할예정이다. 2.0 Bacteria count (cfu/ml) 1.5 1.0 0.5 2% Control 1.4% Control 1.4% Weissella 0.0 0 7 14 21 28 35 42 Time (d) Fig. 2. 종균을첨가하여제조한김치의대장균군변화 (4 ) 염도 2.0% Control: 일반김치대조군, 염도 1.4% Control: 저염김치대조군 염도 1.4% W. cibaria : W. cibaria 첨가김치, - 58 -

5 Bacteria count (cfu/ml) 4 3 2 1 2.0% Control 1.4% Control 1.4% Lc. lactis 1.4% Lb. brevis 1.4% Lc. lactis+lb. brevis 0 0 3 6 9 12 15 18 21 Time (d) Fig. 3. 종균을첨가하여제조한김치의대장균군변화 (10 ) 염도 2.0% Control: 일반김치대조군, 염도 1.4% Control: 저염김치대조군 1.4% Lc. lactis: Lc. lactis 2.0% 첨가염도 1.4% 김치, 1.4% Lb. brevis: Lb. brevis 2.0% 첨가염도 1.4% 김치, 1.4% Lc. lactis + Lb. brevis: Lc. lactis 1.0%, Lb. brevis 각각 1.0% 첨가염도 1.4% 김치 - 59 -

제 6 절계절별원 부재료미생물분포조사 미생물조절에의한김치의품질균일화와보존기간연장을위해서는우수한김치발효특성을갖는미생물스타터의개발이필요하며, 이와병행하여김치제조용원료의청정화가선행되어져야한다. 김치는자연의혼합발효식품으로초기에원 부재료와제조과정중여러가지미생물원으로부터주미생물인유산균외에일반세균, 효모및곰팡이그리고오염지표군인대장균군까지유래된다. 김치의원부재료인배추, 고춧가루, 파, 양파, 마늘, 생강등에는높은수준의대장균군이존재하며, 김치발효에관여하는 80% 가량의유산균이절인배추로부터유래하는등김치의발효양상및위생학적측면에있어매우중요한영향을미친다. 본연구에서는김치의주원료인배추를포함한시판부재료의초기균수를조사하였다. 1. 실험방법 가. 사용된배추및기타부재료계절별수확시기에따른원료배추는겨울에는영암, 해남에서수확한배추 2종과대형마트에서판매중인국내산배추 1종을봄에는해남과국산배추를실험에사용하였다. 기타실험에사용한김치제조용부재료인파, 고춧가루, 마늘, 생강, 무는광주시내에있는대형마트들과시장에서구입하여실험에사용하였다. 나. 사용배지총균수측정을위하여 plate count agar(pca; Difco 제품 ), 유산균수는 Lactobacilli MRS agar와 broth(difco 제품 ), 효모및곰팡이는 potato dextrose agar(pda; Difco 제품 ), 대장균군수는 3M사의 petrifilm 제품인 petrifilm coliform count plate 배지를사용하였다. 다. 원 부재료의전처리원료배추의경우, 겉잎을떼어내고절임하기직전의상태로깨끗이다듬은후, 1/4 등분하여겉잎과속잎을각각 100g 정도씩고루취하였다. 절임배추는천일염으로제조한 10%(w/v) 의소금용액에서 12 15시간실내온도에서절임하고흐르는물에 3회세척하여 3 4시간탈수시켰다. 시료는곱게다진후에 25g을취하여 100ml의멸균식염수와함께살균된 waring blender로 high speed에서 30초간균질화시켰다. 파, 마늘, 생강, 무및고춧가루는김치담그기전의상태로다듬어수돗물로세척한후, 위와같은방법으로균질화시켰다. 균질화시킨각시료는필요에따라적당한단계로희석하여 spreading culture method 방법으로총균수, 유산균수, 효모및곰팡이와대장균군의균수를측정하였다. - 60 -

2. 실험결과 봄, 여름, 겨울철에각기다른 3 지역의배추, 무, 마늘생강, 파, 고춧가루를구입하여초기 균수를측정하였다. 가. 배추봄배추의총균수는 1.68 x 10 5 cfu/g에서 2.96 x 10 5 cfu/g의범위에있었으며, 평균적으 로 2.3 x 10 5 cfu/g을보였다. 유산균수는 2.4 x 10 3 cfu/g 에서 5 x 10 3 cfu/g 범위에있었 으며평균 3.7 x 10 3 cfu/g 이었다. 효모및곰팡이는 2.17 x 10 2 cfu/g에서 7.5 x 10 2 cfu/g 범위에있었으며, 평균적으로 4.8 x 10 2 cfu/g이었다. 대장균군은 2 x 10 1 cfu/g에서 6.6 x 10 3 cfu/g의범위에있었으며평균 3.31 x 10 3 cfu/g이었다 (Table 1-1, 1-4). 천일염에절인 봄배추의총균수는 4.9 x 10 4 cfu/g에서 1.2 x 10 5 cfu/g의범위에있었으며, 평균적으로 8.5 x 10 4 cfu/g을보였다. 유산균수는 2 x 10 2 cfu/g에서 4.33 x 10 2 cfu/g 범위에있었으며 평균 3.17 x 10 2 cfu/g 이었다. 효모및곰팡이는 2.17 x 10 2 cfu/g에서 7.5 x 10 2 cfu/g 범 위에있었으며, 평균적으로 4.8 x 10 2 cfu/g이었다. 대장균군은검출되지않거나 2.5 x 10 3 범위에있었으며, 평균적으로 1.25 x 10 3 cfu/g이었다. 여름배추의총균수는 8.00 x 10 5 cfu/g에서 8.15 x 10 6 cfu/g의범위에있었으며, 평균적으로 4.9 x 10 6 cfu/g을보였다. 유산 균수는 1.39 x 10 3 cfu/g 에서 4.20 x 10 3 cfu/g 범위에있었으며평균 9.26 x 10 6 cfu/g 이 었다. 효모및곰팡이는 3.05 x 10 2 cfu/g에서 1.16 x 10 3 cfu/g 범위에있었으며, 평균적으 로 8.33 x 10 2 cfu/g이었다. 대장균군은검출되지않았다 (Table 1-2, 1-4). 겨울철영암, 해 남, 국내산배추의총균수는 1.60 x 10 6 cfu/g에서 4.82 x 10 6 cfu/g의범위에있었으며, 평 균적으로 1.02 x 10 6 cfu/g을보였다. 유산균수는평균 1.43 x 10 2 cfu/g을나타내었다. 효 모및곰팡이는검출되지않거나 3.6 x 10 2 cfu/g 범위에있었으며, 평균적으로 8.2 x 10 2 cfu/g이었다. 대장균군은검출되지않거나 7.5 x 10 1 cfu/g의범위에있었으며평균 2.5 x 10 1 cfu/g을나타내었다. 천일염에절인겨울배추의총균수는 1.4 x 10 5 cfu/g에서 1.73 x 10 6 cfu/g의범위에있었으며, 평균적으로 7.07 x 10 5 cfu/g을보였다. 유산균수는 1.4 x 10 2 cfu/g에서 3.8 x 10 2 cfu/g 범위에있었으며평균 2.27 x 10 2 cfu/g 이었다. 효모및곰팡이 는 1.6 x 10 1 cfu/g에서 1.05 x 10 3 cfu/g 범위에있었으며, 평균적으로 4.7 x 10 2 cfu/g 이 었다. 대장균군은검출되지않았거나 3 x 10 1 cfu/g 범위에있었으며, 평균적으로 1 x 10 1 cfu/g 이었다 (Table 1-3, 1-5). 나. 무 봄무의경우총균수는 7.6 x 10 2 cfu/g 에서 3.5 x 10 4 cfu/g 의범위에있었으며, 평균적으 - 61 -

로 1.4 x 10 4 cfu/g을보였다. 유산균수는 5 x 10 1 cfu/g에서 1.7 x 10 3 cfu/g 범위에있었으 며평균 7.12 x 10 2 cfu/g 이었다. 효모및곰팡이는검출되지않았다. 대장균군은검출되 지않았거나 7 x 10 1 cfu/g 범위에있었으며평균 3.3 x 10 1 cfu/g 이었다 (Table 1-1, 1-6). 여름무의경우총균수는 2.20 x 10 4 cfu/g에서 4.40 x 10 4 cfu/g의범위에있었으며, 평균 적으로 3.56 x 10 4 cfu/g을보였다. 유산균수는 1.70 x 10 2 cfu/g에서 8.10 x 10 4 cfu/g 범위 에있었으며평균 2.77 x 10 4 cfu/g 이었다. 효모및곰팡이는 4.0 x 10 1 cfu/g에서 3.30 x 10 2 cfu/g 범위에있었으며, 평균적으로 1.47 x 10 2 cfu/g이었다. 대장균군은검출되지않았 다 (Table 1-2, 1-6). 겨울무의경우총균수는 5.7 x 10 3 cfu/g에서 1.02 x 10 4 cfu/g의범위 에있었으며, 평균적으로 8.6 x 10 3 cfu/g을보였다. 유산균수는 5 x 10 1 cfu/g에서 7.7 x 10 3 cfu/g 범위에있었으며평균 2.81 x 10 3 cfu/g 이었다. 효모및곰팡이는검출되지않 거나 1.5 x 10 2 cfu/g 범위에있었으며, 평균적으로 6.7 x 10 1 cfu/g이었다. 대장균군은 1.2 x 10 1 cfu/g에서 1.52 x 10 2 cfu/g 범위에있었으며평균 6.6 x 10 1 cfu/g 이었다 (Table 1-3, 1-6). 다. 마늘마늘의경우총균수는 1.13 x 10 6 cfu/g에서 1.37 x 10 7 cfu/g의범위에있었으며, 평균적 으로 8.7 x 10 6 cfu/g을보였다. 유산균수는 1.34 x 10 6 cfu/g에서 1.13 x 10 7 cfu/g 범위에 있었으며평균 7.4 x 10 6 cfu/g 이었다. 효모및곰팡이는검출되지않았거나 1.67 x 10 4 cfu/g 범위에있었으며, 평균적으로 5.6 x 10 3 cfu/g이었다. 대장균군은검출되지않았다 (Table 1-1, 1-7). 봄마늘의미생물변화양상은껍질을까지않은상태의마늘의경우와 많이달랐다. 깐마늘의경우수작업및기계작업에의하여이루어지므로이러한제조과 정과유통과정에서많은균이오염될수있고, 껍질을벗긴상태에서유통중균의생육 이일어날것으로생각되었다. 여름에도깐마늘을구입하여실험하였다. 그결과, 총균수 는 1.80 x 10 4 cfu/g에서 1.86 x 10 7 cfu/g의범위에있었으며, 평균적으로 9.93 x 10 7 cfu/g 을보였다. 유산균수는 2.90 x 10 6 cfu/g에서 1.37 x 10 9 cfu/g 범위에있었으며평균 7.10 x 10 8 cfu/g 이었다. 효모및곰팡이는 7.0 x 10 1 cfu/g에서 4.25 x 10 4 cfu/g 범위에있었으 며, 평균적으로 1.45 x 10 4 cfu/g이었다. 대장균군은검출되지않거나 1.10 x 10 3 cfu/g 범 위에있었으며, 평균적으로 3.67 x 10 2 cfu/g이었다 (Table 1-2, 1-7). 겨울마늘은껍질을 까지않은상태의마늘을구입하여실험한결과총균수는 3 x 10 2 cfu/g에서 6.3 x 10 2 cfu/g의범위에있었으며, 평균적으로 5.2 x 10 2 cfu/g을보였다. 유산균수는 7.5 x 10 1 cfu/g에서 1.3 x 10 2 cfu/g 범위에있었으며평균 1.02 x 10 2 cfu/g 이었다. 효모및곰팡이 와대장균군은검출되지않았다 (Table 1-3, 1-7). - 62 -

라. 생강봄생강의경우총균수는 7.4 x 10 3 cfu/g에서 2.01 x 10 7 cfu/g의범위에있었으며, 평균 적으로 7 x 10 6 cfu/g을보였다. 유산균수는검출되지않았거나 8 x 10 2 cfu/g 범위에있었 으며평균 8.9 x 10 3 cfu/g 이었다. 효모및곰팡이는 1.3 x 10 3 cfu/g에서 1.14 x 10 5 cfu/g 범위에있었으며, 평균적으로 4.4 x 10 4 cfu/g이었다. 대장균군은검출되지않거나 2 x 10 1 cfu/g 범위에있었으며평균 6.6 cfu/g 이었다 (Table 1-1, 1-8). 여름생강의경우총균수는 2.05 x 10 5 cfu/g에서 5.20 x 10 6 cfu/g의범위에있었으며, 평균적으로 1.98 x 10 6 cfu/g을 보였다. 유산균수는 6.05 x 10 5 cfu/g에서 1.15 x 10 7 cfu/g 범위에있었으며평균 6.05 x 10 6 cfu/g 이었다. 효모및곰팡이는 2.50 x 10 2 cfu/g에서 1.07 x 10 4 cfu/g 범위에있었으 며, 평균적으로 5.0 x 10 2 cfu/g이었다. 대장균군은검출되지않거나 4.35 x 10 4 cfu/g 범위 에있었으며평균 1.51 x 10 4 cfu/g 이었다 (Table 1-2, 1-8). 겨울생강의경우총균수는 1.68 x 10 6 cfu/g에서 4.6 x 10 7 cfu/g의범위에있었으며, 평균적으로 2.38 x 10 7 cfu/g을 보였다. 유산균수는 3.67 x 10 2 cfu/g에서 9 x 10 2 cfu/g 범위에있었으며평균 6.34 x 10 2 cfu/g이었다. 효모및곰팡이는 2 x 10 3 cfu/g에서 2.39 x 10 4 cfu/g 범위에있었으며, 평균 적으로 1.3 x 10 4 cfu/g이었다. 대장균군은검출되지않았다 (Table 1-3, 1-8). 마. 파봄철파의총균수는 5 x 10 2 cfu/g에서 2.5 x 10 3 cfu/g의범위에있었으며, 평균적으로 1.4 x 10 3 cfu/g을보였다. 유산균수는 2.3 x 10 2 cfu/g에서 4.7 x 10 2 cfu/g 범위에있었으 며평균 3.43 x 10 2 cfu/g 이었다. 효모및곰팡이와대장균군은검출되지않았다 (Table 1-1, 1-9). 여름철파의총균수는 8.80 x 10 5 cfu/g에서 2.78 x 10 6 cfu/g의범위에있었으 며, 평균적으로 1.78 x 10 6 cfu/g을보였다. 유산균수는 7.20 x 10 2 cfu/g에서 1.41 x 10 4 cfu/g 범위에있었으며평균 5.11 x 10 4 cfu/g 이었다. 효모및곰팡이는 2.50 x 10 2 cfu/g 에서 9.50 x 10 3 cfu/g 범위에있었으며평균 3.58 x 10 3 cfu/g 이었다. 대장균군은 3.25 x 10 4 cfu/g에서 5.95 x 10 5 cfu/g 범위에있었으며평균 4.98 x 10 4 cfu/g 이었다 (Table 1-2, 1-9). 겨울철파의경우총균수는 1.12 x 10 4 cfu/g에서 1.47 x 10 7 cfu/g의범위에있었으 며, 평균적으로 4.9 x 10 6 cfu/g을보였다. 유산균수는 2.3 x 10 2 cfu/g에서 4.7 x 10 2 cfu/g 범위에있었으며평균 3.43 x 10 2 cfu/g 이었다. 효모및곰팡이는검출되지않거나 5 x 10 1 cfu/g 범위에있었으며, 평균적으로 1.6 x 10 1 cfu/g이었다. 대장균군은검출되지않았 다 (Table 1-3, 1-9). 바. 고추가루 김치제조용시판고춧가루의경우총균수는최저 3.4 x 10 4 cfu/g 에서최고 6.78 x 10 7-63 -

cfu/g로큰차이를보였고, 봄철, 여름철, 겨울철큰변화는없었다. 효모와곰팡이는검출되지않았거나 3.45 x 10 3 cfu/g의변화폭을보였으며, 대장균군의균수는검출되지않았거나 6.6 x 10 3 cfu/g을보였고유산균수는 1.40 x 10 2 cfu/g에서 6.2 x 10 6 cfu/g 정도의큰차이를보였다 (Table 1-10). 이러한결과로부터시판용고춧가루에서의미생물균수의변화는고추의수확후고춧가루의제조및저장조건에따라크게좌우될것으로판단되었다. Table 1-1. 봄철초기균수결과 ( 평균치 ) ( 단위 : CFU/g) ND : not detected Table 1-2. 여름철초기균수결과 ( 평균치 ) ( 단위 : CFU/g) ND : not detected - 64 -

Table 1-3. 겨울철초기균수결과 ( 평균치 ) ( 단위 : CFU/g) ND : not detected Table 1-4. 계절별배추초기균수결과 ( 단위 : CFU/g) ND : not detected Table 1-5. 계절별절임배추초기균수결과 ( 단위 : CFU/g) ND : not detected - 65 -

Table 1-6. 계절별무초기균수결과 ( 단위 : CFU/g) ND : not detected Table 1-7. 계절별마늘초기균수결과 ( 단위 : CFU/g) ND : not detected Table 1-8. 계절별생강초기균수결과 ( 단위 : CFU/g) ND : not detected - 66 -

Table 1-9. 계절별파초기균수결과 ( 단위 : CFU/g) ND : not detected Table 1-10. 계절별고춧가루초기균수결과 ( 단위 : CFU/g) ND : not detected - 67 -

제 7 절처리방법에따른원부재료초기균수저감화조사 원 부재료초기균수를측정한결과, 김치의원부재료인배추, 고춧가루, 파, 양파, 마늘, 생강등에는높은수준의대장균군이존재함을확인하였다. 미생물첨가제이용시이들이김치의발효양상및위생학적측면에있어매우중요한영향을미칠수있기에, 본연구에서는김치의주원료인배추를포함한시판부재료의초기균수저감화방안을조사하였다. 1. 실험방법 가. 사용된배추및기타부재료 원료배추및김치제조용부재료인파, 고춧가루, 마늘, 생강, 무는광주시내에있는대형 마트에서판매중인국내산재료들을구입하여실험에사용하였다. 나. 사용배지총균수, 유산균수측정을위하여 petrifilm(aerobic count plate:3m 제품 ), 효모및곰팡이는 petrifilm(yeast and mold count plate:3m 제품 ), 대장균군수또한 3M사의 petrifilm 제품인 petrifilm coliform count plate 배지를사용하였다. 다. 공정별미생물균수변화 (1) 원 부재료의전처리원료배추의경우, 겉잎을떼어내고절임하기직전의상태로깨끗이다듬은후, 1/4 등분하여겉잎과속잎을각각 50g 정도씩고루취하였다. 절임배추는천일염으로제조한 10%(w/v) 의소금용액에서 8 10시간실내온도에서절임하고흐르는물에 3회세척하여 3 4시간탈수시켰다. 소독수처리용원료는흐르는물에세척하여준비하였고, 저온살균용원료는김치담그기직전의상태로손질하여준비하였다. 준비된시료는소독한 blender곱게다진후에 25g을취하여 225ml의멸균식염수와함께살균된 waring blender로 high speed에서 30초간균질화시켰다. 파, 마늘, 생강, 무및고춧가루는김치담그기전의상태로다듬어수돗물로세척한후, 위와같은방법으로균질화시켰다. 균질화시킨각시료는필요에따라적당한단계로희석하여총균수, 유산균수, 효모및곰팡이와대장균군의균수를측정하였다. (2) 소독수에의한초기균수저감화원 부재료세척용소독수는시중에판매중인 4% 차아염소산나트륨액을 400배희석하여 100ppm으로제조하여사용하였다. 각재료들을흐르는물에세척하여제조한소독 - 68 -

수에각 0분, 2분, 5분동안침지하여초기균수를측정하였다. (3) 저온살균에의한초기균수저감화각재료들을흐르는물에세척한후김치담그기전의상태로다듬은후에 100g씩취하여 65 에맞춰진항온수조에서 30분간침지시켜살균처리하였다. (4) 김치양념의제조각재료들을전처리한후절임배추 83.8, 고춧가루 3, 무 3, 마늘 2.5, 생강 0.8, 파 2.5, 물 4.4 비율로양념을제조하고실험구는무처리구, 소독수 5분처리구, 저온살균처리구로진행하였다. 2. 실험결과및고찰 Table 1-1에서김치원 부재료들의초기균수저감화방안을탐색하기위해광주시내대형 마트에서구입한시료들을소독수침지및저온살균방법을사용하여비교하였다. 배추의총균 수는평균적으로 3.70 x 10 6 CFU/g범위에있었으며, 유산균수는평균 1.75 x 10 5 CFU/g을나타 내었다. 효모및곰팡이는평균적으로 1.15 x 10 3 CFU/g 범위에있었으며, 대장균군은검출되 지않았다. 실험결과소독수 5분처리구에서초기효모및곰팡이수가 34% 저감화되었다. 천일염에절인배추의총균수는평균적으로 4.65 x 10 5 CFU/g를나타내었고유산균수는평 균 4.52 x 10 4 CFU/g를나타내었다. 효모및곰팡이는평균 1.55 x 10 3 CFU/g 이었고대장균군 은 1.35 x 10 3 CFU/g 범위에있었다. 실험결과소독수 5분처리구에서초기대장균군, 효모및 곰팡이수가각각 31%, 100% 저감화되었다. 무의경우총균수는평균 4.10 x 10 4 CFU/g을보였다. 유산균수는평균 6.50 x 10 4 CFU/g 이 었다. 효모및곰팡이는평균적으로 2.00 x 10 1 CFU/g이였다. 대장균군은평균 1.25 x 10 3 CFU/g 이었다. 실험결과소독수 5분처리구에서초기대장균군, 효모및곰팡이수가각각 22%, 60% 저감화되었다. 마늘의총균수는평균적으로 3.05 x 10 7 CFU/g을보였다. 유산균수는평균 1.60 x 10 9 CFU/g 이였다. 효모및곰팡이는평균 1.35 x 10 4 이었고대장균군은검출되지않았다. 실험결과소독 수 5분처리구에서초기효모및곰팡이수가 22% 저감화되었다. 생강의경우총균수는평균적으로 5.45 x 10 5 CFU/g를나타내었다. 유산균수는평균 1.26 x 10 6 CFU/g이었고효모및곰팡이는평균적으로 1.05 x 10 3 CFU/g를나타내었다. 대장균군은검 출되지않았다. 실험결과소독수 5분처리구에서초기효모및곰팡이수가 100% 저감화되 었다. 파의경우총균수는평균적으로 2.78 x 10 6 CFU/g을보였다. 유산균수는평균 1.88 x 10 7 CFU/g이였다. 효모및곰팡이는 1.75 x 10 3 CFU/g 범위에있었으며, 대장균군은 1.35 x 10 4-69 -

CFU/g을보였다. 실험결과소독수 5분처리구에서초기대장균군수는 44% 저감화되었으나, 효모및곰팡이수는감소되지않았다. 김치제조용시판고춧가루의경우총균수는평균 1.00 x 10 7 CFU/g 였고, 유산균수는 1.92 x 10 5 이였다. 효모와곰팡이는 3.45 x 10 3 CFU/g으로측정되었으며, 대장균군의균수는 4.00 x 10 2 CFU/g을보였다. 재료특성상, 소독수처리에의한저감화실험은가능하지않았다. 마지막으로각시료들을배합하여양념을제조하여소독수 5분처리한그룹과무처리구시료들을이용해만든양념을 65 에서 30분저온살균하여대조군과초기균수를비교해보았을때, 무처리구에서의초기총균수는평균 1.23 x 10 7 CFU/g 이였고, 유산균수는 4.20 x 10 6 이였다. 효모와곰팡이는 2.85 x 10 3 CFU/g으로측정되었다. 이에소독수를 5분처리한결과, 초기효모및곰팡이수가 7% 저감화되었고 65, 30분저온살균처리한그룹에서초기효모및곰팡이수가각각 18% 저감화되었으며대장균군은검출되지않았다. 이러한결과로부터시판용소독수와저온살균처리후미생물균수의변화로미루어보았을때소독수에의한살균효과보다는저온살균에의한저감화효과가클것으로판단되었다. - 70 -

Table 1-1. 소독수처리에의한초기균저감화 ( 평균치 ) ( 단위 : CFU/g) 0 분 : 재료를소독수에처리하지않은그룹, 2 분 : 재료를소독수에 2 분동안침지시킨그룹, 5 분 : 재료를소독수에 5 분동안침지시킨그룹 ND : not detected - 71 -

Table 1-2. 저온살균에의한초기균저감화 ( 평균치 ) ( 단위 : CFU/g) 김치양념 무처리 소독수 저온살균 총균수 1.23x10 7 3.55x10 6 3.95x10 6 유산균 4.20x10 6 1.70x10 6 1.70x10 4 효모및곰팡이 2.85x10 3 1.50x10 3 6.65x10 2 ND : not detected 무처리 : 대조군, 소독수 : 김치양념재료를소독수에 5분동안침지시켜양념을제조한그룹, 저온살균 : 김 치양념재료를 65 항온수조에 30분간열처리후양념을제조한그룹 - 72 -

제 1 절전통식품으로부터미생물자원확보 1. 실험목적 현재유통되고있는김치를지역별 종류별로수거하여숙성되어진김치에서미생물자원을 확보하고김치의맛에영향을주는 mannitol 을많이생성하는균주를선발하고자하였다. 2. 재료및방법 가. 재료 (1) 미생물선발을위한시료 인터넷으로유통되는김치류중생산지역이다른것을선발하여 12 개김치시료를확보하였다. Table 2-1. 실험에사용한균주리스트 지역 김치종류 Sample no. 1 강원도태백 묵은지 1-B-1~5 1-P-1~5 2 강원도태백 배추김치 2-B-1~5 2-P-1~5 3 충북충주 석박지 3-B-1~5 3-P-1~5 4 충북충주 사과포도김치 4-B-1~5 4-P-1~5 5 전남순천 깍두기 5-B-1~5 5-P-1~5 6 전남순천 포기김치 6-B-1~5 6-P-1~5 7 전남순천 열무 7-B-1~5 7-P-1~5 8 경북성주 배추김치 8-B-1~5 8-P-1~5 9 제주도 열무김치 9-B-1~5 9-P-1~5 10 전북무안 양파김치 10-B-1~5 10-P-1~5 11 제주도 파김치 11-B-1~5 11-P-1~5 12 제주도 배추김치 12-B-1~5 12-P-1~5 (2) 김치유산균분리및배양 구매한김치는 4 의저온에서숙성시킨후, ph 4.3 내외가되었을때, 상기김치시료 를 0.85% 식염수로 10 배희석하였고, 0.1 ml 씩 PES agar(penylethyl alcoholsucrose agar; - 73 -

tryptone 5 g, yeast extract 0.5 g, sucrose 20 g, ammonium sulfate 2 g, dipotassium phosphate1 g, magnesium sulfate 0.244 g, phenylethyl alcohol 2.5 ml, agar 15 g/d.w. 1 L) 와 MRS agar 플레이트에접종한후, 유리막대로도말하였다. 상기김치시료가도말된아가플레이트를 30 의항온배양기에서 1일동안양한후, 생성된각각의콜로니를 PES agar와 MRS agar 플레이트에획선접종하였고, 25 에서 1일동안배양하여유산균균주를분리하여 MRS 액체배지 (Difco, USA) 를사용하여배양한후대수기에있는배양액에글리세롤 25%(v/v) 가되게첨가하여 -80 에서보관하였으며실험에사용할경우 5 ml MRS 액체배지에접종하여 30 에서 24시간배양한후 MRS 액체배지에 1차계대배양하고다시 MRS 액체배지에 2차계대하여 30 에서 24시간배양하였다. 나. MDH gene 보유확인 (1) Genomic DNA 추출유산균의 genomic DNA는 G-spin genomic DNA extraction kit (intron biotechnology, Korea) 를사용하여김치국물로부터분리하였다. 먼저채취한김치국물을필터후, 샘플을원심분리 (12,000 rpm, 2분 ) 하여상층액을제거한후, 제조사의 protocol에따라 genomic DNA를추출하였다. (2) Primer 제작및 polymerase chain reaction(pcr) PCR 반응에는 PCR machine(eppendorf, Germany) 를사용하였으며, 각각의 primer 1 μl (40 pmol), 10X buffer 2.5μl, dntp 2μl (2.5 mm, Takara), Taq polymerase(5 unit/μl, Takara) 0.1 μl이포함된 25 μl 혼합액에 1 μl template DNA를증폭시켰다. 사용된 primer는 Cosmo Co.(Seoul, Korea) 에의뢰하여제작하였으며 MDH primer의염기서열은 sense5'-attaatcatggaagcacttgttctaac-3',antisense 5'-GTCAGTCTAGATTATG CCTCTTCGCCGCCAA-3' 였다. 각반응은 95 에서 5분간 predenaturation을 1회실시한후, 변성은 95 에서 1분, anealing은 55 에서 1분, extention은 72 에서 1분간의중합반응과정을 30회실시하였고마지막으로 extention을 72 에서 10분간더실시하였다. 반응후증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel 상에서전기영동을시행한후, Gel Documentation System(Bio-rad, USA) 으로사진을촬영하여증폭유무를확인하였다. 3. 실험결과 현재유통중인김치중생산지역과종류가다른김치를 Leu. mesenteroides 선발용 PES agar와 Lactobacillus 선발을위한 MRS agar를이용하여 colony의크기, 모양, 색등의차이에따라각각 5개씩의균주를선발하여총 120개의 colony를선발하였다. 이들균주의특성중맛에영향을주는 mannitol 생성능이우수한균주를확인하기위하여 MDH (mannitol - 74 -

dehydrogenase) 생성 gene 의보유유무를확인한결과 120 개의균주중 72 개의균주에서 MDH gene 의보유가확인되었다. sample MDH sample MDH sample MDH sample MDH sample MDH sample MDH 1-B-1 1-P-1 5-B-1 5-P-1 9-B-1 9-P-1 1-B-2 1-P-2 5-B-2 5-P-2 9-B-2 9-P-2 1-B-3 1-P-3 5-B-3 5-P-3 9-B-3 9-P-3 1-B-4 1-P-4 5-B-4 5-P-4 9-B-4 9-P-4 1-B-5 1-P-5 5-B-5 5-P-5 9-B-5 9-P-5 1-B-6 1-P-6 5-B-6 5-P-6 9-B-6 9-P-6 2-B-1 2-P-1 6-B-1 6-P-1 10-B-1 10-P-1 2-B-2 2-P-2 6-B-2 6-P-2 10-B-2 10-P-2 2-B-3 2-P-3 6-B-3 6-P-3 10-B-3 10-P-3 2-B-4 2-P-4 6-B-4 6-P-4 10-B-4 10-P-4 2-B-5 2-P-5 6-B-5 6-P-5 10-B-5 10-P-5 2-B-6 2-P-6 6-B-6 6-P-6 10-B-6 10-P-6 3-B-1 3-P-1 7-B-1 7-P-1 11-B-1 11-P-1 3-B-2 3-P-2 7-B-2 7-P-2 11-B-2 11-P-2 3-B-3 3-P-3 7-B-3 7-P-3 11-B-3 11-P-3 3-B-4 3-P-4 7-B-4 7-P-4 11-B-4 11-P-4 3-B-5 3-P-5 7-B-5 7-P-5 11-B-5 11-P-5 3-B-6 3-P-6 7-B-6 7-P-6 11-B-6 11-P-6 4-B-1 4-P-1 8-B-1 8-P-1 12-B-1 12-P-1 4-B-2 4-P-2 8-B-2 8-P-2 12-B-2 12-P-2 4-B-3 4-P-3 8-B-3 8-P-3 12-B-3 12-P-3 4-B-4 4-P-4 8-B-4 8-P-4 12-B-4 12-P-4 4-B-5 4-P-5 8-B-5 8-P-5 12-B-5 12-P-5 4-B-6 4 4-P-6 11 8-B-6 12 8-P-6 21 12-B-6 12 12-P-6 12 Fig. 2-1. MDH gene 보유확인결과. 제 2 절미생물첨가제제제화를위한배지조성개발 1. 실험목적 미생물첨가제대량배양기술개발을위하여저가형배지개발을위하여김치공장에서김치 절임공정중발생되는절임배추로부터맑은액상형태의절임배추착즙액을수득하여저가형 식용배지의원료로이용하고자하였다. - 75 -

2. 재료및방법 가. 방법 (1) 1차절임배추착즙액의제조김치공장으로부터회수된절임공정중발생하는절임배추를그라인더로마쇄후, 4-5겹의거즈를이용하여여과하여멸균하였다. 절임배추착즙액은멸균 (121, 15분 ) 시미끌미끌한불용성물질생성되었기에, 추후활성탄, 규조토여과를시도하여제거하였다. 하지만 2차여과추가시멸균공정이다시이루어져야하는단점이있어향후개선이필요하다. 마쇄 : 그라인더 착즙 : 거즈4-5겹 pre-heating : 80-90 10min 여과 : 규조토여과 멸균 : 121 15min 착즙의원활한진행에도움 휴롬보다수율과시간이용이 불용성침전물발생을막기위해도입 침전물제거를위한실험후규조토선정 (2) 2차절임배추착즙액의제조절임배추착즙액의멸균후, 미끌한불용성물질의생성은참고문헌에따르면배추에있는불활성화된효소에의한작용으로침전물은열에의한단백질변성으로생성된물질임을추측할수있었으며, 규조토여과에의하여쉽게제거할수있었다. 절임배추착즙액을멸균전 pre-heating처리를통해멸균전불용성물질의생성을유도하여멸균후침전물이생기는것을방지하고자하였다. - 76 -

Fig. 2-2. 2 차절임배추착즙액멸균후. (3) 절임배추착즙액의특성상기제조방법으로제조된절임배추배양액은노란색의맑은액상형태를띄었으며, ph 6.0 6.2, 고형분 5 7 Brix%, NaCl 2 3% 로측정되었으며초기절임배추사용량대비최종배추배양액의수득률은약 75% 였다. 하지만초기착즙과정중미생물오염등을고려하여 pre-heating을착즙과정의전단계에서실시하도록수정하였다. (4) 절임배추배지의개선절임배추를약 80 90 의온도에서 1차증숙후마쇄, 착즙, 멸균의과정을거쳐배추배양액을제조하였다. 불투명한노란색의액상으로서탁도는있지만기타침전물이생성되는현상은발생하지않았다. 마쇄 : 그라인더 pre-heating : 80-90 10min 착즙 : 거즈 4-5 겹 여과 : 규조토여과 멸균 : 121 15min Fig. 2-3. 2 차절임배추착즙액멸균후. A : 1 차절임배추착즙액멸균후, B : 2 차절임배추착즙액멸균후 - 77 -

3. 실험결과 가. 가열에의해생성된배추이취제거를위한탈취테스트절임배추의가열시특유의이취가발생한다. 이취의발생은향후식용배지로활용에제약을주거나배양액활용에문제를야기할수있을것으로예상되기에이취를제거하고자절임배추의경우가열시배추특유의이취가발생하였기에가열에의한배추이취제거를하고자활성탄을활용하여탈취를실시하였다. 활성탄 (Fintechno CP-2, Ajinimoto) 을배추배지고형분대비 5% 첨가후 60 에서 1시간동안반응후규조토여과를실시하였다. 활성탄여과로배추가열취를제거하는데성공적으로진행되었으며, 활성탄여과후색또한옅어지는효과를나타내었다. 그러나배추배양액자체가유산균배양액으로활용되어김치에첨가시그첨가량이매우소량이라는사유로굳이배추가열취를제거하는공정이불필요할것으로판단되어, 상기공정은최종배추배양액제조에서활용하지않기로하였다. Fig. 2-4. 탈취전후배지. 나. 절임배추즙과 MRS의당성분분석 (1) 실험목적절임배추를유산균성장배지로이용하기위하여기존상업용배지인 MRS와당의함량을분석하여배지 base로의가능성과배지조성의조합에활용하고자분석하였다. (2) 실험방법절임배추착즙액제조 : 절임배추를그라인더로갈아 85 내외에서 10분간가열한후, 거즈로착즙하여규조토로여과후 121 에서 15분간살균하여사용하였다. (3) HPLC를이용한당함량분석결과절임배추착즙액배지와 MRS 배지를 0.45 µm membrane filter로여과한다음 HPLC(JASCO, Japan) 에 20 μl를주입하였다. 이때사용한 column은 Asahipak NH2P-50(Shodex) 였고, 용매는아세토니트릴 : 물 = 75 : 15, flow rate는 1.0ml/min, detector는시차굴절계 (RI) 를이용하였다. 표준품으로 fructose, glucose, sucrose, mannitol, - 78 -

maltose를사용하였다. 시험용액및표준용액을각각 20 μl씩주입하여얻은피크의높이를구하여검량선을작성한후시험용액의유리당함량을계산하였다. 절임배추착즙액과 MRS 배지의당함량을분석한결과 fructose는절임배추착즙액이 MRS배지보다 2배이상높은함량을나타내었으며, glucose의경우 MRS 배지가월등이높은것으로분석되었다. 향후절임배추착즙액을 base로이용한배지를만들이위한배지조성을조절할때, glucose 당원에대한보충량을알수있었다. 절임배추착즙액의경우배지제조에낮지않은당원을함유하고있음을확인하였다. Table 2-2. 절임배추배지와 MRS 배지의당함량분석 Fig. 2-5. 절임배추착즙액과 MRS 배지의 HPLC 분석결과. 다. 절임배추착즙액과일반배지와의균체성장비교 (1) 실험목적절임배추착즙액과 MRS배지를이용하여김치유산균표준균주 2종에대한균체성장을비교함으로써절임배추착즙액의식용배지로서의가능성탐색하고자하였다. (2) 실험방법절임배추착즙액과 MRS배지의유산균성장률을비교해보기위하여표준균주 3종을 (KCCM 3505, Leuconostoc mesenteroides sub sp. mesenteroides : KCCM 3769, Lactococcus lactis sub sp.) 을이용하여접종량은배양액배비 2% (v/v) 으로하였으며, 3 0 에서 24시간배양하여 MRS agar plate를이용하여균수를측정하였다. (3) 실험결과절임배추착즙액과 MRS배지에서의김치유산균성장을관찰하였다. 절임배추로제조된절임배추착즙액 100% 와 MRS배지에서의김치유산균표준균주 3종을배양하여균체성 - 79 -

장을비교하고자하였다. 유산균개체증식수는절임배추착즙액 (10 8 CFU/ml) 보다약 10배정도 MRS배지 (10 9 CFU/ml) 에서더많이증식하는결과를보였다. 아마도절임배추착즙액은균주의성장에필요한영양성분을모두포함하고있는 MRS 배지보다는성장률이떨어질것으로예상되었으나 10정도차이가나는것으로나타났다. 10정도의차이를줄이기위해서절임배추착즙액을기본으로당원과, 단백질원, 미량성분등을조절하면 MRS배지보다는저렴하지만성장률에영향을미치지않는저가용배지를제작할수있을것이라판단된다. Fig. 2-6. 절임배추착즙액과 MRS 배지에서의성장균수측정비교. 라. 절임배추착즙액성장강화성분의조사 (1) 실험목적절임배추착즙액과 MRS배지를이용하여김치유산균표준균주 3종에대한균체성장을비교함으로써절임배추착즙액의식용배지로서의가능성탐색하고자인위적으로당원과질소원을조절하여균주성장에미치는영향을조사하였다. (2) 실험방법 - 이용균주절임배추착즙액의조성에따른성장율을 MRS배지의유산균성장률와비교해보기위하여표준균주 3종을 (KCCM 40265, Lb. acidophilus : KCCM 3505, Leu. mesenteroides sub sp. mesenteroides : KCCM 3769, Lc. lactis sub sp. lactis) 을이용하여접종량은배양액대비 2%(v/v) 으로하였으며, 30 에서 24시간배양하여 MRS agar plate를이용하여균수를측정하였다. - 배지성분절임배추착즙액의질소원, 탄소원강화를위하여대표적인질소원, 탄소원으로효모엑기스와글루코오스를각각고형분대비 1% 를첨가하여유산균성장강화에영향을미치는지여부를확인하기위하여첨가하였다. - 80 -

(3) 실험결과절임배추착즙액에각 1% 의효모액기스와글루코우즈의첨가가균주성장에영향을미치는지에대한결과는유의적인차이를보이지않았다. 첨가량을배추배양액고형분대비 1% 로매우소량을첨가한것이성장에영향을미치지못한것으로사료되었다. 따라서추후에는고형분대비가아닌, 배양액대비 1 2% w/v수준으로첨가가필요할것으로판단되었다. Fig. 2-7. 영양성분을조절한절임배추착즙액배지와 MRS 배지의성장균수측정비교. 결론적으로, 절임배추착즙액으로부터제조된절임배추배지가상업적유산균배양액은 MRS broth와비교하였을때충분히활용가능성을확인할수있었으며, 추후작업으로표준균주가아닌실제김치로부터분리하여동정된대표적인김치균주를활용하여상세한성분조성에변화를주어실험을진행하여야겠다. - 81 -

제 3 절외부적첨가물추가를통한절임배추배지의김치유산균 생육강화테스트 1. 실험목적 가. 탄소원절임배추착즙액으로부터제조된배추배지에탄소원, 질소원및무기원을농도와종류별로첨가하여상업적유산균배양배지인 MRS broth 수준으로균체생육정도를강화하고자한다. 절임배추착즙액으로부터제조된절임배추배지에탄소원의종류와그첨가량에변화를주어상업적유산균배양배지인 MRS broth 수준으로균체생육정도를강화하고자한다. 배추유리당의구성이 glucose와 fructose로이루어져있다는점과첨가원료의단가및식품첨가물로서의사용빈도등을고려하여탄소원으로서 glucose와 fructose를선정하였다. 나. 질소원절임배추착즙액으로부터제조된절임배추배지에질소원의종류와그첨가량에변화를주어상업적유산균배양배지인 MRS broth 수준으로균체생육정도를강화하고자한다. 배추질소원은무기원 ((NH 4 ) 2 SO 4, NH4Cl, (NH 4 )HPO 4, Urea) 과유기원 (peptone, beef extract, yeast extract, CSL(Corn Steep Liquor)) 을절임배추착즙액을이용한배지에질소원으로첨가하여균주성장에미치는영향을조사하고자한다. 다. 미량원소절임배추착즙액으로부터제조된배추배지에질소원의종류와그첨가량에변화를주어상업적유산균배양배지인 MRS broth 수준으로균체생육정도를강화하고자한다. 배추미량원소 (sodium succinate, ammonium citrate, sodium acetate, magnesium sulfate (MgSO 4 ), manganese sulfate (MnSO 4 ), dipotassium phosphate (K 2 HPO 4 )) 을절임배추착즙액을이용한배지에미량원소로첨가하여균주성장에미치는영향을조사하고자한다. 2. 재료및방법 가. 방법 (1) 탄소원 - 사용균주김치에서분리한 Leu. mesenteroides와 Lb. plantarum를비교균주로이용하였다. - 82 -

- glucose 농도조절상업용배지인 MRS배지에비해절임배추착즙액에서부족했던당원 glucose의함량을전체액상부피대비질량으로하여 (g/ml, w/v) 각각 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0% 를첨가하여김치에서분리한두균주의성장률을비교를위하여 30 에서 24시간배양한후, MRS agar plate를이용하여균수를측정하였다. - fructose와 glucose 혼합배지상업용배지인 MRS배지에비해절임배추착즙액에서부족했던당원 glucose의함량을전체액상부피대비질량으로하여 (g/ml, w/v) 각각 2.0% 를첨가하여김치에서분리한두균주의성장률을비교를위하여 30 에서 24시간배양한후, MRS agar plate를이용하여균수를측정하였다. (2) 질소원 - 사용균주김치에서분리한 Leu. mesenteroides와 Lb. plantarum를비교균주로이용하였다. - 사용한질소원식용으로가능한질소원을무기원 4종 ((NH 4 ) 2 SO 4, NH4Cl, (NH 4 )HPO 4, Urea) 과유기원 (peptone, beef extract, yeast extract, CSL(Corn Steep Liquor)) 을질소원으로이용하였다. - 질소원의선발질소원은선발한 8종을각각 2%(w/v) 의농도로절임배추착즙액에첨가하여김치에서분리한두균주의성장률을비교를위하여 30 에서 24시간배양한후, MRS agar plate 를이용하여균수를측정하였다. - Box-Behnken experimental design을이용한첨가량조절질소원 1차 screening단계에서 yeast extract, beef extract, peptone이김치유산균증식에관여한질소원의중요인자로선택되었으며, 상기선택되어진인자들이김치유산균증식에미치는개별적영향뿐만아니라서로의상관관계를관찰하고분석함으로서이를근거하여각인자들이김치유산균증식에가장좋은영향을미치는수준을선정하고자하였다. 본실험에서는반응표면실험법으로서 Box-Behnken design을사용하였으며, 첨가율 0%, 1%, 2% 의값을 +, 0, - 의값으로나누어총 15개의실험을설계하여수행하였다. 상업용유산균증식배지인 MRS broth(difco) 의질소원배합이하나의물질이아닌 peptone 1%(w/v), beef extract 1%, yeast extract 0.5%(w/v) 이혼합되어함유되어있는점을착안하여앞선 1차질소원테스트에서선발된 3종의질소원의최적배합비를찾아보고자하였다. 질소원에대한 1차 screening단계에서 yeast extract, beef extract, peptone이김치유산균증식에관여한질소원의중요인자로선택되었으며, 상기선택되어진인자들이김치유산균증식에미치는개별적영향뿐만아니라서로의상관관계를관찰하고분석함으로서이를근거하여각인자들이김치유산균증식에가장좋은영향을미치는수준을선정하고자하였다. - 83 -

(3) 미량원소 - 사용균주김치에서분리한 Leu. mesenteroides와 Lb. plantarum를비교균주로이용하였다. - 사용한미량원소식용으로가능한미량원소중 (sodium succinate, ammonium citrate, sodium acetate, magnesium sulfate (MgSO 4 ), manganese sulfate (MnSO 4 ), dipotassium phosphate (K 2 HPO 4 )) 를이용하였다. - 미량원소의선발 MRS broth에포함되어있는질소원수준으로질소원을동일하게처리한뒤 (MRS broth의질소원함량수준, peptone 1%, beef extract 1%, yeast 0.5%) 상기표기명시된 5종의미량원소을하나씩제거하여, 유산균증식에영향을주는주요인자를선발하고자하였다. Table 2-3. 배지조성에이용할탄소원, 질소원, 무기원 구분 종류 탄소원 Glucose Fructose Chmically defined (NH 4 ) 2 SO 4 NH 4 Cl (NH 4 )HPO 4 질소원 media Complex media Urea Peptone Beef extract Yeast extract Corn Steep Liquor 무기원 Sodium succinate Ammonium citrate Sodium acetate MgSO 4 MnSO 4 K 2 HPO 4-84 -

Fig. 2-8. 당원으로 glucose 를조절한절임배추착즙액배지와 MRS 배지의성장균수측정비교 Fig. 2-9. Glucose 와 fructose 를강화한절임배추착즙액배지와 MRS 배지의성장균수측정 Table 2-4. 질소원들의농도및효과 (%, w/v) - 85 -

Table 2-5. 3가지질소원을이용한배지성분표준화를위한 Box-Behnken design 3. 실험결과 가. 탄소원앞선실험에서에서절임배추배양액고형분대비 1% 글루코스의첨가량이미비한것으로판단되어그첨가량을고형분대비 2% 까지첨가하여유산균생육정도를관찰하였으나, 첨가수준증가에따른유의적인차이도나타나지않았다. 그래서첨가량을전체액상부피대비질량으로하여 (g/ml, w/v) 실험을진행하였다. glucose와 fructose를 2%w/v(20g/ml) 의농도로추가하여이에따른김치유산균의생육정도를관찰하였다. 첨가농도기준을변경하여그함량을 2%(w/v) 까지증가시켜보았지만, 탄소원첨가에따른유산균증식에긍정적인효과는보이지않았다. 따라서, 절임배추착즙액에 glucose를탄소원으로단독추가하는것을배재하고탄소원을혼합하거나다른당원을이용해야할것이라판단된다. 절임배추착즙액에서더많이존재했던 fructose와미생물의당원으로많이공급되는 glucose의함량을증가시켜미생물성장을측정한결과당원의증가가절임배추착즙액에서키운미생물의성장을비교한결과차이가크지않은것으로확인되었다. 이로서절임배추착즙액에당원의추가는의미가없는것으로판단되어향후질소원과무기원추가실험에서당원의추가를하지않는것으로결정하였다. 따라서, 절임배추착즙액에함유되어있는유리당원만으로도유산균배지로서의탄소원함량을충족하는것으로판단되었다. - 86 -

나. 질소원의선발선발한 8종의질소원을 2%(w/v) 의농도로절임배추착즙액배지에추가하여이에따른김치유산균의생육정도를관찰하였다. 김치의대표적인균주이자김치분리균주인 Leu. mesenteroides와 Lb. plantarum의생육에공통적으로긍정적인효과를준물질로 yeast extract, beef extract, peptone을선정하였다. 유기질소원과무기질소원으로구분해보면, 유기질소원이김치유산균증식에보다긍정적인경향을보였으며, 그중에서도 yeast extract, beef extract, peptone의첨가가보다더효과적으로나타났다. Fig. 2-10. 8 가지질소원을강화한절임배추착즙액배지와 MRS 배지의성장균수측정비교. Table 2-6. 다양한질소원을이용한표면분석의 Canonical Analysis Eigenvectors Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus plantarum Eigenvalues Peptone Beef Yeast -0.007878-0.183802 0.877643-0.442673-0.020626-0.698346 0.200339 0.687152-0.078121 0.691759 0.435439 0.576076 0.024411-0.586593-0.194189 0.786256-0.006069-0.492137 0.856494-0.155627-0.075467 0.643202 0.478236 0.597981-87 -

Table 2-7. 질소원과유산균의최대반응예측분석 Critical Value Factor Coded Uncoded Label a 0.551576 1.551576 Peptone Leuconostoc mesenteroides b 0.480441 1.48044 Beef c 0.49722 1.49722 Yeast Predicted value at stationary point: 0.723915 a 0.645078 1.645078 Peptone Lactobacillus plantarum b 0.495 1.495 Beef c 0.764892 1.764892 Yeast Predicted value at stationary point: 1.604763 상기테이블은 3종의질소원첨가에따른김치유산균생육에미치는효과의반응표면분석결과이다. Leu. mesenteroides 및 Lb. plantarum 모두 maximum point가최고함량치가아닌중간지점에서발생하는 saddle point의형태로나타났다. 이와같은결과로미루어보았을때 Leu. mesenteroides는 peptone 1.5%, beef 1.5%, yeast 1.5% 첨가시켰을때, 최대 OD값 (600nm) 이 0.72으로, Lb. plantarum은 peptone 1.6%, beef 1.5%, yeast 1.8% 첨가하였을때 OD값 (600nm) 이 1.60으로최대값을예측할수있었다. 위통계예측결과를바탕으로하였을때, 총질소원의첨가수준이무려 4.5% 이상을나타내며, 두가지모두 3가지질소원의첨가조합함량에따른증가를보이다가중간지점에서 saddle point를나타내기는하지만 3가지질소원의조합을 1X1의경우의수로각각나누어보았을때 ( 아래 3차원그래프 ) 몇몇조합에서는 saddle point이외에첨가량증가에따른지속적인상승세를나타내는경우가있다. 따라서 3종의질소원조합테스트이외에단일물질의첨가량증대에따른김치유산균생육정도를테스트한후에가장합리적인질소원첨가수준을판단하기로하였다. - 88 -

Fig. 2-11. Peptone and beef extract 의농도별 Leu. mesenteroides 의 OD(600nm) 에서의 3D_ 표면반응분석 Fig. 2-12. Peptone and yeast extract 의농도별 Leu. mesenteroides 의 OD(600nm) 에서 의 3D_ 표면반응분석. - 89 -

Fig. 2-13. Beef extract and yeast extract 의농도별 Leu. mesenteroides 의 OD(600nm) 에서의 3D_ 표면반응분석 Fig. 2-14. Peptone and yeast extract 의농도별 Leu. mesenteroides 의 OD(600nm) 에 서의 3D_ 표면반응분석 - 90 -

Fig. 2-15. Peptone and yeast extract 의농도별 Lb. plantarum 의 OD(600nm) 에서의 3D_ 표면반응분석 Fig. 2-16. Beef extract and yeast extract 의농도별 Lb. plantarum 의 OD(600nm) 에서 의 3D_ 표면반응분석 Peptone, yeast extract, beef extract 를각각 0, 1, 2, 4, 8%(w/v) 의비율로첨가하여유산 균생육정도를관찰하는확인실험을진행한결과, 질소원의종류에따른유의적인차이 는발견되지않았다. 단일질소원처리시첨가량수준에따라비례하며증가하는경향을 - 91 -

나타내었지만, 비용적인측면을고려하였을때무조건높은농도의질소원을넣어주는것은합리적이아닌것으로판단되었다. 따라서, 앞선질소원 3종의최적조합에서나온결과 ( 약총질소원처리량 4.5%) 와질소원의단가적인측면을고려하여 peptone 4%(w/v) 첨가를최적배합으로결정하고, 추후본연구에서개발된절임배추배지를활용하여 fermenter를이용한대량배양을할경우 fed-batch에의한간헐적인추가질소원첨가가이루어질것으로판단되기에질소원첨가수준을최대량이아닌적정수준에서설정하는것은충분히보완될수있을것으로판단된다. Fig. 2-17. 질소원첨가에따른 Leu. mesenteroides 의생균수관찰 Fig. 2-18. 질소원첨가에따른 Lb. plantarum 의생균수관찰 - 92 -

다. 미량원소의선발 Ⅲ실험군은절임배추배지에 MRS broth와동일한수준의미량원소를첨가한것이다. Ⅲ실험군과다른실험군을상대적으로비교하여특정물질제거를통한김치유산균증식에가장큰영향을주는것과그렇지않은것을분류하고자하였다. 극미량원소인 magnesium sulfate (0.01%, w/v) 와 manganese sulfate (0.005%, w/v) 은 1) 그함량이매우미미하여단가적인측면에큰영향을미치지않았으며, 2) 미생물증식에따른안정적인균체내효소분비를위해 Mn, Mg가필수요소인것으로알려져있다. 3) Lb. plantarum의경우 magnesium sulfate와 manganese sulfate 제거에따른균체증식에영향을주는것으로나타났기때문에 magnesium sulfate (0.01%, w/v) 와 manganese sulfate (0.005%, w/v) 은 MRS broth 수준의첨가량을유지하기로결정하였다. 김치유산균증식에민감한영향을보이는미량원소로서일반무기질원보다는 sodium acetate, sodium citrate 등의유기산물질로확인되었다. Fig. 2-19. 미량원소의결핍이유산균의성장에미치는영향 절임배추배지에 peptone 4%, magnesium sulfate 0.01%, manganese sulfate 0.005% 를기본베이스로한뒤에상기미량원소 1차테스트에서김치유산균증식에영향을주는것으로판단된미량원소 2종 sodium acetate, sodium citrate가김치발효에따른유기산변화가가장컸던 succinate( 작년실험결과, 김치발효에의해배추원물에함유되어있던 succinate가발효기간이경과함에따라 80% 이상감소됨, 유리유기산중이용률이가장높음 ) 를 sodium succinate의형태로첨가하였으며동시에그첨가량에따른테스트를실시하였다. SAS통계프로그램을활용한 duncan s multiple range test결과 sodium succinate 1% 첨가한실험군에서 Leu. mesenteroides, Lb. plantarum 모두가장높은수준으로유산균생육정도를나타내었다. 따라서 sodium succinate 1% 를 3번째미량원소로결정하였다. - 93 -

Table 2-8. 배지미량성분첨가량에따른유산균의성장에미치는영향 질소원 유산균종류 미량성분첨가량 미생물 (cfu/ml) Acetate 0.25% 1.58 10 9 bb Acetate 0.50% 1.87 10 9 ab Acetate 1.00% 4.85 10 9 a Leuconostoc mesenteroides Citrate 0.25% 2.01 10 9 b Citrate 0.50% 1.73 10 9 b Citrate 1.00% 1.48 10 9 ab Peptone 4% Magnesium sulfate 0.01%, Manganese sulfate 0.005% Succinate 0.25% 2.28 10 9 b Succinate 0.50% 9.80 10 9 a Succinate 1.00% 7.75 10 8 a Acetate 0.25% 1.01 10 9 bc Acetate 0.50% 2.25 10 8 c Acetate 1.00% 2.02 10 9 ab Lactobacillus plantarum Citrate 0.25% 1.32 10 9 abc Citrate 0.50% 2.56 10 9 a Citrate 1.00% 1.61 10 9 ab Succinate 0.25% 1.51 10 9 ab Succinate 0.50% 1.12 10 9 bc Succinate 1.00% 2.45 10 9 a Fig. 2-20. 개발된절임배추착즙액배지와 MRS 의유산균의성장비교 - 94 -

제 3 절미생물첨가제제제화를위한배지조성개발 1. 실험목적 실제김치로부터분리된김치유산균중김치숙성과정에가장큰영향을주는 2 종의균주 를이용하여, 그에대한생육곡선의추이를관찰함으로최적배양시간을탐색하고자하였다. 2. 실험방법 MRS 및절임배추배지에김치로부터분리하여 Leu. mesenteroides 와 Lb. plantarum 으로동 정된 2 종의김치유산균을배양액대비 2%(v/v) 으로접종하여 30 에서 2 시간간격으로샘플을 채취하여각각의 OD 값 (600nm) 및 MRS agar 평판배양을통하여균수를측정하였다. 3. 실험결과 배지별균주의성장곡선을 OD값과실제생균수를측정하여그려보았다. 실험결과배양시간에따라비슷한추이를나타내었으며, 상기결과를바탕으로실험에사용된김치유산균의최적배양시간을 16시간으로결정하였다. 향후특정효소나균주특성에대한배양시간별조사가필요할것으로사료된다. Fig. 2-21. 흡광도를이용한배지별생장곡선 - 95 -

Fig. 2-22. 평판법을이용한균수측정을통한배지별생장곡선 현재김치의원료를이용한미생물보호제의활용가능성실험을진행하고있다. 마늘을이용한경우유산과마늘을섞어 -70 냉동하여보존제로서의역할을실험하였으며, 보충실험을통하여미생물유통을위한보호제로서의가능성을마늘등식품소재에서확보하고자연구하고있다. 개발되어진저가형식용배지의원가계산결과절임배추배지의원부재료첨가에따른단가는액상배지 L당기준으로약 572원 /L가발생하였다. 이는기존에사용배지로보급화되어있는 MRS broth와비교하여보았다. MRS broth powder 55g을 1L에녹여사용하는일반적인메뉴얼을기준으로삼았을때 MRS broth solution의단가는약 9,681원 /L이발생함을알수있다. 이로서본연구에서개발한배추배지가보급형유산균배지인 MRS broth와가격적인면에서충분히경쟁적우위를차지함을확인하였다. - 96 -

제 4 절활성도및생존율이높은미생물제제개발 1. 실험목적 김치제조가자연발효에서미생물첨가에따른발효조절로패러다임이변화함에따라김치에서분리한유용미생물의현장편의형제제화기술을개발하여저장및유통기간동안미생물첨가제의활성유지및제제공정후생존율을높이고자하였다. 미생물제제의제형별및저장기간별생존율을중심으로종균으로서의가능성을시험하였다. 2. 재료및방법가. 재료 (1) 사용균주및보존 1차년도과제수행중김치로부터분리된 Weissella cibaria SW1-1, Lb. plantarum A-1, Pediococcus pentosaceus A-2균주를사용하였다. 실험균주는유산균배양에적합한 MRS broth(lactobacilli MRS agar, Difco) 에접종하여 30 에서 24시간배양하여활성화시킨후, MRS agar plate에접종하여 4 에서 4주간격으로계대배양하면서보관하였다. 실험균주의장기보관법으로는글리세롤최종농도 20% 로미생물현탁액을제조하여 70 에서에서보존하였다. (2) 김치유래미생물의배양 - 70 에서장기보관된실험균주를 10 ml MRS broth에 1 % (v/v) 접종하여 30 에서 24시간배양한후, 다시 MRS broth에 2차접종하여미생물의활성을증대시킨후사용하였다. (3) 시험균주의계수 MRS broth에 0.2% Bromophenol blue(bpb) 지시약 1% 를첨가하여 MRS-BPB 배지를제조하였다. 미생물현탁액 100 μl를도말하여 30 에서 48시간동안배양한다음미생물군집의숫자를계수하였다. 3. 실험결과가. 액상형유산균제제개발유산균의생존율을보존할수있는현장편의형액상제제를개발하기위하여완충작용을할수있는 Ringer s solution 및 buffer solution을적용하였다. MRS broth에서 24시간배양된 W. cibaria 균주를 3000 rpm 10분간원심분리하여균체를회수하였다. 멸균수로 3회세척한후 10 ml 액상제에 2.2 x 10 10 cfu/ml의초기농도로고정하고 5 에서생존율을시험하였다. Lb. plantarum A-1 및 P. pentosaceus A-2 균주도동일한과정으로 - 97 -

험을진행하였다. 생리식염수에 W. ciabria의초기농도를 2.2 10 10 cfu/ml로고정하고 28일까지생존율을조사하였다. 저장 3일째균주의생존율은 80% 이상유지되었지만저장기간이길어짐에따라급격히감소하여 28일경과후 2.8 10 9 cfu/ml 수준으로감소하여 13% 의매우저조한생존율을나타내었다. Table 2-9. 액상형제제용액의조성 Ringer s solution 및 buffer solution의경우저장 3일째 80% 이상의생존율을나타내었으며저장 7일차각각 75% 및 81% 의우수한생존율을나타내어단기형제제화에관한가능성을제시하였다. 유산균농도 1 10 10 cells/ml을기준으로 1 L 제조하였을때 Ringer s solution이나 buffer solution의제조원가는각각 50원및 400원수준으로산업화를위한경제성을확보하였다. 실제유산균을첨가할때도액상으로양념과섞이기쉬워사용편의성을확보하였다. 그러나, 저장 14일까지생존율이급격하게감소하면서 28일경과후생존율은각각 23% 및 29% 로현저히감소하여장기형제제로는적합하지않다고판단하였다. 120 100 None Ringer's sol. Buffer sol. Survival rate (%) 80 60 40 20 0 0 7 14 21 28 Time (d) Fig. 2-23. 액상형유산균제제의저장기간별생존율 _W. cibaria - 98 -

나. 분말형유산균제제개발장기형김치미생물첨가제를개발하기위하여 W. cibaria의분말형제제화를실시하였다. 0.85% 생리식염수를대조구로사용하고동결건조보호제로탈지유및마늘파쇄액을단독또는조합하여동결건조에대한보호효과를 4 ± 1 o C에서조사하였다. 실험균주의초기농도를각각 1.2 10 9 cfu/ml로고정하고동결보호제종류별 / 농도별생존율을저장기간 28 일까지조사하였다. 생리식염수에실험균주를현탁하여동결건조를실시한직후 10% 미만의저조한생존율을나타내었지만, 동결보호제로마늘파쇄액을 5 ~ 20% 까지첨가한경우 20 ~ 44% 까지생존율이증가하였다. 하지만, 저장기간이증가할수록생존율은비례적으로감소하여저장기간 28일후마늘파쇄액 5, 10, 20% 첨가구에서각각 12, 29, 24% 을생존율을나타내어장기형제제로는적합하지않다고판단하였다. 60 50 None 5% Garlic 10% Garlic 20% Garlic Survival rate (%) 40 30 20 10 0 50 None 5% Skim milk 10% Skim milk 20% Skim milk Survival rate (%) 40 30 20 10 0 0 7 14 21 28 Time (d) Fig. 2-24. 분말형유산균제제의저장기간별생존율 _W. cibaria - 99 -

동결보호제로탈지유 5, 10, 20% 를사용한경우동결건조직후각각 34, 55, 46% 의생존율을나타내었다. 저장기간 14일경과후탈지유 10% 처리구에서 44% 의비교적높은생존율을나타내어마늘파쇄액처리구보다현저히높은보효효과를나타내었다. 저장기간 28일후탈지유 10% 처리구에서 37% 의생존율을기록하여중기형제제의가능성을제시하였다. 다. 냉동형유산균제제제조냉동형보호제로탈지유 10%, 마늘파쇄액 10%, 탈지유 5% + 마늘파쇄액 5%, 찹쌀과멸균수 1:8의비율로제조된찹쌀풀을선정하여보호제종류에따른유산균의생존율을조사하였다. 0.85% 생리식염수를대조구로설정하고 - 20 냉동고에 4주동안저장하면서실험균주의생존율을비교하였다. Survival rate (%) 100 None 10% Garlic 10% Skim milk 80 5% Garlic + 5% Skim milk Glutinous paste 60 40 20 0 0 7 14 21 28 Time (d) Fig. 2-25. 냉동형유산균제제의저장기간별생존율 _W. cibaria 생리식염수에현탁하여냉동하였을때보존기간 7일후 W. cibaria의생존율은 3% 수준이었지만, 동결보호제처리구에서는 30% 이상의생존율을나타내었다. 특히, 10% 마늘파쇄액처리구와찹쌀풀처리구에서각각 49% 및 44% 의비교적높은생존율을나타내었다. 저장기간이늘어날수록 W. cibaria의생존율은비례적으로감소하였고, 저장 28일후모든처리구에서 33% 이하의생존율을나타내어장기형제제로적합하지않다고판단되었다. - 100 -

Survival rate (%) 100 80 60 40 None 10% Garlic 10% Skim milk 5% Garlic + 5% Skim milk Glutinous paste 20 0 0 7 14 21 28 Time (d) Fig. 2-26. 냉동형유산균제제의저장기간별생존율 _Lb. plantarum 세가지실험균주중 Lb. plantarum의냉동형제제는모든처리구에서가장낮은생존율을나타내었다. 저장기간 7일후 10% 마늘파쇄액처리구에서 45% 의최고생존율을기록하였다. 찹쌀풀처리구에서저장기간 7일후 39% 의생존율을기록한후생존율이완만하게감소되어저장 28일후 27% 의생존율을나타내었다. 탈지유및마늘파쇄액단독또는조합한처리구는 Lb. plantarum 냉동형제제를위한동결보호제로적합하지않다고판단되어실험균주의생존율증진을위한새로운냉동형동결보호제가요구되었다. 모든동결보호제처리구에서 P. pentosaceus의냉동형제제는가장높은생존활성을나타내었으며, 특히저장 7일후 10% 마늘파쇄액및찹쌀풀처리구에서각각 60% 와 54% 의생존율을나타내었다. 탈지유와마늘파쇄액의조합에서동결보호상승효과는관찰되지않았다. 찹쌀풀처리구에서저장 14일후와 28일후각각 49% 및 43% 의우수한생존율을기록하였다. 찹쌀풀이김치제조과정중고춧가루, 마늘, 생강등의부재료혼합물에접착력을부여하여절임배추에양념하는용도로이미사용되고있음을감안할때, 김치미생물첨가제에동결보호안정성을부여하는본실험의결과는향후현장편의성미생물첨가제제로서의가능성을확인하였다. - 101 -

Survival rate (%) 100 80 60 40 None 10% Garlic 10% Skim milk 5% Garlic + 5% Skim milk Glutinous paste 20 0 0 7 14 21 28 Time (d) Fig. 2-27. 냉동형유산균제제의저장기간별생존율 _P. pentosaceus 라. 미생물활성및생존율향상을위한보호제선정김치미생물첨가제의장기보존을위하여본연구에서는동결건조방법을이용한분말형제제개발을시도하였다. 김치미생물제제의생존율향상을위하여우수한동결보호제선별및최적농도조건을조사하였다. 또한동결보호제와알지네이트의상승효과를조사하기위하여동결보호제를처리한김치미생물을알지네이트비드에포집하여동결건조후유산균의생존율을조사하였다. 마. 보호제종류별유산균의생존율검정분말형제제를위한동결건조보호제로식품첨가등급의탈지유, 마늘파쇄액, trehalose, 콩가루, 효모추출물등을선정하고 121 에서 15분동안멸균하여보호효과를조사하였다. 유산균이포집된비드는멸균된생리식염수로세척하여 5 ml의 0.3 M sodium citrate 용액에넣고완전히용해시킨후, MRS-BPB 배지에도말하였다. 30 에서 48시간동안배양한다음미생물군집을계수하였다. - 102 -

Table 2-10. 알지네이트비드크기및직경 Bead size Bead diameter(mm) Niddle size 1 0.8 30 2 1.5 24 3 2.0 18 4 2.5 16 식품첨가등급의 10% 탈지유, 10% 효모추출물, 10% 콩가루, 10% trehalose를보호제로선정하고 0.9% 생리식염수를대조구로사용하여동결보호효과를조사하였다. 실험균주모두에서콩가루를동결보호제로사용하였을경우가장높은생존율을나타내었다. 특히, P. pentosaceus의경우동결건조직후 96.2% 의우수한생존율을나타내었으며, W. cibaria 및 Lb. plantarum의경우에서도각각 88% 와 89% 의높은보호효과를나타내었다. 효모추출물처리구의경우 60% 수준의생존활성으로탈지유처리구와유사한효과를나타내었고, trehalose 처리구는실험균주모두에서 20% 미만의가장낮은생존율을기록하여동결보호제로서적합하지않다고판단되었다. 한편, 동결보호제를처리하지않았던대조구의경우대부분의김치미생물이사멸되어 10% 이하의생존율을나타내었다. Fig. 2-28. Photograph of different sizes of alginate beads 바. 동결건조보호제조합에따른김치미생물생존율검정두가지동결건조보호제를 1:1의비율로조합하여최종농도 10% 가되도록첨가한후, 단독으로처리할때동결보호효과가우수한 10% 콩가루처리구를기준으로설정하여동결보호제조합에의한유산균생존율의상승효과를조사하였다. 실험균주모두에서 10% 콩가루단독처리구와비교하여생존율에관한상승효과는나타내지않았지만, 실험군모두에서 40% 이상의생존율을나타내어무처리구보다보호효과가월등하였다. 특히, Lb. plantarum의경우탈지유와콩가루를조합하여동결보호제로첨가하였을때, 84.5% 의생존율을나타내어 10% 콩가루처리구와유사한생존율을나타내었다. Trehalose 처리구의경우단독으로사용하는것보다탈지유와콩가루등의다른보호제와조합하면김치미 - 103 -

생물의생존율이크게증가하는것으로나타났다. 사. 동결건조보호제농도에따른김치미생물생존율조사보호제활성이가장우수한콩가루의농도를 0 ~ 20% 수준으로첨가하여동결건조후김치미생물의생존율을조사하였다. W. cibaria의경우무처리구보다월등히높은생존율을나타내었고, 10% 콩가루를동결보호제로첨가하였을때가장높은생존율 (88%) 나타내었다. 콩가루의농도가 15% 나 20% 로증가하였을때, 김치미생물의생존율은각각 75% 와 72% 로오히려감소하였다. Lb. plantarum과 P. pentosaceus의경우콩가루농도에따른보호효과는 W. cibaria와유사한경향이관찰되어, 세가지실험균주모두 10% 콩가루처리구에서생존율이극대화되었다. - 104 -

A 100 a Survival rate (%) 80 60 40 b b 20 c c 0 100 B a 80 Survival rate (%) 60 40 bc b 20 e d 0 100 C a 80 Survival rate (%) 60 40 b b 20 c d 0 None SM YE SP T Cryoprotective agents Fig. 2-29. Survival rate of lactic acid bacteria (e.g.,w. cibaria (A), Lb. plantanum (B) and P. pentosaceus (C)) during freeze drying process, depending on cryoprotective agents. SM: Skim milk; YE: Yeast extract; SP: Soy powder; T: Trehalose - 105 -

100 A Survival rate (%) 80 60 40 20 0 100 B Survival rate (%) 80 60 40 20 0 100 C Survival rate (%) 80 60 40 20 0 None SP YE+SM YE+SP SM+SP SM+T SP+T Cryoprotective agents Fig. 2-30. Survival rate of lactic acid bacteria (e.g., W. cibaria (A), Lb. plantarum (B), and P. pentosaceus (C)) during freeze drying process, depending on the combination of cryoprotective agents. SM: Skim milk; YE: Yeast extract; SP: Soy powder; T: Trehalose - 106 -

100 A a Survival rate (%) 80 60 40 c b b 20 d 0 100 B a 80 b b Survival rate (%) 60 40 c 20 d 0 100 C a Survival rate (%) 80 60 40 c b b 20 d 0 None 5 10 15 20 Soy powder conc. (%) Fig. 2-31. Survival rate of lactic acid bacteria (e.g., W. cibaria (A), Lb. plantarum (B), and P. pentosaceus (C)) during freeze drying process, depending on the concentration of soy powder. - 107 -

제 5 절활성도및생존율이높은미생물제제개발 1. 실험목적 동결건조후미생물생존율증대를위하여알지네이트비드를제조하여김치미생물을포 집하였다. 2. 방법및결과 가. 탈지유와알지네이트비드의동결보호상승효과검정알지네이트농도및크기에따른보호효과를검정하기위하여동결보호제로 10% 탈지유가첨가된미생물을알지네이트에포집하였다. 페리스탈틱펌프의유속과바늘직경의크기를조절하여직경이 0.8, 1.5, 2.0 mm인비드를제조하였으며알지네이트의농도를 0.5-3% 로조정하여비드의경도를조절하였다. 알지네이트의농도를 0.5% 로조절하여비드를제조하였을때, W. cibaria의생존율은 6% 미만수준으로비드의사이즈에상관없는경향을나타내었다. 알지네이트의농도가 1% 이상일때, 비드직경 1.5 mm 이상에서 50% 이상의생존율을나타내었다. 비드의직경이 0.8 mm로제조되었을때알지네이트농도와상관없이 40% 미만의낮은생존율을나타내어김치미생물의동결건조분말을제조함에있어최소한의알지네이트농도와비드직경이존재한다고판단되었다. 알지네이트의농도 2% 로직경 1.5 mm의비드로김치미생물을포집하였을때, 동결건조후 86% 이상의가장높은생존율을나타내었다. Lb. plantarum의경우 W. cibaria의경우와유사한경향을나타내었다. 0.5% 알지네이트를포집하였을경우 Lb. plantarum은비드의사이즈와상관없이 30% 미만의가장저조한생존율을나타내었다. 알지네이트농도 1% 이상및비드직경 1.5 mm 이상에서 70% 이상의우수한생존율을나타내었으며, 3% 알지네이트및비드직경 2.0 mm 처리구에서 87.8% 의가장우수한생존율을나타내었다. P. pentosaceus의경우앞의두가지실험균주대비상대적으로더욱높은생존율을기록하였다. 알지네이트농도 0.5% 처리구에서비드의직경과상관없이 30% 이상의생존율을기록하였고, 비드직경 0.8 mm 처리구의경우에서도 20% 이상유지하였다. 비드직경이 2.0 mm에서기타사이즈에비해우수한생존율을기록하였고, 특히알지네이트 2%, 비드직경이 1.5 mm와 2.0 mm에서각각 75.9% 및 89.9% 의높은생존율을나타내었다. 세가지실험균주모두에서알지네이트및비드직경이각각 0.5% 이상으로비드직경 0.8 mm 이상제조되어균체를포집하였을때, 동결건조과정에서발생하는균체손상을최소화하여우수한균체보호효과를내타내었다. - 108 -

100 80 Survival rate (%) 60 40 20 2.0 Alginate conc. (%) 0 3.0 2.0 1.0 Bead diameter (mm) 0.5 0 1.5 0.8 Fig. 2-32. Survival rate of W. cibaria after freeze drying process, depending on bead diameter and alginate concentration. 100 Survival rate (%) 80 60 40 20 Bead diameter (mm) 2.0 Alginate conc. (%) 0 3.0 2.0 1.0 0.5 0 1.5 0.8 Fig. 2-33. Survival rate of Lb. plantarum after freeze drying process, depending on bead diameter and alginate concentration. - 109 -

100 Survival rate (%) 80 60 40 20 2.0 Alginate conc. (%) 0 3.0 2.0 1.0 Bead diameter (mm) 0.5 0 1.5 0.8 Fig. 2-34. Survival rate of P. pentosaceus after freeze drying process, depending on bead diameter and alginate concentration. 나. 마늘파쇄액과알지네이트비드포집의동결보호상승효과검정마늘파쇄액 10% 를동결보호제로처리하고알지네이트비드에김치미생물을포집하여동결보호효과를검정하였다. 비드직경 0.8 mm로 W. cibaria를포집하였을때, 알지네이트농도와상관없이 20% 미만의저조한생존율을나타내었다. 1% 알지네이트로직경 2.0 mm의비드를제조하여김치미생물을코팅하였을때 53.9% 의가장높은생존율을나타내어탈지유처리구에비해동결보호효과라저조하였다. - 110 -

70 60 Survival rate (%) 50 40 30 20 10 Bead diameter (mm) 2.0 Alginate conc. (%) 0 3.0 2.0 1.0 0.5 0 1.5 0.8 Fig. 2-35. Survival rate of W. cibaria after freeze drying process, depending on bead diameter and alginate concentration. 비드직경 0.8 mm 이상및알지네이트농도 0.5% 이상처리구에서 Lb. plantarum 생존율은 50 60 % 수준을나타내었으며, 알지네이트 1% 로 2.0 mm의비드로유산균을코팅하였을때 61.6% 의최고생존율을기록하였다. P. pentosaceus를대상으로진행한실험결과에서도 W. cibaria 및 Lb. plantarum과유사한경향을나타내어, 알지네이트코팅을이용한동결건조법을적용하여김치미생물첨가제개발을위해서는일정수준이상의알지네이트농도와비드크기가필요하다고판단되었다. 세가지실험균주를대상으로진행한실험결과에서알지네이트농도와김치미생물생존율의비례적인상관관계가관찰되지않았으며, 전반적으로 1% 알지네이트농도와비드직경 1.5 mm에서균체를포집한처리구에서 50% 이상의우수한보호효율을나타내었다. - 111 -

70 60 Survival rate (%) 50 40 30 20 10 Bead diameter (mm) 2.0 Alginate conc. (% 0 3.0 2.0 1.0 0.5 0 1.5 0.8 Fig. 2-36. Survival rate of Lb. plantarum after freeze drying process, depending on bead diameter and alginate concentration. Survival rate (%) 70 60 50 40 30 20 Alginate conc. (%) 10 0 3.0 2.0 1.0 Bead diameter (mm) 1.5 0.8 0.5 0 2.0 Fig. 2-37. Survival rate of P. pentosaceus after freeze drying process, depending on bead diameter and alginate concentration. - 112 -

다. 동결보호제탈지유와마늘파쇄액조합및알지네이트포집의동결보호상승효과검정탈지유 5% 및마늘파쇄액 5% 를조합하여보호제로사용한후알지네이트로포집하여동결보호상승효과를검정하였다. 거의모든처리구에서 10% 마늘파쇄액을동결보호제로사용한처리구보다우수한생존율을기록하였으며, W. cibaria의경우비드직경 1.5 mm 및 1% 알지네이트로균주를포집한처리구에서 65.2% 의최고생존율을나타내었다. 두가지보호제를혼합하여알지네이트비드에포집하였을때보호효과의상승작용은관찰되지않아, 향후김치미생물첨가제의생존성증진및저장기간향상을위해서는보호제종류및조합비율의조정이필요하다고판단하였다. Lb. plantarum 및 P. pentosaceus를실험균주로사용하여동결보호상승효과를조사한경우에도 W. cibaria와유사한경향을나타내었다. 세가지실험균주의생존율은처리구별커다란차이를나타내지않았으며, 탈지유를보호제로사용하여알지네이트비드에포집한처리구에서가장우수한보호효과를나타내었다. 마늘파쇄액을단독으로보호제로사용한처리구는가장낮은생존율을기록하여알지네이트비드를이용한동결건조법의보호제로서적합하지않다고판단되었다. Survival rate (%) 70 60 50 40 30 20 10 Bead diameter (mm) 2.0 Alginate conc. (%) 0 3.0 2.0 1.0 0.5 0 0.8 1.5 Fig. 2-38. Survival rate of W. cibaria after freeze drying process, depending on bead diameter and alginate concentration. - 113 -

80 Survival rate (%) 60 40 20 2.0 Alginate conc. (%) 0 3.0 2.0 1.0 Bead diameter (mm) 0.5 0 0.8 1.5 Fig. 2-39. Survival rate of Lb. plantarum after freeze drying process, depending on bead diameter and alginate concentration. Survival rate (%) 70 60 50 40 30 20 10 2.0 Alginate conc. (%) 0 3.0 2.0 1.0 Bead diameter (mm) 0.5 0 1.5 0.8 Fig. 2-40. Survival rate of P. pentosaceus after freeze drying process, depending on bead diameter and alginate concentration. - 114 -

제 6 절미생물첨가제제형에따른포장형태및기술개발 1. 실험목적 유통및저장에용이한분말형제제와찹쌀풀을이용한반죽형제제에대해폴리에틸렌재 질의스틱형포장재와튜브형포장재를적용하여저장기간별유산균의생존율을검정하였다. 2. 방법및결과 가. 재료 (1) 김치미생물첨가제제형에따른포장형태개발 Fig. 2-41. 제형별포장형태 (2) 스틱형포장재를이용한유산균제제제조 10% 탈지유를보호제로선정하고제조한김치미생물첨가제분말은각 1g씩스틱형포장재에충진하여 4 ± 1 o C에서저장기간별로유산균의생존율을검정하였다. 세가지실험균주모두저장 7일차에서 80% 이상의우수한생존율을나타내었지만, 저장기간이지날수록감소하였다. W. cibaria의경우저장기간 28일후초기균수는 4.9 10 9 cfu/ml 에서 2.5 10 9 cfu/ml로감소하여약 50% 의생존율을나타내었다. Lb. plantarum과 P. pentosaceus의경우도저장 28일경과후각각 49% 및 53% 의생존율이관찰되었다. - 115 -

120 100 W. cibaria L. plantarum P. pentosaceus Survival rate(%) 80 60 40 20 0 0 7 14 21 28 Time(d) Fig. 2-42. Survival rate of three species of LAB (3) 튜브형포장재를적용한반죽형유산균제제개발찹쌀과멸균수를 1:8비율로혼합한후 100oC에서가열하여반죽형태인찹쌀풀을제조하고냉동보호제로이용하였다. 찹쌀풀과균액은 2:1의비율로혼합후 -20 에서냉동저장하면서저장기간별로 1, 2, 4주동안김치미생물제제를 MRS 고체배지에도말하여생균수를검정하였다. 세가지실험균주모두식품등급의찹쌀풀을동결보호제로처리하여무처리대조구보다월등히높은생존율을나타내었다. 공통적으로저장기간이증가할수록생존율이감소하는경향으로나타났으며, P. pentosaceus의경우 - 20 냉동고에서보존 7일째세균주중 54% 로비교적높은생존율을나타내었으며, 28일이지나서도 43% 이상의생존율을나타냈다. W. cibaria의경우초기균수는 3.1 10 10 cfu/ml에서저장 28일경과후 9.8 10 9 cfu/ml로감소하여 32% 의수준이었고, Lb. plantarum의경우저장 28일째 27% 의생존율을나타내어세균주중가장낮은생존율을보였다. - 116 -

Survival rate (%) 100 80 60 40 None_WC Glutinous rice paste_wc None_LP Glutinous rice paste_ LP None_PP Glutinous rice paste_pp 20 0 0 7 14 21 28 Time (d) Fig. 2-43. Survival rate of lactic acid bacteria during freezing process at 20 o C, depending on storage life. WC: Weissella cibaria; LP: Lactobacillus plantarum; PP: Pediococcus pentosaceus - 117 -

제 7 절미생물첨가제대량배양기술개발 1. 실험목적 김치유래우수미생물자원의산업적생산을위하여실험균주의최적영양원을선발하 였다. 실험균주의발효생산극대화를위한탄소원및질소원선발하여유산균전용생산배 지인 MRS broth 와경제성을비교하였다. 2. 방법및결과 가. 최적탄소원탐색 MRS broth의무기원성분을기초로하여질소원을효모추출물 2.5% 로고정하고탄소원에따른균체량을측정하였다. 탄소원의농도는 2% 로고정하고대수증식기후반기점배양 1% 를 15 ml conical tube에접종하여 30 o C에서 24시간동안정치배양하였다. W. cibaria의경우포도당을비롯한단당류에의한균체생육이우수하였으며, 포도당을주요탄소원으로사용하였을경우 MRS broth보다우수한균체생육 (8.5 x 10 9 cfu/ml) 을기록하였다. 과당및포도당이결합된이당인맥아당에서도우수한균체생육이확인되었다. Erythritol 등의당알콜의경우 W. cibaria의균체생육이낮게나타내어균체의액체배양을위해적합하지않은기질이라판단되었다. a W. cibaria (cfu/ml, x 10 9 ) 8.0 6.0 4.0 2.0 b e c h d i i f g j 0.0 MRS Glu Gal Fru Lac Mal Ery Ino Man Sor Xyl Carbon sources Fig. 2-44. 탄소원에따른 W. cibaria의균체량형성. Glu: glucose; Gal: galactose; Fru: fructose; Lac: lactose; Mal: maltose; Ery: erythritol; Ino: inositol; Man: mannitol; Sor: sorbitol; Xyl: xylitol - 118 -

8.0 a a L. plantarum (cfu/ml, x 10 9 ) 6.0 4.0 2.0 c b e c g f d d fg 0.0 MRS Glu Gal Fru Lac Mal Ery Ino Man Sor Xyl Carbon sources Fig. 2-45. 탄소원에따른 Lb. plantarum 의균체량형성. Glu: glucose; Gal: galactose; Fru: fructose; Lac: lactose; Mal: maltose; Ery: erythritol; Ino: inositol; Man: mannitol; Sor: sorbitol; Xyl: xylitol Lb. plantarum의경우포도당을비롯한단당류에의한균체생육이우수하였고, 전반적으로 W. cibaria와유사한경향을나타내었다. MRS broth와포도당을사용했던배지에서총균체량은가장우수하여 7.5 ~ 7.7 x 10 9 cfu/ml 수준이었다. 당알콜을탄소원으로사용했던경우 6.0 x 10 9 cfu/ml 미만의저조한균체생육경향을나타내어균체의대량배양을위해적합하지않은기질이라판단되었다. 실험균주중 P. pentosaceus의균체생육이가장저조하였다. 포도당및포도당중합체인맥아당을탄소원으로사용하였을경우최고수율인 4.4 x 10 9 cfu/ml 수준의균체를생산하였다. Erythritol을탄소원으로사용했던경우 8.3 x 10 8 cfu/ml의가장낮은균체생육을나타내는등당알콜은적합하지않은기질이라판단되었다. 세가지실험균주모두에서당알콜에의한균체생육보다는당류특히포도당이나포도당중합체인맥아당이균체생육에유리한탄소원으로작용하였다. 배지원가및생산수율등의경제성을고려하여향후질소원선발을위한주요탄소원으로포도당을사용하였다. - 119 -

8.0 P. pentosaceus (cfu/ml, x 10 9 ) 6.0 4.0 2.0 a a b b c a d d d d e 0.0 MRS Glu Gal Fru Lac Mal Ery Ino Man Sor Xyl Carbon sources Fig. 2-46. 탄소원에따른 P. pentosaceus 의균체량형성. Glu: glucose; Gal: galactose; Fru: fructose; Lac: lactose; Mal: maltose; Ery: erythritol; Ino: inositol; Man: mannitol; Sor: sorbitol; Xyl: xylitol 나. 최적질소원탐색포도당 2% 를탄소원으로고정하고 MRS broth의무기원조성을기본으로설정하여질소원선발을실시하였다. 유산균생육을위한질소원으로화학배지 (chemically defined media) 와복합배지 (complex media) 를사용하여실험균주의균체량생성을비교하였다. 화학배지의경우실험균주모두에서 ammonium phosphate이가장우수한균체생육을유도하였다. W. cibaria 균주의생육이같은조건에서다른두균주보다우수하였다 (W. cibaria 4.7 x 10 9 cfu/ml, Lb. plantarum 4.2 x 10 9 cfu/ml, P. pentosaceus 3.2 x 10 9 cfu/ml). Ammonium chloride, ammonium sulfate, 그리고 sodium nitrate을질소원으로사용했을때전반적으로낮은균체생육을나타내어화학배지는실험균주의생육에적합하지않다고판단하였다. 효모추출물을비롯한복합배지를질소원으로사용한경우, 화학배지에서보다우수한유산균생육을나타내었다. W. cibaria의경우효모추출물에서 7.6 x 10 9 cfu/ml 수준으로 MRS broth와유사한균체생육을나타내었고, peptone, 콩가루, beef extract 등도우수한균체생육을유도하였다. Lb. plantarum과 P. pentosaceus의경우에서도효모추출물은가장우수한균체생육을유도하여향후실험균주액체배양을위한기본배지로결정하였다. - 120 -

8.0 a b a W. cibaria (cfu/ml, x 10 9 ) 6.0 4.0 2.0 f d f f c e c 0.0 MRS AC AP AS SN BE C P SP YE Nitrogen sources Fig. 2-47. 질소원에따른 W. cibaria 의균체량형성. MRS: MRS broth; AC: ammonium chloride; AP: ammonium phosphate; AS: ammonium sulfate; SN: sodium nitrate; BE: beef extract; C: casein acid hydrolysate; P: peptone; SP: soy powder; YE: yeast extract L. plantarum (cfu/ml, x 10 9 ) 8.0 6.0 4.0 2.0 a g e g g d f b c a 0.0 MRS AC AP AS SN BE C P SP YE Nitrogen sources Fig. 2-48. 질소원에따른 Lb. plantarum의균체량형성. MRS: MRS broth; AC: ammonium chloride; AP: ammonium phosphate; AS: ammonium sulfate; SN: sodium nitrate; BE: beef extract; C: casein acid hydrolysate; P: peptone; SP: soy powder; YE: yeast extract - 121 -

8.0 P. pentosaceus (cfu/ml, x 10 9 ) 6.0 4.0 2.0 b f c ef ef d e c c a 0.0 MRS AC AP AS SN BE C P SP YE Nitrogen sources Fig. 2-49. 질소원에따른 P. pentosaceus의균체량형성. MRS: MRS broth; AC: ammonium chloride; AP: ammonium phosphate; AS: ammonium sulfate; SN: sodium nitrate; BE: beef extract; C: casein acid hydrolysate; P: peptone; SP: soy powder; YE: yeast extract 다. 대용량발효생산배지성분을포도당 2%, 효모추출물 2.5%, 초산나트륨 0.5%, 황산마그네슘 0.01%, 황산망간 0.005%, 인산나트륨 0.2% 으로구성하고 W. cibaria와 Lb. plantarum 균주를사용하여 50 L 및 500 L 실험공장수준에서실험균주의대량생산을시도하였다. MRS broth에서김치미생물의점배양을실시한후후기대수증식기단계의실험균주 1% 를 pliot 발효기에접종하였다. 50 L 및 500 L 생물발효기의교반속도를각각 60과 40으로고정한후, 30 o C에서균체의발효생산을진행하였다. 배양온도 30 o C에서 24시간 W. cibaria를생산하였을때, 50 L 생물발효기에서 1.2 x 10 9 cfu/ml 수준의균체를생산하였다. 배양 14시간이후산생성이급격히증가하였고, ph는시간에따라지속적으로감소하여배양 24시간 5.2 수준이었다. 500 L 생물발효기에서초반 10시간까지균체생육은 8 x 10 8 cfu/ml 수준으로비교적빠르게진행되었지만, 이후 8시간동안생육속도가급격히감소하여균체량이증가하지않았다. 배양 24시간최종수율은 1.04 x 10 9 cfu/ml을기록하여균체의효율적인대량생산을위해새로운배양전략이필요하다고판단되었다. 500 L 배양의산생성경향은 50 L 배양과유사하였지만, 배양초기부터더높은산도를유지하였다. W. cibaria의균체생육속도는배양액 ph가 5.4 수준까지빠르게진행되었지만 ph가더낮아지면서비례적으로줄어들어배양환경의 ph와균체의비증식속도는음성적상관관계를나타내었다. W. cibaria는내산성이높지않은균주로김치발효초기부터중기까 - 122 -

지만주도적으로김치발효에관여하는균임을고려할때, 배양액의 ph를주요한발효조절인자로설정하고대량생산에관한배양전략이수립되어야한다고판단하였다. Lb. plantarum의경우 50 L 생물발효기에서배양 20시간산도 1% 에서 1.5 x 10 9 cfu/ml의최고수율을나타내었다. 배양 6시간부터 12시간까지 ph가급격히감소하고균체생육속도는비례적으로증가하였다. 배양 12시간이후산생성속도가느려지면서균체의비증식속도가감소하여, Lb. plantarum의증식과산도의비례적인상관관계를형성한다고판단하였다. 500 L 생물발효기에서도배양 12시간까지배양액의산도가증가할수록균체생육은꾸준히증가하였으나, 산생성이주춤한배양 14시간이후 9.0 x 10 8 cfu/ml 수준으로균체농도는증가하지않았다. 6.6 50 L 15 1.2 ph 6.3 6.0 5.7 5.4 ph W. cibaria Acidity 12 9 6 3 0 W. cibaria (cfu/ml, x 10 8 ) 0.9 0.6 0.3 Acidity (%) 6.9 500 L 12 1.2 ph 6.6 6.3 6.0 5.7 5.4 5.1 ph W. cibaria Acidity 9 6 3 W. cibaria (cfu/ml, x 10 8 ) 1.0 0.8 0.6 0.4 Acidity (%) 4.8 0 0 5 10 15 20 25 Time (h) 0.2 Fig. 2-50. Growth profile of W. cibaria in 50 L and 500 L pilot scale fermentation. - 123 -

ph 6.5 6.0 5.5 5.0 50 L ph L. plantarum Acidity 18 15 12 9 6 3 L. plantarum (cfu/ml, x 10 8 ) 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 Acidity (%) ph 4.5 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 500 L 0 5 10 15 20 25 Time (h) ph L. plantarum Acidity Fig. 2-51. Growth profile of Lb. plantarum in 50 L and 500 L pilot scale fermentation. 0 10 8 6 4 2 0 L. plantarum (cfu/ml, x 10 8 ) 1.2 0.9 0.6 0.3 0.0 Acidity (%) 배양 20시간 1.0 x 10 9 cfu/ml 수준의최고수율을기록하였고산도는 0.7% 를나타내었다. Lb. plantarum이내산성이강하여각종프로바이오틱후보균주로선발및제품화되고김치발효중후반기주도적인산생성에관여한다는점을고려할때, 산도를주요한발효조절인자로설정하고대량생산에관한배양전략이수립되어야한다고판단하였다. - 124 -

제 8 절모의유통조건을통한미생물첨가제활성유지조건확립 1. 실험목적 김치제조가자연발효에서미생물첨가에따른발효조절로패러다임이변화함에따라김치에서분리한유용미생물의현장편의형제제화기술을개발하여저장및유통기간동안미생물첨가제의활성유지및제제공정후생존율을높이고자하였다. 김치미생물첨가제의장기보존을위하여본연구에서는동결건조방법을이용한분말형제제를개발하여, 김치미생물제제의생존율향상을위하여우수한동결보호제선별및최적조건을조사하였다. 또한동결보호제와알지네이트의동결보호상승효과를조사하기위하여김치미생물을알지네이트비드에포집하여동결보호제를처리하여동결건조후유산균의생존율을조사하였다. 2. 방법및결과 가. 미생물활성및생존율향상을위한보호제선정 (1) 사용균주및보존 1차년도과제수행중김치로부터분리된 Lacobacillus brevis A101, Lactococcus lactis CHJ10 균주를사용하였다. 실험균주는유산균배양에적합한 MRS broth(lactobacilli MRS agar, Difco) 에접종하여 30 에서 24±12시간배양하여활성화시킨후, MRS agar plate 에접종하여 4 에서 4주간격으로계대배양하면서보관하였다. 실험균주의장기보관법으로는글리세롤최종농도 20% 로미생물현탁액을제조하여 80 에서보존하였 Fig. 2-52. Lactic acid bacteria, Lacobacillus brevis A101(left) and Lactococcus lactis CHJ10(right). - 125 -

(2) 김치유래미생물의배양 -80 에서장기보관된실험균주를 10 ml MRS broth에 1 % (v/v) 접종하여 30 에서 24시간배양한후, 다시 MRS broth에 2차접종하여미생물의활성을증대시킨후사용하였다. (3) 시험균주의계수 MRS broth에 0.2% Bromophenol blue(bpb) 지시약 1% 를첨가하여 MRS-BPB 배지를제조하였다. 미생물현탁액 100 μl도말하여 30 에서 24±12시간동안배양한다음미생물군집의숫자를계수하였다. 분말형제제를위한동결건조보호제로식품첨가등급의콩가루, skim milk, yeats extract, trehalose와 sodium alginate를 121 에서 15분동안멸균하여사용하였다. 유산균이포집된비드는멸균된생리식염수로세척하여 1 ml의 0.3 M sodium citrate 용액에넣고완전히용해시킨후, MRS-BPB 배지에도말하였다. 30 에서 36±12시간동안배양한다음미생물군집을계수하였다. (4) 모의유통과정조건에따른생존율조사가장우수한동결보호제를선정하여 alginate bead에유산균을포집하여 sodium alginate와동결보호제의동결건조직후및저장기간동안의생존율을식품및축산물의유통기한설정실험가이드라인의실측실험을참고하여저장온도김치에서분리한유산균을이용하여모의유통조건에따른활성유지조건을탐색하고자분말형으로제조된유산균제제를실온, 냉장, 냉동온도 (-18, 4, 10, 20, 30, 35 and room temperature) 저장기간에따른생존율을조사하여미생물첨가제의활성이유지되는최적조건을탐색하고자하였다. 또한저장기간에따라서 0, 7, 14, 28, 56일까지생존율을조사하였다. Fig. 2-53. 식품의약품안전처식품및축산물의유통기한설정실험가이드라인 - 126 -

(5) 용어의정의 - 냉동저장 : 식품의수분을얼려효소나산화에의한변질을최소화하는저장방법, 온도위는 18 이하 - 냉장저장 : 식품의어는점이상의낮은온도에서식품을보관및저장, 온도범위는 0 10 - 실온저장 : 식품을환기장치와단열만으로저장하는방법온도범위는 1 35 - 상온저장 : 온도범위는 15 25 - 실측실험 : 의도하는유통기한동안실제저장조건또는유통조건으로저장하면서선정한품질지표에대해품질한계에이를때까지일정간격으로실험을진행하면서변화를측정하는실험 - 실측실험의저장조건 - 저장온도는제조후보관, 유통, 진열, 소비전보관등제조에서소비에이르기까지일어날수있는조건들을고려하여최소 2개의온도즉, 유통온도와비교온도를설정함 - 유통온도 : 제품의대표적인유통온도조건을선택함 - 비교온도 : 극단의환경, 여러유통단계에서소비된시간을참조하여적절한비교온도를결정함, * 유통온도 : 반드시제품의대표유통온도를포함하여저장조건을설정 Table. 2-11 유통온도및저장온도예 구분유통온도저장온도 - 127 -

나. 동결보호제종류에따른동결건조전후생존율검정 네가지식품첨가등급의동결보호제를첨가하여김치미생물의동결보호효과를검정한결과두가지균주의경우에서동결보호제를사용하지않은처리구보다생존율이증가하였다. Lb. brevis A101균주의경우동결건조직후콩가루를보호제로사용하였을경우보호효과가 90% 이상의높은생존율을나타내었다. Lc. lactis CHJ10의경우에서도콩가루를보호제로사용하였을때 94% 의높은생존율을기록하였다. 본연구에서동결보호제로선정한콩가루는식품첨가등급의경제적인소재이면서단백질, 섬유질, 무기질, 지질, 각종비타민등과 lysine을비롯한다양한아미노산류가풍부한식품소재로써동결건조중실험균주를보호해주는역할을수행하여동결건조중김치미생물의생존율향상에크게기여한것으로판단되었다. 일반적으로동결보호제로널리사용되고있는탈지유는식품에첨가할경우풍미에영향을미칠수있으며또한섭취시유당소화불량및유당불내증환자의경우음용하는데어려움이있으나콩가루를사용할경우이러한점을개선할수있을뿐만아니라식물성단백질과칼슘및철분이풍부하여단백질이보강되고풍미가향상될수있을것으로여겨진다. 본실험에사용한콩가루는 9.7% 의질소함량과 sodium, phosphorus, chloride, potassium, calcium 등의무기염류가함유되어동결건조과정중탈지유에비해높은보호효과가나타난것으로사료된다. 본실험결과에서동결보호제로탈지유를사용한처리구에서실험균주의생존율은각각 70 76% 수준으로나타내어보호효과가우수한콩가루를사용했을경우의생존율보다비교적낮은수준으로나타났다. 효모추출물처리구에서도두가지균주모두에서 65% 이상보호효과를기록하여동결보호제로서의가능성을제시하였다. 천연비환원성당인 trehalose는단백질의동결에의한보호작용건조에따른세포보호작용등을수행하여미생물의생명보전및건조에의한영향에작용하는보호물질로서, Lc. lactis CHJ10 균주의경우 45% 의낮은생존율을기록하였으나, Lb. brevis A101 경우에는각각 60% 의비교적높은생존율을나타내었다. 따라서, 동결보호제종류별유산균의생존율에미치는효과는균의차이, 보호제농도의차이에따라서도영향이있는것으로판단된다. 이상사용된식품첨가등급의네가지보호제는유산균제제의동결보호효과가탁월하여건조과정중미생물의생존율을극대화시키는장점이있다. 실제미생물제제의제조시동결보호효과가높은보호제를사용하여동결건조중발생하는유산균의손실을최소화하여초기비용을줄일수있을것으로판단된다. 본연구결과를바탕으로향후내산성, 내답증성, 장내부착능향상을고려한보호제조합이연구된다면김치미생물을이용한미생물첨가제및장내균총조절용프로바이오틱스제품개발등다양한산업적이용방안에사용될수있을것이라사료된다. - 128 -

120 100 a Ralative viability (%) 80 60 40 b b b 20 c 0 DW SM YE SP T Cryoprotectant agent Fig. 2-54. Viability of lactic acid bacteria, Lactobacillus brevis A101 during freeze drying process, depending on different protective agents. SM: Skim milk; YE: Yeast extract; SP: Soy powder; T: Trehalose. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). Different characters were significantly different (p < 0.05). 120 100 a Ralative viability (%) 80 60 40 b b c 20 d 0 DW SM YE SP T Cryoprotective agent Fig. 2-55. Viability of lactic acid bacteria, Lactococcus lactis CHJ10 during freeze drying process, depending on different protective agents. SM: Skim milk; YE: Yeast extract; SP: Soy powder; T: Trehalose. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). Different characters were significantly different (p < 0.05). - 129 -

다. 동결보호제종류별무기염류함량네가지식품첨가등급의동결보호제를첨가하여김치미생물의동결보호효과를검정한결과모든경우에서동결보호제를사용하지않은처리구보다생존율이증가되는효과를나타내었으며, 특히콩가루에서효과가뛰어난결과를바탕으로, 콩가루의주요성분중질소원과무기염류성분이동결보호효과상승에크게작용한것으로판단되어각동결보호제성분을 ICP를이용하여양이온의함량을조사하였다. 동결보호제종류별무기염류함량으로는 soy powder의경우 magnesium이온과 sodium이온의함량이 2,495 mg/kg, 6,996 mg/kg으로다른동결보호제의함량과비교해보았을때가장높게나타났다. 따라서 magnesium이온과 sodium이온이동결보호효과에큰영향을미쳤을것으로판단되었다. Table 2-12. 동결보호제종류별무기염류함량 (mg/kg) sodium phosphorus potassium calcium Magnesium skim milk 3,790 9,406 12,947 12,358 1,135 Yeast extract 5,256 10,219 32,759 980 986 soy powder 6,996 3,172 23,145 831 2,495 sodium alginate 5,232 0 517 2,161 97 라. Powder 제제의저장기간별생존율검정김치에서분리한유산균을이용하여모의유통조건에따른활성유지조건을탐색하고자분말형으로제조된유산균제제를실온, 냉장, 냉동온도별로 (-18, 4, 10, 20, 30, 3 5, room temperature) 저장기간에따른생존율을조사하여미생물첨가제의활성이유지되는최적조건을탐색하고자하였다. 멸균수를대조구로사용하고동결보호효과가가장우수한콩가루를동결보호제로사용하여제조한분말형제제를동결건조직후및저장기간별로 7, 14, 28, 56일까지생존율을조사하였다. Lb. brevis A101의초기농도는 1.2 10 10 cfu/ml로대조구인멸균수에실험균주를현탁하여동결건조를실시한직후 10% 미만의낮은생존율을나타내었지만, 동결보호제를사용한처리구에서는동결건조직후 95.1% 의생존율을나타내었다. -20 에서저장한제제의경우저장기간 7일경과후의생존율은대조구와처리구각각 7.4%, 93.5% 로나타내었고, 14일경과후의생존율은대조구및처리구의생존율은 7.3%, 92.4%, 28일경과후에는각각 4.9%, 87.6%, 56일경과하였을때는각각 2.9%, 44.6% 로크게감소하였다. 4 에서보관한제제의경우대조구및처리구의 28일경과후의생존율은 4.3%, 68.9% 로나타났고 56일경과시에는각각 1.9%, 34.1% 로나타났다. 10 에서보관한제제의경우대 - 130 -

조구및처리구의 28일경과후의생존율은 4.1%, 65.7% 로나타났고, 저장 56일경과후에는 0.1%, 20.8% 로나타났다. 20 에서보관한제제의경우대조구및처리구의 28일경과후의생존율은 3.7%, 55.1% 로나타났으며, 56일경과후에는각각 0.4%, 13.2% 로나타났다. 30 에서보관한제제의 28일경과후의생존율은 34%, 50.5%, 56일경과후에는대조구의경우에는 0.2%, 처리구에서는 9.7% 로저장온도가상승할수록생존율이급격히감소하는것을확인하였다. 35 에서보관한제제의경우 7일경과후대조구의생존율이 5.3% 로감소하였고동결보호제를처리한실험군에서도생존율이 76.5% 로감소한것을확인하였다. 저장기간 28일및 56일이경과하였때처리구에서는 46.8%, 6.5% 를나타내어 35 에서제제를보관한경우 56 일이경과시생존율이매우낮아지는것을확인하였다. 따라서, 저장온도가낮을수록특히, -18 에서저장하는것이저장기간에따른생존율의변화가적은것을알수있었다. 실험결과, 저장기간이증가할수록생존율은비례적으로감소하였으나동결보호제를사용한제제의경우에서는보호제의효과로인해생존율이비교적상승함을확인하였으며제제의저장온도는 20 에서저장한경우의생존율이가장높게나타나유통과정온도로가장적합하다고판단되었다. L lacis CHJ10을이용한분말형제제의초기농도는 1.6 10 10 cfu/ml로동결건조직후의생존율은대조구및처리구의경우 8.9%, 96.6% 로동결보호제를사용한처리구의생존율이매우높게나타났다. 각온도별저장기간에생존율을조사한결과, 18 에서저장한대조구의생존율은동결건조직후및저장기간동안 10% 미만의낮은생존율을나타낸반면동결보호제를사용한처리구의경우에는저장기간 7일경과후의생존율은 96.0%, 14일차는 93.4%, 28일차에는 90.9%, 56일차의생존율은 46.2% 를나타내었다. 4 에서보관한제제의경우저장 28일경과후의생존율은 73.0% 로감소하였으며, 저장 56일경과후의생존율은 39.8% 로급격히감소하는것으로나타났다. 10 에서보관한제제의경우저장 28일경과후의생존율은 66.2%, 56일경과후에는 25.5% 로감소하였다. 20 에서보관한제제의경우처리구의 28일경과후의생존율은 58.1% 에서 56일경과후에는 15.7% 로감소하였고, 30 에서보관한제제의경우 28일경과후의생존율은 50.6%, 56일경과후에는 8.5% 로생존율이저하되었다. 35 에서보관한제제의경우 28일경과후의생존율은 48.3% 로나타났으며 56일경과후에는 5.3% 의낮은생존율을보였다. 실온저장일경우 7일차에서의생존율은 81.7% 로나타났고, 28일차에는 31.9%, 56일차에는 0.1% 로 56일차의생존율은극히저조하게나타났다. - 131 -

마. Alginate bead로포집한제제의저장기간별생존율검정동결건조후미생물생존율상승효과를조사하기위하여동결건조보호효과가가장뛰어난콩가루와 sodium alginate를이용하여김치유산균을 alginate bead포집하여제조한분말형제제의모의유통조건에따른활성유지조건을탐색하고자 0.85% 생리식염수를대조구로사용하고콩가루를동결보호제로사용한 alginate bead를이용한제제를동결건조직후및저장기간별로 7, 14, 28, 56일까지생존율을조사하였다. 유산균제제를실온, 냉장, 냉동온도 (-1 8, 4, 10, 20, 30, 35 and room temperature) 저장기간에따른생존율을조사하여미생물첨가제의활성이유지되는최적조건을탐색하고자하였다. alginate bead의농도및크기는 2차년도연구결과에따른보호효과를결과를참고하여. 페리스탈틱펌프의유속과바늘직경의크기를조절하여직경이 1.8±±0.2mm의비드를제조하였으며알지네이트의농도를 1% 로조정하여비드의경도를조절하였다. Lb. brevis A101의초기농도는 2.6 10 10 cfu/ml로농축하여 alginate bead를제조하였다. 대조구인멸균수에 bead를침지한후동결건조를실시한직후 88.8% 의생존율을나타내어 bead에포집하지않은대조구의생존율보다높은생존율을나타내었다. bead에포집한후콩가루를동결보호제로사용하여동결보호용액에침지하여동결건조후의처리구에서는 97.9% 의생존율을나타내어기존의분말형제제인 95.1% 의생존율보다상승하는것을확인하였다. -20 에서저장한제제의경우저장기간 7일경과후의생존율은대조구와처리구각각 86.2%, 96.5% 로나타내었고 4 에서보관한제제의경우대조구및처리구의 28일경과후의생존율은 40.8%, 80.8% 로나타났고 56일경과시에는각각 28.9%, 52.9% 로나타났다. 10 에서보관한제제의경우대조구및처리구의 28 일경과후의생존율은 36.6%, 72.8% 로나타났고, 저장 56일경과후에는각각 25.2%, 40.0% 로나타났다. 20 에서보관한제제의경우대조구및처리구의 28일경과후의생존율은 33.3%, 61.0% 로나타났으며, 56일경과후에는각각 21.2%, 30.5% 로나타났다. 30 에서보관한제제의처리구의경우 28일경과후의대조구와처리구의생존율은각각 29.5%, 53.9%, 56일경과후에는대조구의경우에는 13.5%, 처리구에서는 20.9% 로 bead에포집하여동결건조보호제에침지하여제조한분말형제제의경우에도저장온도가상승할수록생존율이급격히감소하는것을확인하였다. 35 에서보관한제제의경우 7일경과후대조구의생존율이 69.4% 로급격히감소하였고동결보호제를처리한실험군에서도생존율이 79.5% 로감소한것을확인하였다. 실온에서보관할경우 28일경과후대조구의생존율은 36.9%, 처리구의생존율은 58.1% 로나타났다. 이는기존의분말형제제에비하여저장기간에따라서도전체적으로생존율이높은것으로, 저장기간이경과함에따라서도 sodium alginate와동결보호제의상승효과가있는것으로판단되어진다. Lc. lactis CHJ10의초기농도는 1.5 10 10 cfu/ml로동결직후의대조구의생존율은 84.5%, 동결보호제처리구의생존율은 97.7% 를나타내었다. 이는보호제만사용할경우의생존율보다높은것을 Lc. lactis CHJ10의경우에서도나타나는것을확인하였다. -20 에서저장한제제의경우저장기간 7일경과후의생존율은대조구와처리구각각 83.9%, 94.3% 로나타내었고, 28일경과후각각의생존율은 55.9%, 89.1% 로나타 - 132 -

났다. 56일경과후의각각의생존율은 29.1%, 43.4% 의생존율을나타내어 28일경과후의동결보호제를이용한 20 에서저장한유산균제제의생존율이매우우수한것을확인할수있었다. 10 에서보관한제제의경우대조구및처리구의 28일경과후의생존율은 49.1%, 75.7% 로나타났고, 저장 56일경과후에는 12.7%, 29.3% 로나타났다. 20 에서보관한제제의경우대조구및처리구의 28일경과후의생존율은 45.0%, 68.0% 로나타났으며, 56일경과후에는각각 5.9%, 14.3% 로나타났다. 30 에서보관한제제의처리구의경우 28일경과후의대조구와처리구의생존율은각각 41.6%, 60.5%, 56일경과후에는대조구의경우에는 0.7%, 처리구에서는 10.5% 로 bead에포집하여동결건조보호제에침지하여제조한분말형제제의경우에도저장온도가상승할수록생존율이급격히감소하는것을확인하였다. bead에포집하여동결건조한제제의경우실온에보관할경우의생존율은저장 28일경과후대조구및처리구의생존율이각 45.9%, 59.3% 를나타내었고, 56일경과후에는 0.9%, 9.3% 로급격히감소하는것을확인하였다. 모의유통과정온도별로 28일까지의저장기간에서보호제를사용한처리구의경우냉동, 냉장, 10 에서의생존율이각각 93.2%, 86.4%, 83.4% 로확인되어위저장온도와저장기간이매우우수한생존율을나타내는조건인것으로나타났다. 120 100-18 o C Relative viability (%) 80 60 40 20 None Soy powder Microencapsulation Soy powder + Microencapsulation 0 0 7 14 28 56 Time (days) Fig. 2-56. Relative viability of Lb. brevis A101 at 18 o C. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). - 133 -

120 100 4 o C Relative viability (%) 80 60 40 20 None Soy powder Microencapsulation Soy powder + Microencapsulation 0 0 7 14 28 56 Time (days) Fig. 2-57. Relative viability of Lb. brevis A101 at 4 o C. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). 120 100 10 o C Relative viability (%) 80 60 40 20 None Soy powder Microencapsulation Soy powder + Microencapsulation 0 0 7 14 28 56 Time (days) Fig. 2-58. Relative viability of Lb. brevis A101 at 10 o C. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). - 134 -

120 100 20 o C Relative viability (%) 80 60 40 20 None Soy powder Microencapsulation Soy powder + Microencapsulation 0 0 7 14 28 56 Time (days) Fig. 2-59. Relative viability of Lb. brevis A101 at 20 o C. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). 120 100 30 o C Relative viability (%) 80 60 40 20 0 None Soy powder Microencapsulation Soy powder + Microencapsulation 0 7 14 28 56 Time (days) Fig. 2-60. Relative viability of Lb. brevis A101 at 30 o C. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). - 135 -

120 100 35 o C Relative viability (%) 80 60 40 20 None Soy powder Microencapsulation Soy powder + Microencapsulation 0 0 7 14 28 56 Time (days) Fig. 2-61. Relative viability of Lb. brevis A101 at 35 o C. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). 120 100 Room temperature Relative viability (%) 80 60 40 20 None Soy powder Microencapsulation Soy powder + Microencapsulation 0 0 7 14 28 56 Time (days) Fig. 2-62. Relative viability of Lb. brevis A101 at room temperature. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). - 136 -

120 100-18 o C Relative viability (%) 80 60 40 20 None Soy powder Microencapsulation Soy powder +Microencapsulation 0 0 7 14 28 56 Time (days) Fig. 2-63. Relative viability of Lc. lactis CHJ10 at 18 o C. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). 120 100 4 o C Relative viability (%) 80 60 40 20 None Soy powder Microencapsulation Soy powder + Microencapsulation 0 0 7 14 28 56 Time (days) Fig. 2-64. Relative viability of Lc. lactis CHJ10 at 4 o C. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). - 137 -

120 100 10 o C Relative viability (%) 80 60 40 20 None Soy powder Microencapsulation Soy powder + Microencapsulation 0 0 7 14 28 56 Time (days) Fig. 2-65. Relative viability of Lc. lactis CHJ10 at 10 o C. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). 120 100 20 o C Relative viability (%) 80 60 40 20 None Soy powder Microencapsulation Soy powder + Microencapsulation 0 0 7 14 28 56 Time (days) Fig. 2-66. Relative viability of Lc. lactis CHJ10 at 20 o C. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). - 138 -

120 100 30 o C Relative viability (%) 80 60 40 20 None Soy powder Microencapsulation Soy powder + Microencapsulation 0 0 7 14 28 56 Time (days) Fig. 2-67. Relative viability of Lc. lactis CHJ10 at 30 o C. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). 120 100 35 o C Relative viability (%) 80 60 40 20 None Soy powder Microencapsulation Soy powder + Microencapsulation 0 0 7 14 28 56 Time (days) Fig. 2-68. Relative viability of Lc. lactis CHJ10 at 35 o C. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). - 139 -

120 100 Room temperature Relative viability (%) 80 60 40 20 None Soy powder Microencapsulation Soy powder + Microencapsulation 0 0 7 14 28 56 Time (days) Fig. 2-69. Relative viability of Lc. lactis CHJ10 at room temperature. Data were expressed as mean ± SD (n = 3). - 140 -

제 9 절미생물첨가제사용매뉴얼 ( 안 ) 1. 개요 미생물첨가제사용매뉴얼은균종별제형별생존율에대한자료를제시하고, 첨가제를김치제조에활용법을알려줌으로서효과적인김치제품개발및생산에도움이되고자함 미생물첨가제사용매뉴얼은균종별제형별생존율에대한보증기간을제시함 실제공급시별도의안내책자를제공함 2. 제형별생존율및효능 김치에서분리한유산균을이용하여김치제조현장에서적용하기편한제형으로미생물첨가제를제조하여저장및유통기간동안의생존율을조사함 각미생물제제의균종류에따른제형별및저장기간별생존율을중심으로종균으로서의가능성을시험함 미생물첨가제에대한생물학적환경안전성에대한보증은별도로제공하지않으며, 용도는김치제조및관련시험목적으로한정함 3. 미생물첨가제사용법 미생물첨가제는 3 가지형태별종류가있으며, 각생산현장의특성에따라적합 한형태를활용할수있도록제공됨 그림. 미생물첨가제형태별종류 - 141 -

제 10 절미생물첨가제보급시스템구축 ( 안 ) < 미생물첨가제보급시스템메인페이지 ( 안 )> - 142 -

< 온라인용신청페이지 ( 안 )> - 143 -

< 미생물첨가제보급신청서 ( 안 )> 미생물첨가제접수 세계김치연구소, 503-360, 광주광역시남구김치로 86 번지 ( 임암동 675-1 번지 ) 접수번호 : 접수일자 : 미생물첨가제보급신청서 본인은아래첨가제의보급을의뢰합니다. 미생물명보급형태 ( 표시 ) 1. 액상분말냉동반죽 2. 액상분말냉동반죽 3. 액상분말냉동반죽 보급비용은미생물, 보급형태, 제공량에따라달라질수있음. 각미생물첨가제는생존율에대한객관적인자료및사용방법에대한매뉴얼을함께제공함. 소속기관주소우편번호신청자명전화 E-mail F A X 균주우송 : 우편우송 ( ) 직접수령 ( ) 접수자 - 144 -

제 1 절젓갈용우수미생물선발및미생물첨가제를이용한 젓갈발효조절기술개발 1. 고염젓갈 ( 멸치젓, 새우젓 ) 및저염젓갈 ( 오징어젓 ) 용우수미생물선발 가. 고염젓갈 ( 멸치젓, 새우젓 ) 미생물군집분석을통한우점종도출 (1) 젓갈시료및고염에서생장하는 bacteria 선발 Bacteria 분리를위한멸치젓과새우젓은수원시소재재래시장에서 2011년 9월에구입하였고, 멸균한거즈로걸러분리한젓갈시료의여액을 bacteria 선발및성분분석에사용하였다. 여액의 NaCl 농도는식품공전에따라측정하였고, ph는 ph meter를사용하여측정하였다. 멸치젓과새우젓시료각 1종을여과하여얻어진여액의 ph는 5.6과 7.4 로, 염도는 27% (w/v) 와 22% (w/v) 로측정되었다. 멸치젓의염도가새우젓에비해높은것으로나타났고, 새우젓의 ph는중성으로기존에보고된다른종류의젓갈에비해다소높은것으로나타났다. 새우젓의 ph가중성을나타내는원인중의하나로새우껍질에포함된 calcium ion의유리를들수있다 [Evers and Carroll, 1998]. 여액은멸균한생리식염수를이용하여 bacteria의분리가가능한농도로희석한다음, 고체배지에도말하여 10, 20, 30 에서 48시간이상배양하며관찰하였다. Bacteria 분리에사용한배지는 1.8% (w/v) 한천을첨가한 nutrient medium (Difco, USA) 과 marine medium (MBcell, Korea), MRS medium을사용하였고, 필요에따라서 NaCl을 15% (w/v) 가되도록첨가하였다. 가능한다양한 colony의선발을위하여각배지에서생장한 colony들중, 외관상크기, 색, 모양등의형태학적특성에따라각배지당 10~30개정도의 colony 를선발하였고, colony 선발과정과동일한배지를사용하여순수분리하였다. (2) 선발균주의동정순수분리된 bacteria는 16S rrna 유전자 (rdna) 염기서열분석에의해계통발생학적으로동정하였다. 분리된 bacteria의 16S rdna 증폭은 DNeasy tissue kit (Qiagen, Germany) 을이용하여추출된 DNA를 PCR 하거나 colony PCR을이용하여수행하였다. PCR 증폭에사용된 primer는다양한미생물의증폭에사용되는 eubacterial universal primer 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') 와 1492R (5'-GGT TAC CTT GTT AGG ACT T-3') 을사용하였다 [Lane, 1991]. PCR 반응은 T3000 Thermocycler (Biometra, - 145 -

Germany) 를사용하였고, 50 μl PCR 반응계에는 template DNA 또는소량의 colony, 100 mm dntp, 1 U Taq polymerase (Roche, Germany), 20 pmol의 primer를첨가하였다. PCR 반응은 95 에서 5분간예비가열후, 95 에서 1분간변성, 57 에서 1분 annealing, 72 에서 1분중합반응의과정을 30회반복하였고, 마지막에 72 에서 5분간처리한후반응을중단시켰다. 증폭된 PCR 산물은 PCR product purification kit (SolGent, Korea) 을사용하여정제한후, 수탁업체 (SolGent) 에의뢰하여염기서열을결정하였다. 결정된염기서열은 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 와 EzTaxon server 2.1 [Chun et al., 2007] 에등록된염기서열정보를대상으로 nucleotide blast search를통해계통발생학적분석을수행하였다. Database에등록된표준균주 (type strain) 와가장높은상동성을나타내는분류군을해당염기서열에해당하는 bacteria로동정하였다. (3) 멸치젓발효관련 bacteria의다양성멸치젓으로부터총 315 균주를순수분리하여 16S rdna 염기서열분석에의해동정한결과, 31종은기존의분류단위 bacteria와 97% 이상의 16S rdna 상동성을갖지않는신종균으로추정되고, 나머지 284 균주는 28속 67종의 bacteria가존재하는것으로나타났다 (Fig. 3-1). - 146 -

Fig. 3-1. Phylogenetic tree of the isolates from Myeolchi-jeotgal, showing the relationship based on the determination of the near-complete 16S rdna sequences (1407 nt) of the isolates. DNA sequences were aligned with those of neighboring taxa based on secondary structure information using the PHYDIT program. Evolutionary distances were calculated according to Kimura s two-parameter model, and clustering was performed using the neighbor-joining method. The phylogenetic tree was generated by a treeing algorithm contained within the PHYDIT program. New, unidentified species showing similarities of less than 97% with the closest type strain are presented in bold letters. The bar indicates the number of nucleotide substitutions per site. - 147 -

분리동정된총 284 균주의 19% 를차지하는 Sporosarcina 속이가장높은빈도로검출되었고, Virgibacillus 속과 Bacillus 속이각각 16% 와 10% 분리되어뒤를이었다. Staphylococcus, Halomonas, Kocuria 속이각각 9%, 8%, 5% 분리되었다. Enterococcus, Lactobacillus, Tetragenococcus 속의유산균이소수분리되었지만, 큰비중을차지하지는않았다. (4) 새우젓발효관련 bacteria의다양성새우젓으로부터총 295 균주를순수분리하여 16S rdna 염기서열분석에의해동정한결과, 30속 53종의 bacteria가존재하는것으로나타났고, 멸치젓과는다른 bacteria의다양성을나타내었다 (Fig. 3-2). 가장높은빈도로검출된 bacteria는 Staphylococcus 속으로 141 균주가분리되어전체의 48% 를차지했고, 그중 135 균주는 S. equorum으로동정되었다. Staphylococcus 속의다음으로는 Salinicoccus 속 (10%), Lactobacillus 속 (7%), Salinivibrio 속 (4%), Kocuria 속 (4%), Salimicrobium 속 (4%) 이분리되었다. (5) 멸치젓과새우젓발효관련우점종 6종의배지를이용한멸치젓과새우젓의 bacteria 군집분석결과, 47속 104종의 bacteria의존재가밝혀졌고, Kocuria, Microbacterium, Halomonas, Psychrobacter, Bacillus, Enterococcus, Lactobacillus, Lysinibacillus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Weissella 속이공통적으로검출되었다. 두젓갈로부터가장높은빈도로검출된속은 Staphylococcus, Bacillus, Halomonas, Kocuria 순으로나타났다. 멸치젓에서우점으로검출된 bacteria인 Sporosarcina 속은 2001년 Bacillus 속으로부터분리된속이고, Virgibacillus, Paenibacillus, Brevibacillus 등도 Bacillus 속으로부터재분류된속들이다. 따라서멸치젓의발효를담당하는우점종은 Bacillus 및근연속의 bacteria로추정된다. 새우젓에서가장많이검출된 Staphylococcus 속은새우젓발효의우점종으로확실시되고, 이들은 coagulase를생산하지않아식품위해균 Staphylococcus aureus와구분되는 coagulase-negative staphylococci (CNS) 로분류되고, 이들에대한위해성은보고된바없다. - 148 -

Fig. 3-2. Phylogenetic tree of the isolates from Saeu-jeotgal. The tree shows the relationship based on the determination of the near-complete 16S rdna sequences (1407 nt) of the isolates. The bar indicates the number of nucleotide substitutions per site. - 149 -

나. 저염양념젓갈 ( 오징어젓갈 ) 미생물군집분석을통한우점종도출및위생지표미생물 및식중독균생육저해활성보유우수균주선발 (1) 오징어젓갈시료 Bacteria 분리를위한오징어젓갈은 2011년 9월수원시소재재래시장과대형마트에서각각 1종씩구입하였다. 시료 60 g에동량의멸균수를혼합하여균질화한후, 멸균한거즈로걸러분리한여액을 bacteria 분리및 NaCl 농도, ph, 당도측정에사용하였다. NaCl 농도는식품공전에따라측정하였고, ph는 ph meter로, 당도는 refractometer (Atago, Japan) 로측정하였다. 두시료의 ph, NaCl 농도, 당도에는큰차이가없었고, NaCl 농도는평균 6.7% 정도로상당한저염화가달성된것으로보인다 (Table 3-1). Table 3-1. The phs, NaCl concentrations, sugar concentrations of Ojingeo-jeotgal samples from a traditional market (A) and a super market (B) in Suwon, Korea. Chemical index Sample A Sample B ph 6.2 6.1 NaCl concentration (%) 6.6 6.7 Sugar concentration (Brix) 16.2 17.5 (2) 배양법에의한 bacteria 선발, 분리각시료여액을생리식염수로 bacteria의분리가가능한농도로십진희석한다음, 고체배지에도말하여 30 에서 48시간이상배양하면서 colony의형성및다양성을관찰하였다. 다양한 bacteria의분리를위하여 nutrient agar (Difco, USA), marine agar (MBcell, Korea), MRS agar (Difco) 와이들배지에 NaCl의최종농도가 5% (w/v) 가되도록첨가한총 6종의배지를사용하였고, 단백질분해활성의확인을위하여 skim milk (Difco) 를 2% (w/v) 첨가하였다. 각배지에서생육한생균수는 10 5-10 6 CFU/ml 수준으로기존의젓갈에서보고된일반세균의측정치와크게다르지않았다. 각배지에서생장한 bacteria는크기, 모양, 색깔및 skim milk 분해에따른투명환 (clear zone) 생성여부에따라각배지당 10개정도의 colony를선발한다음, 동일한배지를이용하여순수분리하였다. (3) 오징어젓갈 bacteria 군집분석순수분리한 bacteria의동정은멸치젓및새우젓유래 bacteria 군집분석에서사용한방법을동일하게적용하였다. 순수분리한총 121 균주의동정결과, 각배지로부터분리된 bacteria의다양성은속 (genus) 수준에서는큰차이가나타나지않았지만, 종 (species) 수준에서는시료 B의다양성이높은것으로나타났다 (Table 3-2). 유산균은 MRS agar 및 NaCl을첨가한 MRS agar에서만검출되었지만, Bacillus 속은모든배지에서고르게검출되었으며, 염첨가에따른영향이크게나타나지않았다. Staphylococcus 속의 - 150 -

검출은 nutrient agar 와 marine agar 에서높게나타났고, 염을첨가한배지가검출에유리 한것으로나타났다. Table 3-2. Numbers of isolates from Ojingeo-jeotgal summarized at the species level. Species Sample A Sample B 0% a 5% a Total 0% a 5% a N M R N M R N M R N M R Aerococcus viridans 1 1 Bacillus aerius 2 1 3 Bacillus amyloliquefaciens 1 1 2 4 Bacillus clausii 1 1 Bacillus atrophaeus 1 1 2 Bacillus licheniformis 1 1 1 1 2 Bacillus methylotrophicus 2 2 3 1 4 2 10 Bacillus pumilus 1 1 1 1 Bacillus safensis 0 3 3 1 2 1 4 Bacillus siamensis 1 1 Bacillus sonorensis 1 1 1 3 Bacillus subitils 2 1 1 4 2 2 1 5 Bacillus tequilensis 1 3 1 5 2 1 1 1 5 Bacillus sp. 5 2 3 3 4 17 1 3 2 3 2 11 Brevibaeterium halotolerans 1 1 Carnobacterium maltaromaticum Corynebacterium variabile 1 1 Total 1 1 Kocuria salsicia 1 1 Leuconostoc pseudomesenteroides 1 2 3 Pediococcus pentosaceus 1 1 Staphylococcus equorum 1 1 Staphylococcus sciuri 1 1 Staphylococcus xylosus 1 1 Staphylococcus sp. 1 2 3 3 9 2 1 3 Weissella confusa 3 3 Weissella hellenica 1 1 Weissella thailandensis 1 7 8 Total 10 11 10 10 9 10 60 10 10 11 10 10 10 61 Abbreviations: N, nutrient agar; M, marine agar; R, MRS agar. a The final concentrations of NaCl are indicated and 0% means NaCl was not added to the medium. - 151 -

Bacillus 속이두시료모두에서우점으로검출되었고, 기존의연구에서보고되었던 Staphylococcus, Micrococcus, Pseudomonas, Acinetobacter, Aeromonas 속중에서 Staphylococcus 속만이본연구에서검출되었다 [Kim et al., 1993]. Bacteria 분리에사용한배지, 배양조건및시료의차이에서그원인을찾을수있지만, 고전적동정법을적용한기존연구에서분리균주들을비교한특성이제한적이었다는점을고려하면, 최근에적용되고있는계통발생학적동정결과와는차이가나타날가능성이크다. 재래시장에서구입한시료 A에서는 Weissella 속이 Bacillus 속의뒤를이었지만, 대형마트에서구입한시료 B에존재하는 bacteria의우점은 Staphylococcus 속이뒤를이었다. 유산균은 Carnobacterium, Leuconostoc, Pediococcus, Weissella 속이검출되었고, 시료에따라검출되는종과속이다르게나타났으며, 시료 B보다 A에서높은빈도로검출되었다. 시료 A 로부터각각 11 균주와 4 균주가분리된 Weissella 속과 Leuconostoc 속은시료 B로부터는 Weissella hellenica 1 균주만이분리되어, 시료에따라유산균과 Staphylococcus 속의비중이달라질수있는가능성이제시되었다. Probiotics 및식품용종균개발을목적으로젓갈유래 Lactococcus, Lactobacillus 속유산균분리가보고되었고 [Kim et al., 1997; Lee et al., 2003; Paik et al., 2003], 유산균의우점을보고한 bacteria 군집분석결과도있지만 [Roh et al., 2010], 고염조건에서생육이어렵다는점을고려하면발효숙성에적극적으로관여하는우점종으로작용할가능성은크지않다. 비교적염도가낮은오징어젓갈에서도 Bacillus 속에비하면그비중이크지않은것으로보아오징어젓갈뿐만아니라고염젓갈의숙성에서는큰영향을미치지않고생리적활성이거의없는상태로존재하는것으로추정된다. 기존연구 [Kim et al., 1993] 에서검출된바있는 Staphylococcus 속은두시료모두로부터분리되었고, NaCl이 5% 첨가된배지에서우세하게검출된다는점을고려하면, Bacillus 속다음을차지하는오징어젓갈우점 bacteria로추정된다. 각배지로부터순수분리한 Bacillus 속및 Staphylococcus 속의일부균주들은 16S rdna 염기서열의상동이높아계통발생학적분류위치를정확히결정할수없어종수준에서의우점종을결정하기힘들지만, 종수준에서의동정이결정된균주들중에서는 B. methylotrophicus, B. subtilis, B. tequilensis가다수분리되었다 (Table 3-2). Bacillus 속이우점으로검출되었지만, 식품위해가능성이있는 Bacillus cereus는검출되지않았다. 분리된 Staphylococcus 속중에서 S. aureus로동정된균주는존재하지않았고, 모두 coagulase-negative staphylococci (CNS) 라는범주에속한다. CNS는유럽의육류및소시지발효에서높은빈도로검출되고, 종균으로도식품발효에사용되고있으며, 문헌상으로식중독관련성이보고된바는없다 [Marty et al., 2012; Rantsiou et al., 2005]. (4) 황색포도상구균및장염비브리오균생육저해활성보유균주선발 본연구에서분리동정한 121 균주로부터젓갈에서발생가능성이있는황색포도상구 - 152 -

균및장염비브리오균에대한생육저해활성보유균주의선발을시도하였다. 선발을위한지시균 S. aureus ATCC12692와 V. parahaemolyticus ATCC17802는 Korean Culture Center for Microorganisms (KCCM) 로부터구입하였고, 전배양한지시균주를약 10 5 10 6 CFU/ml농도로한천배지에 200 μl 도말하여건조시킨다음, 약 10 8 CFU/ml농도의실험균주를백금이를이용해획선접종하여 30 에서 24시간배양후생육저지환의생성유무로생육저해활성을확인하였다. 활성측정을위한한천배지는각각의지시균 S. aureus ATCC12692와 V. parahaemolyticus ATCC17802의생장이우수하게나타난 nutrient agar와 marine agar를사용하였고, 젓갈의염도를고려하여최종농도가 5% 가되도록 NaCl을첨가하였다. 분리균주중, 55 균주가 S. aureus에대하여생육저해활성을나타내었고, Bacillus 속균주들이대부분이었다 (Table 3-3). 분리빈도가높지는않지만, 분리된모든 B. pumilus, B. safensis, B. siamensis, B. sonorensis, Weissella confusa 균주는활성을나타냈다. V. parahaemolyticus에대해서는 Bacillus 속 21 균주만이생육저해활성을나타내었고, S. aureus 대비활성보유균주의선발확률이높지않았다 (Table 3-4). 2 종류의식중독균에대하여활성을갖는균주는모두 Bacillus 속으로, 6 균주가분리되었다. 이들균주의식중독균생육저해는 NaCl이 6% 첨가된배지에서도활성이나타나는것으로보아오징어젓갈의숙성과정에서식중독균의저해가가능한것으로추정된다 (Fig. 3-3). 총 3 균주가분리된 B. pumilus와 B. siamensis는모두두식중독균에대하여저해활성을나타내었지만, 분리된개체수가낮아종수준의저해활성으로평가하기는힘들고, 대부분의저해활성은균주특이적으로나타났다. 젓갈발효용종균의가장중요한기능성으로고려되고있는단백질분해활성을 skim milk를 2% 첨가한 nutrient agar에서확인해본결과, 6 균주모두단백질분해활성을가지고있었지만, NaCl 첨가에따라활성이감소했고, colony의모양이 NaCl의농도에따라변화함을확인하였다 (Fig. 3-4). B. siamensis RM502 균주가 NaCl이 6% 첨가된배지에서가장높은단백질분해활성을나타내었다. 최종적으로선발된 6 균주의생육저해활성과단백질분해활성을정량적으로비교하지는못했지만, 6% 염농도에서활성을나타내고있어오징어젓갈의제조과정에서식중독균생육저해및단백질분해활성을나타낼수있을것으로예상한다. - 153 -

Table 3-3. Numbers of isolates from Ojingeo-jeotgal showed the growth inhibition of Staphylococcus aureus ATCC12692 on nutrient agar supplemented 5% NaCl. Species Isolates Sample A Sample B Active strains Isolates Active strains Bacillus aerius 0 0 3 1 Bacillus licheniformis 1 1 2 1 Bacillus pumilus 1 1 1 1 Bacillus safensis 3 3 4 4 Bacillus siamensis 0 0 1 1 Bacillus sonorensis 0 0 3 3 Bacillus subtilis 4 3 5 3 Bacillus tequilensis 5 4 5 3 Bacillus sp. 17 10 11 10 Leuconostoc pseudomesenteroides 3 1 0 0 Staphylococcus equorum 0 0 1 1 Weissella confusa 3 3 0 0 Weissella thailandensis 8 1 0 0 Total 45 27 36 28 Table 3-4. Numbers of isolates from Ojingeo-jeotgal showed the growth inhibition of Vibrio parahaemolyticus ATCC17802 on marine agar added 3% NaCl. Species Sample A Isolates Active strains Isolates Sample B Bacillus amyloliquefaciens 0 0 4 2 Bacillus atrophaeus 2 1 0 0 Bacillus methylotrophicus 2 1 10 5 Bacillus pumilus 1 1 1 1 Bacillus siamensis 0 0 1 1 Bacillus tequilensis 5 3 5 3 Bacillus sp. 17 2 11 1 Active strains Total 27 8 32 13-154 -

Fig. 3-3. Growth inhibition of S. aureus ATCC12692 (A) and V. parahaemolyticus ATCC17802 (B) by the isolates from Ojingeo-jeotgal at the NaCl added conditions. Nutrient agar and marine agar were used for the growths of S. aureus (A) and V. parahaemolyticus (B), respectively. Isolates: a, B. pumilus ANR7; b, B. pumilus RM010; c, B. siamensis RM502; d, B. tequilensis AM5R3; e, B. tequilensis MA504; f, B. tequilensis MS503. - 155 -

Fig. 3-4. Effect of NaCl on the growth and protease activity of isolates from Ojingeo-jeotgal. Nutrient agar containing 2% (w/v) skim milk was used for the detection of growth and protease activity. Isolates: a, B. pumilus ANR7; b, B. pumilus RM010; c, B. siamensis RM502; d, B. tequilensis AM5R3; e, B. tequilensis MA504; f, B. tequilensis MS503. - 156 -

2. 선발된우수균주의안전성평가및미생물첨가제개발 가. 젓갈발효의우점종 Staphylococcus equorum 의안전성평가 (1) 연구의배경멸치젓, 새우젓, 오징어젓갈에서모두검출되었고, 새우젓발효의우점종으로검출된 S. equorum은젓갈발효용종균으로적용될높은가능성을가지고있으나, 우리나라에서식품용으로사용된예가없어안전성평가에대한필요성이제기되었다. 유럽에서는소시지및육류의발효에 S. carnosus, S. equorum, S. saprophyticus, S. xylosus 등의 CNS bacteria를종균으로사용하고있어 [Berdague et al., 1993; Sondergaard and Stahnke, 2002; Stahnke, 1994], 사용이력의측면에서는안전성이확보되었다고할수있으나, 식중독균인 S. aureus와동인한속 (genus) 로분류되고있어, 우리나라에서종균으로사용하기위해서는 S. equorum에대한안전성의증명이요구된다. 한편우리나라식품의약품안전처에서는종균에대한기준이없어, 본연구에서는종균의안전성평가에대한기준이설정되어있는유럽과미국의기준을참고하여본과제의수행을통하여확보한 S. equorum 균주들에대한항생물질내성, 혈청분해능, 독소인자보유등의안전성평가및발효관련기능성평가를수행하였다. (2) 항생물질내성평가 2012년식품의약품안전처자료에의하면국내에서검출되는항생물질내성 bacteria의대다수는 ampicillin 내성대장균으로보고되었다. 따라서우리나라에서분리되는 bacteria 에서가장높은빈도로나타날수있는항생물질내성은 ampicillin에대한내성으로예상된다. Ampicillin이 32 μg/ml 첨가된 TSA를이용하여본과제를통하여확보한 185 S. equorum 균주에대한생육저해실험을수행한결과, 59 균주 (31.9%) 가 ampicillin 내성을나타내었다. Ampicillin 내성을보유하고있지않은 126 S. equorum 균주의 14종항생물질에대한내성을평가한결과는 Fig. 3-5과같다. 항생물질내성평가는 Clinical and Laboratory Standards Institute (http://www.clsi.org/) 와 European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (http://www.eucast.org) 의기준에의하여 disc agar diffusion 법으로진행하였다. 실험에사용한항생물질 disc 14종, amikacin (30μg), cefoxitin (30μg), chloramphenicol (30μg), ciprofloxacin (5μg), erythromycin (15μg), gentamicin (10μg), lincomycin (15μg), linezolid (10μg), ofloxacin (5μg), oxacillin (1 μ g), penicillin G (10 units), rifampicin (5μg), tetracycline (30μg), trimethoprim (5μg) 은 Oxoid (Basingstoke, Hants, UK) 로부터구입하였다. Penicillin G (34.1%) 에대한내성을보유한균주가가장많이검출되었고, erythromycin (9.5%), trimethoprim (9.5%), lincomycin (8.9%), chloramphenicol (4.8%) 의순 - 157 -

으로내성을보유한균주들이존재하는것으로나타났다. 최종적으로 126 균주중, 66 균주가적어도한종류의항생물질에대한내성을가지고있었고, 24 균주는 2종류이상의항생물질에대한내성을가지고있었다 (Table 3-5). S. equorum 균주들의항생물질내성은균주특이적 (strain-specific) 으로여러가지양상으로나타났고, 특이점은본연구를통하여우리나라에서분리된 S. equorum 균주들의항생물질내성은우리나라의항생물질판매량과상관관계가있는것으로나타났다. 식품의약품안전처가 2009년에발표한국내의항생물질판매량은 oxytetracycline, penicillin, trimethoprim을포함하는 sulfonamides, erythromycin을포함하는 macrolides의순으로이들항생물질에대한내성이유럽에서분리된 S. equorum 균주들에서보다높은빈도로검출되었다. Fig. 3-5. Antibiotic resistance of the ampicillin-sensitive 126 S. equorum strains from jeotgal. The numbers in parentheses represent the numbers of resistant strains among the tested strains. - 158 -

Table 3-5. Antibiotic resistance phenotypes of multidrug-resistant strains and resistance-gene-amplified strains. Phenotype Strain Origin I II III IV Genotype C3x02 Saeu-jeotgal P T C4X41 Saeu-jeotgal Te Gm P T C5054 Saeu-jeotgal L T C6018 Saeu-jeotgal P T KM2064 Myeolchi-jeotgal E L KS1025 Saeu-jeotgal A R KS1026 Saeu-jeotgal O T KS1032 Saeu-jeotgal E L KS1051 Saeu-jeotgal P T KS1054 Saeu-jeotgal E Gm KS1085 Saeu-jeotgal P T KS2020 Saeu-jeotgal Te P T KS2030 Saeu-jeotgal E Gm KS2088 Saeu-jeotgal Gm P KS2097 Saeu-jeotgal Ox P KS3038 Saeu-jeotgal E C P KS3040 Saeu-jeotgal E C P KS3097 Saeu-jeotgal L P KM1031 Myeolchi-jeotgal E C L P lnua KS1022 Saeu-jeotgal E L P lnua KS1030 Saeu-jeotgal L P lnua KS3044 Saeu-jeotgal L Lz P lnua KS1086 Saeu-jeotgal P T pbp KS3022 Saeu-jeotgal P Cp pbp KS3083 Saeu-jeotgal P pbp Classification categories based on reaction mechanisms: I, protein synthesis inhibitor; II, cell envelope antibiotic; III, transcription inhibitor; IV, folate pathway inhibitor. Abbreviations: A, amikacin; C, chloramphenicol; Cp, ciprofloxacin; E, erythromycin; Gm, gentamicin; L, lincomycin; Lz, linezolid; O, ofloxacin; Ox, oxacillin; P, penicillin G; R, rifampicin; T, trimethoprim, Te, tetracycline. (3) 항생물질내성유전자의존재확인 Plasmid 또는 transposon의형태로외부로부터획득한항생물질내성유전자를보유한미생물을식품용으로사용할경우, 항생물질내성유전자가사람의장내에서위해미생물로전이될가능성을가지고있어, 궁극적으로위해미생물에의해감염된사람을대상으로한항생물질치료가불가능한상황에도달할수있다. 따라서사람에게위해한영향을미칠수있는획득형항생물질내성유전자를보유한미생물은식품용으로사용불가 - 159 -

한것으로평가되고있다. 본연구에서는기존에 plasmid 또는 transposon에존재하여유전자이동이잘일어나는것으로알려진 15개유전자의존재를 PCR로확인해보았다 [Colomer-Lluch et al., 2011; Lina et al., 1999; Luthje and Schwarz, 2006; Toh et al., 2007; Xi et al., 2009; Zhu et al., 2013]. 9종의항생물질내성과관련이있는 15개유전자의증폭을위한 PCR primer에대한정보는 Table 3-6에나타내었다. 15개유전자중, lnua와 pbp 유전자가 7균주로부터증폭되었다 (Table 3-5). 7 균주로부터증폭된두유전자의염기서열로부터의추정아미노산서열은기존에보고된 Staphylococcus 속유래의 lnua 및 pbp 유전자산물의아미노산서열과 97% 이상의상동성을가지고있었다. 이들두유전자는기존에유전체정보가공개된 S. equorum Mu2의유전체에존재하지않고, 일부의균주들만이 lincomycin 및 Penicillin G에대한내성을나타내는것으로보아획득형내성유전자가증폭된것으로추정된다 (Table 3-5). - 160 -

Table 3-6. Oligonucleotides for the identification of antibiotic resistance genes. Class Antibiotics Gene Oligonucleotide sequence (5'-3') Size Forward (5' 3') Reverse (5' 3') (bp) Reference I Gentamicin apha GCGCGGATCTTTAAATGGAGT GT AAGCTGGTGGGAGAAAATGA AAAC 411 This study (NC_017331.1) Chloramphenicol cat CCAGCAAACTACGTATAGCAT TAC GATGAAGCTGCAAGGCAACT GG 499 This study (X60827) Linezolid cfr GCTACAGGCGACATTGGATT CTGCCCTTCGTTTGCTTCT 570 This study (JN97096.1) Erythromycin erma GTTCAAGAACAATCAATACAG AG GGATCAGGAAAAGGACATTTT AC 421 (Lina et al., 1999) ermb CCGTTTACGAAATTGGAACAG GTAAAGGGC GAATCGAGACTTGAGTGTGC 359 (Lina et al., 1999) ermc GCTAATATTGTTTAAATCGTC AATTCC GGATCAGGAAAAGGACATTTT AC 572 (Lina et al., 1999) msra GGCACAATAAGAGTGTTTAAA GG AAGTTATATCATGAATAGATT GTCCTGTT 323 (Lina et al., 1999) mphc GAGCTACCAGAGGAGCCTGA CG CATACGCCGATTCTCCTGAT 940 (Luthje and Schwarz, 2006) Lincomycin lnua GGTGGCTGGGGGGTAGATGT ATTAAACTGG GTTCTTTTGAAATACATGGTA TTTTTCGATC 310 (Lina et al., 1999) Tetracycline tetk TTAGGTGAAGGGTTAGGTCC GCAAACTCATTCCAGAAGCA 718 (Aarestrup et al., 2000) tetm ACAGAAAGCTTATTATATAAC TGGCGTGTCTATGATGTTCAC 171 (Aminov et al., 2001) II Penicillin blaz AAGAGATTTGCCTATGCTTC GCTTGACCACTTTTATCAGC 518 (Lina et al., 1999) pbp GTTGCTATATCTGGCGGACGT G TGAAGCAGAACCACCAAGTA 386 This study (DQ413595.1) III Quinolone nora GGCAGAAGTTTCACATCGTAT GCC AGCCTTGCCTTTCTCCAGC 531 This study (NC_009782.1) IV Trimethoprim dfra CGAAGCAATGATTGACCAGG TTCCCTTTTCTACGCACTAAA TG 185 This study (NC_014369.1) Classification categories based on reaction mechanisms: I, protein synthesis inhibitor; II, cell envelope antibiotic; III, transcription inhibitor; IV, folate pathway inhibitor. (4) Biofilm 형성, 혈청분해 (hemolysis), Enterotoxin 생성유전자의존재확인유럽식품안전국 EFSA는식품용으로미생물을사용하려는경우, 항생물질내성및위해인자가존재하지않음과같은안전성에대한근거를요구하고있지만, Staphylococcus 속에대한위해인자에대한정확한정의가없어, CNS의안전성평가에있어확실한결론을제시하지못하고있다. 본연구에서는 CNS 구성원들중, 기회감염균으로알려진 Staphylococcus epidermidis의안전성평가에서주로사용되고있는 biofilm 형성, 혈청분해, enterotoxin 유전자의존재를확인하였다 [Otto, 2012]. 혈청분해 (hemolysis) 의평가는 TSA에 horse blood 또는 sheep blood를첨가하여실시하였고, Staphylococcus aureus Newman 균주및 USA300-P23 균주를대조군으로사용하였 - 161 -

다. 혈청분해능을평가한 126 균주중, α-hemolysis 활성을나타낸균주는존재하지않았 고, β-hemolysis 활성은 3 균주가나타내었으며, 87 균주가 δ-hemolysis 활성을나타내었 다. β-hemolysis 활성을나타낸균주는모두 δ-hemolysis 활성을나타내었다 (Fig. 3-6). Fig. 3-6. β-hemolytic activities (A), δ-hemolytic activities (B) and biofilm formations (C) of S. equorum strains. S. aureus USA300-P23 (USA) and Newman were used as the positive controls for hemolytic activities and biofilm formation. 혈청분해관련유전자의존재확인을위하여 S. aureus가보유하고있는 α-hemolysis, β-hemolysis, δ-hemolysis 유전자 hla, hlb, hld와 S. epidermidis가보유하고있는 SE_0613, SE_1760 유전자를 PCR로증폭하였다. 혈청분해관련유전자증폭에사용한 PCR primer는 Table 3-7에나타내었다. PCR 수행결과, β-hemolysis 활성을나타낸 S. equorum KS2042 균주로부터 SE_0613 유전자가증폭되었고, 증폭산물은 S. equorum ATCC 12228 균주의 hemolysin 유전자와 99% 상동성을가지고있었다. 126 균주중, 단 1 개의균주로부터 SE_0613 유전자가증폭되어 S. equorum 균주들에서나타나는혈청분해의원인은알수없지만, KS2042 균주로부터증폭된 SE_0613 유전자는 S. epidermidis 균주로부터의수평이동 (horizontal transfer) 에의한것으로추정된다. - 162 -

Table 3-7. Primer sets for the detection of virulence factors in S. equorum isolates from jeotgal. Target gene Hemolysin genes hla hlb hld SE_0613 SE_1760 Enterotoxin genes sea seb sec sed see Forward (5' 3') CTGATTACTATCCAAGAAA TTCGATTG GATGGTGGCGTAGCGATT GTAAG AAGAATTTTTATCTTAATT AAGGAAGGAGTG AGCTAAAAAGGGTGATCG TAAGG AATATTGTCACGAGCCAAC CTAA GGTTATCAATGTGCGGGT GG TCGCATCAAACTGACAAAC G AGATGAAGTAGTTGATGT GTATGG CCAATAATAGGAGAAAATA AAAG AGGTTTTTTCACAGGTCAT CC Oligonucleotide sequence (5'-3') Reverse (5' 3') CTTTCCAGCCTACTTTTTTAT CAGT CCCATGGCTTAGGTTTTTCA GTCAC TTAGTGAATTTGTTCACTGT GTCGA CCCACATTCACTCCAATATCA AT AACAATGGTGGCACATTAGA GTC Size (bp) 209 519 111 CGGCACTTTTTTCTCTTCGG 102 GCAGGTACTCTATAAGTGCC TGC CACACTTTTAGAATCAACCG 451 ATTGGTATTTTTTTTCGTTC 278 CTTTTTTTTCTTCGGTCAATC 209 Reference (Jarraud et al., 2002) This study (KC242859.1) (Jarraud et al., 2002) 156 (Even et al., 2010) 227 (Even et al., 2010) (Mehrotra et al., 2000) 477 (Becker et al., 1998) (Mehrotra et al., 2000) (Mehrotra et al., 2000) (Mehrotra et al., 2000) 미생물이생산하는 biofilm은직접적인위해성과는관련이없지만, 위해미생물이식품이나용기의표면에부착하여생장하면서위생상의문제를일으킬가능성이높다. 미생물이 microplate 상에형성한 biofilm을 0.1% safranin 용액으로염색하는방법 [Heilmann et al., 1996] 을이용하여 126 균주의 biofilm 형성을검토한결과, 37 균주가 biofilm을형성하는것으로나타났다. Staphylococcus 속이생산하는 enterotoxin (SE) 는소화효소및가열처리에의해불활성화되지않기때문에식품산업에있어위험한요소로인식되고있으며 [Evenson et al., 1988], S. aureus가대표적생산균으로알려져있지만, 드물게 CNS 균주들에서의생산도보고되고있으며 [Valle et al., 1990; Zell et al., 2008], 혈청학적으로 SEA, SEB, SEC, SED, SEE 5 종류가알려져있다 [Bergdoll et al., 1959]. 이들 5종의 SE를증폭할수있는 PCR primer를구축하여 (Table 3-7), 126 균주를대상으로 PCR 증폭을수행한결과 SE 유전자는증폭되지않았다. 본연구에서의 Biofilm 형성, 혈청분해 (hemolysis), Enterotoxin 생성유전자의존재확인을통하여이들특성은모두균주특이적으로나타남을확인하였다. 최종적으로항생물질내성평가, 혈청분해검토, biofilm 형성평가, enterotoxin 유전자의존재확인실험을통하여, 위해성이없는것으로나타난 39 균주가선발되었다 (Table 3-8). - 163 -

Table 3-8. Technological properties of the 39 S. equorum strains selected by the safety assessments. Strains Proteas e Lipase Nitrate reductas e Biogenic amine production (ppm) Growth in NaCl Cadaverine Histamine Putrescine Tyramine 15% 20% 25% C3024 + + - 23.3 ± 0.1 ND ND ND + + - C3038 - + + 21.8 ± 0.2 33.0 ± 5.3 ND 28.1 ± 1.9 + + + C4005 + + + 29.6 ± 0.1 31.9 ± 6.0 22.6 ± 0.9 29.7 ± 0.8 + + - C4040 + - - ND 31.5 ± 6.3 ND ND + + + C4X11 + + + ND ND ND ND + + - C5059 - + - 22.0 ± 0.1 35.0 ± 3.8 ND 28.8 ± 1.4 + + + C6002 + + - 19.5 ± 0.2 22.3 ± 0.6 15.8 ± 0.1 25.1 ± 2.1 + + - C6017 - - + ND ND ND ND + + - C6019 + + - 24.4 ± 0.6 31.9 ± 6.0 18.6 ± 0.9 28.0 ± 2.0 + + - C6047 + + + ND ND ND ND + + W C7016 - + - 23.1 ± 2.1 ND 17.9 ± 0.8 29.0 ± 1.3 + + - C7023 + + - 24.6 ± 0.9 34.0 ± 4.5 ND 28.0 ± 1.1 + + - C8003 - + + 23.7 ± 1.9 34.5 ± 0.9 ND ND + + - KM1007 - + + 23.7 ± 0.3 ND 18.3 ± 0.7 28.9 ± 1.4 + + - KS1008 + - - ND ND ND ND + + - KS1015 + + - 18.7 ± 0.2 ND ND ND + + - KS1035 + + + ND ND ND ND + - - KS1039 + + + ND ND ND ND + + + KS1048 + + + ND 38.0 ± 0.4 ND ND + + + KS1052 + - + 21.5 ± 2.6 36.8 ± 1.2 ND 29.1 ± 0.8 + + + KS1053 + + + 18.4 ± 0.5 22.3 ± 0.8 18.6 ± 1.5 ND + + - KS1090 + + + 20.7 ± 0.3 ND ND 29.2 ± 1.1 + + - KS1099 + + - 19.3 ± 0.2 36.0 ± 3.1 ND ND + + + KS2002 - + + 19.2 ± 0.3 22.3 ± 0.1 ND 28.1 ± 3.1 + + + KS2010 + + + 22.4 ± 0.2 34.2 ± 4.4 17.2 ± 0.3 28.2 ± 1.9 + + - KS2015 + + + 21.6 ± 0.1 40.0 ± 0.3 ND ND + + - KS2019 + + + 20.2 ± 0.1 38.5 ± 1.3 ND ND + + - KS2036 + + + ND ND ND ND + + - KS2055 + + + 19.0 ± 0.1 37.2 ± 2.2 ND ND + + - KS2059 - + - 19.3 ± 5.3 22.3 ± 3.1 ND ND + + - KS2095 - + - 20.0 ± 0.4 32.7 ± 5.3 ND ND + + + KS3006 + + + 20.2 ± 0.1 ND ND ND + + + KS3029 - + + 19.2 ± 0.5 ND 15.5 ± 0.1 ND + + + KS3031 + + - 18.5 ± 0.3 ND ND ND + + - KS3055 + + + 20.1 ± 0.3 33.8 ± 4.7 ND ND + + - KS3057 - + + 19.9 ± 0.6 22.3 ± 0.8 15.9 ± 2.2 ND + - - KS3081 - + - 22.3 ± 0.2 ND 17.4 ± 2.6 ND + + - KS3084 - + - 21.5 ± 0.3 32.9 ± 2.1 16.3 ± 0.3 ND + + + KS3086 + + + 23.3 ± 1.3 32.0 ± 0.4 16.2 ± 0.5 ND + + - - 164 -

(5) S. equorum의기능성및 biogenic amines 생성평가발효용종균으로이용되기위해서는안전성과함께기능성또한중요한요소이다. 따라서안전성이확보된 39 S. equorum 균주를대상으로발효용종균으로써의기능성을평가하였다. 그러나아직젓갈을대상으로한종균이개발된바없어, 기능성평가를위한기준이보고된바없다. 따라서유럽의발효육류종균개발의척도인 protease, lipase, nitrate reductase 활성을측정하였다 [Leroy et al., 2006]. Protease 및 lipase 활성측정은 2% 탈지분유와 1% tributryn을각각첨가한 TSA를이용하였고, nitrate reductase 활성측정은 Miralles et al. [1996] 의방법을변형하여사용하였다. Table 3-8에는 protease, lipase, nitrate reductase 활성측정결과를제시하였다. 균주에따라서 3가지활성은다양한양상으로균주특이적으로나타났고, 39 균주중 16 균주가 3가지활성을모두가지고있는것으로나타났다. 단백질함량이높은식품소재의발효과정에서다량으로생성되는 biogenic amines에대한건강위해성이정확히밝혀지지는않았지만, 세계적으로규제의수위가높아지고있어우리나라전통발효식품의수출에있어걸림돌이되고있다 [Shalaby, 1996; Sila Santos, 1996]. 모든 biogenic amine을대상으로한기준규격이만들어지진않았지만, histamine과 tyramine에대한위해성이밝혀지고있어, 두종류에대한기준이만들어지고있다. Biogenic amines의생성은식품의종류와발효에관련하는미생물의종류에따라크게차이가있지만 [Carelli et al., 2007], 아직젓갈을대상으로한주요 biogenic amines가도출되어있지않아, 본연구에서는위해성이논란의대상이되고있는 cadaverine, histamine, putrescine, tyramine의생성을검토하였다. 분리균주들에대한 4 종 biogenic amines의생성은이들의전구체 histidine, lysine, ornithine, tyrosine을 TSB에 0.25% 첨가하여 30 에서 48시간배양한후, 생성된 biogenic amines를 HPLC로정량적으로검출하였다. 각균주가생성한 4종의 biogenic amine의양은균주특이적인양상을보였고, 4 균주는 4종류의 biogenic amines를모두생성하였고, 7 균주는 4종류의 biogenic amines를모두생성하지않았다 (Table 3-8). Biogenic amines 비생성균주중 C4X11, C6037, KS1035, KS1039. KS2036 균주는 protease, lipase, nitrate reductase 활성을보유하고있었다. 새우젓과멸치젓은 20% 이상의고염상태에서숙성이진행되기때문에선발된균주들이종균으로써의기능을발휘하기위해서는고염상태에서의생장이요구된다. 젓갈에서분리된 39 S. equorum 균주들은대부분 20% NaCl을첨가한배지에서는생장을나타내었고, 13 균주는 25% NaCl 농도에서도생장이가능하였다. - 165 -

나. 미생물첨가제의첨가법개발 (1) 연구의배경본과제의수행을통하여 bacteria가젓갈의발효에관여한다는근거를확보하였고, 새우젓및멸치젓에서의우점종을확인할수있었으며, 이들우점종이고염에서생장가능함을확인하였다. 향후우점종으로도출된우점균들의첨가를위한식품용배지의개발을검토하였다. 젓갈의주원료인멸치나새우는식품용배지를개발하는데필요한충분한영양소를함유하고있는것으로사료된다. 본연구에서는가장많은소비를보이는새우젓발효용종균의첨가를위한배지의제조를검토하였다. (2) 새우를이용한식품용배지의개발건조하지않은젓갈제조용새우에동량의물을넣고믹서로잘게갈아원심분리 (6,000 g, 20 min) 하여얻어진상등액을살균한결과, 침전물이생기는것을확인하였다. 따라서침전물의발생을억제하기위해살균에앞서상등액을 100, 5분간의가열처리로침전물을제거한후에얻어진상등액을살균하여배지로사용하였다. 살균후, 침전물이생기지않아젓갈의종균첨가용배지로사용가능한수준으로나타났고, 종균후보균주인 S. equorum의생육을흡광도의증가로확인하였다. 새우를이용한식품용배지에서의가능한높은수준의종균증식을확보할목적으로 NaCl을살균전단계에서첨가하여살균한식품용배지에 S. euorum을접종하여균주의증식을확인하였다. Tryptic soy broth (TSB) 를이용한경우에는 S. equorum이 NaCl이 5% (w/v) 에서무첨가배지보다높은생장을나타내었지만, 새우를이용하여제조한배지에서는 NaCl을첨가하지않은상태에서가장높은생육을나타내었다 (Fig. 3-7). 이러한현상은새우의채취과정에서포함된 NaCl의농도가 S. equorum의생장에충분한것으로보인다. NaCl의첨가없이제조한새우를재료로한배지는젓갈발효를위한종균의첨가에적용가능한것으로나타났다. - 166 -

Fig. 3-7. Growth of a Staphylococcus equorum isolate at different concentrations of NaCl. (3) 동결건조에의한 S. equorum의생존율측정식품용배지에서배양한종균배양액을첨가하는방법이아닌종균을수요자에게공급하는경우를고려하여 S. equorum의생존에미치는동결건조의영향을검토해보았다. NaCl을 5% 첨가한 TSB에서배양한균주를회수한다음, 생리식염수로세척한후, 동결건조전과후의생균수를측정하여동결건조에의한영향을검토하였다. 젓갈에서분리한 2 균주와표준균주를이용하여생존율을검토한결과, 분리균주들의생존율이표준균주에비해약간높은것으로나타났고, 평균 40% 정도생존하는것으로나타났다 (Table 3-9). 동결건조를통하여 40% 정도의균주가살아남는것으로나타났지만, 종균의공급에는큰문제점이없는것으로추정된다. Table 3-9. Survival of Staphylococcus equorum strains after freeze-drying. Strain Cell count (cfu/ml) Before freeze-drying After freeze-drying Survival rate (%) S. equroum KS1048 1.5 X 10 11 6.2 X 10 10 41.3 S. equroum KS1051 2.0 X 10 12 9.2 X 10 11 46.8 S. equorum DSM20674 T 1.8 X 10 12 6.7 X 10 11 37.2-167 -

제 2 절미생물첨가제를이용한젓갈발효조절기술개발 1. 젓갈용미생물첨가제에의한효과분석 가. 새우젓갈숙성에따른 bacteria 군집천이모니터링 (1) 연구의배경고염에대한내성및단백질가수분해활성등의생리학적특징을기준으로분리한 bacteria 첨가로동남아시아에서생산되는 fish sauce의숙성기간단축에성공한몇건의연구결과가보고되었지만, 숙성기간동안미생물상및미생물천이에대한연구는미진한실정이다 [Gildberg et al., 1984; Sinsuwan et al., 2007, 2008; Siringan et al., 2006; Udomsil et al., 2011; Yongsawatdigul et al., 2007]. 또한발효식품에첨가하는종균의개발은특정식품의주발효를담당하는우점종을사용하는방향으로진행되어왔기때문에젓갈발효관련미생물의생태학적이해를기반으로젓갈발효의종균화가진행되어야한다. 미생물군집분석의결과는우점종의도출뿐만아니라속성발효, 품질표준화달성에필요한미생물학적기초자료를제공할수있다. 따라서젓갈발효의종균화에필요한기초과학적지식의확보를위하여새우젓갈의숙성에따른 bacteria 군집의천이를모니터링하였다. (2) 새우젓갈시료숙성기간별 bacteria 군집분석을위한새우젓갈은서해안소래포구에서젓새우 (Acetes japonicus) 를구입후, 소금물과천일염을첨가하여최종 NaCl 농도가 24% (w/w) 가되도록제조하였다. 제조된새우젓갈은 3L 플라스틱용기에담아 15 에보관하면서 1, 5, 10, 15, 25, 35, 65, 135일에시료를채취하여미생물분석을진행하였다. (3) 시료의전처리및배양법에의한 bacteria 선발, 분리멸균한거즈로걸러분리한젓갈시료의여액은 ph meter로 ph를측정하였고, Mohr법 [Che, 1998] 을이용하여 NaCl 농도를측정하였으며, bacteria 분리에사용하였다. Bacteria 분리를위한새우젓갈여액은 single colony 분리가가능한농도로생리식염수로희석한다음, 한천배지에도말하여 30 에서 24시간이상배양하며관찰하였다. Bacteria 분리에는 1.8% (w/v) 한천을첨가한 marine medium (MBcell, Korea), nutrient medium (Difco, USA), MRS medium (Difco, USA) 과이들배지에 NaCl을최종농도가 6% (w/v) 되도록첨가한배지를이용하였다. 배양및균수측정후, 형성된 colony는색, 모양, 크기등의형태학적특성을고려하여각배지별로약 10 colony를선발하였고, 선발과정에서사용한동일배지를이용하여순수분리하였다. - 168 -

(4) 분리균주의동정 분리된균주의동정은멸치젓및새우젓유래 bacteria 군집분석에서사용한방법을 동일하게적용하였다. (5) 새우젓갈숙성중의 ph 변화새우젓갈의 ph는 6.9~7.1로숙성기간동안거의일정하게유지되었다 (Fig. 3-8). 젓갈및발효식품의품질특성을나타내는지표중하나인 ph는젓갈숙성중미생물에의해생성되는젖산및유기산등으로인하여그값이떨어지는것으로알려져있다 [Kang et al., 2001; Park et al., 2002a]. 대다수의젓갈의 ph는 5.0~6.5 정도로보고되었지만새우젓갈의 ph는중성으로일정하게유지되어기존에보고된다른종류의젓갈에비해다소높은것으로나타났다 [Lee et al., 1999, 2001]. 새우젓갈의 ph가중성으로유지되는이유는갑각류젓갈의숙성중생성되는 amine의영향을들수있으며 [Mok et al., 2000], 새우껍질에포함된 calcium ion의유리가주된원인으로추정된다 [Um and Lee. 1996; Evers and Carroll. 1998]. Fig. 3-8. The phs and NaCl concentrations of Saeu-jeotgal during ripening. NaCl concentration ( ); ph ( ). (6) 배지에따른숙성중의생균수변화새우젓갈숙성기간동안 6종의배지에서검출된 bacteria의수는숙성초기의모든배지에서약 10 5 CFU/mL 수준으로나타났지만, marine agar 및 NaCl이첨가된 marine agar 를제외하고는모두숙성과정에서감소하는경향을나타내었다 (Fig. 3-9). Marine agar에서생장한 bacteria는 65일까지 10 7 에서 10 8 CFU/mL 수준까지증가하다가, 이후감소하여 135일차에는 10 6 CFU/mL 수준으로검출되었다. 그밖의배지에서는숙성초기부터감소 - 169 -

하는양상을보였고, 135일차의생균수는 10 3 ~10 4 CFU/mL 수준으로나타났다. 한편, 배지에첨가한 6% 의 NaCl은 bacteria의생장에큰영향을미치지않는것으로나타났다 (Fig. 3-2). 기존에보고된새우젓갈의생균수는 10 2 ~10 4 CFU/mL 수준으로 marine agar를제외한배지에서나타난결과와크게다르지않다 [Lee et al., 1999; Ham and Jin. 2002]. 하지만본연구에서는기존연구에서사용하지않은 marine agar를통하여 10 7 ~10 8 CFU/mL 수준의생균수검출이가능하였다. 이결과는 bacteria가고농도의 NaCl이존재하는새우젓갈에서생장가능함을제시하였고, 원재료유래의단백질분해효소에의한단순숙성이아닌 bacteria에의한발효가새우젓갈의숙성에관여하고있음을제시한것으로사료된다. Fig. 3-9. Cell counts in Saeu-jeotgal during ripening on several media. Media: marine agar ( ), marine agar containing 6% NaCl ( ), nutrient agar ( ), nutrient agar containing 6% NaCl ( ), MRS agar ( ), and MRS agar containing 6% NaCl ( ). The results are the average values of three replicates. (7) 새우젓갈에서분리된 bacteria의다양성 135일의숙성기간동안 8번의시료채취를통하여총 467 균주를순수분리하였고, 16S DNA 염기서열분석에의해동정한결과, 기존의분류단위 bacteria와 97% 미만의 16S rdna 상동성을나타내어신종균으로추정되는 16균주가분리되었고, 나머지 451균주는 42속 87종으로분류되었다 (Fig. 3-10). 분리동정된총 467균주의 26% 를차지하는 Staphylococcus 속이가장높은빈도로검 - 170 -

출되었고, Salimicrobium, Kocuria 속이각각 17%, 13% 로분리되어뒤를이었다. 종수준에서는 Staphylococcus equorum, Salimicrobium salexigens, Kocuria palustris가각각 25%, 17%, 11% 순으로우점하였다. 시중에판매되는새우젓갈의 bacteria의다양성을분석한결과와동일하게 Staphylococcus 속이가장높은빈도로검출되었고, Salimicrobium, Kocuria 속또한높은빈도로검출되어제조시기, 제조방법, 제조환경에따라균의다양성은다소차이는있었지만새우젓갈의주요 bacteria는동일하게나타났다 [Guan et al., 2011]. - 171 -

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Fig. 3-10. Phylogenetic tree of the isolates from Saeu-jeotgal, showing the relationship based on the determination of the near-complete 16S rdna sequences of the isolates. DNA sequences were aligned with those of neighboring taxa based on secondary structure information using the PHYDIT program. Evolutionary distances were calculated according to Kimura s two-parameter model, and clustering was performed using the neighbor-joining method. The Phylogenetic tree was generated by a treeing algorithm contained within the PHYDIT program. The numbers in parentheses indicate the numbers of isolates identified as the same species. New, unidentified species showing similarities of less than 97% with the closest type strain are presented in bold letters. The bar indicates the number of nucleotide substitutions per site. (8) 배지에따른분리 bacteria의다양성기존에진행된새우젓갈미생물분석연구에서는대부분 TSA, nutrient agar 및 plate count agar를 bacteria의분리및계수에사용하였다 [Ha et al., 2007; Lee et al., 1999; Oh et al., 2005]. 본연구에서는 bacteria 다양성을높이기위하여 1.8% (w/v) 한천을첨가한 marine medium, nutrient medium, MRS medium과새우젓갈의소금농도를고려하여각배지에 NaCl을최종농도가 6% (w/v) 되도록첨가한배지를이용하여확인하였다. Marine agar에서는 Salimicrobium 속이 NaCl의첨가에관계없이우점하는것으로나타났고, NaCl 무첨가의경우에는 Psychrobacter, Staphylococcus 속이, NaCl을첨가한경우에는 Psychrobacter, Salinicoccus 속이그뒤를이어검출되었다 (Table 3-10). 가장많이검출된 Salimicrobium 속의경우, 25일이후부터검출이증가하는것으로보아고염상태에도증식이가능한것으로추정된다. Marine agar에서 Salimicrobium 속이우점종으로 41% 정도의비중으로검출된것과는달리, nutrient agar에서는우점으로검출된 bacteria 속들간에차이가줄어들었다 (Table 3-11). Nutrient agar에서는 Staphylococcus, Kocuria, Microbacterium 속의순으로, 6% NaCl을첨가한배지에서는 Psychrobacter 속이우점하였고, Kocuria, Staphylococcus 속이뒤를이었다. MRS agar에서는숙성초기에다양한 bacteria가검출되었지만, 숙성의진행에따라 Staphylococcus 속이가장큰비중으로증가하였고, Vagococcus, Kocuria, Granulicatella 속이뒤를이었다 (Table 3-12). NaCl을첨가한 MRS agar에서는 Staphylococcus, Kocuria, Jeotgalicoccus 속의순으로우점하였다. 3종류의 NaCl 무첨가배지로부터총 237 균주를분리하여동정한결과 Staphylococcus, Salimicrobium, Kocuria, Psychrobacter 속이차지하는비중은각각 30%, 14%, 8%, 4% 로순으로나타났고, NaCl을첨가한배지로부터는총 230 균주를분리하여동정한결과 Staphylococcus, Salimicrobium, Kocuria, Psychrobacter 속이차지하는비중은각각 20%, 18%, 17%, 12% 로순으로나타났다. 배지에첨가한 NaCl의유무에따라우점종이차지하는비율은달라졌으나우점하는순서는동일하게나타났다. - 173 -

배지의종류에따라검출된 bacteria 의다양성이다르게나타났지만, Staphylococcus 속 만이연구에이용된 6 종류의모든배지에서높은빈도로검출되었다. nutrient agar 에서 종의다양성이가장높게나타났고, MRS agar 에서가장낮게나타났다. Table 3-10. Numbers of isolates from Saeu-jeotgal on marine agar and NaCl supplemented marine agar during ripening summarized at the genus level. Marine agar (2% NaCl) a Marine agar (6% NaCl) a Genus Storage time (day) Total Storage time (day) Total 1 5 10 15 25 35 65 135 1 5 10 15 25 35 65 135 Actinomyces 2(2) 1(1) 3(3) 1(1) 1(1) Agrococcus 1 1 2 1 1 2 Alkalibacillus 1 1 2 Bacillus 1 1 Brachybacterium 1 1 2 1 2 1 4 Citricoccus 1 1 Corynebacterium 3 3 Dietzia 1 1 1 3 1 1 Exiguobacterium 1 1 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) Idiomarina 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1 1 Janibacter 2 2 Jeotgalicoccus 1 1 2 1 1 4 Kocuria 1 1 1 1 1 5 Trichococcus 1(1) 1(1) 2(2) 1(1) 1(1) Kytococcus 1 1 1 1 Leucobacter 1 1 1 1 Microbacterium 1 1 2 1 1 Oceanobacillus 1 1 Ornithinimicrobium 1 1 Planococcus 1 1 2 1 1 2 Planomicrobium 1 1 Psychrobacter 3 1 1 3 8 1 1 1 1 1 1 6 Salimicrobium 1 1 1 3 8 11 8 33 1 6 11 11 9 38 Salinicoccus 1 1 1 1 4 3 1 1 1 6 Staphylococcus 2 2 1 1 2 8 2 1 1 4 Vibrio 1 1 Total 10(1) 10(1) 11(2) 10(1) 8 10 11 10 80(5) 11 10(1) 10 9 9(1) 12 12 11 84(2) The numbers of likely new unidentified species are indicated in parentheses (with less than 97% 16S rdna similarities to any known species). a Final NaCl concentration in the medium was indicated in the parenthesis. - 174 -

Table 3-11. Numbers of isolates from Saeu-jeotgal on nutrient agar and NaCl supplemented nutrient agar during ripening summarized at the genus level. Nutrient agar Nutrient agar (6% NaCl) a Genus Storage time (day) Total Storage time (day) 1 5 10 15 25 35 65 135 1 5 10 15 25 35 65 135 Total Acinetobacter 1 1 Agrococcus 1 1 2 1 1 Arthrobacter 1 1 Bacillus 1 1 2 1 1 Brachybacterium 2 1 1 4 1 1 1 2 5 Corynebacterium 1 1 2 1 1 2 Dietzia 1 1 2 Exiguobacterium 1 1 2 1 1 Jeotgalicoccus 1 1 1 3 Kocuria 2 2 2 2 3 3 1 15 1 1 1 7 10 Trichococcus 1(1) 1(1) Trueperella 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) Kytococcus 1 2 3 1 1 Leucobacter 1(1) 1 2(1) Marinobacter 1 1 Methylobacterium 1 1 2 Microbacterium 2 1 1 2 1 1 8 Micrococcus 2 2 Oceanobacillus 1 1 2 Paracoccus 1 1 Planococcus 1 1 2 Psychrobacter 1 1 2 2 4 3 4 2 1 1 4 21 Rhodococcus 1 1 Rothia 1 1 1 1 Salimicrobium 1 3 4 Salinicoccus 1 1 1 1 4 Staphylococcus 2 3 3 4 3 2 3 20 2 3 2 3 10 Vagococcus 1 2 3 Vibrio 1 1 Total 7(2) 10 10 10 12 11 10 7 77(2) 7 9 10(1) 12 9 8 9 7 71(1) The numbers of likely new unidentified species are indicated in parentheses (with less than 97% 16S rdna similarities to any known species). a Final NaCl concentration in the medium was indicated in the parenthesis. - 175 -

Table 3-12. Numbers of isolates from Saeu-jeotgal on MRS agar and NaCl supplemented MRS agar during ripening summarized at the genus level. Genus MRS agar Storage time (day) Total MRS agar (6% NaCl) a Storage time (day) 1 5 10 15 25 35 65 135 1 5 10 15 25 35 65 135 Aerococcus 1 1 1 3 1 1 2 Arthrobacter 2 2 1 1 Brachybacterium 1 1 Brevibacterium 1 1 Carnobacterium 1 1 Corynebacterium 1 1 1 3 1 1 Enterococcus 1 1 Exiguobacterium 1 1 Granulicatella 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 2(2) 1(1) 1(1) 1(1) 5(5) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) Jeotgalicoccus 4 1 5 Kocuria 1 1 2 1 5 2 1 5 3 1 4 6 1 23 Kurthia 1 1 Leuconostoc 2 2 Macrococcus 1 1 Micrococcus 1 1 Oceanobacillus 1 1 Paracoccus 1 1 Psychrobacter 1 1 Rothia 3 3 Salinicoccus 1 1 1 3 Serratia 1 1 Staphylococcus 2 2 4 8 4 11 12 43 1 2 3 2 11 5 3 5 32 Streptococcus 1 1 Vagococcus 2 3 2 7 1 1 Total 10(1) 10 10(1) 7(1) 11(2) 8 11 13 80(5) 9 10 9 8(1) 12 10 9 8 75(1) The numbers of likely new unidentified species are indicated in parentheses (with less than 97% 16S rdna similarities to any known species). a Final NaCl concentration in the medium was indicated in the parenthesis. Total (9) 새우젓갈숙성에따른 bacteria 상의변화새우젓갈숙성에따른 bacteria 군집변화의이해를위하여각배지로부터분리동정된 bacteria의다양성을숙성기간에따라정리하였다 (Table 3-13). 새우젓갈담금후, 숙성 1 일차에는 39종, 135일차에는 13종이확인되었고, 각시료로부터 3균주미만이분리된 bacteria는 1일차에 37% 를차지하였지만, 135일차에는 5% 로나타나숙성이진행되면서 bacteria의다양성이단순화되는것으로나타났다 (Fig. 3-11). Brachybacterium, Kocuria, Microbacterium, Psychrobacter, Salimicrobium, Salincoccus, Staphylococcus 속은숙성과정중에꾸준하게검출되었고, 이중 Staphylococcus, Salimicrobium 속은숙성 1일차에각각 2% 의낮은비중으로검출되었지만, 숙성에따라계속적으로증가하여 135일차에는각각 39%, 36% 의높은비중으로검출되었다. 따라서이들두속은새우젓갈의발효를담당하는우점종으로추정된다. 본연구에서분리된 467 균주중, 가장많이검출된 St. equorum은 117 균주가분리되었다. St. equorum은소시지, 발효육류및치즈에서분리되어유럽에서식품발효의종균으로이용되고있으며 [Hoppe-Seyler et al., 2004; Place et al., 2003; Talon et al., 2008], coagulase를생산하지않아식품위해균 Staphylococcus aureus와구분되는 coagulase-negative staphylococci - 176 -

(CNS) 로분류되고, 이들에대한위해성은보고된바없다. Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Leucobacter, Oceanobacillus, Streptococcus, Vagococcus 속의유산균이소수분리되었지만, 대부분숙성초기에검출이되었고큰비중을차지하지않아젓갈발효에크게관여하지않는것으로추정된다. - 177 -

Table 3-13. Numbers of isolates from Saeu-jeotgal during ripening summarized at the genus level. Class Genus Storage time (day) 1 5 10 15 25 35 65 135 Total γ-proteobacteria α-proteobacteria Bacilli Actinobacteria Acinetobacter 1 1 Idiomarina 1 1 Marinobacter 1 1 Psychrobacter 7 6 5 6 7 1 1 5 38 Serratia 1 1 Vibrio 2 2 Methylobacterium 1 1 2 Paracoccus 1 1 Aerococcus 1 1 2 1 5 Alkalibacillus 1 1 2 Bacillus 1 1 1 1 4 Carnobacterium 1 1 Enterococcus 1 1 Exiguobacterium 2 2 1 5 Jeotgalicoccus 7 3 1 1 1 13 Granulicatella 1(1) 1(1) 2(2) 2(2) 6(6) Kurthia 1 1 Leuconostoc 2 2 Macrococcus 2 2 Oceanobacillus 1 1 1 1 4 Planococcus 3 2 1 1 7 Planomicrobium 1 1 Salimicrobium 1 1 2 9 20 22 20 75 Salinicoccus 6 3 3 2 1 1 1 17 Staphylococcus 1 6 14 15 27 16 16 22 117 Streptococcus 1 1 Vagococcus 3 3 2 3 11 Trichococcus 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 4(4) Actinomyces 1(1) 2(2) 1(1) 4(4) Agrococcus 2 1 2 2 7 Arthrobacter 3 1 4 Brachybacterium 2 1 4 2 4 2 1 16 Brevibacterium 1 1 Citricoccus 1 1 Corynebacterium 3 2 4 1 1 11 Dietzia 1 3 1 1 6 Janibacter 2 2 Kocuria 3 5 8 8 4 11 16 3 58 Trueperella 1(1) 1(1) Kytococcus 2 1 1 2 6 Leucobacter 1(1) 1 2 3(1) Microbacterium 1 2 2 1 3 1 1 11 Micrococcus 2 2 Ornithinimicrobium 1 1 Rhodococcus 1 1 Rothia 1 1 3 5 Total 54 59 60 56 61 59 62 56 467 The numbers of likely new unidentified species are indicated in parentheses (with less than 97% 16S rdna similarities to any known species). - 178 -

Fig. 3-11. Cultivable bacterial community migration during the ripening of Saeu-jeotgal. (10) 분리균주의 NaCl 내성분리균주중, 높은빈도로검출되었고, 숙성에따라그비중이증가하는것으로나타난 St. equorum, Sm. salexigens 그리고 Ko. palustris의새우젓갈숙성중의우점화에대한원인규명및향후새우젓갈의종균으로써의적용가능성을검토하기위하여 NaCl에대한내성을측정하였다. 모든균주들은 marine ager보다 nutrient agar에 NaCl을첨가한경우에더높은생장을보였으며, St. equorum, Sm. salexigens, Ko. palustris는매우느린생장을보였지만각각염농도 22%, 26%, 14% 까지생장하는것을확인하였다 (Fig. 3-12). 이러한 NaCl 20% 이상의고염배지에서 St. equorum과 Sm. salexigens의생장은이들에의한새우젓갈의발효가능성에대한추가적근거로사료된다. 이들균주의생장을고체배지에서확인하기까지 15일정도의배양시간이소요되는점은고염식품인새우젓갈의숙성에오랜시간이걸리는이유로추정된다. St. equorum 표준균주의경우, NaCl 15% 이상의환경에서는생장이나타나지않았지만, 본실험에서분리한균주들은모두높은내염성을보여, 같은종으로분류된균주들간에내염성에대한차이가큰것으로추정된다 (data not shown). St. equorum은 ph 5.1 이하의산성영역에서는생장이불가능하다고보고된바있지만 (Place et al., 2003), 새우젓갈의환경은중성 ph가계속적으로유지되기때문에이들균주가생장하기에좋은조건을제공한것으로사료된다. 본실험을통하여새우젓갈발효의우점종으로확인된 St. equorum과 Sm. salexigens는국내에서종균으로사용된바가없어향후이들을새우젓갈발효의종균으로적용하고자할경우, 이들에대한안전성평가가요구된다. - 179 -

Fig. 3-12. Effect of NaCl on the growth of predominant species isolated from Saeu-jeotgal. Twelve strains in the species were cultured on the nutrient agar containing NaCl at 30 o C for 15 days. - 180 -