Journal of The Korea Society of Computer and Information Vol. 21 No. 5, pp. 135-139, May 2016 www.ksci.re.kr http://dx.doi.org/10.9708/jksci.2016.21.5.135 Scrophularia ningpoensis hemsl has been traditionally used in China and Vietnam for treatment of bacteria, atopy, pimple, tonsillitis, angina and encephalitis for a long time. The main objectives of this study were to evaluate the antibacterial activity of the Scrophularia ningpoensis hemsl extract on biofilm formation of Klebsiella pneumoniae. Antibacterial activity was conducted using disc diffusion assay and minimum inhibitory concentration (MIC), and minimum bactericidal concentration (MBC) were determined using the broth micro dilution method in accordance to Clinical and Laboratory Standards Institute guidelines(clsi). Furthermore, cytotoxicity on L929 were assessed using animal cell culture for the proliferation test(mtt cell assay) and the biofilm forming capacity of the K. pneumoniae were determined using the colony forming unit (CFU) assay. The extract exhibited considerable antibacterial activity. K. pneumoniae was susceptible to the extract with the MIC and MBC of 0.1875 and 1.5 mg / ml respectively. Cytoxicity test in L929 showed no sign of toxicity at the concentration of 0.75mg / ml and at the same concentration the extract caused inhibition of bacterial biofilm formation. The extract of Scrophularia ningpoensis hemsl possesses an in vitro antibacterial antibiofilm activities against K. pneumoniae, with no sign of cytoxicity on L929. Klebsiella pneumoniae 는자연에넓게분포하고있으며흙과물에서많이있다. K. pneumoniae 는 Proteobacteria 문, 장내세균과에속하는세균이다. 이세균은원통형의막대기모양이면길이는 2 마이크론, 직경은 0.5 마이크론이다. 협막을가지고있으며협막은 160 nm 이다 [1]. Klebsiella 는그람음성막대균으로폐렴, 요로감염그리고연골조직감염, 균혈증등과같은감염을일으키고이질환들을막기위해요즘많은방법들을찾아내고있다 [2-3]. 특히 K. pneumoniae 는병원내에서획득한내성유전자가 Extended-Spectrum -Lactamase 을생성하여항생제내성을초래하는것은세계적인문제가되었고적절한감염관리와항생제관리전략이필요하다 [4]. 병원내병원성세균에대한내성은최근문제화되고있으며이는헬스케어의중대한도전이되고있다 [5]. 항균제의잘못된사용은약제에대한다제내성을유도하여항균제내성을키우고치료를더어렵게만든다 [6]. Scrophularia 속에는 300 여가지의종이존재하는것으로알려져있으며, 중국의전통의학에서는말린뿌리를다양한질병을치료하는허브차로수백년에걸쳐중국에서이용되어지고있다 [7]. Scrophularia ningpoensis Hemsl에는다양한 iridoid glycosides성분을함유하고있는것으로알려져있으며, 이는앞선연구에서항균작용, 해열, 항염작용 ( 후두염, 신경염 ), 부종제거, 변비및농양치료, 혈압을낮추는등의효과가있는것으로보고된바있다 [8-11] Harpagoside, angroside C, acteoside 그리고 cinnamic acid가생물체작용하는성분이다 [8,12-15].
136 Journal of The Korea Society of Computer and Information 본연구는 Scrophularia ningpoensis Hemsl 추출물의 K. pneumoniae 에대한항균력시험 ( 디스크확산법, 최소억제농도, 최소살균농도, 바이오필름형성과부유생물의성장 ) 과세포독성을평가하고자실시하였다. 2.1.1 추출액본연구에사용된식물추출액은해외생물소재센터 (International Biological Material Research center) 에서분양받아사용하였다. 말린 Scrophularia ningpoensis Hemsl, Buddleja officinalis Maxim, Clinopodium chinense (Benth.) Kuntze 200g을 1.5L 메탄올용액에첨가한후, 50 에서초음파로 (15분/2시간간격 ) 파쇄하며 3일간추출하였다. 식물추출액은여과지로필터한후, 45 에서감압농축하였으며, 농축잔여물은최종동결건조하였다. 2.1.2 사용균주본연구에서는 Staphylococcus aureus(atcc 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853), K. pneumoniae (ATCC 700831) 을 Muller-Hinton (MH) agar에접종하여 37 에서 24시간 2회계대배양하여활성화한후, 실험에사용하였다. 2.2 시약및배지 2.1.1 시약제조본연구에서균을배양하기위해 Muller Hinton agar, broth 배지 (Sparks, MD, USA) 를사용하였으며, 구입처인 BD사의양식에따라제조하여사용하였다. 2.1.2 디스크확산 (Disk diffusion) 검사본연구에서식물추출액의항균력을알아보기위해디스크확산법을시행하였다 [16]. S. aureus, E. coli, P. aeruginosa K. pneumoniae 는 MH agar에 24시간전미리배양하였으며, 형성된집락을이용해 McFaland 0.5 (1.5 X 108colony forming unit(cfu)/ ml ) 탁도의균주액을제조하여 100 μl을배지에분주한후, 멸균면봉을이용하여도말하였다. 시험군으로는구매한직경 6mm blank 디스크 (Thermo) 에각각의식물추출액 ( 최종농도 0.5mg ) 을탑재하였으며, 음성대조군으로는메탄올 50 μl, 양성대조군으로는 cefotaxime 30 μg, ampicillin 10 μg, 디스크를올려놓은후, 37 에서 24시간동안배양하였으며, 이후형성된억제대의직경을측정하였다. K. pneumoniae 에대한식물추출액의최소억제농도 (minimum Inhibitory concentration, MIC) 와최소살균농도 (minimum bacteriocidal concentration, MBC) 실험은액체배지희석법을이용하여측정하였다 [16]. MIC의측정은 96-well plate의각 well에 MH broth를이용하여 10 7 CFU/ ml로조정한균주액 100 μl씩을넣고, 항균제디스크확산검사에서항균효과를보인식물추출액을 2단계씩희석한농도의식물추출액을 50 μl씩첨가하였다. 37 에서 24시간동안배양후, 식물추출액을첨가하지않은균배양액과식물추출액을첨가한균배양액과비교하여, 최초로균의증식이억제된농도를각균의 MIC로하였다. 2.1.4 최소사멸농도시험 MBC의측정은 96-well plate의각 well에 MH broth를이용하여 10 7 CFU/ ml로조정한각균주액 100 μl씩을첨가하고, MIC 농도를전 후로 2단계씩희석한농도의식물추출액을 50 μl씩첨가한다음, 37 에서 24시간동안배양하였다. 배양후, 균의사멸여부를확인하기위하여, 각 well에있는배양액 50 μl씩을 MH agar에도말하여, 37 에서 24시간동안추가배양하였다. 2.1.5 세포독성시험 (MTT assay) MTT assay에사용된흰쥐의섬유아세포 (L929) 세포는 DMEM배지에 10% FBS, 100 unit ml-1 의 penicillin/streptomycin 을첨가한것을사용하였으며, 37, 5% CO 2 배양기를이용하여유지하였다. 2 10 5 의 L929세포를 96-well plate에분주한후, 0.75, 1.5, 3mg/ ml의최종농도로식물추출액과혼합하여 37, 5% CO2 배양기에서 24시간동안배양하였다. 24시간후, MTT 용액 10 μl (5 mg/ ml ) 을각각의 well에첨가하고 4시간추가배양하였다. 배지를제거하고 200 L의 DMSO (dimethyl sulfoxide) 로 well에생성된 formazan 결정을완전히용해시켜 ELISA reader (Tecan, Zurich, Switzerland) 640 nm에서흡광도를측정하였다. 세포독성은시료의흡광도를대조군의흡광도에대한백분율로나타내었다. 2.1.6 바이오필름형성억제효과평가시험 24-well plate (TPP, Trasad- ingen, Switzerland) 각 well에 107CFU/ ml조정한균주액 (MH broth) 과세포독성이없는것으로확인된 0.75mg/ ml의최종농도로식물추출액을첨가한후, 37 에서 24시간동안배양하였다. 음성대조군으로는균주액또는 MH broth만을배양하였으며, 양성대조군으로는 gentamicin 을 200μg / ml의최종농도로균주액과함께배양하였다. 배양이끝난실험군및대조군은 phosphate buffered saline (PBS) 로 5회세척한후, CFU assay를시행하였다. CFU assay는각 well에형성된바이오필름에 1ml의 PBS를
Antimicrobial activity and cytotoxicity test of Scrophularia ningpoensis hemsl extracts against Klebsiella pneumoniae 137 첨가한후, scraper 을이용하여균을수집하였으며, 단계별희석을통하여형성된집락의수를측정하였다. 본연구에서모든실험은최소세번이상수행하였으며모든결과값들은 mean±standard deviation(s.d.) 으로나타내었다. 실험군에따른데이터간의통계적유의성검정을위해 ANOVA와 student s t-test를수행하였다 (p<0.05). Zone of inhibition (mm) 40 30 ** 20 15 10 5 laria ningpoensis Hemsl 0 Buddleja officinalis Maxim CNT Clinopodium chinense (Benth.) Disc diffusion *** Cefotaxime CNT Scrophularia ningpoensis Hemsl Buddleja officinalis Maxim Clinopodium chinense (Benth.) Cefotaxime 3.1.1 항균제디스크검사결과항균력이있는식물추출액 (Table.1) 을선별하기위해디스크확산시험을우선적으로시행하였다. 각각의식물추출액은 0.5mg의최종농도로디스크에분주하였으며, 음성대조군으로는메탄올을양성대조군으로는 cefotaxime 항생제 (30μg) 를 E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae 표준균주실험군에 ampicillin(10 μg,) 디스크는 S. aureus 표준균주실험군에사용하여향균력을비교하였다 (Data not shown). 실험결과, Scrophularia ningpoensis hemsl 의메탄올추출물이 Buddleja officinalis maxim, Clinopodium chinense (Benth.) Kuntze 추출물에비해그람음성세균인 K.pneumoniae 에대하여대조균항균제 cefotaxime 은평균 32mm이고 Scrophularia ningpoensis hemsl는평균 10mm의억제대, Buddleja officinalis maxim와 Clinopodium chinense Kuntze 는전혀억제대가없는 6mm로나타나항균력의유의한차이를보여주었다 (Fig 1). 디스크확산시험을통해항균력이있는것으로확인된 Scrophularia ningpoensis hemsl 메탄올추출물의 K. pneumoniae 에대한 MIC, MBC를측정하였다. 3.1.2 최소억제농도시험결과액체배지희석법을통한실험결과 K. pneumoniae 에대한 Scrophularia ningpoensis hemsl MIC 농도는 0.1875mg / ml로나타났다. 3.1.3 최소사멸농도시험결과 MBC 농도는 1.5mg / ml로각각측정되었다 (Table 2). Botanical Name S c r o p h u l a r i a ningpoensis Hemsl Buddleja Maxim officinalis C l i n o p o d i u m chinense (Benth.) Kuntze Antibacterial activity MIC MBC Fig. 1. Antibacterial activity of different plant extracts(**p<0.05, ***p<0.001) Table 1. Information on the plants used and report on evidence of their activities Traditional uses Antibacteria, Atopy, Pimple, tonsillitis, Angina, Encephalitis, Hypertensive petechial fever, scrofula Rheumatism Gonorrhea, Hematuria, Epistaxis Table 2. Antibacterial activity of the methanol extract of Scrophularia ningpoensis Hemsl against K.pneumoniae (n=3) Scrophularia ningpoensis Hemsl 0.1875mg/ml 1.5mg/ml 3.1.4 Scrophularia ningpoensis hemsl 의 흰쥐섬유아세포 (L929) 에대한세포독성평가 L929 는일반적으로어떤물질의독성을판단할때기준이 되는세포로서한국식품의약품안전청에서독성평가시에사용 되는세포주이다. Scrophularia ningpoensis hemsl 추출물이 L929 세포에미치는세포독성을알아보기위하여 MTT assay 를시행하였다. MBC 농도를기준으로고농도와저농도의추출 물을사람말초혈액세포 (2 X 10 5 /well) 와 24 시간배양하였다. 실험결과, 세포배양액만첨가한대조군은 102% 의세포생존률 을보였으며, 3 mg / ml의추출액농도에대해서는 79%, 1.5 mg / ml 은 91%,0.75 mg / ml은 98% 의세포생존율을보임으로써 L929 세포에대한세포독성을띄지않음을확인할수있었다 (Fig. 2).
138 Journal of The Korea Society of Computer and Information MTT assay (200ug/ml)) 150 n.s ** *** % Cell viability 100 50 0 CNT 0.75 1.5 3 Extracts conc (mg/ml) Fig. 2. Effect of the different concentration on L929 cells.(**p<0.05, ***p<0.001) 3.1.5 Scrophularia ningpoensis hemsl 추출물의 K. 형성억제효과 pneumoniae 바이오필름 Scrophularia ningpoensis hemsl 추출물의 K.pn eumoniae 바이오필름에대한항균효과를확인하기 위해추출액과 (0.75mg/ml) 균부유액을 (1.5 X 1 0 8 / ml ) 함께배양하였다. 24 시간배양후, 현미경관찰및 CFU assay 을시행한결과,Scrophularia ningpoensis hemsl 추출물이첨가된실험군이대조군에 비해유의하게생존균수가감소해있음을확인하였다 (Figur3). 앞선연구에서 Scrophularia ningpoensis hemsl에대한항균작용, 해열, 항염작용, 부종제거, 변비및농양치료, 혈압을낮추는등의효과가있는것으로보고된바있지만폐렴과요로감염등을일으키는 K. pneumoniae 에대한항미생물작용과세포독성실험연구가없어본연구를실시하였다. 디스크확산항균력시험을위해식물추출액은 0.5mg의최종농도로디스크에분주하고, 음성대조군으로는메탄올을양성대조군으로는하여 cefotaxime (30μg) 항생제를 E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae 을실험군에 ampicillin (10μg,) 디스크는 S. aureus 표준균주실험군에사용하여향균력을비교한바, 장내세균인 K. pneumoniae 에 Scrophularia ningpoensis hemsl 의메탄올추출물이 10mm 억제대를, Buddleja officinalis maxim 와 Clinopodium chinense (Benth.) Kuntze은억제대가나타나지않아유의한차이를보였다. 액체배지희석법을이용하여실험한결과 K. pneumoniae 에대한 Scrophularia ningpoensis hemsl 최소억제농도 (MIC) 는 0.1875mg / ml로나타났다. 최소사멸농도 (MBC) 는 1.5mg / ml로각각결과가보였다. 일반적으로어떤물질의독성을판단할때기준이되는세포로서 L929는한국식품의약품안전청에서독성평가시에사용되는세포주이다. Scrophularia ningpoensis hemsl 추출물이 L929세포에미치는세포독성을알아보기위하여 MTT assay를시행하였다. 최소사멸농도를기준으로고농도와저농도의추출물을 L929 세포주 (2 X 10 5 /well) 와 24시간배양하여세포배양액만첨가한대조군은 102% 의세포생존율을보였으며, 3mg / ml의추출액농도에대해서는 79%, 1.5mg / ml은 9 1%,0.75mg / ml은 98% 의세포생존율을보여 L929세포에대한세포독성을띄지않음을확인할수있었다. Scrophularia ningpoensis hemsl 추출물의 K.pneumoniae 바이오필름에대한항균효과를보기위해추출액과 (0.7 5mg/ml) 균부유액을 (1.5 X 10 8 / ml ) 함께배양하였고 24시간배양후, 현미경관찰및 CFU assay 을분석한결과, Scrophularia ningpoensis hemsl 추출물이첨가된실험군이대조군에비해유의하게생존균수가감소해바이오필름에대한항균효과도있음을확인하였다. Fig. 3. Microscopic images (X400) on biofilm formation of K. pneumoniae treated with Scrophularia ningpoensis Hemsl extract (**p=<0.05, ***p<0.001) A:CNT( 음성대조군 ), B:Scrophularia ningpoensis hemsl 추출물 C: gentamicin D:Colony forming unit (CFU) assay 결과 (CNT : only K.pneumoniae, Extracts : Scrophularia ningpoensis hemsl추출물 (0.75mg/m)l, gentamicin [1]Gowsiya Shaik, Sujatha and Santosh Kumar Mehar,
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